CN101041691A - 中国南海信号芋螺神经毒素基因lt5.4及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中国南海信号芋螺神经毒素基因lt5.4及其编码的多肽lt5d，以及该多肽在制备神经生物学研究的工具药和镇痛药物中的应用。本发明用构建cDNA文库的方法，从中国南海信号芋螺毒管中克隆得到的芋螺毒素T－超家族成员lt5.4，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。该基因编码的多肽(神经毒素lt5d)，其前体肽和成熟肽氨基酸序列如序列表<400>2序列所示。本发明的神经毒素lt5d能够阻断TTX－敏感型电压门控钠离子通道电流且具有镇痛作用，可用于制备神经生物学研究的工具药和镇痛剂。

Description

中国南海信号芋螺神经毒素基因lt5.4及其应用

技术领域

本发明涉及一种中国南海信号芋螺神经毒素基因lt5.4及其编码的多肽lt5d，以及该多肽在制备神经生物学研究的工具药和镇痛药物中的应用。

背景技术

芋螺，亦称鸡心螺，系软体动物门，腹足纲，前鳃亚纲，芋螺科(Conidae)动物之总称。壳呈圆锥形或纺锤形，表面常有各色花纹。壳口窄长，厣小而不能遮盖壳口。全球有约500种，我国有百余种。它们分布于热带海域中的浅水区，少数在广东、广西沿海，海南岛北部，个别种延伸到东海。芋螺虽然种类很多，个体大小和食物类型有很大差异，但它们都是食肉动物，而且是靠它们的毒液来捕食猎物。按照食性，芋螺大致可分为三类，食鱼芋螺、食其它软体动物的食螺芋螺和以蠕虫为食的食虫芋螺。其中食鱼芋螺毒液的毒性最高，食虫芋螺的毒性最低。

芋螺毒素是一类来源于芋螺毒液的活性多肽，对芋螺自身而言，它们主要用于捕食猎物、相互竞争与防御敌害。近几十年来的研究表明，芋螺毒素的构象稳定，主要选择性作用于细胞膜上各种离子通道和神经递质/激肽的受体，从而影响神经传导，产生不同的生理作用。它们具有如下特点：分子质量小，为含有8-46个氨基酸的小肽；富含二硫键，并形成有一定保守性的骨架；信号肽高度保守而成熟肽具有高变性；作用靶点广且具高组织选择性。芋螺毒素常被作为探针用于各种离子通道和受体的类型及亚型的分类和鉴定，也极有望直接开发成药物或作为先导化合物用于新药的开发。

自80年代初首个芋螺毒素的氨基酸序列被测定以来，已经分离鉴定了一百多个芋螺毒素，按照其结构特点(前体肽中N端高度保守的信号肽区和C端的二硫键骨架)，将其分为不同的超家族。这些毒素分别选择性的作用于钙、钠、钾离子通道，或者乙酰胆碱、NMDA、5-羟色胺等受体，许多已经成为神经生理学研究的工具药。但是，目前已知的芋螺毒素大多是从食鱼芋螺中分离得到，食虫芋螺的毒液研究的相对较少。至今已有数种芋螺毒素申请美国专利，它们在镇痛、局部缺血性保护、癫痫治疗、某些疾病诊断和受体研究中具有广泛的应用价值，有的已进入临床研究或已被FDA正式批准为治疗新药，用作特异诊断试剂和镇痛药。如由Olivera等从幻芋螺(Conus magus)中分离的ω-CTX，MVIIA，已被美国FAD正式批准为治疗顽痛的药物，其商品名Ziconotide。ω-芋螺毒素MVIIA是由25个氨基酸、3对二硫键组成的碱性亲水性小肽，C端酰胺化，N端为Cys。可选择性抑制N型电压敏感性钙通道，广泛用作神经生物学探针和无致瘾性镇痛剂，并具有多种药物发展前景；沿脊髓传递的Ziconotide能阻断伤害感受器释放神经传递素，阻止疼痛信号传入大脑，临床表现出强大的镇痛作用，效果优于吗啡等现有的镇痛剂，用于艾滋病、癌症及神经痛患者的治疗，无成瘾性，且疗效确切。来源不同的ω-CTX，尽管其氨基酸序列不同，但在结构上的差异都不是很大，如来自地纹芋螺(C.geographus)的GVIA、GVIC、GVIIA和GVIIB等，和来自幻芋螺MVIIA、MVIIC、以及来自线纹芋螺(C.striatus)的SO3等ω-CTX，在药理学方面有相似的作用。α-CTX能结合并阻断小细胞肺癌表面相关的nAChR受体，在小细胞肺癌的诊断和治疗中有潜在价值，这将是CTX的又一个研究领域。芋螺毒素备受关注，已成为海洋毒素研究的热点。新的芋螺毒素及新的亚型不断被发现，并对这些芋螺毒素的高级结构、药理和构效关系进行了大量的研究工作。这些新型芋螺毒素在一级结构上各具特点，且有独特的生理活性。

我国关于芋螺毒素研究的报道不多。卢柏松等，魏开华等对我国的少数几种芋螺(线纹芋螺，织锦芋螺和桶形芋螺)的毒素基因或毒液成份进行了研究。我国近海的芋螺约有70种，主要分布在海南岛，西沙群岛和台湾，大多数种类的芋螺毒素研究还未展开。由于每种芋螺毒液都有自己特定的药理学作用范围和生物学活性，因而使芋螺毒素具有重要的理论研究价值和应用价值。芋螺毒素既可直接用作天然药物，又可以作为设计新药的先导化合物。深入研究芋螺毒素，不仅对海洋制药工业具有重要意义，且可为我国芋螺海洋资源开发利用提供重要理论依据。

国外已研究了约30种芋螺的毒素，但这些芋螺大多分布在国外的暖海区(如西太平洋)，有的在我国也有分布，但由于地理条件的不同，国内与国外同一种芋螺的毒素可能完全不同，因为CTX具有高度遗传多样性特征。因此，开展我国南海芋螺毒素的生化、生理、药理，尤其是其分子生物学领域的探索研究，对于推动我国多肽科学的发展，促进多肽药物的开发，具有不容忽视的理论价值和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种神经毒素多肽，以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一个目的是提供这些多肽的用途。

本发明的第一方面，提供一种新的神经毒素多肽，其包括含有序列表<400>2所示的氨基酸序列的多肽、或者其保守性变异多肽、或其活性衍生物。

上述的新的神经毒素多肽优选自以下组之一：

(a)由序列表<400>2所示的氨基酸序列组成的多肽；

(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或舔加而形成的具有相同功能的由(a)衍生的多肽。

本发明的第二方面，提供一种多核苷酸，该多核苷酸包含有选自以下组之一核苷酸序列：

(a)编码上述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

较佳的，该多核苷酸编码<400>2所示的氨基酸序列。

本发明的第三方面，提供上述的神经毒素多肽的成熟肽DCCPAKLLCCNP及其修饰物，以及含有上述成熟肽片段的多肽。

本发明的第四个方面提供上述多肽的用途：本发明获得的中国南海信号芋螺神经毒素多肽的成熟肽是一种神经毒素lt5d，具有生物活性。该神经毒素具有镇痛作用。分离纯化的lt5d在50nM时即能抑制TTX-敏感型钠离子通道电流。因此，本发明的中国南海信号芋螺神经毒素lt5d可用于制备神经生物学研究的工具药和镇痛药物。

附图说明

图1为中国南海信号芋螺毒管cDNA文库的EST序列长度分布统计图。从图中可见在500-600bp，700-800bp和800-900bp处存在高丰度的EST序列，而本发明所克隆的南海信号芋螺神经毒素基因Lt5.4的EST序列长度正位于500-600bp之间。

图2a为本发明的中国南海信号芋螺神经毒素lt5d的分子筛分离图谱；

图2b为中国南海信号芋螺神经毒素lt5d分子筛分离后阴离子交换分离图；

图2c为中国南海信号芋螺神经毒素lt5d阴离子分离后HPLC分离图；

图2d为中国南海信号芋螺神经毒素lt5d纯化后MALDI-TOF鉴定图。

图3a为神经毒素lt5d的膜片钳活性鉴定实验结果图；

图3b为神经毒素lt5d生理模型上的镇痛药效实验结果图。

具体实施方式

在本发明申请中，“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另外一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。

本发明中的多核苷酸指RNA序列、DNA序列或cDNA。

本发明用构建cDNA文库的方法，从中国南海信号芋螺毒管中克隆得到的芋螺毒素T-超家族成员lt5.4，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。

上述本发明基因编码的多肽的氨基酸序列如序列表<400>2所示，该多肽是一前体肽，其成熟肽(神经毒素lt5d)的氨基酸序列如序列表中<400>3序列所示：该成熟肽由12个氨基酸组成，分子量为1274.8778道尔顿。

该成熟多肽可以通过分离纯化得到，HPLC鉴定其纯度达到96.5％，MALDI-TOF鉴定其分子量正确。

本发明所选择的信号芋螺属于中国南海食虫性信号芋螺(Conuslitteratus)，采自海南省三亚市。

中国南海信号芋螺毒管cDNA文库的构建：首先分离信号芋螺毒管，提取总RNA。取总RNA进行反转录合成cDNA第一链产物。再取cDNA用于连接反应，转化液分别涂板，其余用于摇总库菌液，从平板上挑取单克隆保种。

本发明通过对以上重组克隆大规模序列测定，得到18条EST序列编码中国南海信号芋螺神经毒素T-超家族成员，命名为lt5.4(其DNA序列如序列表中<400>1序列所示)。新基因编码的前体肽的氨基酸序列如序列表<400>2所示，而该前体肽的成熟肽氨基酸序列如序列表中<400>3序列所示由12个氨基酸组成，分子量为1274.8778道尔顿，具有典型芋螺毒素一级结构的特征，分子内具有两对二硫键。

本发明通过分离纯化得到了一条多肽lt5d，DCCPAKLLCCNP，分子量为1274.8778道尔顿，其分子内第一个和第三个半胱氨酸成一对二硫键，第二个和第四个半胱氨酸成另一对二硫键。

以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1：中国南海信号芋螺毒管cDNA文库的构建及EST序列分析

总RNA的提取和cDNA合成：分离中国南海信号芋螺毒管，参照Gibco BRL公司的TRIZOL LS试剂说明书进行毒管总RNA提取。取1μg信号芋螺毒管总RNA以SMART III olignuclotide(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3’)和CDSIII/3’PCR引物(5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)₃₀N_-1N-3’)进行逆转录合成第一链，得到10μl cDNA第一链产物。

信号芋螺毒管cDNA文库的构建和鉴定：取cDNA 1.5μl用于连接反应，反应体系5μl，转化其中1μl，取5ul转化液分别涂板，取300ul转化液用于摇总库菌落。隔日记数平板的单菌落数分别为：800，680和1072个。因此双链cDNA7ul可获得的cDNA文库克隆数为：(800+680+1072)*1050*7*5/3*5*1.5＝4.170*10⁶(个)。随机挑取46个单克隆，利用载体多克隆位点两端的T7和SP6引物PCR扩增，结果显示，重组率超过98％(45/46)，大部分的插入片段大于500bp(41/46)，平均插入片段长度为638bp。从平板上随机挑取六板单克隆摇菌、保种、提取质粒、T7引物单向测序，手工使用BLASTN和BLASTX在线同源比对，SEQTOOL、ClustalX 1.83程序分析测序结果。测序结果显示信号芋螺平均插入片段长度为544(543.68)bp。

以上结果显示我们构建的信号芋螺毒管cDNA文库在文库重组子数、重组率和插入片段大小等方面均符合良好文库的质量标准。

实施例2：神经毒素基因lt5.4序列的测定和分析

南海信号芋螺神经毒素基因lt5.4的质粒和序列来自实施例一中国南海信号芋螺毒管cDNA文库中所克隆到的18条高度同源的EST序列，神经毒素基因lt5.4属于高表达基因，约占所有EST序列的4％，以5号板D12号克隆为例对其进行生物信息学分析，结果显示其cDNA序列长度为523bp。利用工具软件SEQTOOL对其碱基序列进行分析，并获得其最大读码框，长度189bp，编码62个氨基酸残基的前体肽。进一步分析显示，该前体肽的第1-20位氨基酸残基为其信号肽区域，其第50位残基为精氨酸，可认为是标准蛋白质水解信号，将前体肽的前导肽和成熟肽部分分开。故确定lt5d成熟肽序列为DCCPAKLLCCNP，分子量为1274.8778道尔顿。由于lt5d前体肽中信号肽区和成熟肽区半胱氨酸骨架和所有已经报道的芋螺毒素T-超家族有明显的相似性，lt5d为新的T-超家族毒素。

实施例3：神经毒素lt5d的分离纯化

取信号芋螺毒管，剪碎后用50mmol/L Tris-Cl，pH8.6+100mmol/L NaCl萃取，用G25Fine(i.d2.6*100cm)分离，以萃取缓冲液洗脱，280nm检测；收集第2峰上Q Sepharose fast flow分离，NaCl梯度洗脱，收集第1峰上C18反相柱分离，乙腈梯度洗脱，收集保留时间为33.7min的峰。分离纯化的神经毒素lt5d序列为DCCPAKLLCCNP，分子量为1274.8778道尔顿，分子内第一个和第三个半胱氨酸成一对二硫键，第二个和第四个半胱氨酸成另一对二硫键。

实施例4：神经毒素lt5d的生理活性鉴定

方案一：全细胞膜片钳实验

急性分离大鼠背根神经节(DRG)神经元细胞，选1月左右的SD大鼠，处死后，迅速取出胸腰段脊柱，剖开，置于氧饱和的DMEM液(Dubecco’s ModifiedEagle’s Medium)内，pH7.4，渗透压为340mOsm/L。分离DRG，并尽可能地剪碎，置培养瓶内。然后加入胰酶(type III，Sigma)0.5mg/ml，胶原酶(type IA，Sigma)1.0mg/ml，DNA酶(type III，Sigma)0.1mg/ml，在恒温振荡水浴器(35℃，80次/分)中温孵。孵育毕，加入1.25mg/ml大豆胰酶抑制剂(typeII2S，Sigma)终止酶的消化作用。将上述酶和机械分离的DRG细胞转移至24孔培养板内，37℃细胞培养箱中培养3h。

采用全细胞膜片钳电压钳模式。记录INa的电极内液成分(mmol/L)为：NaCl5.8，CsCl 134，MgCl₂ 1，EGTA 3，HEPES 10，pH用CsOH调至7.2。记录INa的细胞外液：NaCl 140，KCl 3，MgCl₂ 2，GaGl₂ 1，葡萄糖10，HEPES 10，pH用NaOH调至7.4。电极阻抗2～4MΩ。待电极和细胞间形成大于1GΩ的高阻封接后继续施以负压，将电极内膜片吸破，调节慢电容和串联电阻补偿。保持电位为-80mV，此时即可进行钠电流记录。

lt5d对TTX敏感型电压门控钠离子通道的激活电压没有影响，而能明显的抑制其峰值电流；但是对TTX不敏感型电压门控钠离子通道则没有影响，结果如图3a所示。

方案二：生理模型上的镇痛药效实验法

基本方案：小鼠热板法

选取健康雌性SPF级NIH小鼠，体重20±2g。把小鼠放于事先加热到55℃的GJ-8402型热板镇痛仪上，用秒表记录小鼠自投入热板至出现舔后足或跳跃的时间(秒)为该鼠的痛阈值。腹腔注射前先测定每只小鼠的痛阈(共测两次，以平均值不超过20秒者为合格。)注射后0.5h，1h，1.5h，2h，3h测定一次，如痛阈值超过60秒，即停止测试而按60秒计算(时间过久，易烫伤足部)。实验结束，按所测之痛阈平均值计算痛阈提高百分率，即：

痛阈提高百分率＝(用药后平均痛阈值-用药前平均痛阈值)/用药前平均值。

实验设计：选取健康雌性SPF级NIH小鼠，体重20±2g，随机分为3组，每组10只，空白对照、阳性对照和待测药品lt5d各一组。具体如下：

第一组：空白对照组10只小鼠每只均注射0.2ml PBS，pH7.4

第二组：阳性对照组10只小鼠10mg/kg给药注射药品母液浓度为1mg/ml吲哚美辛溶液

第三组：lt5d样品10只小鼠0.25mg/kg给药注射药品母液浓度为1mmol/L lt5d，lt5d能够有效抑制热刺激引起的小鼠舔足反应，在给药1h时达到镇痛作用的峰值，与同期空白对照小鼠的痛阈值相比，具有显著性差异，结果如图3b所示。

                     序列表

<110>中山大学

<120>中国南海信号芋螺神经毒素基因lt5.4及其应用

<160>3

<210>1

<211>189

<212>DNA

<213>中国南海信号芋螺(Conus litteratus)

<220>

<221>precursor peptide

<222>(1)…(189)

<400>1

atg cgc tgt ctc cca gtc ttc atc att ctt ctg ctg ctg att cca tct

Met Arg Cys Leu Pro Val Phe Ile Ile Leu Leu Leu Leu Ile Pro Ser

1               5                   10                  15

gca ccc agc gtt gat gcc caa ccg acg acc aaa gat gat gtg ccc ctg

Ala Pro Ser Val Asp Ala Gln Pro Thr Thr Lys Asp Asp Val Pro Leu

            20                  25                  30

gca tct cta cat gat aat gca aag cga gcc cta caa atg ttt tgg aac

Ala Ser Leu His Asp Asn Ala Lys Arg Ala Leu Gln Met Phe Try Asn

        35                  40                  45

aaa cgc gat tgc tgc cca gca aaa ctt tta tgc tgt aat cca tga

Lys Arg Asp Cys Cys Pro Ala Lys Leu Leu Cys Cys Asn Pro End

    50                  55                  60

<210>2

<211>63

<212>PRT

<213>中国南海信号芋螺(Conus litteratus)

<220>

<221>precursor peptide

<222>(1)…(62)

<400>2

Met Arg Cys Leu Pro Val Phe Ile Ile Leu Leu Leu Leu Ile Pro Ser

1               5                   10                  15

Ala Pro Ser Val Asp Ala Gln Pro Thr Thr Lys Asp Asp Val Pro Leu

            20                  25                  30

Ala Ser Leu His Asp Asn Ala Lys Arg Ala Leu Gln Met Phe Try Asn

        35                  40                  45

Lys Arg Asp Cys Cys Pro Ala Lys Leu Leu Cys Cys Asn Pro

    50                  55                  60

<210>3

<211>12

<212>PRT

<213>中国南海信号芋螺(Conus litteratus)

<400>3

Asp Cys Cys Pro Ala Lys Leu Leu Cys Cys Asn Pro

1               5                   10

Claims (7)

1、一种神经毒素多肽，其包括含有序列表<400>2所示的氨基酸序列的多肽、或者其保守性变异多肽、或其活性衍生物。

2、按照权利要求1所述的神经毒素多肽，其特征在于：该新的神经毒素多肽选自以下组之一：

(a)由序列表<400>2所示的氨基酸序列组成的多肽；

(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或舔加而形成的具有相同功能的由(a)衍生的多肽。

3、一种多核苷酸，该多核苷酸包含有选自以下组之一核苷酸序列：

(a)编码权利要求1的多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

4、按权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于：该核苷酸是编码序列表<400>2所示的氨基酸序列的多核苷酸。

5、权利要求2的所述的神经毒素多肽的成熟肽片段，其氨基酸序列如序列表400<3>所示。

6、权利要求4所述的神经毒素多肽的成熟肽片段用于制备神经生物学研究的工具药和镇痛药物的应用。

7、权利要求4所述的神经毒素多肽的成熟肽片段DCCPAKLLCCNP的C末端酰胺化修饰物用于制备神经生物学研究的工具药和镇痛药物的应用。

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