CN101412752A - 齐考诺肽的固相合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种齐考诺肽的固相合成方法，所述方法包括如下顺序步骤：以Fmoc－Rink Amide－MBHA树脂为固相载体，进行程序反应，依次进行缩合反应连接25个保护基氨基酸，得到25个氨基酸的线性肽全保护树脂；其中，形成二硫键的三组Cys中，同组的Cys同时连接Trt、Acm或Mob保护基中的一种，且不同组的Cys所连接保护基各不相同；依次脱除3组Cys的保护基、并进行环化反应形成二硫环键，脱除侧链保护基团并切割树脂，得到含有3个二硫环的齐考诺肽。本发明的有益效果主要体现在：副产物少，定向效率高、方法简便，有利于产品纯化，产物收率高。
Description
技术领域
本发明属生物化学技术领域，具体涉及一种齐考诺肽的固相合成方法。
背景技术
齐考诺肽化学名：L-半胱酰胺-L-赖氨酰-L-甘氨酰-L-赖氨酰-L-甘氨酰-L-丙氨酰-L-赖氨酰-L-半胱氨酰-L-丝氨酰-L-精氨酰-L-亮氨酰-L-蛋氨酰-L-酪氨酰-L-天冬氨酰-L-半胱氨酰-L-半胱氨酰-L-苏氨酰-L-甘氨酰-L-丝氨酰-L-半胱氨酰-L-精氨酰-L-丝氨酰-L-甘氨酰-L-赖氨酰-L-半胱氨酰胺(1→16)(8→20)(15→25)三环二硫化物。
化学结构式为：
分子式：C102H172N36O32S7
分子量：2639.13
齐考诺肽系从南太平洋海洋蜗牛Conus magus提取的包含25个氨基酸、3个二硫键肽类毒素合成物。可选择性作用于树突和轴突终末支N型电敏钙通道，从而抑制最初的伤害刺激传入。一系列的临床实验已经证明鞘内注射齐考诺肽可以治疗带状疱疹后遗神经痛、幻肢痛、HIV相关神经病理性疼痛、难治性癌痛、手术后疼痛。其鞘内注射较吗啡更具潜力而不必担心药物的耐受及成瘾性。
目前多对二硫键多肽的合成方法，一类是基于生物提取技术，另外一类是使用单一的半胱氨酸保护基，脱除后再通过低温下控制其在自然条件下反应组构成环。
生物提取受到现有有限生物资源的影响，提取过程较繁琐，效率低，且比较难得到高纯度的产物；低温自然成环反应属于热力学控制，环化过程慢，过程控制较复杂，反应收率低。
发明内容
本发明目的是提供一种过程简单、效率高、收率高的齐考诺肽的固相合成方法。
本发明采用的技术方案是：
一种齐考诺肽的固相合成方法，所述方法包括如下顺序步骤：
(1)以Fmoc-Rink Amide-MBHA树脂为固相载体，进行程序反应，依次进行缩合反应连接25个保护基氨基酸，得到25个氨基酸的线性肽全保护树脂；其中，形成二硫键的三组Cys(1→16、8→20、15→25)中，同组的Cys同时连接Trt、Acm或Mob保护基中的一种，且不同组的Cys所连接保护基各不相同；
(2)依次脱除3组Cys的保护基、并进行环化反应形成二硫环键，脱除侧链保护基团并切割树脂，得到含有3个二硫环的齐考诺肽。
本发明针对多对二硫键多肽的特点，结合半胱氨酸侧链巯基的化学反应特性，通过使用多种的不同保护强度的巯基暂时性保护基，来依次脱除，依次成环，这样可以将环化过程由热力学控制改为动力学控制方法，提高环化速度，反应效率，并且得到较满意的收率。所接入的其他氨基酸的保护基，可根据尝试设计。
所述及的Fmoc-Rink Amide-AM树脂的化学结构为：
可采用市售产品，如可采用天津南开和成科技公司生产的规格为：subst.0.5mmol/g，DVB：1％，Mesh 100～200的Fmoc-Rink Amide-AM树脂。
具体的，所述方法包括如下顺序步骤：
(1)以Fmoc-Rink Amide-MBHA树脂为固相载体，进行程序反应，依次连接以下保护基：Fmoc-Cys(Mob)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Cys(Acm)-OH，Fmoc-Cys(Mob)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoce-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Cys(Acm)-OH，得到H2N-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Ala-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Leu-Met-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Cys(Mob)-Cys(Acm)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Mob)-NH-Rink Amide AM树脂；其中Fmoc＝芴甲氧羰基，Trt＝三苯甲基，Acm＝乙酰胺甲基，Mob＝对甲氧基苄基，tBu＝叔丁基，Boc＝叔丁氧羰基，Mtr＝4-甲氧基-2，3，6-三甲基苄基磺酰基，Pbf＝2，2，4，6，7-五甲二氢苯并呋哺-5-磺酰基；
(2)脱除Cys(Trt)的Trt保护基，得到H2N-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Ala-Lys(Boc)-Cys(H)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Leu-Met-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Cys(Mob)-Cys(Acm)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Cys(H)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Mob)-NH-Rink Amide AM树脂，再进行第一次环化反应，得到一环肽树脂：
(3)脱除Cys(Acm)的Acm保护基、同时进行第二次环化反应，得到二环肽树脂：
(4)脱除Cys(Mob)的Mob保护基和剩余侧链保护基，并切割树脂，得到二环肽：
(5)进行第三次环化反应，反应结束后经C18填料的反相高效液相色谱柱纯化，洗脱、浓缩、干燥，得到所述齐考诺肽：
步骤(2)中脱除Trt保护基反应条件为：1％的TFA(三氟醋酸)/DCM(二氯甲烷)溶液中、室温反应20分钟。
步骤(2)中环化反应条件为：水、乙腈、DMSO体积比15：10：1的混合溶液中，pH 8，室温反应4小时。
步骤(3)的反应条件为：碘浓度为0.4mmol/ml的碘/甲醇溶液中，室温反应1～2小时。
步骤(4)的反应条件为：三氟醋酸、三氟甲磺酸、硫代苯甲醚、乙二硫醇体积比80：8：8：4的混合溶液中，室温反应3小时。
步骤(5)的反应条件为：二环肽溶于水中，调pH 8，双氧水存在下，室温反应1小时。
(6)如权利要求1或2所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于所述程序反应步骤如下：先用20％的哌啶/DMF溶液室温处理脱去Fmoc-保护基；再加入1～5当量的Fmoc-保护氨基酸、1～5当量的HOBt和1～5当量的N，N-二异丙基碳二亚胺，搅拌，室温反应2～5小时，连接Fmoc-保护氨基酸；所述HOBt用二氯甲烷或二氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液溶解后加入。
(7)如权利要求1或2所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于所述程序反应步骤如下：
①洗涤：用二氯甲烷和乙醇交替洗涤2～3次，二氯甲烷用量为5～7mL/g树脂，乙醇用量为5～7mL/g树脂；
②脱保护基：用20％的哌啶/DMF溶液室温下处理2～3次，每次20min，脱去Fmoc-保护基；
③洗涤：用二氯甲烷和乙醇交替洗涤2～3次，二氯甲烷用量为5～7mL/g树脂，乙醇用量为5～7mL/g树脂；
④连接保护基：加入1～5当量的Fmoc-保护氨基酸，1～5当量的HOBt，所述HOBt用二氯甲烷或二氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液溶解，然后加入1～5当量的N，N-二异丙基碳二亚胺，搅拌，室温反应2～5小时；
⑤洗涤：用二氯甲烷和乙醇交替洗涤2～3次，二氯甲烷用量为5～7mL/g树脂，乙醇用量为5～7mL/g树脂。
本发明的有益效果主要体现在：副产物少，定向效率高、方法简便，有利于产品纯化，产物收率高。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：齐考诺肽线形肽树脂的制备
操作：(1)将Fmoc-Rink Amide-AM树脂50g(25mmol)放于多肽合成反应器中，用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗2次，2分钟/次，抽干。加入20％(v/v)的哌啶/DMF溶液500ml，室温搅拌反应20分钟，抽干。树脂用二氯甲烷、乙醇300ml交替洗3次，2分钟/次，抽干。
(2)将Fmoc保护氨基酸及HOBt 16.9g用500ml二氯甲烷/DMF(体积比1：1)溶液溶解后，加入树脂中，再滴加N，N-二异丙基碳二亚胺19ml，滴毕后室温搅拌3小时。
(3)抽干。树脂用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分钟，抽干。
(4)重复步骤(1)～(3)至偶联完毕所有的氨基酸。
(5)甲醇洗涤树脂后干燥得齐考诺肽线形肽树脂135.8g，收率72％。
氨基酸用量如表1：
表1：各氨基酸用量
| 序列 | 氨基酸名称 | 用量(克) |
| 1 | Fmoc-Cys(Mob)-OH | 57.9 |
| 2 | Fmoc-Lys(Boc)-OH | 58.6 |
| 3 | Fmoc-Gly-OH | 37.2 |
| 4 | Fmoc-Ser(tBu)-OH | 47.9 |
| 5 | Fmoc-Arg(Pbf)-OH | 81.1 |
| 6 | Fmoc-Cys(Trt)-OH | 73.2 |
| 7 | Fmoc-Ser(tBu)-OH | 47.9 |
| 8 | Fmoc-Gly-OH | 37.1 |
| 9 | Fmoc-Thr(tBu)-OH | 49.7 |
| 10 | Fmoc-Cys(Acm)-OH | 51.8 |
| 11 | Fmoc-Cys(Mob)-OH | 57.9 |
| 12 | Fmoc-Asp(OtBu)-OH | 51.4 |
| 13 | Fmoc-Tyr(tBu)-OH | 57.4 |
| 14 | Fmoc-Met-OH | 46.4 |
| 15 | Fmoc-Leu-OH | 44.1 |
| 16 | Fmoc-Arg(Pbf)-OH | 81.0 |
| 17 | Fmoc-Ser(tBu)-OH | 47.9 |
| 18 | Fmoc-Cys(Trt)-OH | 73.2 |
| 19 | Fmoc-Lys(Boc)-OH | 58.5 |
| 20 | Fmoc-Ala-OH | 38.9 |
| 21 | Fmoc-Gly-OH | 37.1 |
| 22 | Fmoc-Lys(Boc)-OH | 58.5 |
| 23 | Fmoc-Gly-OH | 37.1 |
| 24 | Fmoc-Lys(Boc)-OH | 58.5 |
| 25 | Fmoc-Cys(Acm)-OH | 51.8 |
实施例2：齐考诺肽一环肽树脂的制备
操作：将实施例1制得齐考诺肽线形肽树脂加入至2000ml圆底烧瓶中，加入1％(v/v)三氟醋酸/二氯甲烷溶液1300ml，室温搅拌反应20分钟，过滤，用二氯甲烷，甲醇交替洗涤树脂后，加入1200ml水/乙腈(体积比6:4)和DMSO(二甲基亚砜)48ml，用稀氨水调节pH 8，室温下搅拌反应4小时。得到齐考诺肽一环肽树脂。
实施例3：齐考诺肽二环肽树脂的制备
操作：将实施例2制得齐考诺肽一环肽树脂加入至2000ml圆底烧瓶中，加入碘/甲醇溶液1300ml(128g碘溶于1300ml甲醇中)，室温搅拌反应2小时，过滤，用DMF(N，N-二甲基甲酰胺)，甲醇，1M的抗坏血酸DMF溶液交替洗涤树脂，干燥得到齐考诺肽二环肽树脂126.1g。
实施例4：齐考诺肽二环粗肽的制备
操作：齐考诺肽二环肽树脂126.1g加入到2000ml圆底烧瓶中，量取苯甲硫醚96ml、乙二硫醇48ml，加入树脂中，冰水浴搅拌下加入三氟醋酸960ml，反应10分钟后，缓慢滴加96ml三氟甲磺酸，滴加完毕后室温反应3小时，过滤，滤除树脂，用60ml三氟醋酸洗涤树脂，滤液浓缩后，加入10L冷乙醚，即析出大量的白色固体，过滤，收集白色固体，干燥，得齐考诺肽二环粗肽43.2g。收率65.5％。
实施例5：齐考诺肽三环肽粗品的制备
将齐考诺肽二环粗肽溶于25L水制备成1mmol/L的稀溶液，用稀氨水调节pH至8，缓慢滴加30％(m/m)的过氧化氢水溶液(双氧水)50ml，滴加完毕后，室温反应1小时，得到齐考诺肽三环肽粗品的水溶液。
实施例6
齐考诺肽粗制品纯化
装置：C18制备柱(100×800mm)
洗脱液A：0.1％(v/v)TFA/H2O
洗脱液B：乙腈
流速：200ml/min
紫外检测波长：230nm
操作：(1)齐考诺肽三环肽粗品的水溶液用0.45μm微孔滤膜过滤；
(2)滤液直接上样；
(3)18～23％(v/v)乙腈-水流动相梯度洗脱；
(4)收集目的肽馏分；
(5)浓缩，冷冻干燥；
(6)得齐考诺肽白色固体28.4g。
产物经MS质谱确认，总收率43％。
Claims (9)
1、一种齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于所述方法包括如下顺序步骤：
(1).以Fmoc-Rink Amide-MBHA树脂为固相载体，进行程序反应，依次进行缩合反应连接25个保护基氨基酸，得到25个氨基酸的线性肽全保护树脂；其中，形成二硫键的三组Cys中，同组的Cys同时连接Trt、Acm或Mob保护基中的一种，且不同组的Cys所连接保护基各不相同；
(2).依次脱除3组Cys的保护基、并进行环化反应形成二硫环键，脱除侧链保护基团并切割树脂，得到含有3个二硫环的齐考诺肽。
2、如权利要求1所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于所述方法包括如下顺序步骤：
(1).以Fmoc-Rink Amide-MBHA树脂为固相载体，进行程序反应，依次连接以下保护基：Fmoc-Cys(Mob)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Cys(Acm)-OH，Fmoc-Cys(Mob)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoce-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Cys(Acm)-OH，得到H2N-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Ala-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Leu-Met-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Cys(Mob)-Cys(Acm)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Mob)-NH-Rink Amide AM树脂；
(2).脱除Cys(Trt)的Trt保护基，进行第一次环化反应，得到一环肽树脂；
(3).脱除Cys(Acm)的Acm保护基、同时进行第二次环化反应，得到二环肽树脂；
(4).脱除Cys(Mob)的Mob保护基和剩余侧链保护基，并切割树脂，得到二环肽；
(5).进行第三次环化反应，反应结束后经C18填料的反相高效液相色谱柱纯化，洗脱、浓缩、干燥，得到所述齐考诺肽。
3、如权利要求2所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于步骤(2)中脱除Trt保护基反应条件为：1％的TFA/DCM溶液中、室温反应20分钟。
4、如权利要求2所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于步骤(2)中环化反应条件为：水、乙腈、DMSO体积比15：10：1的混合溶液中，pH8，室温反应4小时。
5、如权利要求2所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于步骤(3)的反应条件为：碘浓度为0.4mmol/ml的碘/甲醇溶液中，室温反应1～2小时。
6、如权利要求2所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于步骤(4)的反应条件为：三氟醋酸、三氟甲磺酸、硫代苯甲醚、乙二硫醇体积比80：8：8：4的混合溶液中，室温反应3小时。
7、如权利要求2所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于步骤(5)的反应条件为：二环肽溶于水中，调pH8，双氧水存在下，室温反应1小时。
8、如权利要求1或2所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于所述程序反应步骤如下：先用20％的哌啶/DMF溶液室温处理脱去Fmoc-保护基；再加入1～5当量的Fmoc-保护氨基酸、1～5当量的HOBt和1～5当量的N，N-二异丙基碳二亚胺，搅拌，室温反应2～5小时，连接Fmoc-保护氨基酸；所述HOBt用二氯甲烷或二氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液溶解后加入。
9、如权利要求1或2所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于所述程序反应步骤如下：
①洗涤：用二氯甲烷和乙醇交替洗涤2～3次，二氯甲烷用量为5～7mL/g树脂，乙醇用量为5～7mL/g树脂；
②脱保护基：用20％的哌啶/DMF溶液室温下处理2～3次，每次20min，脱去Fmoc-保护基；
③洗涤：用二氯甲烷和乙醇交替洗涤2～3次，二氯甲烷用量为5～7mL/g树脂，乙醇用量为5～7mL/g树脂；
④连接保护基：加入1～5当量的Fmoc-保护氨基酸，1～5当量的HOBt，所述HOBt用二氯甲烷或二氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液溶解，然后加入1～5当量的N，N-二异丙基碳二亚胺，搅拌，室温反应2～5小时；
⑤洗涤：用二氯甲烷和乙醇交替洗涤2～3次，二氯甲烷用量为5～7mL/g树脂，乙醇用量为5～7mL/g树脂。
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