CN106749614A - 一种片段法固液结合制备替度鲁肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于多肽合成领域,涉及一种固液结合制备替度鲁肽的方法,本发明采用液相方式合成部分短肽片段,再以所合成的短肽片段进行投料,减少了14步固相偶联反应,大幅提高了偶联效率,避免了多个位点缺失肽的生成,从原料角度上杜绝了特殊工艺杂质的生成,最终目标肽纯度达到70%以上,精肽总体收率达到45.08%。与现有技术相比,本发明合成路线简单,固相偶联步数少,解决了肽序过长偶联困难,容易产生缺失肽的难题,同时兼顾了避免重点杂质生成,且液相合成片段技术成熟,物料成本低,能够进行工业大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成领域,特别涉及一种以片段法固液结合制备替度鲁肽的方法。
背景技术
替度鲁肽,英文名称为Teduglutide,由33个天然氨基酸组成,可减少胃排空和分泌,并调节小肠内膜细胞的生长、增殖和修复,是一种天然生成的激素,在临床上用于治疗成人短肠综合征,其肽序为:H-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH。
目前,替度鲁肽的制备方法有以下报道;专利CN104072603A先合成替度鲁肽2-33位氨基酸片段,而后采用特殊保护基保护的His进行1位偶联,该方法减少了1位His的消旋杂质生成,但与逐个氨基酸偶联的方法无异,固相合成步数多,溶剂用量大,三废严重;专利CN104418949A公开的替度鲁肽合成方法是将肽序分为两段,先合成1-3位和4-33位氨基酸片段,而后再偶联而成,该方法降低了合成过程中3-Asu杂质的生成,但并未解决长肽链合成后期偶联困难,粗肽纯度不高,工艺杂质繁多的问题;专利CN104072605A采取了片段法进行替度鲁肽合成,先将肽链分为三个片段,再将三个片段偶联得替度鲁肽,粗肽纯度有较大的改善,但片段法成本太大,且片段纯化费时费力,工业规模生产时成本不可控,且该专利在进行片段法合成时,并未针对性的控制特殊杂质,例如1-His消旋,3-Asu杂质。
替度鲁肽是由33个氨基酸组成的多肽,从固相合成的角度而言,肽链较长,随着肽链的延伸偶联反应会较为困难,容易产生较多工艺杂质而不利于后期纯化。目前存在的替度鲁肽固相合成方法主要分为两类,其一为针对性控制重点杂质,但忽视了长肽链偶联困难,粗肽纯度不高,工艺杂质繁多,溶剂用量巨大的问题;其二为着重解决长链偶联困难而采用片段法合成,但并未对重点杂质进行针对性控制,导致后期纯化困难,总体收率不高。
发明内容
为解决替度鲁肽合成中存在的以上缺陷,本发明提供了一种片段法固液结合制备替度鲁肽的新方法。具体技术方案如下:
一种片段法固液结合制备替度鲁肽的方法,包括如下步骤:
(a)液相条件下合成所需短肽片段:Fmoc-His(Trt)-Gly-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH,Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH,Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH,Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH,Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH,Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH;
(b)以Wang Resin或CTC树脂为固相载体,在偶联剂存在下,依次与Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH,Fmoc-His(Trt)-Gly-OH,
得侧链保护的替度鲁肽肽树脂,其结构如下:
Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(OtBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Resin;
(c)替度鲁肽肽树脂经过裂解,纯化,冻干得到替度鲁肽精肽。
其中步骤(a)中,
Fmoc-His(Trt)-Gly-OH的制备方法为:首先将Fmoc-His(Trt)-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-His(Trt)-OSu,然后将生成的Fmoc-His(Trt)-OSu和H-Gly-OH在碱A条件下生成Fmoc-His(Trt)-Gly-OH;
Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH的制备方法为:首先将Fmoc-Asp(OtBu)-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-OSu,然后将生成的Fmoc-Asp(OtBu)-OSu和H-Gly-OH在碱A条件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH;
Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH的制备方法为:首先将Fmoc-Ser(tBu)-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Ser(tBu)-OSu,然后将生成的Fmoc-Ser(tBu)-OSu和H-Phe-OH在碱A条件下生成Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH;
Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH的制备方法为:首先将Fmoc-Glu(OtBu)-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Glu(OtBu)-OSu,然后将生成的Fmoc-Glu(OtBu)-OSu和H-Met-OH在碱A条件下生成Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH;
Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH的制备方法为:首先将Fmoc-Thr(tBu)-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Thr(tBu)-OSu,然后将生成的Fmoc-Thr(tBu)-OSu和H-Ile-OH在碱A条件下生成Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH,Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu,最后将生成的Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu和H-Leu-OH在碱A条件下生成Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH;
Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH的制备方法为:首先将Fmoc-Asn(Trt)-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Asn(Trt)-OSu,然后将生成的Fmoc-Asn(Trt)-OSu和H-Leu-OH在碱A条件下生成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH,Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu,将生成的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu和H-Ala-OH在碱A条件下生成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH,Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu,将生成的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu和H-Ala-OH在碱A条件下生成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH;
Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH的制备方法为:首先将Fmoc-Asp(OtBu)-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-OSu,然后将生成的Fmoc-Asp(OtBu)-OSu和H-Phe-OH在碱A条件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OSu,然后将生成的Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OSu和H-Ile-OH在碱A条件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH;
Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH的制备方法为:首先将Fmoc-Trp(Boc)-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Trp(Boc)-OSu,然后将生成的Fmoc-Trp(Boc)-OSu和H-Leu-OH在碱A条件下生成Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH,Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu,最后将生成的Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu和H-Ile-OH在碱A条件下生成Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH;
Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH的制备方法为:首先将Fmoc-Lys(Boc)-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Lys(Boc)-OSu,然后将生成的Fmoc-Lys(Boc)-OSu和H-Ile-OH在碱A条件下生成Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH。
优选的,步骤(a)中二肽片段Fmoc-His(Trt)-Gly-OH的具体制备方法为:
步骤1)首先制备Fmoc-His(Trt)-OSu:将Fmoc-His(Trt)-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的物质量比例溶于有机溶剂B中,冰水浴下将1.0-1.2倍物质量的DCC/有机溶剂B(以Fmoc-His(Trt)-OH的量计)溶液滴加到Fmoc-His(Trt)-OH/HOSu溶液中,1h内滴加完毕,撤冰浴,25℃继续搅拌反应2h;反应完成后抽滤,滤液浓缩,减压蒸去80%的有机溶剂,剩余油状物加入石油醚,直至上层溶液不再变白为止,析出白色固体,抽滤,干燥,得Fmoc-His(Trt)-OSu。
步骤2)制备二肽片段Fmoc-His(Trt)-Gly-OH:将H-Gly-OH和碱A按照摩尔比1:1~2的比例溶解在水中,加入5~20%体积的有机溶剂B助溶,完全溶解后,冰浴搅拌下将步骤1)中制备Fmoc-His(Trt)-OSu的有机溶剂B溶液滴加到H-Gly-OH的溶液中,其中H-Gly-OH的摩尔量为Fmoc-His(Trt)-OSu的1.2~1.5倍;TLC监测反应终点,待反应结束后减压蒸馏除去有机溶剂B,再以10%的柠檬酸/水将反应液pH值调至2~3,乙酸乙酯萃取,析晶得Fmoc-His(Trt)-Gly-OH。
其中以上步骤中碱A为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾中的一种;有机溶剂B为四氢呋喃、二氧六环、丙酮、乙腈中的一种或几种。
优选的,步骤(a)中三肽片段Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH制备方法为:
步骤1)首先制备Fmoc-Thr(tBu)-OSu:将Fmoc-Thr(tBu)-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的物质量比例溶于有机溶剂B中,冰水浴下将1.0-1.2倍物质量的DCC/有机溶剂B(以Fmoc-Thr(tBu)-OH的量计)溶液滴加到Fmoc-Thr(tBu)-OH/HOSu溶液中,1h内滴加完毕,撤冰浴,25℃继续搅拌反应2h;反应完成后抽滤,滤液浓缩,减压蒸去80%的有机溶剂,剩余油状物加入石油醚,直至上层溶液不再变白为止,析出白色固体,抽滤,干燥,得Fmoc-Thr(tBu)-OSu;
步骤2)然后制备Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH:将H-Ile-OH和碱A按照摩尔比1:1~2的比例溶解在水中,加入5~20%体积的有机溶剂B助溶,完全溶解后,冰浴搅拌下将步骤1)中制备的Fmoc-Thr(tBu)-OSu有机溶剂B溶液滴加入至H-Ile-OH溶液中,其中,H-Ile-OH的摩尔量为Fmoc-Thr(tBu)-OSu摩尔量的1.2~1.5倍,TLC监测反应终点,待反应结束,减压蒸发去掉有机溶剂B后,再以10%的柠檬酸/水将反应液pH值调至2~3,乙酸乙酯萃取,析晶得Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH;
步骤3)Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu的制备方法为:将步骤2)中的Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的物质量比例溶于有机溶剂B中,冰水浴下将1.0-1.2倍物质量的DCC/有机溶剂B(以Fmoc-Thr(tBu)-OH的量计)溶液滴加到Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH/HOSu溶液中,1h内滴加完毕,撤冰浴,25℃继续搅拌反应2h;反应完成后抽滤,滤液浓缩,减压蒸去60%的有机溶剂,剩余油状物加入石油醚,直至上层溶液不再变白为止,析出白色固体,抽滤,干燥,得Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu;
步骤4)三肽片段Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH制备方法为:
将H-Leu-OH和碱A按照摩尔比1:1~2的比例溶解在水中,加入5~20%体积的有机溶剂B助溶;完全溶解后,冰浴搅拌下将步骤3)中制备的Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu的有机溶剂B溶液滴加入H-Leu-OH溶液中,其中,H-Leu-OH的摩尔量为Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu摩尔量的1.2~1.5;TLC监测反应终点,待反应结束减压蒸馏除去有机溶剂B后,再以10%的柠檬酸/水将反应液pH值调至2~3,乙酸乙酯萃取,析晶得Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH。
其中以上步骤中碱A为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾中的一种。有机溶剂B为四氢呋喃、二氧六环、丙酮、乙腈中的一种或几种。
优选的,步骤(a)中四肽片段Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH制备方法为,
步骤1)制备Fmoc-Asn(Trt)-OSu:将Fmoc-Asn(Trt)-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的物质量比例溶于有机溶剂B中,冰水浴下将1.0-1.2倍物质量的DCC/有机溶剂B(以Fmoc-Asn(Trt)-OH的量计)溶液滴加到Fmoc-Asn(Trt)-OH/HOSu溶液中,1h内滴加完毕,撤冰浴,25℃继续搅拌反应2h;反应完成后抽滤,滤液浓缩,减压蒸去80%的有机溶剂,剩余油状物加入石油醚,直至上层溶液不再变白为止,析出白色固体,抽滤,干燥,得Fmoc-Asn(Trt)-OSu;
步骤2)制备Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH:将H-Leu-OH和碱A按照摩尔比1:1~2的比例溶解在水中,加入5~20%体积的有机溶剂B助溶。完全溶解后,冰浴搅拌下将步骤1)中的Fmoc-Asn(Trt)-OSu的有机溶剂B溶液滴加入至H-Leu-OH溶液中,其中,H-Leu-OH的摩尔量为Fmoc-Asn(Trt)-OSu摩尔量的1.2~1.5倍;TLC监测反应终点,待反应结束,减压蒸发去掉有机溶剂B后,再以10%的柠檬酸/水将反应液pH值调至2~3,乙酸乙酯萃取,析晶得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH;
步骤3)制备Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu:将步骤2)中的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的物质量比例溶于有机溶剂B中,冰水浴下将1.0-1.2倍物质量的DCC/有机溶剂B(以Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH的量计)溶液滴加到Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH/HOSu溶液中,1h内滴加完毕,撤冰浴,25℃继续搅拌反应2h;反应完成后抽滤,滤液浓缩,减压蒸去80%的有机溶剂,剩余油状物加入石油醚,直至上层溶液不再变白为止,析出白色固体,抽滤,干燥,得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu;
步骤4)制备Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH:将H-Ala-OH和碱A按照摩尔比1:1~2的比例溶解在水中,加入5~20%体积的有机溶剂B助溶。完全溶解后,冰浴搅拌下将步骤3)中的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu的有机溶剂B溶液滴加入至H-Ala-OH溶液中,其中,H-Ala-OH的摩尔量为Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu摩尔量的1.2~1.5倍;TLC监测反应终点,待反应结束,减压蒸发去掉有机溶剂B后,再以10%的柠檬酸/水将反应液pH值调至2~3,乙酸乙酯萃取,析晶得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH;
步骤5)制备Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu:将步骤4)中的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的物质量比例溶于有机溶剂B中,冰水浴下将1.0-1.2倍物质量的DCC/有机溶剂B(以Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH的量计)溶液滴加到Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH/HOSu溶液中,1h内滴加完毕,撤冰浴,25℃继续搅拌反应2h。反应完成后抽滤,滤液浓缩,减压蒸去60%的有机溶剂,剩余油状物加入石油醚,直至上层溶液不再变白为止,析出白色固体,抽滤,干燥,得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu;
步骤6)四肽片段Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH的制备:将H-Ala-OH和碱A按照摩尔比1:1~2的比例溶解在水中,加入5~20%体积的有机溶剂B助溶;完全溶解后,冰浴搅拌下将步骤5)中的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu的有机溶剂B溶液滴加入H-Ala-OH溶液中,其中,H-Ala-OH的摩尔量为Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu摩尔量的1.2~1.5倍。TLC监测反应终点,待反应结束减压蒸馏除去有机溶剂B后,再以10%的柠檬酸/水将反应液pH值调至2~3,乙酸乙酯萃取,析晶得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH。
其中以上步骤中碱A为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾中的一种。有机溶剂B为四氢呋喃、二氧六环、丙酮、乙腈中的一种或几种。
其中步骤(b)中,以Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH投料偶联30~31位,以Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH投料偶联25~27,以Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH投料偶联21~23位,以Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH投料偶联16~19位,以Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH投料偶联12~14位,以Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH投料偶联9~10位,以Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH投料偶联5~6位,以Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH投料偶联3~4位,以Fmoc-His(Trt)-Gly-OH投料偶联1~2位。
步骤(b)中,Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH,Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH,Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH,Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH,Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH,Fmoc-His(Trt)-Gly-OH的摩尔投料比为树脂的3~5倍,其余单个氨基酸的摩尔投料比为树脂的2~3倍。
步骤(b)中的Wang Resin或CTC Resin初始替代度为0.3~0.5mmol/g,改造后树脂替代度为0.25~0.45mmol/g,改造后树脂优选替代度为0.30~0.35mmol/g;步骤(b)中偶联剂为HOBt/DIC,HOAt/DIC,HOBt/HBTU/DIEA,HOAt/HATU/DIEA,PyBOP/DIEA,TBTU/DIEA中的一种或几种;步骤(c)中的裂解试剂为加入体积比1-5%清除剂的TFA溶液,所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、苯酚、水中的一种或几种。
相对于现有技术,本发明的有益效果是:
1、本申请将替度鲁肽中所有不带功能侧链的氨基酸Ile,Leu,Ala,Phe,Met,Gly做成二肽,三肽,及四肽片段,将固相合成步数由33步降低为19步,使31位,27位,26位,23位,22位,19位,18位,17位,14位,13位,10位,6位,4位,2位这些位点的固相偶联效率达到了百分之百,提高了目标肽纯度,粗肽纯度达到70%以上,同时避免了这些位点缺失肽的形成,降低了工艺杂质的个数,提升了后期纯化的效率,最终收率达到45.08%。
2、1位2位以Fmoc-His(OH)-Gly-OH的方式进行投料,从原料角度上杜绝了1位His的消旋杂质的产生;3位4位以Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH的方式投料,同样从原料角度上避免了引入3-Asu杂质。
3、固相偶联步数由33步缩短至19步,大大降低固相合成中溶剂的用量,降低了物料成本,减少了三废排放。
4、选取Ile,Leu,Ala,Phe,Met,Gly这些不含侧链功能基团的氨基酸进行短肽片段的合成,结合成熟的HOSu/DCC偶联方法,可大大降低片段液相合成的成本,能够应用于工业大规模生产。
说明书和权利要求书中所使用的缩写含义如下:
Fmoc 9-芴甲氧羰基
CTC树脂 2-氯三苯甲基氯树脂
Wang Resin 王树脂
tBu 叔丁基
Trt 三苯甲基
DCM 二氯甲烷
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMAP 4-二甲氨基吡啶
DIEA N,N-二异丙基乙胺
DIC N,N-二异丙基碳二亚胺
HBTU 苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐
HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
TBTU O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸
HOBT 1-羟基苯并三唑
HOAT 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
TFA 三氟乙酸
HOSu N-羟基琥珀酰亚胺
EA 乙酸乙酯
THF 四氢呋喃
PE 石油醚
DCC 二环己基碳二亚胺
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明进行详细说明,但不限定本专利;根据本发明改变原料的投料比,或是反应溶剂或及缩合剂等,均在本发明的保护范围内。
实施例1:Fmoc-His(Trt)-OSu的制备
准确称取Fmoc-His(Trt)-OH 1239.4g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml四氢呋喃中,冰水浴搅拌。准确称取DCC 412.8g(2mol),溶于2400ml四氢呋喃中,缓慢滴加到上述溶液中,冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤,滤液旋蒸浓缩至2000~2500ml。浓缩完成后抽滤,滤液加入8000ml石油醚,析出大量白色固体,溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤,滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固体,抽滤,滤饼干燥,称重,得Fmoc-His(Trt)-OSu 1340.4g,收率93.5%。
实施例2:Fmoc-His(Trt)-Gly-OH的制备
准确称取H-Gly-OH 202.7g(2.7mol)和碳酸钠343.4g(3.24mol)溶于4000mL水中,冰浴下(2~8℃)缓慢加入实施例1中制备的Fmoc-His(Trt)-OSu(1290.2g,1.8mol)的四氢呋喃溶液3000ml,搅拌反应,TLC监测反应终点。反应完全后,减压旋蒸除去四氢呋喃,剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10%的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有机相,以3000ml饱和食盐水分三次洗涤,无水硫酸钠干燥,旋蒸抽去乙酸乙酯,剩余油状物加入2000ml甲醇,溶液澄清透明,置于-20℃冰箱中静置过夜,析出大量白色固体,抽滤,干燥得Fmoc-His(Trt)-Gly-OH 916.1g,收率75.2%。
实施例3:Fmoc-Asp(OtBu)-OSu的制备
准确称取Fmoc-Asp(OtBu)-OH 822.3g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml乙睛中,冰水浴搅拌。准确称取DCC 412.8g(2mol),溶于2400ml乙睛中,缓慢滴加到上述溶液中,冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤,滤液旋蒸浓缩至2000~2500ml。浓缩完成后抽滤,滤液加入8000ml石油醚,析出大量白色固体,溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤,滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固体,抽滤,滤饼干燥,称重,得Fmoc-Asp(OtBu)-OSu937.8g,收率92.3%。
实施例4:Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH的制备
准确称取H-Gly-OH 202.7g(2.7mol)和碳酸钾447.7g(3.24mol)溶于4000mL水中,冰浴下(2~8℃)缓慢加入实施例3中制备的Fmoc-Asp(OtBu)-OSu(914.42g,1.8mol)的乙睛溶液3000ml,搅拌反应,TLC监测反应终点。反应完全后,减压旋蒸除去乙睛,剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10%的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有机相,以3000ml饱和食盐水分三次洗涤,无水硫酸钠干燥,旋蒸抽去乙酸乙酯,剩余油状物加入2000ml甲醇,溶液澄清透明,置于-20℃冰箱中静置过夜,析出大量白色固体,抽滤,干燥得Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH 686.6g,收率81.5%。
实施例5:Fmoc-Ser(tBu)-OSu的制备
准确称取Fmoc-Ser(tBu)-OH 766.9g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml二氧六环中,冰水浴搅拌。准确称取DCC 412.8g(2mol),溶于2400ml二氧六环中,缓慢滴加到上述溶液中,冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤,滤液旋蒸浓缩至2000~2500ml。浓缩完成后抽滤,滤液加入8000ml石油醚,析出大量白色固体,溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤,滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固体,抽滤,滤饼干燥,称重,得Fmoc-Ser(tBu)-OSu884.2g,收率92.1%。
实施例6:Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH的制备
准确称取H-Phe-OH 483.3g(2.7mol)和碳酸氢钠272.16g(3.24mol)溶于4000mL水中,冰浴下(2~8℃)缓慢加入实施例5中制备的Fmoc-Ser(tBu)-OSu(864.9g,1.8mol)的二氧六环溶液3000ml,搅拌反应,TLC监测反应终点。反应完全后,减压旋蒸除去二氧六环,剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10%的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有机相,以3000ml饱和食盐水分三次洗涤,无水硫酸钠干燥,旋蒸浓缩至3000ml,加入石油醚4000ml析晶,得Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH 838.2g,收率85.6%。
实施例7:Fmoc-Glu(OtBu)-OSu的制备
准确称取Fmoc-Glu(OtBu)-OH 850.9g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml二氧六环中,冰水浴搅拌。准确称取DCC 412.8g(2mol),溶于2400ml二氧六环中,缓慢滴加到上述溶液中,冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤,滤液旋蒸浓缩至2000~2500ml。浓缩完成后抽滤,滤液加入8000ml石油醚,析出大量白色固体,溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤,滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固体,抽滤,滤饼干燥,称重,得Fmoc-Glu(OtBu)-OSu 941.7g,收率90.2%。
实施例8:Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH的制备
准确称取H-Met-OH 402.3g(2.7mol)和碳酸氢钾324.5g(3.24mol)溶于4000mL水中,冰浴下(2~8℃)缓慢加入实施例7中制备的Fmoc-Glu(OtBu)-OSu(940.6g,1.8mol)的二氧六环溶液3000ml,搅拌反应,TLC监测反应终点。反应完全后,减压旋蒸除去二氧六环,剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10%的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有机相,以3000ml饱和食盐水分三次洗涤,无水硫酸钠干燥,旋蒸浓缩至4000ml,加入石油醚4000ml析晶,得Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH 832.6g,收率83.2%。
实施例9:Fmoc-Thr(tBu)-OSu的制备
准确称取Fmoc-Thr(tBu)-OH 794.6g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml丙酮中,冰水浴搅拌。准确称取DCC 412.8g(2mol),溶于2400ml丙酮中,缓慢滴加到上述溶液中,冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤,滤液旋蒸浓缩至2000~2500ml。浓缩完成后抽滤,滤液加入8000ml石油醚,析出大量白色固体,溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤,滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固体,抽滤,滤饼干燥,称重,得Fmoc-Thr(tBu)-OSu910.9g,收率92.2%。
实施例10:Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH的制备
准确称取H-Ile-OH 354.2g(2.7mol)和碳酸钠343.4g(3.24mol)溶于4000mL水中,冰浴下(2~8℃)缓慢加入实施例9中制备的Fmoc-Thr(tBu)-OSu(1248.7g,1.8mol)的丙酮溶液3000ml,搅拌反应,TLC监测反应终点。反应完全后,减压旋蒸除去丙酮,剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10%的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有机相,以3000ml饱和食盐水分三次洗涤,无水硫酸钠干燥,旋蒸除去乙酸乙酯,剩余油状物加入2000ml甲醇复溶,溶液澄清透明,置于-20℃冰箱中析晶,得Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH 773.8g,收率84.3%。
实施例11:Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu的制备
准确称取实施例10中制备的Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH 765.2g(1.5mol)和HOSu172.5g(1.5mol)溶于4000ml丙酮中,冰水浴搅拌。准确称取DCC 309.6g(1.5mol),溶于2400ml丙酮中,缓慢滴加到上述溶液中,冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤,滤液旋蒸浓缩至3000~3500ml。浓缩完成后抽滤,滤液加入8000ml石油醚,析出大量白色固体,溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤,滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固体,抽滤,滤饼干燥,称重,得Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu 812.2g,收率89.2%。
实施例12:Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH的制备
准确称取H-Leu-OH 235.8g(1.8mol)和碳酸钠228.9g(2.16mol)溶于2000mL水中,冰浴下(2~8℃)缓慢加入实施例11中制备的Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu(728.4g,1.2mol)的丙酮溶液3000ml,搅拌反应,TLC监测反应终点。反应完全后,减压旋蒸除去丙酮,剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10%的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有机相,以3000ml饱和食盐水分三次洗涤,无水硫酸钠干燥,旋蒸除去乙酸乙酯,加入3500ml甲醇,加热至40℃溶液澄清透明,置于-20℃析晶,得Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH607.1g,收率81.2%。
实施例13:Fmoc-Asn(Trt)-OSu的制备
准确称取Fmoc-Asn(Trt)-OH 1193.4g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml四氢呋喃中,冰水浴搅拌。准确称取DCC 412.8g(2mol),溶于2400ml四氢呋喃中,缓慢滴加到上述溶液中,冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤,滤液旋蒸浓缩至2000~2500ml。浓缩完成后抽滤,滤液加入8000ml石油醚,析出大量白色固体,溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤,滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固体,抽滤,滤饼干燥,称重,得Fmoc-Asn(Trt)-OSu 1279.3g,收率92.2%。
实施例14:Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH的制备
准确称取H-Leu-OH354.2g(2.7mol)和碳酸钠343.4g(3.24mol)溶于4000mL水中,冰浴下(2~8℃)缓慢加入实施例13中制备的Fmoc-Asn(Trt)-OSu(1248.7g,1.8mol)的四氢呋喃溶液3000ml,搅拌反应,TLC监测反应终点。反应完全后,减压旋蒸除去四氢呋喃,剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10%的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有机相,以3000ml饱和食盐水分三次洗涤,无水硫酸钠干燥,旋蒸除去乙酸乙酯,剩余油状物加入2000ml甲醇复溶,溶液澄清透明,置于-20℃冰箱中析晶,得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH 1100.2g,收率86.1%。
实施例15:Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu的制备
准确称取实施例14中制备的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH 1063.9g(1.5mol)和HOSu172.5g(1.5mol)溶于4000ml四氢呋喃中,冰水浴搅拌。准确称取DCC 309.6g(1.5mol),溶于2400ml四氢呋喃中,缓慢滴加到上述溶液中,冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤,滤液旋蒸浓缩至3000~3500ml。浓缩完成后抽滤,滤液加入8000ml石油醚,析出大量白色固体,溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤,滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固体,抽滤,滤饼干燥,称重,得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu 1079.6g,收率89.2%。
实施例16:Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH的制备
准确称取H-Ala-OH 160.2g(1.8mol)和碳酸钠228.9g(2.16mol)溶于2000mL水中,冰浴下(2~8℃)缓慢加入实施例15中制备的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu(968.28g,1.2mol)的四氢呋喃溶液3000ml,搅拌反应,TLC监测反应终点。反应完全后,减压旋蒸除去四氢呋喃,剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10%的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有机相,以3000ml饱和食盐水分三次洗涤,无水硫酸钠干燥,旋蒸除去乙酸乙酯,加入3500ml甲醇,加热至40℃溶液澄清透明,置于-20℃析晶,得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH 760.1g,收率81.1%。
实施例17:Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu的制备
准确称取实施例16中制备的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH 702.9g(0.9mol)和HOSu103.5g(0.9mol)溶于4000ml四氢呋喃中,冰水浴搅拌。准确称取DCC 185.7g(1.5mol),溶于2400ml四氢呋喃中,缓慢滴加到上述溶液中,冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤,滤液旋蒸浓缩至3000~3500ml。浓缩完成后抽滤,滤液加入8000ml石油醚,析出大量白色固体,溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤,滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固体,抽滤,滤饼干燥,称重,得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu 704.9g,收率89.2%。
实施例18:Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH的制备
准确称取H-Ala-OH 93.5g(1.05mol)和碳酸钠133.5g(1.26mol)溶于2000mL水中,冰浴下(2~8℃)缓慢加入实施例17中制备的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu(614.6g,0.7mol)的四氢呋喃溶液3000ml,搅拌反应,TLC监测反应终点。反应完全后,减压旋蒸除去四氢呋喃,剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10%的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有机相,以3000ml饱和食盐水分三次洗涤,无水硫酸钠干燥,旋蒸除去乙酸乙酯,加入3500ml甲醇,加热至40℃溶液澄清透明,置于-20℃析晶,得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH 510.5g,收率85.6%。
实施例19:Fmoc-Asp(OtBu)-OSu的制备
准确称取Fmoc-Asp(OtBu)-OH 822.3g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml四氢呋喃中,冰水浴搅拌。准确称取DCC 412.8g(2mol),溶于2400ml四氢呋喃中,缓慢滴加到上述溶液中,冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤,滤液旋蒸浓缩至2000~2500ml。浓缩完成后抽滤,滤液加入8000ml石油醚,析出大量白色固体,溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤,滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固体,抽滤,滤饼干燥,称重,得Fmoc-Asp(OtBu)-OSu 926.6g,收率91.2%。
实施例20:Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OH的制备
准确称取H-Phe-OH 483.3g(2.7mol)和碳酸钠343.4g(3.24mol)溶于4000mL水中,冰浴下(2~8℃)缓慢加入实施例19中制备的Fmoc-Asp(OtBu)-OSu(914.4g,1.8mol)的四氢呋喃溶液3000ml,搅拌反应,TLC监测反应终点。反应完全后,减压旋蒸除去四氢呋喃,剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10%的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有机相,以3000ml饱和食盐水分三次洗涤,无水硫酸钠干燥,旋蒸除去乙酸乙酯,剩余油状物加入2000ml甲醇复溶,溶液澄清透明,置于-20℃冰箱中析晶,得Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OH 877.2g,收率85.2%。
实施例21:Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OSu的制备
准确称取实施例20中制备的Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OH 858.3g(1.5mol)和HOSu172.5g(1.5mol)溶于4000ml四氢呋喃中,冰水浴搅拌。准确称取DCC 309.6g(1.5mol),溶于2400ml四氢呋喃中,缓慢滴加到上述溶液中,冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤,滤液旋蒸浓缩至3000~3500ml。浓缩完成后抽滤,滤液加入8000ml石油醚,析出大量白色固体,溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤,滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固体,抽滤,滤饼干燥,称重,得Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OSu 915.2g,收率91.2%。
实施例22:Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH的制备
准确称取H-Ile-OH 235.8g(1.8mol)和碳酸钠228.9g(2.16mol)溶于2000mL水中,冰浴下(2~8℃)缓慢加入实施例21中制备的Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OSu(802.8g,1.2mol)的四氢呋喃溶液3000ml,搅拌反应,TLC监测反应终点。反应完全后,减压旋蒸除去四氢呋喃,剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10%的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有机相,以3000ml饱和食盐水分三次洗涤,无水硫酸钠干燥,旋蒸除去乙酸乙酯,加入3500ml甲醇,加热至40℃溶液澄清透明,置于-20℃析晶,得Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH 676.6g,收率82.3%。
实施例23:Fmoc-Trp(Boc)-OSu的制备
准确称取Fmoc-Trp(Boc)-OH 1053.2g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml四氢呋喃中,冰水浴搅拌。准确称取DCC 412.8g(2mol),溶于2400ml四氢呋喃中,缓慢滴加到上述溶液中,冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤,滤液旋蒸浓缩至2000~2500ml。浓缩完成后抽滤,滤液加入8000ml石油醚,析出大量白色固体,溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤,滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固体,抽滤,滤饼干燥,称重,得Fmoc-Trp(Boc)-OSu 1135.3g,收率91.6%。
实施例24:Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH的制备
准确称取H-Leu-OH 354.2g(2.7mol)和碳酸钠343.4g(3.24mol)溶于4000mL水中,冰浴下(2~8℃)缓慢加入实施例23中制备的Fmoc-Trp(Boc)-OSu(1115.5g,1.8mol)的四氢呋喃溶液3000ml,搅拌反应,TLC监测反应终点。反应完全后,减压旋蒸除去四氢呋喃,剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10%的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有机相,以3000ml饱和食盐水分三次洗涤,无水硫酸钠干燥,旋蒸浓缩除去乙酸乙酯,加入2500ml甲醇复溶,溶液澄清,置于-20℃析晶,得Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH905.1g,收率78.6%。
实施例25:Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu的制备
准确称取实施例24中制备的Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH 896.4g(1.5mol)和HOSu172.5g(1.5mol)溶于4000ml四氢呋喃中,冰水浴搅拌。准确称取DCC 309.6g(1.5mol),溶于2400ml四氢呋喃中,缓慢滴加到上述溶液中,冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤,滤液旋蒸浓缩至2000~2500ml。浓缩完成后抽滤,滤液加入8000ml石油醚,析出大量白色固体,溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤,滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固体,抽滤,滤饼干燥,称重,得Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu 1096.3g,收率90.2%。
实施例26:Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH的制备
准确称取H-Ile-OH 235.8g(1.8mol)和碳酸钠228.9g(2.16mol)溶于2000mL水中,冰浴下(2~8℃)缓慢加入实施例25中制备的Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu(932.5g,1.2mol)的四氢呋喃溶液3000ml,搅拌反应,TLC监测反应终点。反应完全后,减压旋蒸除去四氢呋喃,剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10%的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有机相,以3000ml饱和食盐水分三次洗涤,无水硫酸钠干燥,旋蒸除去乙酸乙酯,加入3500ml甲醇,加热至40℃溶液澄清透明,置于-20℃析晶,得Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH 725.5g,收率81.6%。
实施例27:Fmoc-Lys(Boc)-OSu的制备
准确称取Fmoc-Lys(Boc)-OH 937.2g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml四氢呋喃中,冰水浴搅拌。准确称取DCC 412.8g(2mol),溶于2400ml四氢呋喃中,缓慢滴加到上述溶液中,冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤,滤液旋蒸浓缩至2000~2500ml。浓缩完成后抽滤,滤液加入8000ml石油醚,析出大量白色固体,溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤,滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固体,抽滤,滤饼干燥,称重,得Fmoc-Lys(Boc)-OSu 1036.8g,收率92.3%。
实施例28:Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH的制备
准确称取H-Ile-OH 355.6g(2.7mol)和碳酸钠343.4g(3.24mol)溶于4000mL水中,冰浴下(2~8℃)缓慢加入实施例28中制备的Fmoc-Lys(Boc)-OSu(1010.3g,1.8mol)的四氢呋喃溶液3000ml,搅拌反应,TLC监测反应终点。反应完全后,减压旋蒸除去四氢呋喃,剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10%的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有机相,以3000ml饱和食盐水分三次洗涤,无水硫酸钠干燥,旋蒸抽去乙酸乙酯,新加入2000ml四氢呋喃复溶,加入4000ml石油醚析晶,得Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH871.2g,收率83.2%。
实施例29:Fmoc-Asp(OtBu)-Wang Resin的合成
称取30.0g(Sub=0.47mmol/g)Wang Resin置于固相反应器,以DMF洗涤树脂两次,200ml/次,重新加入DCM 200ml溶胀树脂30min。树脂溶胀的同时,称取Fmoc-Asp(OtBu)-OH17.38g(42.3mmol,3eq),HOBt 6.28g(46.5mmol,3.3eq),以150ml体积比为1:1的DMF和DCM的混合溶液溶解,冰浴10min,加入DIC 7.25ml(46.5mmol,3eq)活化5min。树脂溶胀及氨基酸活化完成后,投料反应,氮气搅拌,10min后加入DMAP 0.51g(4.23mmol,0.3eq),继续反应5h。5h后,抽掉反应液,DMF洗涤树脂4次,200ml/每次;DCM洗涤树脂2次,200ml/次。加入封端试剂180mL(50ml乙酸酐和42.5ml吡啶溶解于87.5mL DMF中)将剩余未反应羟基乙酰化2h。反应完成后抽滤反应液,分别以DMF,DCM,甲醇洗涤树脂3次,200ml/次,真空干燥后得Fmoc-Asp(OtBu)-Wang Resin 36.7g,改造后替代度为0.31mmol/g。
实施例30:Fmoc-Asp(OtBu)-CTC Resin的合成
称取CTC树脂30.0g(sub=0.40mmol/g)置于合成柱中,用200mL DMF洗涤两次,加入200mL DCM溶胀30min;抽去DCM后,加入溶有9.86g(24mmol)Fmoc-Asp(OtBu)-OH的DCM/DMF(3/1,体积比)溶液100ml,N2搅拌5min后加入DIPEA 4.0ml(24mmol),继续鼓N2搅拌反应60min。反应完成后抽掉反应液,加入DCM/CH3OH/DIPEA(体积比17:2:1)混合溶液封端3次,每次200ml,反应10min;然后用DMF、DCM、甲醇分别洗涤3次,真空干燥得Fmoc-Asp(OtBu)-CTC Resin 37.1g,测改造后替代度为0.30mmol/g。
实施例31:替度鲁肽肽树脂的制备
准确称取实施例29中制备的替代度为0.31mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang Resin32.25g(合成规模10mmol)置于固相反应器中,DMF洗涤树脂2次,150ml/次,加入150ml DCM溶胀30min;树脂溶胀完毕后以20%的哌啶/DMF脱Fmoc 2次,150ml/次,分别反应5min和10min;脱保护完成后以DMF洗涤4次,DCM洗涤2次,150ml/次。取小样以Kaiser试剂检测,树脂呈深蓝色。
称取Fmoc-Thr(tBu)-OH 11.91g(30mmol,3eq),HOBt 4.05g(30mmol,3eq),以120ml体积比为1:1的DMF,DCM溶液溶解,冰水浴10min,加入DIC 4.68ml(30mmol,3eq)活化5min。活化完成后投料反应,氮气搅拌2h,反应终点以Kaiser试剂检测结果为准,检测反应完成后,抽滤除去反应液,以DMF洗涤4次,DCM洗涤2次,200ml/次。以20%的哌啶/DMF脱Fmoc2次,150ml/次,分别反应5min和10min;脱保护完成后以DMF洗涤4次,DCM洗涤2次,150ml/次。取小样以Kaiser试剂检测,树脂呈深蓝色,32位Thr偶联完成。
按照32位Thr的偶联方法,依照替度鲁肽肽序,依次连接氨基酸及短肽片段:
Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH,Fmoc-His(Trt)-Gly-OH。肽树脂合成结束后,依次以DMF洗涤4次,DCM洗涤2次,甲醇洗涤3次,200ml/次,树脂25度真空干燥8h,称重得96.33g。
实施例32:替度鲁肽肽树脂的制备
准确称取实施例30中制备的替代度为0.31mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-CTC Resin33.33g(合成规模10mmol)置于合成柱中,DMF洗涤树脂2次,150ml/次,加入150ml DCM溶胀30min;树脂溶胀完毕后以20%的哌啶/DMF脱Fmoc 2次,150ml/次,分别反应5min和10min;脱保护完成后以DMF洗涤4次,DCM洗涤2次,150ml/次。取小样以Kaiser试剂检测,树脂呈深蓝色。
称取Fmoc-Thr(tBu)-OH 11.91g(30mmol,3eq),HOBt 4.05g(30mmol,3eq),以120ml体积比为1:1的DMF,DCM溶液溶解,冰水浴10min,加入DIC 4.68ml(30mmol,3eq)活化5min。活化完成后投料反应,氮气搅拌2h,反应终点以Kaiser试剂检测结果为准,检测反应完成后,抽滤除去反应液,以DMF洗涤4次,DCM洗涤2次,200ml/次。以20%的哌啶/DMF脱Fmoc2次,150ml/次,分别反应5min和10min;脱保护完成后以DMF洗涤4次,DCM洗涤2次,150ml/次。取小样以Kaiser试剂检测,树脂呈深蓝色,32位Thr偶联完成。
按照32位Thr的偶联方法,依照替度鲁肽肽序,依次连接氨基酸及短肽片段:
Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH,Fmoc-His(Trt)-Gly-OH。肽树脂合成结束后,依次以DMF洗涤4次,DCM洗涤2次,甲醇洗涤3次,200ml/次,树脂25度真空干燥8h,称重得92.12g。
实施例33:替度鲁肽粗肽的制备
将实施例31所制备的替度鲁肽肽树脂90g置于2000ml圆底烧瓶中,冰浴预冷。配置裂解试剂900ml,其体积比为TFA:PhSC:Phenol:EDT:H2O=82.5:5:5:2.5:5,置于-20冰箱中预冷30min。按照1g树脂10ml的比例将裂解试剂加入到肽树脂中,冰水浴搅拌2h,25度搅拌2h,停止反应后抽滤,树脂以TFA洗涤两次,100ml/次,合并滤液,缓慢倾倒至9L预冷的乙醚中,搅拌,置于-20冰箱中静置1h。将乙醚沉降液离心,并以乙醚洗涤六次,离心所得固体干燥,得39.88g,收率106.3%。取粗肽样品分析,纯度为73.1%。
实施例34:替度鲁肽粗肽的制备
将实施例32所制备的替度鲁肽肽树脂90g置于1000ml圆底烧瓶中,冰浴预冷。配置裂解试剂900ml,其体积比为TFA:PhSC:Phenol:EDT:H2O=82.5:5:5:2.5:5,置于-20冰箱中预冷30min。按照1g树脂10ml的比例将裂解试剂加入到肽树脂中,冰水浴搅拌2h,25度搅拌2h,停止反应后抽滤,树脂以TFA洗涤两次,100ml/次,合并滤液,缓慢倾倒至9L预冷的乙醚中,搅拌,置于-20冰箱中静置1h。将乙醚沉降液离心,并以乙醚洗涤六次,离心所得固体干燥,得34.33g,收率91.5%。取粗肽样品分析,纯度为71.3%。
实施例35:替度鲁肽粗肽的纯化
称取实施例33所得粗肽10.0g,以500ml 5%的乙腈/水溶解,超声助溶,0.45um滤膜过滤。内径为100mm的C18制备柱,流动相A为0.1%TFA/水,流动相B为0.1%TFA/乙腈,上样量为10g/针,流速300ml/min,检测波长210nm。梯度洗脱,峰前和峰后循环进样,得到中控分析纯度为98.5%以上的精肽溶液;以醋酸/乙腈/水体系转盐后冻干得替度鲁肽精肽4.23g,纯度99.5%以上,总收率45.08%。
实施例36:替度鲁肽粗肽的纯化
称取实施例34所得粗肽10.0g,以500ml 5%的乙腈/水溶解,超声助溶,0.45um滤膜过滤。内径为100mm的C18制备柱,流动相A为0.1%TFA/水,流动相B为0.1%TFA/乙腈,上样量为10g/针,流速300ml/min,检测波长210nm。梯度洗脱,峰前和峰后循环进样,得到中控分析纯度为98.5%以上的精肽溶液;以醋酸/乙腈/水体系转盐后冻干得替度鲁肽精肽4.19g,纯度99.5%以上,总收率38.36%。
Claims (9)
1.一种片段法固液结合制备替度鲁肽的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(a)液相条件下合成所需短肽片段:Fmoc-His(Trt)-Gly-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH,Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH,Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH,Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH,Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH,Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH;
(b)以Wang Resin或CTC树脂为固相载体,在偶联剂存在下,依次与Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH,Fmoc-His(Trt)-Gly-OH偶联,得侧链保护的替度鲁肽肽树脂,其结构如下:
Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(OtBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Resin;
(c)替度鲁肽肽树脂经过裂解,纯化,冻干得到替度鲁肽精肽。
2.根据权利要求1所述的一种以片段法固液结合制备替度鲁肽的方法,其特征在于,步骤(a)中,
所述的Fmoc-His(Trt)-Gly-OH的制备方法为:首先将Fmoc-His(Trt)-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-His(Trt)-OSu,然后将生成的Fmoc-His(Trt)-OSu和H-Gly-OH在碱A条件下生成Fmoc-His(Trt)-Gly-OH;
所述的Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH的制备方法为:首先将Fmoc-Asp(OtBu)-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-OSu,然后将生成的Fmoc-Asp(OtBu)-OSu和H-Gly-OH在碱A条件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH;
所述的Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH的制备方法为:首先将Fmoc-Ser(tBu)-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Ser(tBu)-OSu,然后将生成的Fmoc-Ser(tBu)-OSu和H-Phe-OH在碱A条件下生成Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH;
所述的Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH的制备方法为:首先将Fmoc-Glu(OtBu)-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Glu(OtBu)-OSu,然后将生成的Fmoc-Glu(OtBu)-OSu和H-Met-OH在碱A条件下生成Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH;
所述的Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH的制备方法为:首先将Fmoc-Thr(tBu)-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Thr(tBu)-OSu,然后将生成的Fmoc-Thr(tBu)-OSu和H-Ile-OH在碱A条件下生成Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH,Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu,最后将生成的Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu和H-Leu-OH在碱A条件下生成Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH;
所述的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH的制备方法为:首先将Fmoc-Asn(Trt)-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Asn(Trt)-OSu,然后将生成的Fmoc-Asn(Trt)-OSu和H-Leu-OH在碱A条件下生成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH,Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu,Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu和H-Ala-OH在碱A条件下生成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH,Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu,Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu和H-Ala-OH在碱A条件下生成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH;
所述的Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH的制备方法为:首先将Fmoc-Asp(OtBu)-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-OSu,然后将生成的Fmoc-Asp(OtBu)-OSu和H-Phe-OH在碱A条件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OSu,Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OSu和H-Ile-OH在碱A条件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH;
所述的Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH的制备方法为:首先将Fmoc-Trp(Boc)-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Trp(Boc)-OSu,然后将生成的Fmoc-Trp(Boc)-OSu和H-Leu-OH在碱A条件下生成Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH,Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu,Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu和H-Ile-OH在碱A条件下生成Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH;
所述的Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH的制备方法为:首先将Fmoc-Lys(Boc)-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Lys(Boc)-OSu,然后将生成的Fmoc-Lys(Boc)-OSu和H-Ile-OH在碱A条件下生成Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH。
3.根据权利要求2所述的一种以片段法固液结合制备替度鲁肽的方法,其特征在于,步骤(a)中,所述的碱A为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾中的一种。有机溶剂B为四氢呋喃、二氧六环、丙酮、乙腈中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的一种以片段法固液结合制备替度鲁肽的方法,其特征在于,步骤(b)中,以Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH投料偶联30~31位,以Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH投料偶联25~27,以Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH投料偶联21~23位,以Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH投料偶联16~19位,以Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH投料偶联12~14位,以Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH投料偶联9~10位,以Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH投料偶联5~6位,以Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH投料偶联3~4位,以Fmoc-His(Trt)-Gly-OH投料偶联1~2位。
5.根据权利要求1所述的一种以片段法固液结合制备替度鲁肽的方法,其特征在于,步骤(b)中,Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH,Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH,Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH,Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH,Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH,Fmoc-His(Trt)-Gly-OH的摩尔投料比为树脂的3~5倍,其余单个氨基酸的摩尔投料比为树脂的2~3倍。
6.根据权利要求1所述的一种以片段法固液结合制备替度鲁肽的方法,其特征在于,步骤(b)中,所述的Wang Resin或CTC Resin初始替代度为0.3~0.5mmol/g,改造后树脂替代度为0.25~0.45mmol/g。
7.根据权利要求1所述的一种以片段法固液结合制备替度鲁肽的方法,其特征在于,改造后树脂优选替代度为0.30~0.35mmol/g。
8.根据权利要求1所述的一种以片段法固液结合制备替度鲁肽的方法,其特征在于,步骤(b)中,所述的偶联剂为HOBt/DIC,HOAt/DIC,HOBt/HBTU/DIEA,HOAt/HATU/DIEA,PyBOP/DIEA,TBTU/DIEA中的一种或几种。
9.根据权利要求1所述的一种以片段法固液结合制备替度鲁肽的方法,其特征在于,步骤(c)中,所述的裂解试剂为加入体积比1-5%清除剂的TFA溶液,所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、苯酚、水、中的一种或几种。
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Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019069274A1 (en) | 2017-10-04 | 2019-04-11 | Chemical & Biopharmaceutical Laboratories Of Patras S.A. | PROCESS FOR THE PREPARATION OF A GLUCAGON-LIKE PEPTIDE |
CN110903352A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-03-24 | 中肽生化有限公司 | 一种西曲瑞克的制备方法 |
CN112175067A (zh) * | 2019-05-28 | 2021-01-05 | 深圳市星银医药有限公司 | 一种替度鲁肽的制备方法 |
CN113480633A (zh) * | 2021-08-04 | 2021-10-08 | 成都诺和晟泰生物科技有限公司 | 一种替度鲁肽的制备方法 |
CN113501871A (zh) * | 2021-07-21 | 2021-10-15 | 汉肽生物医药集团有限公司 | 一种固液相结合制备达西高血糖素的方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104072605A (zh) * | 2013-03-27 | 2014-10-01 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种替度鲁肽的制备方法 |
CN104817638A (zh) * | 2015-05-26 | 2015-08-05 | 成都圣诺生物科技股份有限公司 | 一种合成替度鲁肽的方法 |
CN105384809A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-03-09 | 济南康和医药科技有限公司 | 一种片段法固液结合制备特立帕肽的方法 |
-
2017
- 2017-01-05 CN CN201710008007.1A patent/CN106749614A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104072605A (zh) * | 2013-03-27 | 2014-10-01 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种替度鲁肽的制备方法 |
CN104817638A (zh) * | 2015-05-26 | 2015-08-05 | 成都圣诺生物科技股份有限公司 | 一种合成替度鲁肽的方法 |
CN105384809A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-03-09 | 济南康和医药科技有限公司 | 一种片段法固液结合制备特立帕肽的方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
邵蓉主编: "《药品注册指导原则》", 1 September 2011, 中国医药科技出版社 * |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019069274A1 (en) | 2017-10-04 | 2019-04-11 | Chemical & Biopharmaceutical Laboratories Of Patras S.A. | PROCESS FOR THE PREPARATION OF A GLUCAGON-LIKE PEPTIDE |
CN112175067A (zh) * | 2019-05-28 | 2021-01-05 | 深圳市星银医药有限公司 | 一种替度鲁肽的制备方法 |
CN112175067B (zh) * | 2019-05-28 | 2022-04-15 | 深圳市星银医药有限公司 | 一种替度鲁肽的制备方法 |
CN110903352A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-03-24 | 中肽生化有限公司 | 一种西曲瑞克的制备方法 |
CN113501871A (zh) * | 2021-07-21 | 2021-10-15 | 汉肽生物医药集团有限公司 | 一种固液相结合制备达西高血糖素的方法 |
CN113501871B (zh) * | 2021-07-21 | 2022-10-28 | 汉肽生物医药集团有限公司 | 一种固液相结合制备达西高血糖素的方法 |
CN113480633A (zh) * | 2021-08-04 | 2021-10-08 | 成都诺和晟泰生物科技有限公司 | 一种替度鲁肽的制备方法 |
CN113480633B (zh) * | 2021-08-04 | 2023-08-25 | 成都诺和晟泰生物科技有限公司 | 一种替度鲁肽的制备方法 |
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