CN104031127B - 一种固液结合制备比伐卢定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于多肽合成领域，涉及一种固液结合制备比伐卢定的方法，本发明采用液相和固相相结合的方法制备比伐卢定，能够很好的避免杂质肽的产生，提高粗肽纯度，降低生产成本。该方法首先采用液相法合成片段六肽Fmoc‑Arg(pbf)‑Pro‑Gly‑Gly‑Gly‑Gly‑OH，然后再在固相上接肽，利用此方法可以避免产生杂质肽Biv±Gly和Biv±2Gly，还避免了固相接Arg时难以偶联完全的难题；利用此合成工艺，可以使粗肽纯度达到90%以上，降低了纯化难度，使最终产品的纯度超过99.5%，进一步降低了生产成本。与现有技术相比，本发明工艺操作简单，合成成本低，利于工业大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种固液结合制备比伐卢定的方法。
技术背景
比伐卢定（Bivalirudin)，商品名Angiomax，由美国Medicines公司申请，2000年12月经FDA批准首先在美国上市。作为抗凝药用于治疗接受经皮冠状动脉腔内成型术（PTCA）的不稳定型心绞痛患者。比伐卢定是水蛭素类似物，根据水蛭素蛋白序列设计，化学合成。与水蛭素相比，其作为凝血酶抑制剂具有直接性、特异性、可逆性等优点。
比伐卢定是一个有20个氨基酸组成的多肽，氨基酸序列如下所示：D-1Phe-Pro-Arg-Pro-5Gly-Gly-Gly-Gly-9Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-15Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-20Leu-OH。
关于比伐卢定的制备方法，国内外已有大量报道。中国专利CN101475631A、CN102164609A、CN102264757A采用液相合成方法，由于比伐卢定含有20个氨基酸残基，肽序较长，液相反应较为繁琐，不易纯化，合成起来花费时间较长，收率低。
比伐卢定结构中含有-Gly-Gly-Gly-Gly-片段，采用固相逐步接肽合成时，由于Gly自身的特性，在合成中会极易产生Bivalirudin±1Gly和Bivalirudin±2Gly的杂质肽，而且这些杂质在后续分离中很难去除；针对上述难题，专利WO2010117725采用Fmoc-Gly-Gly-OH作为单体合成比伐卢定，很好的避免了杂质Bivalirudin±1Gly的生成，但仍然无法避免Bivalirudin±2Gly的产生；CN102260323A提出先在液相条件下合成Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH四肽片段，然后将其接到肽树脂上，再逐步接上剩余氨基酸，可有效避免上述四个杂质的产生。专利CN102286076A和CN102532274A，其中也是在液相条件下合成两肽、三肽或四肽等片段肽，将其接到肽树脂上，其目的也是尽量避免上述杂质肽的生成。
同时比伐卢定的合成过程中，发现Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH的溶解性较差，即使在DMF中也很难完全溶解，给接肽反应带来困难；专利CN103242431A采取先液相合成片段5肽Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH，然后再固相接到肽树脂上，片段5肽在DMF中的溶解性远远好于Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH，为片段肽的纯化及后续的接肽反应，降低了难度。
在比伐卢定的工艺开发中，3位Arg的连接比较困难，难以避免产生缺失Arg的杂质或是此位点由于偶联不完全而封端的杂质肽，即使复投两次也难以达到反应终点；专利CN102532274A采用Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-OH作为单体，解决了这个问题；但其采用Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH作为单体接肽，仍然会后遇到溶解困难，单体难以纯化的问题。
发明内容
为了解决以上比伐卢定合成中遇到的难点，本发明提供一种固液结合制备比伐卢定的方法，既能避免杂质Bivalirudin±1Gly和Bivalirudin±2Gly的产生，又能解决3位Arg的偶联困难，需要多次复投的难题；同时提高粗肽的纯度，降低纯化难度，使生产成本进一步降低，利于工业上大规模生产比伐卢定。
为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种固液结合制备比伐卢定的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（a）采用Wang树脂或CTC树脂为固相载体，用Fmoc-Leu-OH与之偶联反应制备Fmoc-Leu-Wang树脂或Fmoc-Leu-CTC树脂，再按序列依次偶联连接11个Fmoc保护氨基酸，得侧链保护比伐卢定[9-20]肽树脂；
比伐卢定[9-20]肽树脂的结构如下：
Fmoc-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)- Leu-树脂；
（b）在液相条件下由双甘肽和Boc-Pro-OH或Fmoc-Pro-OH为原料制备Pro-Gly--Gly -Gly--Gly-OH，然后再用Fmoc-Arg(pbf)-OH与之反应得到片段六肽Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly- Gly-Gly-Gly-OH；
（c）比伐卢定[9-20]肽树脂脱掉Fmoc保护基后，再和片段六肽Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly- Gly-OH在固相条件下缩合反应生成18肽片段肽保护树脂，再按序列依次连接上Fmoc-Pro-OH和Boc-D-Phe-OH或Fmoc-D-Phe-OH，完成比伐卢定肽树脂的制备，经裂解、纯化、冷冻干燥得比伐卢定精肽。
优选的，步骤（a）中：所述固相载体为替代度为0.3-1.5mmol/g的Wang树脂或CTC树脂；所述Fmoc-Leu-Wang树脂或Fmoc-Leu-CTC树脂脱除Fmoc保护后，以2-3倍的投料比加入相应的Fmoc保护氨基酸进行偶联反应，每一个偶联反应均是在缩合剂的存在下进行的固相接肽反应，每一步偶联反应均以Kaiser试剂检测反应终点，反应完毕后用脱保护试剂脱除Fmoc，再与下一个Fmoc保护氨基酸进行偶联反应；重复操作直至合成得到侧链全保护的比伐卢定[9-20]肽树脂：Fmoc-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu) -Glu(OtBu)-Ile-Pro- Glu(OtBu)- Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-树脂。更进一步优选的，步骤（a）中，所述制备的Fmoc-Leu-Wang树脂或Fmoc-Leu-CTC树脂替代度为0.3-1.5mmol/g，优选0.4-0.8mmol/g；所述脱保护试剂优选为20%哌啶的DMF溶液（体积比）；偶联反应中所用的缩合剂为以下组合DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA的一种。
优选的，所述步骤（c）中具体操作步骤为：
（1）将所述比伐卢定[9-20]肽树脂用脱保护试剂脱除Fmoc后，再加入Fmoc-Arg(pbf)-Pro -Gly-Gly-Gly-Gly-OH的活化溶液发生偶联反应，制得侧链全保护的比伐卢定[3-20]肽树脂：
Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu) -Glu(OtBu)-Ile-Pro- Glu(OtBu)- Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-树脂；
（2）将上述比伐卢定[3-20]肽树脂用脱保护试剂脱除Fmoc后，再依次与Fmoc-Pro-OH和Boc-D-Phe-OH发生偶联反应，制得比伐卢定肽树脂；
（3）所得比伐卢定肽树脂经裂解试剂处理后，滤得裂解液，经沉降、分离得比伐卢定粗肽；所得粗肽经制备液相纯化后得的精肽溶液，浓缩冻干后得比伐卢定精肽。
进一步优选的，所述脱保护试剂优选为20%哌啶的DMF溶液（体积比）；偶联反应中所用的缩合剂为以下组合DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA的一种；所述裂解试剂为加入体积比1-5%清除剂的TFA溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水中的一种或几种。
优选的，步骤（b）中，所述片段六肽Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH制备方法为：
将Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和碳酸钠溶于水中，加入Fmoc-Arg(pbf)-OSu的有机溶剂溶液，搅拌反应，TLC监测反应终点，反应结束后，加入稀盐酸调溶液pH值至2～3，析出固体，抽滤得白色固体，水洗3遍，干燥后重结晶，即得。
所述Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和碳酸钠的摩尔比为1：1～2；Fmoc-Arg(pbf)-OSu与Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH摩尔比为1：0.8～1.2；所述有机溶剂为四氢呋喃、二氧六环、丙酮中一种或一种以上的混合液。
优选的，所述Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH的制备方法为：
由Boc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH经TFA处理后，冷乙醚中沉降析出。
优选的，所述Boc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH制备方法如下：
将双甘肽Gly-Gly-OH和碳酸钠溶于水中，加入Boc-Pro-OSu的有机溶剂溶液，搅拌反应，TLC监测反应终点，反应结束后，减压蒸掉有机溶剂，加入10%柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，乙酸乙酯萃取，浓缩后加入石油醚析晶得Boc-Pro-Gly-Gly-OH；
将双甘肽Gly-Gly-OH和碳酸钠溶于水中，加入Boc-Pro-Gly-Gly-OSu的有机溶剂溶液，搅拌反应，TLC监测反应终点，反应结束后，加入10%柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，乙酸乙酯萃取，浓缩后加入石油醚析晶得Boc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH。
更进一步优选的，所述有机溶剂为四氢呋喃、二氧六环、丙酮中一种或一种以上的混合液；双甘肽Gly-Gly-OH和碳酸钠的摩尔比为1：1～2；Boc-Pro-OSu与Gly-Gly-OH摩尔比为1：0.8～1.2；Boc-Pro-Gly-Gly-OSu与Gly-Gly-OH摩尔比为1：0.8～1.2。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明首次液相合成Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH，并将其应用于比伐卢定的固相合成中，使得杂质Bivalirudin±Gly的含量降低到0.1%以下；同时采用片段六肽Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH参与接肽反应，解决了Arg偶联困难的问题，提高了比伐卢定粗肽的纯度，使粗肽纯度超过90%；降低了纯化难度，使最终产品的纯度超过99.5%，进一步降低了生产成本。与现有技术相比，本发明工艺操作简单，合成成本低，利于工业大规模生产。
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明进行详细说明，但不限定本专利；根据本发明改变原料的投料比、或是反应溶剂或及缩合剂等，均在本发明的保护范围内。
说明书和权利要求书中所使用的缩写含义如下：
Fmoc 9-芴甲氧羰基
CTC树脂 2-氯三苯甲基氯树脂
Wang Resins 王树脂
tBu 叔丁基
Pbf 2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基
Trt 三苯甲基
DCM 二氯甲烷
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMAP 4-二甲氨基吡啶
DIPEA N,N-二异丙基乙胺
DIC N,N-二异丙基碳二亚胺
HBTU 苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐
HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
TBTU O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸
HOBT 1-羟基苯并三唑
HOAT 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
TFA 三氟乙酸
HOSu N-羟基琥珀酰亚胺
实施例1：Boc-Pro-Gly-Gly-OH的制备
准确称取双甘肽Gly-Gly-OH 79.8g（0.6mol）和碳酸钠127.2g（1.2mol）溶于1200mL水中，低温下（2-8℃）缓慢加入Boc-Pro-OSu的四氢呋喃溶液（123.6g，0.6mol）/1000ml，搅拌反应，TLC监测反应终点，反应完全后，旋蒸掉THF，冰水浴下加入10%柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，1000ml乙酸乙酯萃取3次,合并有机相，旋蒸浓缩至1000ml，200ml饱和食盐水洗3次，无水硫酸钠干燥，加入石油醚2000ml析晶，得Boc-Pro-Gly-Gly-OH148.4g，收率75.2%。
实施例2：Boc-Pro-Gly-Gly-OH的制备
准确称取双甘肽Gly-Gly-OH 79.8g（0.6mol）和碳酸钠63.6g（0.6mol）溶于1200mL水中，低温下（2-8℃）缓慢加入Boc-Pro-OSu的四氢呋喃溶液（123.6g，0.6mol）/1000ml，搅拌反应，TLC监测反应终点，反应完全后，旋蒸掉THF，冰水浴下加入10%柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，1000ml乙酸乙酯萃取3次,合并有机相，旋蒸浓缩至1000ml，200ml饱和食盐水洗3次，无水硫酸钠干燥，加入石油醚2000ml析晶，得Boc-Pro-Gly-Gly-OH 145.2g，收率73.5%。
实施例3：Boc-Pro-Gly-Gly -Gly-Gly-OH的制备
准确称取双甘肽Gly-Gly-OH 53.2g（0.4mol)和碳酸钠84.8g（0.8mol)溶于800mL水中，低温下（2-8℃）缓慢加入Boc-Pro-Gly-Gly-OSu的四氢呋喃溶液（170.4g，0.4mol）/1000ml，搅拌反应，TLC监测反应终点，反应完全后，旋蒸掉THF，冰水浴下加入10%柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，1000ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，旋蒸浓缩至800ml，120ml饱和食盐水洗3次，无水硫酸钠干燥，加入石油醚1200ml析晶，得Boc-Pro-Gly-Gly-Gly- Gly-OH 128.6g，收率72.6% 。
实施例4：Boc-Pro-Gly-Gly -Gly-Gly-OH的制备
准确称取双甘肽Gly-Gly-OH 53.2g（0.4mol)和碳酸钠42.4g（0.4mol)溶于800mL水中，低温下（2-8℃）缓慢加入Boc-Pro-Gly-Gly-OSu的四氢呋喃溶液（170.4g，0.4mol）/1000ml，搅拌反应，TLC监测反应终点，反应完全后，旋蒸掉THF，冰水浴下加入10%柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，1000ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，旋蒸浓缩至800ml，120ml饱和食盐水洗3次，无水硫酸钠干燥，加入石油醚1200ml析晶，得Boc-Pro-Gly-Gly-Gly- Gly-OH 121.6g，收率68.6%。
实施例5：Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH
准确称取Boc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 88.6g（200mmol)溶于300mlTFA中，搅拌反应30分钟后，将其加入3L冷乙醚中，静置1h后，抽滤得白色固体，冷乙醚洗涤六次后，真空干燥，加入400mL水溶解，缓慢加入碳酸钠调pH至3-4后，再加入碳酸钠21.2g（200mmol)；低温下（2-8℃）缓慢加入Fmoc-Arg(pbf)-OSu的四氢呋喃溶液（152g，200mmol）/1000ml，搅拌反应，TLC监测反应终点，反应完全后，加入稀盐酸调溶液pH值至2～3，析出固体，抽滤得白色固体，水洗3遍，干燥后重结晶得Fmoc-Arg(pbf)-Pro- Gly-Gly-Gly-Gly-OH 160.1g，收率80.2%。
实施例6：Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH
准确称取Boc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 88.6g（200mmol)溶于300mlTFA中，搅拌反应30分钟后，将其加入3L冷乙醚中，静置1h后，抽滤得白色固体，冷乙醚洗涤六次后，真空干燥，加入400mL水溶解，缓慢加入碳酸钠调pH至3-4后，再加入碳酸钠42.4g（400mmol)；低温下（2-8℃）缓慢加入Fmoc-Arg(pbf)-OSu的四氢呋喃溶液（152g, 200mmol）/1000ml，搅拌反应，TLC监测反应终点，反应完全后，加入稀盐酸调溶液pH值至2～3，析出固体，抽滤得白色固体，水洗3遍，干燥后重结晶得Fmoc-Arg(pbf)-Pro- Gly-Gly-Gly-Gly-OH 176.9g，收率89.5%。
实施例7: Fmoc-Leu-Wang Resins的合成
将载体Wang树脂20.0g(sub=1.0mmol/g)置于合成柱中，用120mL DMF 洗涤两次，加入120mL DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，加入Fmoc-Leu-OH/DIC/HOBT的混合DCM溶液[称取8.472g(24mmol) Fmoc-Leu-OH和3.240g(24mmol) HOBT置于亮氨酸活化瓶，加入120mL体积比例为1∶1的DMF和DCM混合溶液搅拌溶解，低温(0℃）下加入3.024g(24mmol) DIC,活化5分钟]，反应10min后加入0.264g(0.24mmol) DMAP；反应2h，抽掉反应液，用120mL DMF洗涤两次，加入封端试剂120mL(24ml乙酸酐和20.4ml吡啶溶解于75.6mL DMF中)反应2h，抽滤掉反应液，分别用DMF、DCM、甲醇洗涤2次，真空干燥后得Fmoc-Leu-Wang Resins 25.7ｇ；取少量树脂，测替代度为0.68mmol/g。
实施例8: Fmoc-Leu-Wang Resins的合成
将载体Wang树脂10.0g(sub=1.0mmol/g)置于合成柱中，用60mL DMF 洗涤两次，加入60mL DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，加入Fmoc-Leu-OH/DIC/HOBT的混合DCM溶液[称取4.236g(12mmol) Fmoc-Leu-OH和1.620g(12mmol) HOBT置于亮氨酸活化瓶，加入60mL体积比例为1∶1的DMF和DCM混合溶液搅拌溶解，低温（0℃）下加入1.512g(12mmol) DIC，活化5分钟],反应10min后加入0.132g 0.12mmol)DMAP；反应1h，抽掉反应液，用60mL DMF洗涤两次，加入封端试剂60mL(12ml乙酸酐和10.2ml吡啶溶解于38mL DMF中)反应2h，抽滤掉反应液，分别用DMF、DCM、甲醇洗涤2次，真空干燥后得Fmoc-Leu-Wang Resins12.2ｇ；取少量树脂，测替代度为0.42mmol/g。
实施例9: Fmoc-Leu-CTC Resins的合成
称取CTC树脂10.0g置于合成柱中，用60mL DMF 洗涤两次,加入60mL DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，加入溶有Fmoc-Leu-OH 3.53g的DCM溶液60ml，搅拌后加入DIPEA9.24ml，鼓N2反应60min，抽掉反应液，加入DCM/CH3OH/DIPEA (体积比17：2：1) 混合溶液60ml封端3次，每次5min；然后用DMF、DCM、甲醇分别洗涤2次，真空干燥得Fmoc-Leu-CTCResins 13.2g。测替代度为0.65mmol/g.
实施例10：比伐卢定肽树脂的制备
准确称取替代度为0.68mmol/g Fmoc-Leu-Wang Resins 14.7g(合成规模10mmol)置于合成柱中，加入100ml DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，100ml DMF洗涤2次，加入20%哌啶/DMF溶液160ml脱保护2次，分别反应5min和10min；然后用100ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH 9.180g(20mmol)、HOBT 2.70g(20mmol)和DIC 3.28ml(20mmol)的DMF溶液100ml，鼓N2搅拌反应2h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用100ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；随后再脱保护。如此反复循环操作，按照比伐卢定肽序，逐一和保护氨基酸偶联；依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-Pro- Gly-Gly-Gly-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Boc-D-Phe-OH。肽树脂制备完后，用100ml DCM和甲醇分别洗涤2次，真空干燥得肽树脂46.0g。
实施例11：比伐卢定肽树脂的制备
准确称取替代度为0.42mmol/g Fmoc-Leu-Wang Resins 11.9g(合成规模5mmol)置于合成柱中，加入50ml DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，50ml DMF洗涤2次，加入20%哌啶/DMF溶液80ml脱保护2次，分别反应5min和10min;然后用50ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH 4.595g(10mmol)、HOBT 1.35g(10mmol)和DIC 1.64ml(10mmol)的DMF溶液50ml，鼓N2搅拌反应2h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用50ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；随后再脱保护。如此反复循环操作，按照比伐卢定肽序，逐一和保护氨基酸偶联；依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-Pro- Gly-Gly-Gly-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Boc-D-Phe-OH。肽树脂制备完后，用50ml DCM和甲醇分别洗涤2次，真空干燥得肽树脂27.55g。
实施例12：比伐卢定肽树脂的制备
准确称取替代度为0.65mmol/g Fmoc-Leu-CTC Resins 7.7g(合成规模5mmol)置于合成柱中，加入50ml DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，50ml DMF洗涤2次，加入20%哌啶/DMF溶液80ml脱保护2次，分别反应5min和10min;然后用50ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH 4.595g、HOBT 1.35g和DIC 1.64m的DMF溶液50ml，鼓N2搅拌反应2h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用50ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；随后再脱保护。如此反复循环操作，按照比伐卢定肽序，逐一和保护氨基酸偶联；依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-Pro- Gly-Gly-Gly-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Boc-D-Phe-OH。肽树脂制备完后，用用50ml DCM和甲醇分别洗涤2次，真空干燥得肽树脂22.6g。
实施例13：比伐卢定粗肽的制备
称取实施例11所得比伐卢定肽树脂40g置于1000ml圆底烧瓶中，冰浴下加入400ml裂解K试剂（三氟醋酸/苯酚/苯甲硫醚/水/乙二硫醇=82.5/5/5/5/2.5，体积比），反应4h后，抽滤，树脂用20ml TFA洗涤3次，合并滤液和洗液，倾倒入5L冷的甲叔醚中，冰柜内静止1h，抽滤得固体，冷的甲叔醚洗涤6次后真空干燥得粗肽23.4g，纯度90.17%，收率113.5%。
实施例14：比伐卢定粗肽的制备
称取实施例13所得比伐卢定肽树脂20g置于500ml圆底烧瓶中，冰浴下加入200ml裂解K试剂（三氟醋酸/苯酚/苯甲硫醚/水/乙二硫醇=82.5/5/5/5/2.5，体积比），反应4h后，抽滤，树脂用10mlTFA洗涤3次，合并滤液和洗液，倾倒入2.5L冷的甲叔醚中，冰柜内静止1h,抽滤得固体，冷的甲叔醚洗涤6次后真空干燥得粗肽10.9g，纯度90.56%，收率118.6%。
实施例15：比伐卢定粗肽的制备
称取实施例12所得比伐卢定肽树脂25g置于500ml圆底烧瓶中，冰浴下加入200ml裂解K试剂（三氟醋酸/苯酚/苯甲硫醚/水/乙二硫醇=82.5/5/5/5/2.5，体积比），反应4h后，抽滤，树脂用10mlTFA洗涤3次，合并滤液和洗液，倾倒入2.5L冷的甲叔醚中，冰柜内静止1h,抽滤得固体，冷的甲叔醚洗涤6次后真空干燥得粗肽10.4g，纯度91.32%，收率110.2%。
实施例16：比伐卢定粗肽的纯化
称取实施例14所得粗肽20g溶于10%乙腈水溶液500ml中，震荡溶解后，0.45um滤膜过滤后备用。
内径为100mm C18制备柱，流动相为0.1%TFA/水- 0.1%TFA/乙腈体系，上样量为10g/次，流速300ml/min，梯度洗脱；峰前和峰后循环进样，得到0.1%TFA/水- 0.1%TFA/乙腈体系中控分析纯度为100%的精肽溶液，脱盐后冻干得精肽13.2g，纯度99.5%以上，杂质Bivalirudin±Gly的含量均低于0.1%。
Claims (7)
1.一种固液结合制备比伐卢定的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)采用Wang树脂或2-chlorotrityl树脂为固相载体，用Fmoc-Leu-OH与之偶联反应制备Fmoc-Leu-Wang树脂或Fmoc-Leu-CTC树脂，脱保护试剂脱掉保护基Fmoc后，再按序列依次偶联连接11个Fmoc保护氨基酸，得侧链保护的比伐卢定[9-20]肽树脂；
比伐卢定[9-20]肽树脂的结构如下：
Fmoc-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-树脂；
(b)在液相条件下由双甘肽和Boc-Pro-OH为原料制备Pro-Gly--Gly-Gly--Gly-OH，然后再用Fmoc-Arg(pbf)-OH与之反应得到片段六肽Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH；
所述Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH的制备方法为：由Boc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH经TFA处理后，冷乙醚中析晶得Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH；
所述Boc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH制备方法如下：
将双甘肽Gly-Gly-OH和碳酸钠溶于水中，加入Boc-Pro-OSu的有机溶剂溶液，搅拌反应，TLC监测反应终点，反应结束后，减压旋蒸掉有机溶剂，加入柠檬酸调溶液pH值至2～3，乙酸乙酯萃取，浓缩萃取液，饱和食盐水洗3遍，加入石油醚析晶得Boc-Pro-Gly-Gly-OH；
将双甘肽Gly-Gly-OH和碳酸钠溶于水中，加入Boc-Pro-Gly-Gly-OSu的有机溶剂溶液，搅拌反应，TLC监测反应终点，反应结束后，加入柠檬酸调溶液pH值至2～3，乙酸乙酯萃取，浓缩萃取液，饱和食盐水洗3遍，加入石油醚析晶得Boc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH；
所述片段六肽Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH制备方法为：
将Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和碳酸钠溶于水中，加入Fmoc-Arg(pbf)-OSu的有机溶剂溶液，搅拌反应，TLC监测反应终点，反应结束后，加入稀盐酸调溶液pH值至2～3，析出固体，抽滤得白色固体，水洗3遍，干燥后重结晶，即得；
(c)比伐卢定[9-20]肽树脂脱Fmoc后和片段六肽Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH在固相条件下缩合反应生成18肽片段肽保护树脂，再按序列依次连接上Fmoc-Pro-OH和Boc-D-Phe-OH或Fmoc-D-Phe-OH，完成比伐卢定肽树脂的制备，经裂解、纯化、冷冻干燥得比伐卢定精肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(a)中，所述制备的Fmoc-Leu-Wang树脂或Fmoc-Leu-CTC树脂替代度为0.3-1.5mmol/g；
所述脱保护试剂为体积比20％哌啶的DMF溶液；偶联反应中所用的缩合剂为以下组合DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA的一种。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(a)中，所述制备的Fmoc-Leu-Wang树脂或Fmoc-Leu-CTC树脂替代度为0.4-0.8mmol/g。
4.根据权利要求1所述的固液结合制备比伐卢定的方法，其特征在于步骤(c)中具体操作步骤为：
(1)将所述比伐卢定[9-20]肽树脂用脱保护试剂脱除Fmoc后，再加入Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH的活化溶液发生偶联反应，制得侧链全保护的比伐卢定[3-20]肽树脂：
Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-树脂；
(2)将上述比伐卢定[3-20]肽树脂用脱保护试剂脱除Fmoc后，再依次与Fmoc-Pro-OH和Boc-D-Phe-OH发生偶联反应，制得比伐卢定肽树脂；
(3)所得比伐卢定肽树脂经裂解试剂处理后，滤得裂解液，经沉降、分离得比伐卢定粗肽；所得粗肽经制备液相纯化后得的精肽溶液，浓缩冻干后得比伐卢定精肽。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述脱保护试剂为体积比20％哌啶的DMF溶液；偶联反应中所用的缩合剂为以下组合DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA的一种；所述裂解试剂为加入体积比1-5％清除剂的TFA溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(b)中Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和碳酸钠的摩尔比为1：1～2；Fmoc-Arg(pbf)-OSu与Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH摩尔比为1：0.8～1.2；所述有机溶剂为四氢呋喃、二氧六环、丙酮中一种或一种以上的混合液。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤b)中的有机溶剂为四氢呋喃、二氧六环、丙酮中一种或一种以上的混合液；双甘肽Gly-Gly-OH和碳酸钠的摩尔比为1：1～2；Boc-Pro-OSu与Gly-Gly-OH摩尔比为1：0.8～1.2；Boc-Pro-Gly-Gly-OSu与Gly-Gly-OH摩尔比为1：0.8～1.2。
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