CN1232535C - 芋螺毒素mvii a基因的gst融合表达及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种芋螺毒素MVII A基因的GST融合表达及其应用，是在大肠杆菌中克隆并表达GST-CTX MVII A重组融合蛋白，经GST亲和层析纯化，得到纯化的GST-CTX MVII A融合蛋白。本发明得到的融合蛋白，可在制备治疗晚期癌症和爱滋病人的顽痛药物中应用，也可在制备治疗手术后的急性疼痛、烧伤、胆绞痛病人、难治性神经疼痛等镇痛药物中应用，因有神经保护作用，还可在制备用于脑缺血和脑损创的治疗药物中应用。本发明工艺简单、质量稳定、成本较低，得到的融合蛋白分子量较大，体内的半衰期(t_1/2)较长，可作为中间体，经酶切，得到活性的ω-芋螺毒素MVII A小肽，可直接进行药物开发。

Description

芋螺毒素MVIIA基因的GST融合表达及其应用

技术领域

本发明属基因工程，涉及化学合成多肽，尤其涉及ω-芋螺毒素MVII A基因的GST融合表达及其在药物中的应用。

背景技术

芋螺毒素(Conotoxin，CTX)是从海洋腹足纲软体动物芋螺(Conus)中得到的一类具有生物活性的肽类毒素，至今已有50000余种^[1]。这些多肽结构新颖，功能独特。按其作用靶位可分为α-、ω-、μ-、δ-等类型。由于它们可选择性地作用于不同的离子通道及其亚型^[2]，在离子通道亚型鉴定，疾病治疗及神经生物学研究方面发挥重要的作用。

ω型CTX是近年来芋螺毒素的重要研究方向，具有广阔的药物开发前景^[3]。其中，ω-芋螺毒素MVII A(CTX MVII A)是电压敏感型钙离子通道的抑制剂，其组成序列为C K G K G A K C S R L M Y D C C T G S C R S G K C，它由25个氨基酸组成，含6个半胱氨酸(Cys)残基，形成三对全交叉二硫键(即二硫键连接方式为Cysl-Cys16，Cys8-Cys20，Cys15-Cys25)^[3]。它们具有很高的镇痛活性且无成瘾性，作为替代吗啡等成瘾止痛剂的候选药物，目前已进入III期临床试验^[3]。

目前，ω-芋螺毒素MVII A可以用化学合成的方法获得，但因为分子中有6个半胱氨酸(Cys)需要准确配对形成二硫键，需要20多步反应，得率很低，工艺十分困难，质量不稳定，而且成本较高。因此，寻找一种合适的方法获得ω-芋螺毒素MVII A成为需要。

发明内容

本发明的一个目的是在大肠杆菌中克隆并表达谷胱甘肽S-转移酶(GST)与ω-芋螺毒素MVIIA的重组融合蛋白(GST-CTX MVII A重组融合蛋白)，经GST亲和层析纯化，得到纯化的GST-CTX MVII A融合蛋白，SEQ ID NO：1为GST-CTX MVIIA重组融合蛋白的一种氨基酸序列：

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231  GAKCSRLMYD CCTGSCRSGK C

(融合蛋白质分子中C227与C242、C234与C246、C241与C251分别形成三对二硫键)

该融合蛋白共由251个氨基酸组成；其中，小写部分为GST的序列，大写部分为芋螺毒素MVIIA的序列，有下划线的氨基酸为连接部分，该融合蛋白序列中，GST和连接部分的氨基酸序列允许有多种突变，但芋螺毒素MVIIA的序列不变。SEQ ID NO：2和3为GST-CTX MVIIA重组融合蛋白的另二种氨基酸序列：SEQ ID NO：2(246个氨基酸)

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231  RLMYDCCTGS CRSGKC

SEQ ID NO：3(253个氨基酸)

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231  GKGAKCSRLM YDCCTGSCRS GKC

GST-CTX MVII A重组融合蛋白的表达，是把合成的CTX MVII A基因，直接克隆到谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白表达载体pGEX-2T的BamH I和EcoRI位点之间，构建重组质粒pGEX-2T/CTX MVII A，经DNA序列测定，确认其序列的准确性，然后将此重组质粒导入大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达后获得重组融合蛋白，用谷胱甘肽偶联的Sepharose 4B经亲和层析一步即可获得纯化的GST-CTX融合蛋白。

本发明的另一个目的是得到的纯化GST-CTX MVII A融合蛋白，在制备治疗晚期癌症和爱滋病人的顽痛药物中的应用。

本发明的又一个目的是得到的纯化GST-CTX MVII A融合蛋白，在制备治疗手术后的急性疼痛、烧伤、胆绞痛病人、难治性神经疼痛等镇痛药物中的应用。

本发明的还有一个目的是得到的纯化GST-CTX MVII A融合蛋白，在制备治疗脑缺血和脑损创等神经保护药物中的应用。

本发明具有的特点是：采用的表达系统是pGEX-2T，其特点是Ptac启动子受乳糖操纵子的控制。其上游为谷胱甘肽S转移酶(GST)基因，在GST和多克隆位点之间存在凝血酶的酶切位点。外源基因片段以正确阅读框架克隆到强启动子下游的多克隆位点上，在IPTG的诱导下能表达外源蛋白与GST形成的融合蛋白，且可显著提高融合蛋白的表达产率。在凝血酶作用下，GST和下上游蛋白分子分离，便于纯化^[5]。GST融合蛋白在水溶液中可溶，在不变性的条件下，通过亲和层析得到。由于细菌诱导因不同蛋白而异，为了达到最佳的表达量，本研究首先对诱导时间和诱导时的温度进行了摸索。经摸索发现(实验数据未列出)，在37℃，诱导3h时表达的量最大(可达50～60mg蛋白/L菌液)，且可溶性好。

本发明采用基因工程生产出的GST-CTX MVII A融合蛋白，经热板法测定其对小鼠的镇痛活性，结果表明它具有很高的镇痛活性。比文选报道的吗啡(有效剂量7.5mg/kg)的镇痛效果大10～20倍。因融合蛋白具有产量大，易于提取，纯化方便，中间流程少、体内停留的半衰期长等特点，可以为开发新的镇痛药物提供新的途径。本发明为进一步的研究芋螺毒素，开辟了新途径奠定基础。

本发明的融合蛋白基因工程的生产方法，可以得到工艺简单、质量稳定、成本较低的生产路线。而且得到的与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白质，分子量较大，体内的半衰期(t_1/2)较长，可以直接作为新药进行开发；  也可以作为中间体，经酶切，得到活性的ω-芋螺毒素MVII A小肽，进行药物开发。

附图说明

图1为pGEX-2T/CTX MVII A重组质粒的构建图示。

图2为融合蛋白GST-CTX MVII A的诱导表达。

图3为融合蛋白GST-CTX MVII A的可溶性分析和纯化。

图4为小鼠侧脑室给药后不同时间内的痛阈提高百分率。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，而非限定本发明。

实施例1芋螺毒素MVIIA基因的的一种表达

材料与方法

1.1材料与试剂

pGEX-2T质粒及大肠杆菌BL21菌种由本室所存；CTX基因合成由上海生工生物工程公司完成；T4多核苷酸激酶(TPK)、T4 DNA连接酶，限制性内切酶，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)及中分子量Marker，还原型谷光甘肽购于上海生工生物工程公司；Glutathione-Sepharose 4B购于Parmacia公司；其他试剂均购于国内各公司。

1.2方法

1.2.1目的基因的化学合成

因CTX MVII A多肽基因长度较短，所以合成更方便快捷。CTX MVII A全序列由上海生工生物工程公司合成，在其5端引入BamH I的酶切位点，3端引入EcoR I的酶切位点及终止密码子，并用T4多核苷酸激酶(TPK)使每条链的5端磷酸化。把合成的CTX MVII A基因双链各取10微升混合，于95℃水浴变性，缓慢降温直至降到45℃为止，复性完成。

1.2.2重组质粒pGEX-2T/CTX MVII A的构建

把退火后的CTX双链插入到经BamH I和EcoR I双酶切的pGEX-2T载体中，以T4 DNA连接酶连接过夜，形成重组质粒，结果参见图1，合成的芋螺毒素MVIIA基因被插入到经过限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切的pGEX-2T载体中，构成重组质粒。图中黑色长条

代表芋螺毒素MVIIA基因。重组后的质粒经测序鉴定。SEQ ID NO：1为GST-CTX MVIIA重组融合蛋白的一种氨基酸序列：

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231  GAKCSRLMYD  CCTGSCRSGK C

(融合蛋白质分子中C227与C242、C234与C246、C241与C251分别形成三对二硫键)

该融合蛋白共由251个氨基酸组成；其中，小写部分为GST的序列，大写部分为芋螺毒素MVIIA的序列，有下划线的氨基酸为连接部分，该融合蛋白序列中，GST和连接部分的氨基酸序列允许有多种突变，但芋螺毒素MVIIA的序列不变，下面是GST-CTX MVIIA重组融合蛋白的另二种氨基酸序列：

(1)(246个氨基酸)

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232  RLMYDCCTGS CRSGKC

(2)(253个氨基酸)

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231  GKGAKCSRLM YDCCTGSCRS GKC

1.2.3 GST-CTX融合蛋白的诱导表达

BL21感受态的制备参照文献^[4]，采用CaCl₂法。质粒的转化参照文献^[4]，将GST-CTX质粒导入大肠杆菌BL21中，以BL21空菌和含未插入目的基因的质粒的BL21为阴、阳性对照。挑取重组成功的克隆接种到含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振摇过夜，2％比例接种新鲜LB培养基，培养至对数中期。取出1毫升，以作阴性对照，其余加入IPTG至终浓度为0.1mM，37℃诱导表达3小时。

1.2.4 GST-CTX融合蛋白的可溶性分析

将诱导表达的重组菌5000rpm离心10min，弃上清，沉淀重悬于冰预冷的PBS+5mM EDTA(pH8.0)中，以超声破碎法裂解。15000rpm离心15min，取出上清(沉淀约占总体积的2-4％)，并向沉淀中加入与上清等体积的蒸馏水。各取10微升沉淀及上清，分别加入2×SDS上样缓冲液，煮沸3-5min，进行12％SDS-PAGE，以检测融合蛋白的可溶性。

1.2.5表达融合蛋白的纯化

挑取克隆成功的重组菌接种到含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振摇过夜，将菌液按1∶50的比例接种于含氨苄青霉素的新鲜LB培养基，37℃培养至OD₆₀₀为0.8左右，加入IPTG至终浓度为0.1M，继续培养3小时。5000rpm，4℃离心10分钟，收集细菌，重悬于冰预冷的含5mM的EDTA(PH8.0)的PBS中，冰上放置，超声裂解。15000rpm，4℃离心15分钟，取出上清。在PH6.5的5mM的PB中透析过夜。按方法[5，6]，向上清中加入50％Glutathione-Sepharose 4B，混合，4℃轻轻振荡30min，500g离心5min，小心去上清。用10倍体积的PBS洗涤沉淀，500g离心5min，去上清。重复3次。然后再加入还原型谷光甘肽和50mMTris-Hcl(PH8.0)，混合轻摇10min，500g离心5min，收集上清。纯化后的融合蛋白经12％SDS-PAGE鉴定。按Bradford法^[7]测定融合蛋白的含量。

1.2.6 GST-CTX融合蛋白镇痛活性的测定

热板法^[8，9]测GST-CTX MVII A融合蛋白对小鼠的镇痛作用。挑取大小相近的雌性小鼠25只，任意分为5组，每组5只。调节热板温度为55±0.5℃，置小鼠于热板上，测定各小鼠的正常痛反应。以小鼠舔后足或抬后足并回头为标准，痛阈时间为5～30s为正常。60s为最大值。以生理盐水为对照，用生理盐水倍比稀释融合蛋白溶液，对小鼠进行侧脑室给药，每只给药10ul。记录给药后不同时间的痛阈。求出各组平均值，计算痛阈提高的百分率。

1结果

2.1重组质粒pGEX-2T/CTX MVII A的序列测定

提取重组的质粒，序列测定由上海生工生物工程公司完成。表明目的基因片段完全正确插入到载体中，重组质粒构建成功。下列序列为表达质粒pGEX-2T/CTX MVIIA的核苷酸序列，其中加浓的黑色序列为插入的CTX MVII A基因序列：

1    CTCCAAAATC GGATCTGGTT CCGCGTGGAT CCTGCAAAGG TAAAGGTGCG

51   AAATGCTCTC GTCTGATGTA CGACTGCTGC ACCGGTTCTT GCCGTTCTGG

101  TAAATGCTGA GAATTCATCG TGACTGACTG ACGATCTGCC TCGCGCGTTT

151  CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT

2.2 GST-CTX MVII A融合蛋白在宿主菌中的诱导表达

各取0.5毫升诱导菌和未诱导菌菌液，以pGEX-2T空载体经IPTG诱导后的菌液为对照，与等体积的2×SDS上样缓冲液混合，煮沸3-5min，离心后，各取10微升上样，观察蛋白质是否表达。结果表明：含重组质粒的诱导菌表达的蛋白质在分子量约28600处有一浓带，与预期的GST-CTX MVII A融合蛋白的分子量相符。作为对照的含空载体的BL21菌液经诱导后没有此分子量的浓带，而在分子量为26000处有一浓带，结果参见图2，其中M：标准分子量，1：IPTG诱导的含pGEX-2T质粒的细菌裂解液，2：未用IPTG诱导的含pGEX-2T质粒的细菌裂解液，3：IPTG诱导的含pGEX-2T/CTX重组质粒的细菌裂解液，4：未用IPTG诱导的含pGEX-2T/CTX MVIIA重组质粒的细菌裂解液。

2.3 GST-CTX融合蛋白的可溶性鉴定

将诱导培养后的重组菌离心，重悬，以超声破碎法裂解。变性后各取10微升上清和沉淀上样，进行SDS-PAGE，结果参见图3，其中M：标准分子量，1：未用IPTG诱导的含pGEX-2T/CTX MVII A重组质粒的细菌裂解液，2：IPTG诱导的含pGEX-2T/CTX重组质粒的细菌裂解液的沉淀，3：IPTG诱导的含pGEX-2T/CTX重组质粒的细菌裂解液的上清，4：纯化的GST-CTX MVII A融合蛋白。在上清和沉淀中有粗细相近的蛋白质条带。因沉淀的体积仅占总体积的2％左右，故所表达的蛋白质绝大部分是可溶的，占目的蛋白的95％以上。

2.4 GST-CTX MVII A融合蛋白的纯化

收集诱导表达的重组菌，经超声破碎后，取上清。用Glutathione-Sepharose 4B进行亲和纯化，纯化后的融合蛋白进行12％SDS-PAGE，参见图4：在分子量为28600处有一单一条带，表明纯化完全，得到了纯化的GST-CTX MVII A融合蛋白。融合蛋白的含量按Bradford法测定，表明每升细菌培养液可得到50～60mg蛋白。

2.5 GST-CTX MVII A融合蛋白镇痛活性的测定

分别测定给药后不同时间小鼠的平均痛阈值，按以下公式计算痛阈提高的百分率：

痛阈提高百分率＝(用药后平均痛阈值-用药前平均痛阈值)/用药前平均痛阈值

根据每组不同时间的痛阈提高百分率作图，横坐标代表时间，纵坐标代表痛阈提高百分率，结果参见图4，图中的曲线表示不同的给药量(ug/kg)。结果表明其镇痛活性比吗啡(有效剂量7.5mg/kg)大10～20倍左右，比MVII A略低，具有很高的镇痛活性。

实施例2

由于芋螺毒素MVIIA可以阻断神经细胞N-型电压敏感钙离子通道，从而可以抑制痛觉信号传递，具有广泛的镇痛作用。可以用于急性与持续性疼痛，例如癌症晚期、爱滋病、手术后的急性疼痛、烧伤、胆绞痛病人、难治性神经疼痛等病人的镇痛，其作用可以代替吗啡类镇痛剂。我们用电板镇痛(国际公认的模型)，已经证明了其效果。方法见1.2.6，结果参见图4，结果表明它具有很高的镇痛活性。比文选报道的吗啡(有效剂量7.5mg/kg)的镇痛效果大1000倍。可作为替代吗啡等成瘾止痛剂的候选药物。

实施例3

另外，芋螺毒素还有神经保护作用，当大脑局部缺血或机械性创伤发生时，由于芋螺毒素MVI IA可以阻断神经细胞N-型电压敏感钙离子通道，从而可以抑制刺激性神经递质的释放和病原性钙离子进入神经细胞，可能作为脑损伤的保护剂，可进行大脑局部缺血或机械性创伤保护药的开发^[11-13]。

本发明涉及的部分参考文献

1.Baldomero M，Olivera，Lourdes J，Cruz Conotoxins，in retrospect Toxicon 2001；39：7-14

2.Olivera BM，Rivier J，Clark C，et a1.Diversity ofconus neuropeptides.J Science，1990，249：1338

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在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (4)

1.芋螺毒素MVIIA基因重组融合蛋白，其特征是：SEQ ID NO：1为芋螺毒素MVIIA基因重组融合蛋白的一种氨基酸序列，SEQ ID NO：2和3为芋螺毒素MVIIA基因重组融合蛋白的另二种氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的芋螺毒素MVIIA基因重组融合蛋白的制备方法，其特征是：把合成的CTX MVIIA基因，直接克隆到谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白表达载体pGEX-2T的BamHI和EcoRI位点之间，构建重组质粒pGEX-2T/CTXMVIIA，经DNA序列测定，确认其序列的准确性，然后将此重组质粒导入大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达后获得重组融合蛋白，用谷胱甘肽偶联的Sepharose4B经亲和层析获得纯化的芋螺毒素MVIIA基因重组融合蛋白。

3.如权利要求1所述的芋螺毒素MVIIA基因重组融合蛋白的应用，其特征是：得到的纯化芋螺毒素MVIIA基因融合蛋白，在制备治疗晚期癌症和爱滋病人的顽痛药物中的应用。

4.如权利要求1所述的芋螺毒素MVIIA基因重组融合蛋白的应用，其特征是：得到的纯化芋螺毒素MVIIA基因重组融合蛋白，在制备治疗手术后的急性疼痛、烧伤、胆绞痛病人、难治性神经疼痛镇痛药物中的应用。

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