CN107216374A - 一种齐考诺肽的合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种齐考诺肽的合成方法，以Fmoc‑氨基型树脂为固相载体，依次偶联5个保护氨基酸，得到线性全保护肽树脂，形成二硫键的三组Cys分别采用Mmt、Trt、Acm保护基，线肽偶联结束后，先选择性脱除Mmt保护基并在固相载体上形成第一对二硫键；切割树脂得一环肽并在液相中氧化得第二对二硫键；最后加入试剂再脱除Acm的同时形成第三对二硫键得齐考诺肽。本发明采用三种不同的保护基使其三对二硫键依次分别成环，避免了多对二硫键同时成环的选择性差的问题；该路线采用一次性酸裂解，亦避免了现有专利中两次酸裂解的操作，通过简便的方法依次进行三对二硫键的成环，既能准确定点环化又能提高产率降低成本。

Description

一种齐考诺肽的合成方法
技术领域
本发明涉及一种齐考诺肽的合成方法。
背景技术
2004年12月28日,FDA批准Elan公司的齐考诺肽注射液(ziconotide，Prialt) 上市，用于鞘内注射治疗，主要适用于其他治疗方法不能耐受或不能控制的严重慢性疼痛患者。欧盟于2005年2月22亦进行了相同的批准。2007年，联合镇痛会议专门小组推荐齐考诺肽作为一线鞘内镇痛药。
齐考诺肽是一种强效的、选择性的N型电压敏感性钙通道阻滞剂，它包含的3个二硫键形成了一个完整的、结构稳定的不均匀的环，使得齐考诺肽可以特异性地、选择性地、可逆地抑制脊髓背角上I、Ⅱ层的、与疼痛传递有关的A δ、C神经纤维末梢的N一型电压敏感性钙通道，可阻止脊髓初级疼痛传入神经元上钙离子的涌入，抑制神经递质如P物质、降钙素基因相关肽以及谷氨酸等的释放，从而阻止或降低疼痛信号的传导。齐考诺肽还作用于大脑皮层、神经垂体和脊髓中的钙通道上，但不作用于神经肌肉接点处的钙通道。此外，齐考诺肽不与阿片受体、胆碱能受体、单胺类受体或肽能受体结合。生物体外研究表明，齐考诺肽能够部分地但却有效地阻断去甲肾上腺素的释放，而不影响γ-氨基丁酸或谷氨酸的释放，也不阻断烟碱样乙酰胆碱受体离子通道。在小鼠模型试验中，齐考诺肽具有可逆的，剂量相关的镇痛效果。当将齐考诺肽直接应用于鼠神经受损的部位时，可引起热痛觉过敏和机械性异常性疼痛，而对正常神经无此反应。
在药理学方面，齐考诺肽和阿片类镇痛剂的进一步区别在于阿片类作用的多种模式，而齐考诺肽具有高选择性作用。因此，齐考诺肽新的药理学特征的潜能来自其3个特性：在阿片类无效的病例中有效；即使在有阿片类耐受性的病人中，与阿片类镇痛剂联合使用时也有辅助的镇痛效果；齐考诺肽不会引起耐受性。因此，齐考诺肽在疼痛治疗中具有独特的地位。
调查结果显示，至少40％～50％的慢性疼痛(持续3个多月或以上)病人缺乏治疗。2004年，美国人在止痛药物上的支出为180亿美元。
齐考诺肽是25个氨基酸组成的聚合阳离子肽(polycationicpeptide)，含有的碱性氨基酸包括4个赖氨酸和2个精氨酸；等电点pI是11.215，相对分子质量是2639.1，其化学结构如下式所示：
目前对齐考诺肽合成工艺报道的有以下路线：
在US2007269528、US2006234939、LU91181专利中，主要是其药理和治疗方面的报道，其中所述的齐考诺为纯液相合成所得。国内报道的工艺均为固相合成主链再采用不同方式进行成环。
在专利CN102268082中，虽然采用Cys(Trt)、Cys(Acm)、Cys(tBu)三种不同保护基，但在形成二硫键时采用一次性形成二对二硫键的方式，成键准确率低，而且采用了两次高浓度的三氟乙酸进行裂解，三氟乙酸消耗大，不仅成本高，而且对环境污染也大。
在专利CN101709082中，成环的六个Cys全部采用Acm为保护基，线性肽在含铊的试剂中脱除Acm保护基，最后在液相中自由成环。该法不仅用到重金属铊，而且同时形成三对二硫键，成环准确率低，后期纯化困难。
在专利CN101412752A中，采用Cys(Trt)、Cys(Acm)、Cys(Mob)三组保护基合成肽链，虽然是依次进行三对二硫键的环化，但其路线采用在固相上完成前两对二硫键的氧化，由于肽链一端固定在载体上，由于肽链自由旋转空间受限，第二对二硫键成环难度大，收率低。而且还要使用强腐蚀的超强酸三氟甲磺酸，操作危险大。
在CN104974237A中，采用片断法先合成四个片断，然后再将片断依次偶联，最后得齐考诺肽线性肽，最后自主成环得齐考诺肽。该法采用片断缩合方式，因片段间反应为液相条件，过程中的副产物除去困难，操作步骤繁琐且其成环方式为三对二硫键同时成环，二硫键之间成环准确度低。
在CN103304655A中，采用Lys-Gly、Thr-Gly、Ser-Gly三个二肽代替单个氨基酸偶联，与专利CN101709082B一样存在成环无选择性的问题。
在文献《固相法氧化选择性合成齐考诺肽》中，采用四个Trt保护基与2个 Acm保护基合成线性肽，一步自主选择形成两对二硫键。此法采用自主配对成环氧化，二硫键定位差。
齐考诺肽报道的合成方法有固相和液相合成方法，但是各方法都有方法本身的不足，因此需要一种与上述方法相比具有较大的改进的合成方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种偶联条件温和、成环选择性高、操作过程简单、产品纯度高的齐考诺肽的合成方法。
本发明为实现上述目的采用的技术方案是：一种齐考诺肽的合成方法，该方法包括如下步骤：
(1)以Fmoc氨基型树脂为固相载体，按照肽序从C端到N端依次偶联所需的25个保护氨基酸，得到线性肽树脂；
(2)将步骤(1)得到的线性肽树脂选择性脱除Mmt随后在树脂上氧化形成第一对二硫键得一环肽树脂；
(3)将步骤(2)所得一环肽树脂进行裂解，脱除有Acm保护基的一环肽，然后在液相中氧化形成第二对二硫键得二环肽；
(4)将步骤(3)得的二环肽在脱除Acm保护基的同时形成第三对二硫键，经纯化、冻干得齐考诺肽；
进一步地，三组Cys形成二硫键，形成二硫键的三组Cys(1-16、8-20、15-25) 中，同组的Cys同时连接Mmt、Trt、Acm三种保护基中的一种，且不同组的 Cys所连接保护基互不相同；
进一步地，步骤(1)中所述的Fmoc氨基型树脂包括但不仅限于Rink Amide 树脂、Rink Amide MBHA树脂、Rink Amide AM树脂、Rink Amide BHA树脂、或Sieber树脂，取代度可选范围为0.3-1.0mmol/g；
进一步地，步骤(1)中所述的保护氨基酸分别为：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Acm) -OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH；
进一步地，步骤(1)中使用肽链偶联缩合剂，所述的肽链偶联缩合剂体系采用DIC/A、HBTU/A/B或HATU/C/B体系；
进一步地，所述A为HOBt或6-Cl-HOBt，B为DIPEA或TMP，C为HOAt；
进一步地，步骤(2)中所述的脱除Cys(Mmt)上的Mmt保护基的条件为含0.1-3％TFA的二氯甲烷溶液；氧化第一对二硫键的条件为在固相载体上用 DMF、DCM、NMP中任一种试剂做溶剂，加入Et3N调节pH值为7.5-9.0，搅拌下通入空气进行氧化成环；
进一步地，步骤(3)中所述的裂解条件为三氟乙酸与清除剂的混合试剂，其中三氟乙酸的比例不低于85％；裂解粗肽经醚沉淀、离心后溶解在甲醇溶液中，加入Et3N调节pH值为7.5-9，搅拌下通入空气进行氧化形成第二对二硫键得二环肽；
进一步地，所述清除剂为水、苯甲醚或硫代苯甲醚；
进一步地，步骤(4)中所述形成第三对二硫键条件为向步骤(3)所得液体中加入碘单质，在15-30℃条件下搅拌环化形成第三对二硫键，再用抗坏血酸除去多余的碘，溶液经纯化、冻干得齐考诺肽。
本发明的制备齐考诺肽的合成方法包括以下步骤：
(1)以Fmoc-氨基树脂为固相载体，按照肽序从C端到N端依次偶联所需的25个保护氨基酸，得到线性全保护肽树脂。其中，形成二硫键的三组Cys(1-16、 8-20、15-25)中，同组的Cys同时连接Mmt、Trt、Acm三种保护基中的一种，且不同组的Cys所连接保护基互不相同。Fmoc-氨基树脂包括Rink Amide树脂、 Rink Amide MBHA树脂、Rink Amide AM树脂、RinkAmide BHA树脂、或Sieber 树脂，取代度可选范围为0.3-1.0mmol/g。保护氨基酸间缩合采用的偶联剂可选用HBTU/6-Cl-HOBt/DIPEA、HBTU/6-Cl-HOBt/TMP、DIC/HOBt、 DIC/6-Cl-HOBt、HBTU/HOBt/DIPEA、HBTU/HOBt/TMP、HATU/HOAt/DIPEA、 HATU/HOAt/TMP等组合。
(2)将步骤(1)得到的线性肽树脂用含0.1-3％TFA的DCM溶液选择性脱除Mmt。随后直接在树脂上空气氧化形成第一对二硫键得一环肽树脂，氧化时所选用的溶剂为DMF、DCM或NMP中的任一种或任两种的混合试剂或上述三种的混合试剂均可。
(3)将步骤(2)所得一环肽树脂用含有清除剂的TFA溶液进行裂解，清除剂可选用水、硫代苯甲醚、苯甲醚、三异丙基硅烷、苯酚中的一种或几种照一定比例配成的混合液。裂解脱除Acm后所得的溶液用醚沉淀得固体，将该固体溶解在水溶液中，用氨水调节pH后，经空气氧化形成第二对二硫键得二环肽。
(4)将步骤(3)所得的二环肽用5-20倍当量的碘在15-30℃下脱除Acm保护基并同时形成第三对二硫键，得到齐考诺肽粗肽溶液。粗肽溶液经HPLC纯化、冻干得齐考诺肽。
在步骤(1)中所述氨基树脂优选为Rink Amide MBHA树脂或Rink Amide AM树脂，优选取代度为0.4-0.7mmol/g。脱除Fmoc保护基的条件采用室温条件下以20％的Pip/DMF溶液分两次反应脱除，时间分别为5min、25min；脱除 Fmoc保护基后用DMF洗涤除去其中的Pip溶液。偶联缩合剂优选为 DIC/6-Cl-HOBt或HBTU/6-Cl-HOBt/DIPEA体系。线性肽偶联所用的保护氨基酸为：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、 Fmoc-Tyr(tBu)-OH。最终所得的线性肽树脂结构如下：
H-Cys(A)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Ala-Lys(Boc)-Cys(B)-Ser(tBu)-Arg(pbf )-Leu-Met-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Cys(C)-Cys(A)-Thr-Gly-Ser(tBu)-Cys(B)-Arg(pbf)- Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Cys(C)-氨基树脂(其中A、B、C三组分别为Mmt、Trt、 Acm保护基中的一种，且不同组的保护基互不相同)。
步骤(2)中脱除Cys(Mmt)中Mmt保护基所用条件采用含TFA为0.1-3％的DCM溶液，优选条件为0.3-1％的TFA/DCM溶液。脱除Mmt保护基后，在树脂上直接氧化形成第一对二硫键采用溶剂为DMF、DCM、NMP中的任一种或任两种的混合试剂或上述三种的混合试剂，优选溶剂为NMP。氧化需使用 Et3N调节溶液pH值为7.5-9.0，在搅拌下通入空气氧化形成第一对二硫键得一环肽树脂，氧化时间为10-20h。
步骤(3)中裂解肽树脂所用的裂解液为TFA/硫代苯甲醚/苯甲醚/水按照一定比例配置的混合溶液，要求其中TFA的比例不小于85％，优选条件为TFA：硫代苯甲醚：苯甲醚：水＝90：5：2.5：2.5。裂解1g肽树脂所用的裂解液为8-20ml，优选条件为每克肽树脂所用裂解液为10ml。裂解在室温进行，裂解时间为1.5-3h，优选时间为2h。裂解所得的一环肽用醚进行沉淀，优选甲基叔丁基醚。固体经离心、洗涤后溶解在水相中，加入氨水调节pH值为7.5-9.0，搅拌下通入空气氧化形成第二对二硫键得二环肽，氧化时间为10-20h。
步骤(4)中脱除Acm保护基并形成第三对二硫键是在15-30℃下向步骤(3) 中的溶液加入5-20倍当量碘单质，优选碘用量为5倍当量。搅拌下选择性脱除 Cys上的Acm保护基并同时形成第三对二硫键。反应完全后，加入抗坏血酸消耗掉多余的碘直到溶液变为无色。再经HPLC纯化、冻干得齐考诺肽纯品。
本发明的有益效果是：
有益效果
与已有技术相比，本发明先采用固相合成线性肽树脂并在树脂上选择性脱除Mmt保护基后在树脂上经空气氧化得一环肽；再将从树脂上裂解所得一环肽在液相中氧化得二环肽；最后用碘在脱Acm保护基的同时形成第三对二硫键得目标物。本发明优势就在于固相方法合成线性肽方法简便可控，逐步选择性脱侧链保护并分步成环，能避免二硫键的错位。采用在液相中分步形成第二对二硫键与第三对二硫键，不仅可以避免在树脂上形成二对二硫键会因肽链旋转受限导致成环收率低也可以避免液相中同时形成二对二硫键环的错位环化。
本发明根据齐考诺肽的本身特性，巧妙运用三种保护基的特性，分步形成目标物的三对二硫键，得到了高纯度，高收率，二硫键准确定位的产物，避免了其它方法采用多次高深度TFA裂解、重金属催化、二硫键错位成环等问题。本发明工艺具有反应操作简单、产品质量高、环境污染少、成本低等优点，具有可观的经济实用价值，适合工业化放大生产。
附图说明
图1为本发明的齐考诺肽的合成方法的合成路线流程示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中所使用的缩写的含义列于下表中：
Fmoc 9-芴甲氧羰基
DCM 二氯甲烷
DMF N，N-二甲基甲酰胺
DIC N,N-二异丙基碳二亚胺
HOBt 1-羟基苯并三唑
6-Cl-HOBt 6-氯-1-羟基苯并三唑
HOAt 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)
HBTU 苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯
HATU 2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
DIPEA N，N-二异丙基乙胺
TMP 2，4，6-三甲基吡啶
MTBE 甲基叔丁基醚
TFA 三氟乙酸
Pip 六氢吡啶
Trt 三苯甲基
Acm 乙酰氨甲基
Mmt 4-甲氧基三苯甲基
实施例1：
用DIC/6-Cl-HOBt在Rink Amide MBHA树脂上合成线性肽树脂：
(1)称取250g取代值为0.40mmol/g的Rink Amide MBHA树脂(即100mmol) 于多肽合成仪中，加入1500ml的DMF洗涤树脂一次，再加入1500ml的DCM溶胀树脂30min，过滤；再用1500ml的DMF洗涤树脂一次；
(2)加入脱Fmoc试剂(Pip/DMF＝20/80)1250ml在室温下脱保护两次，时间为5min+15min；脱保护后用DMF洗涤8次；
(3)称取300mmol的Fmoc-Cys(Acm)-OH加入到1000ml的DMF中，再加入 300mmol的6-Cl-HOBt，搅拌溶解完全后再加入300mmol的DIC；将活化后的溶液加入到反应器中与树脂室温反应2h；反应毕，排出废液，用1250ml/次的DMF 洗涤树脂4次；
重复上述步骤(2)与步骤(3)依次偶联所需氨基酸最后得得线性肽树脂 H-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Ala-Lys(Boc)-Cys(Mmt)-Ser(tBu)- Arg(pbf)-Leu-Met-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Cys(Acm)-Cys(Trt)-Thr-Gly-Ser(tB u)-Cys(Mmt)-Arg(pbf)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Acm)-Rink Amide MBHA树脂，最后用DCM与MeOH交替洗涤树脂三次，室温空气晾5h后在30-35℃真空减压干燥20-25h得线性肽树脂。线性肽树脂收率不低于90％。
实施例2：
用HBTU/6-Cl-HOBt/DIPEA在Rink Amide MBHA树脂上合成线性肽树脂：
(1)称取250g取代值为0.40mmol/g的Rink Amide MBHA树脂(即100mmol) 于多肽合成仪中，加入1500ml的DMF洗涤树脂一次，再加入1500ml的DCM溶胀树脂30min，过滤；再用1500ml的DMF洗涤树脂一次；
(2)加入脱Fmoc试剂(Pip/DMF＝20/80)1250ml在室温下脱保护两次，时间为5min+15min；脱保护后用DMF洗涤8次；
(3)称取300mmol的Fmoc-Cys(Acm)-OH加入到1000ml的DMF中，再加入 300mmol的6-Cl-HOBt以及300mmol的DIPEA，最后加入300mmol的HBTU，搅拌 5-10min使其完全溶解；将溶液加入到反应器中与树脂室温反应2h；反应毕，排出废液，用1250ml/次的DMF洗涤树脂4次；
重复上述步骤(2)与步骤(3)依次偶联所需氨基酸最后得得线性肽树脂 H-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Ala-Lys(Boc)-Cys(Mmt)-Ser(tBu)- Arg(pbf)-Leu-Met-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Cys(Acm)-Cys(Trt)-Thr-Gly-Ser(tB u)-Cys(Mmt)-Arg(pbf)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Acm)-Rink Amide MBHA树脂，最后用DCM与MeOH交替洗涤树脂三次，室温空气晾5h后在30-35℃真空减压干燥20-25h得线性肽树脂。线性肽树脂收率不低于90％。
实施例3：
用DIC/6-Cl-HOBt在Rink Amide AM树脂上合成线性肽树脂：
(1)称取200g取代值为0.50mmol/g的Rink Amide AM树脂(即100mmol) 于多肽合成仪中，加入1200ml的DMF洗涤树脂一次，再加入1200ml的DCM溶胀树脂30min，过滤；再用1200ml的DMF洗涤树脂一次；
(2)加入脱Fmoc试剂(Pip/DMF＝20/80)1200ml在室温下脱保护两次，时间为5min+15min；脱保护后用DMF洗涤8次；
(3)称取300mmol的Fmoc-Cys(Trt)-OH加入到1000ml的DMF中，再加入 300mmol的6-Cl-HOBt，搅拌溶解完全后再加入300mmol的DIC；将活化后的溶液加入到反应器中与树脂室温反应2h；反应毕，排出废液，用1200ml/次的DMF 洗涤树脂4次；
重复上述步骤(2)与步骤(3)依次偶联所需氨基酸最后得得线性肽树脂 H-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Ala-Lys(Boc)-Cys(Mmt)-Ser(tBu)- Arg(pbf)-Leu-Met-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Thr-Gly-Ser(tB u)-Cys(Mmt)-Arg(pbf)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Rink Amide MBHA树脂，最后用DCM与MeOH交替洗涤树脂三次，室温空气晾5h后在30-35℃真空减压干燥20-25h得线性肽树脂。线性肽树脂收率不低于90％。
实施例4：
用HBTU/6-Cl-HOBt/DIPEA在Rink Amide AM树脂上合成线性肽树脂：
(1)称取200g取代值为0.50mmol/g的Rink Amide AM树脂(即100mmol) 于多肽合成仪中，加入1200ml的DMF洗涤树脂一次，再加入1200ml的DCM溶胀树脂30min，过滤；再用1200ml的DMF洗涤树脂一次；
(2)加入脱Fmoc试剂(Pip/DMF＝20/80)1200ml在室温下脱保护两次，时间为5min+15min；脱保护后用DMF洗涤8次；
(3)称取300mmol的Fmoc-Cys(Trt)-OH加入到1000ml的DMF中，再加入 300mmol的6-Cl-HOBt以及300mmol的DIPEA，最后加入300mmol的HBTU，搅拌 5-10min使其完全溶解；将活化后的溶液加入到反应器中与树脂室温反应2h；反应毕，排出废液，用1200ml/次的DMF洗涤树脂4次；
重复上述步骤(2)与步骤(3)依次偶联所需氨基酸最后得得线性肽树脂 H-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Ala-Lys(Boc)-Cys(Mmt)-Ser(tBu)- Arg(pbf)-Leu-Met-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Thr-Gly-Ser(tB u)-Cys(Mmt)-Arg(pbf)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Rink Amide MBHA树脂，最后用DCM与MeOH交替洗涤树脂三次，室温空气晾5h后在30-35℃真空减压干燥20-25h得线性肽树脂。线性肽树脂收率不低于90％。
实施例5：
合成一环肽树脂：
将上述实施例1所得已干燥的线性肽树脂750g加入多肽合成仪中，加入 3000ml含0.5％TFA的DCM溶液，室温反应5min排出废液。重复处理3次以确保 Mmt保护基能完全脱除。用2000ml的DCM洗涤树脂三次后，加入2000ml NMP溶液溶胀树脂并加入Et3N调节溶液pH值保持在7.5-9.0之间，室温下通空气搅拌氧化反应8h，取小量树脂裂解监测环化情况。待反应结束后过滤除去废液。用MeOH洗涤树脂三次，室温空气晾5h后在30-35℃真空减压干燥20-25h得一环肽树脂，该步反应基本定量完成。
实施例6：
合成二环肽：
取上述实施例3所得树脂250g慢慢加入到2500ml预先冷至5-15℃的裂解液(TFA：硫代苯甲醚：苯甲醚：水＝90：5：2.5：2.5)中，保持裂解液温度在 20-30℃搅拌反应2h。过滤，树脂用100ml/次的TFA洗涤3次。合并裂解液入洗涤树脂的TFA液，真空减压浓缩(20-30℃)至1L体积，将浓缩液加入预先冷至0℃的5.0L的MTBE中搅拌沉淀，静置半小时后过滤，滤饼用4.0L/次的MTBE 洗涤6次。固体在通风柜中干燥3h后真空减压干燥24h得固体80g。本步收率 92.4％。
将上述固体溶解于40L的甲醇：水＝4：1的溶液中，用氨水调节pH值为 7.5-9.0之间，在室温下通入空气搅拌环化反应10-20h。用HPLC监测反应情况，反应毕停止通空气并关闭搅拌得二环肽溶液。
实施例7：
向实施例4的溶液中慢慢加入HOAc调节pH值为6.0-7.0，保持温度在 15-30℃条件下加入5倍当量的碘单质搅拌反应2h。反应毕，向反应溶液中加入抗坏血酸直至溶液变为无色。
将溶液过滤后用制备色谱进行分离，色谱条件如下：
流动相A：20mM的乙酸铵(pH＝3.5)溶液；流动相B：乙腈
洗脱梯度：4％B(60min)14％B
制备柱填料：C18硅胶柱
收集主峰所得目标物馏分，浓缩后冻干得齐考诺肽不低于28g，冻干粉HPLC 纯度大于99.0％。
上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种齐考诺肽的合成方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)以Fmoc氨基型树脂为固相载体，按照肽序从C端到N端依次偶联所需的25个保护氨基酸，得到线性肽树脂；
(2)将步骤(1)得到的线性肽树脂选择性脱除Mmt，随后在树脂上氧化形成第一对二硫键得一环肽树脂；
(3)将步骤(2)所得一环肽树脂进行裂解，得脱除有Acm保护基的一环肽，然后在液相中氧化形成第二对二硫键得二环肽；
(4)将步骤(3)得的二环肽在脱除Acm保护基的同时形成第三对二硫键，经纯化、冻干得齐考诺肽。
2.如权利要求1所述的一种齐考诺肽的合成方法，其特征在于，三组Cys形成二硫键，形成二硫键的三组Cys中，同组的Cys同时连接Mmt、Trt、Acm三种保护基中的一种，且不同组的Cys所连接保护基互不相同。
3.如权利要求1所述的一种齐考诺肽的合成方法，其特征在于，步骤(1)中所述的Fmoc氨基型树脂包括但不仅限于Rink Amide树脂、Rink Amide MBHA树脂、Rink Amide AM树脂、Rink Amide BHA树脂、或Sieber树脂。
4.如权利要求1所述的一种齐考诺肽的合成方法，其特征在于，步骤(1)中所述的保护氨基酸分别为：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH。
5.如权利要求1所述的一种齐考诺肽的合成方法，其特征在于，步骤(1)中缩合使用肽链偶联缩合剂体系，所述的肽链偶联缩合剂体系采用DIC/A、HBTU/A/B或HATU/C/B体系。
6.如权利要求5述的一种齐考诺肽的合成方法，其特征在于，所述A为HOBt或6-Cl-HOBt，B为DIPEA或TMP，C为HOAt。
7.权利要求1所述的一种齐考诺肽的合成方法，其特征在于，步骤(2)中所述的脱除Cys(Mmt)上的Mmt保护基的条件为含0.1-3％TFA的二氯甲烷溶液；氧化第一对二硫键的条件为在固相载体上用DMF、DCM、NMP中任一种或任两种的混合试剂或上述三种的混合试剂做溶剂，加入Et3N调节pH值为7.5-9.0，搅拌下通入空气进行氧化成环。
8.权利要求1所述的一种齐考诺肽的合成方法，其特征在于，步骤(3)中所述的裂解条件为三氟乙酸与清除剂的混合试剂，其中三氟乙酸的比例不低于85％；裂解粗肽经醚沉淀、离心后溶解在甲醇溶液中，加入Et3N调节pH值为7.5-9，搅拌下通入空气进行氧化形成第二对二硫键得二环肽。
9.权利要求1所述的一种齐考诺肽的合成方法，其特征在于，所述清除剂为水、苯甲醚或硫代苯甲醚。
10.权利要求1所述的一种齐考诺肽的合成方法，其特征在于，步骤(4)中所述形成第三对二硫键条件为向步骤(3)所得液体中加入碘单质，在15-30℃条件下搅拌环化形成第三对二硫键，再用抗坏血酸除去多余的碘，溶液经纯化、冻干得齐考诺肽。
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