CN1632120A

CN1632120A - 海水养殖鲈鱼的hepcidin抗菌肽基因

Info

Publication number: CN1632120A
Application number: CNA2004100920132A
Authority: CN
Inventors: 王克坚; 周红玲; 杨明
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2004-11-03
Filing date: 2004-11-03
Publication date: 2005-06-29

Abstract

海水养殖鲈鱼的hepcidin抗菌肽基因，涉及从海水养殖鲈鱼中克隆的hepcidin抗菌肽基因。以攻毒鲈鱼肝脏总RNA为模板，参考杂交斑纹鲈鱼hepcidin和人hepcidin的基因序列，设计合成特异引物，利用RT－PCR、5`race和3`race等手段，属hepcidin基因家族新组员。具有抗真菌和革兰氏阳性、阴性菌的活性，是一种与铁代谢密切相关的铁调节激素，可与毕赤酵母等构建真核表达载体建立高效表达hepcidin的基因工程菌株，体外大量生产鲈鱼hepcidin抗菌肽，作为饲料免疫添加剂，减少乃至消除抗生素在水产品中的蓄积，提高水产品质量；作为某些耐药性抗生素的有效替代品，用于水产养殖业中耐药性细菌的防治药物及转基因鱼的育种研究。

Description

海水养殖鲈鱼的hepcidin抗菌肽基因

技术领域

本发明涉及一种从海水养殖鲈鱼(Lateolabrax japonicus)中克隆的hepcidin抗菌肽基因。

背景技术

海水养殖鲈鱼(英文名Japanese seabass，拉丁名Lateolabrax Japonica，俗称花鲈、七星鲈、鲈板)是重要的海水养殖经济鱼类。在我国近年鲈鱼的养殖地位不断上升，网箱和池塘养鲈已在全国沿海展开。但是随着养殖密度的增加，养殖水体富营养化现象越来越严重，致使养殖环境恶化，病毒病、细菌病、真菌病和寄生虫病等病害不断暴发，既造成巨大经济损失，又严重挫伤了人们的养殖积极性。

抗菌肽(Antibacterial Peptides，ABP)是一类具有很强的广谱抗细菌活性的天然小肽类物质，被认为是鱼、虾、贝等动物非特异性免疫防御系统的主要成分之一，当鱼体受到损伤或病原微生物侵袭时，能迅速产生抗菌肽以预防和杀伤病原微生物的入侵，其合成速度快，在体内扩散迅速、灵活的特点是其他大分子蛋白质(如抗体等)和免疫细胞所不具备的，在防御海水性细菌和病毒入侵方面起着重要作用。Hepcidin抗菌肽是近年来发现的另一类具有独特性质的抗菌肽，2000年Krause A等(Krause A，et al.，FEBS Lett.，2000，480(2-3)：147-150)从人的血液滤液分离到LEAP-1(liver-expressed antimicrobial peptide，肝脏表达的抗菌肽)、2001年Park等从人尿液中分离出一个富含半胱氨酸的肽，因为它来源于肝且有抗菌特性，所以首先命名为hepcidin(Park C H，et al.，Biol，Chem.，2001，276(11)：7806-7810)，继之从鼠(Mus musculus)分离到同家族的2个hepcidin前体肽(PigeonC，et al.，J.Biol.Chem，276：7811-7819；IlyinG，et al.，FEBS Lett.，2003，542：22-26)。Shiker等于2002年首次报道从杂交斑纹鲈鱼(Morone chrysops×M.saxatilis)分离到一个hepcidin成熟肽(Shike H，et al.，Eur.J.Biochem.，2002，269：2232-2237)，初步研究发现hepcidin抗菌肽与其它报道的抗菌肽一样，具有抗菌作用。研究证明，不同种属来源的hepcidin抗菌肽基因家族在成熟肽同一位点上含有典型特征的八个半胱氨酸残基的保守序列，有抗各种真菌和革兰氏阳性、阴性菌的活性。在鱼类，除已报道从杂交斑纹鲈鱼、斑马鱼(zebrafish)、美洲拟鲽(winter flounder)、鲑鱼(salmon)等分离出hepcidin成熟肽外(Shike H，et al.，Dvelopment and Comparatvive Immunology.，2004，28：747-745；Douglas S E，et al.，Dvelopment and Comparatvive Immunology.，2001，25：137-147；Douglas S E，et al.，Dvelopment and Comparatvive Immunology.，2003，27：587-601)，还报道从其他鱼类如日本比目鱼(Paralichthys olivaceus)、大西洋鲑(Salmo salar)和虾虎鱼(Gillichthys mirabilis)等的基因文库中通过表达序列标签(EST)分析发现具有hepcidin基因序列。

抗菌肽基本的抗菌机理是：抗菌肽分子破坏细菌的细胞膜结构，引起胞内水溶性物质大量渗出，导致细菌停止生长或死亡。其抗菌机理不同于传统抗生素，由于分子量小，极易扩散到感染部位，使用后不存在产生耐药性问题，且进入机体后无有害残留。因此，抗菌肽在海水养殖鱼类的疾病防治上将是一种应用前景广阔的抗菌药物；但通过鱼类直接提取或利用化学方法人工合成天然的抗菌肽，受动物来源和化学合成方法的局限，很难获得足够量的抗菌肽，且费用昂贵，因而分离克隆抗菌肽基因，利用基因工程方法体外大量生产抗菌肽，是获得高产量的抗菌肽并保证其在水产养殖业大面积推广应用的前提。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种从海水养殖鲈鱼(Lateolabrax japonicus)中克隆的hepcidin抗菌肽基因(Hepc)。该基因可与毕赤酵母等构建真核表达载体建立高效表达hepcidin的基因工程菌株，体外大量生产鲈鱼hepcidin抗菌肽，作为饲料免疫添加剂可替代传统饲料中的某些抗生素。

本发明所说的海水养殖鲈鱼hepcidin抗菌肽基因cDNA(Hepc)共有574nt(不包括poly(A))，其中含有5’端非编码区长102nt(5’UTR)，1个阅读框长258nt，3’非编码翻译区长214nt(3’UTR)。其GenBank系列号为AY604195。其序列如下：

序列表一：海水养殖鲈鱼(Lateolabrax japonicus)的hepcidin抗菌肽全长cDNA序列：

10 20 30 40 50 60

cgcggggaga caggagaaga gcagagaagc tgacaagagc caccaaaaga cctgaagaag

70 80 90 100 110 120

ttcagttgat ttaacaactt aaaccactca aaccctccta ag atgaagac attcagtgtt

130 140 150 160 170 180

gcagttgcag tggccgtcgt gctcaccttt atttgtattc aggagagctc tgctgtcccg

190 200 210 220 230 240

gtcactgaag tgcaagagct ggaggagcca atgagcaacg acaatccagt tgctgcacat

250 260 270 280 290 300

gaggagacat cagtggactc atggaagatg ccgtataaca gcagacacaa gcgtgccatt

310 320 330 340 350 360

aagtgcaaat tttgctgcgg ctgctgcacc cccggtgtct gtggagtgtg ctgcagattc

370 380 390 400 410 420

ggattcc tgcaacaaca acaacaacaa ccattaaata tattatttgt tttaaagcaa

430 440 450 460 470 480

attaaacact ttgaattgta ttcatggttg tacacattta aagatctggt cacgctgtag

490 500 510 520 530 540

gtaatgtgtg ctcagtgatg tatcatccac atgttatgat aagtatctgc aaatactgca

550 560 570 580 588

atgattgtta caataaactt caatgttact actgaaaaaa aaaaaaaa

序列表二：海水养殖鲈鱼的hepcidin抗菌肽cDNA预测编码蛋白氨基酸序列：

10 20 30 40 50 60

MKTFSVAVAV AVVLTFICIQ ESS AVPVTEV QELEEPMSND NPVAAHEETS VDSWKMPYNS

70 80 86

RHKRAIKCKF CCGCCTPGVC GVCCRF*

序列表三：海水养殖鲈鱼的hepcidin抗菌cDNA读码框及预测蛋白氨基酸序列：

1 CGC GGG GAG ACA GGA GAA GAG CAG AGA AGC TGA CAA GAG CCA CCA AAA GAC CTG AAG AAG 60

61 TTC AGT TGA TTT AAC AAC TTA AAC CAC TCA AAC CCT CCT AAG ATG AAG ACA TTC AGT GTT 120

-24 Met Lys Thr Phe Ser Val

-19

121 GCA GTT GCA GTG GCC GTC GTG CTC ACC TTT ATT TGT ATT CAG GAG AGC TCT GCT GTC CCG 180

-18 Ala Val Ala Val Ala Val Val Leu Thr Phe Ile Cys Ile Gln Glu Ser Ser Ala Val Pro 2

-1 +1

181 GTC ACT GAA GTG CAA GAG CTG GAG GAG CCA ATG AGC AAC GAC AAT CCA GTT GCT GCA CAT 240

3 Val Thr Glu Val Gln Glu Leu Glu Glu Pro Met Ser Asn Asp Asn Pro Val Ala Ala His 22

241 GAG GAG ACA TCA GTG GAC TCA TGG AAG ATG CCG TAT AAC AGC AGA CAC AAG CGT GCC ATT 300

23 Glu Glu Thr Ser Val Asp Ser Trp Lys Met Pro Tyr Asn Ser Arg His Lys Arg Ala Ile 42

301 AAG TGC AAA TTT TGC TGC GGC TGC TGC ACC CCC GGT GTC TGT GGA GTG TGC TGC AGA TTC 360

43 Lys Cys Lys Phe Cys Cys Gly Cys Cys Thr Pro Gly Val Cys Gly Val Cys Cys Arg Phe 62

361

GGA TTC CTG CAA CAA CAA CAA CAA CAA CCA TTA AAT ATA TTA TTT GTT TTA AAG CAA 420

63*** 63

421 ATT AAA CAC TTT GAA TTG TAT TCA TGG TTG TAC ACA TTT AAA GAT CTG GTC ACG CTG TAG 480

481 GTA ATG TGT GCT CAG TGA TGT ATC ATC CAC ATG TTA TGA TAA GTA TCT GCA AAT ACT GCA 540

541 ATG ATT GTT AC A ATA AAC TTC AAT GTT ACT ACT GAA AAA AAA AAA AAA 588

海水养殖鲈鱼hepcidin cDNA基因克隆过程如下：

1)参考杂交斑纹鲈鱼hepcidin和人hepcidin的基因序列(Shike H，et al.，Eur.J.Biochem.，2002，269：2232-2237；Park C H，et al.，Biol，Chem.，2001，276(11)：7806-7810)，通过优化选择设计合成特异引物：S1(上游引物：起始密码子ATG前段序列24个bp(含ATG)+2个修饰碱基CG)：CGA AGC AGT CAA ACC CTC CTA AGA TG，A1(下游引物：终止密码子TGA前段序列25个bp)：GAA CCT GCA GCA GAC ACC ACA TCC G，以细菌感染后海水养殖鲈鱼肝脏总RNA为模板进行RT-PCR扩增，得到约300bp特异扩增cDNA条带，经测序得到287bp的基因片段hepc；在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)通过Blast分析证实得到的287bp基因hepc可连续编码，与杂交斑纹鲈鱼的抗菌肽hepcidin同源性为90％，并且该基因推导的氨基酸序列C末端也富含hepcidin基因家族特有的八个半胱氨酸的保守序列。

2)根据获得的hepc片段设计合成特异引物GSP2(密码子ATG下游105bp-82bp)作为下游引物：TGG CTC CTC CAG CTC TTG CAC CTC，利用5′-CDS引物(Clontech.)：5′-(T₂₅)N_-1 N-3′，N＝A、C、G或T；N_-1＝A、G或C和SMART IIA oligo(SMART RACE cDNA AmplificationKit，Clontech.)：(5′)AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CGC GGG做为上游引物，以细菌感染后鲈鱼肝脏总RNA为模板，进行5｀race。

3)为进一步获得5’race产物的量，利用UPM(Clontech).：(5′)CTA ATA CGA CTC ACTATA GGG CAA CGC AGA GT、NUPM(Clontech)：(5′)AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT和GSP2进行嵌套PCR扩增得到大约200bp从cDNA条带，测序得210bp hepc5端cDNA片段。

4)利用引物S1和Oligo dT-3sites Adaptor Primer(3’-Full RACE Core Set，TaKaRaBio)，以细菌感染后鲈鱼肝脏总RNA为模板，进行3｀race及PCR扩增出500bp左右的cDNA条带，测序得509bp hepc 3｀端cDNA片段。经5’race和3’race的测序结果拼接得全长鲈鱼Hepcidin cDNA。

本发明以攻毒鲈鱼肝脏总RNA为模板，参考杂交斑纹鲈鱼hepcidin和人hepcidin的基因序列，通过优化选择设计的特异性引物，利用RT-PCR、5｀race和3｀race等分子生物学技术手段，成功地克隆到海水养殖鲈鱼hepcidin cDNA全长序列，该基因属于hepcidin基因家族的新组员。该基因序列其前体序列与Shike H等发表的杂交斑纹鲈鱼的hepcidin基因序列同源性为90％，且推导的氨基酸序列在C末端成熟肽同一位置上都富含八个半胱氨酸的保守序列，两者预测的氨基酸序列信号肽切点、结构域切点都一致，分别在“SSA”、“RHKR”序列处。但从推导的氨基酸序列(如下：Hepc为海水养殖鲈，Bass为杂交斑纹鲈鱼)

Hepc：MKTFSVAVAVAVVLTFICIQESSAVPVTEVQELEEPMSNDNPVAAHEETSVDSWKMPYNS 60

Bass：MKTFSVAVAVAVVLAFICLQESSAVPVTEVQELEEPMSNEYQEMPVE--------SWKMPYNN

Hepc：61 RHKRA-IK--CKFCCGCCTPGV-CGVCCRF 86

Bass：61 RHKRHSSPGGCRFCCNCCPNMSGCGVCCRF 85

与国外报道的杂交斑纹鲈鱼氨基酸序列比较发现，本发明克隆的鲈鱼前体蛋白序列含有86个氨基酸，杂交斑纹鲈鱼85个氨基酸，两者氨基酸差异主要表现在成熟肽序列，共有13个氨基酸差异；与其它种类的抗菌肽相比，Hepc序列区别于以前发现的所有其他种类抗菌肽，具有独特的结构，该抗菌肽不仅具有抗真菌和革兰氏阳性、阴性菌的活性，而且还是一种与铁代谢密切相关的重要的铁调节激素，可与毕赤酵母等构建真核表达载体建立高效表达hepcidin的基因工程菌株，体外大量生产鲈鱼hepcidin抗菌肽，作为饲料免疫添加剂可替代传统饲料中的某些抗生素，用于海水养殖业，实现绿色养殖，减少乃至消除抗生素在水产品中的蓄积，提高水产品质量；也可以作为某些耐药性抗生素的有效替代品，用于水产养殖业中耐药性细菌的防治药物。另外，该基因还可以用于转基因鱼的育种研究。

附图说明

图1为提取攻毒鲈鱼的肝总RNA电泳图。

图2为RT-PCR电泳图。

图3为5｀race电泳图。

图4为3｀race电泳图。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明：

1.攻毒鲈鱼肝RNA的提取

称取100mg海水养殖鲈鱼肝组织，用液氮研磨成粉末状，加到含有1mL Trizol的一无核酸酶离心管中。2～8℃下12000g离心10min，吸出粉红色上清，室温下温育5min，彻底去除核蛋白复合物，然后加200μL氯仿，盖紧盖子。剧烈振荡15sec，室温下温育2～3min，2～8℃下12000g离心15min。取上清至另一无核酸酶离心管，再加500μL异丙醇，轻轻混匀以沉淀RNA。室温温育10min，2～8℃下12000g离心10min，离心管底部可见一胶样沉淀即为RNA。弃上清，用1mL 75％乙醇洗涤RNA沉淀，2～8℃下7500g离心5min。凉干RNA沉淀，并用100μL无核酸酶水溶解。测OD_260nm/OD_280nm和OD_260nm/OD_230nm，于1％琼脂糖凝胶电泳上分析(见图1)。

2.RT-PCR扩增目的片段hepc

2.1反转录反应

参考杂交斑纹鲈鱼hepcidin和人hepcidin的基因序列(Shike H，et al.，Eur.J.Biochem.，2002，269：2232-2237；Park C H，et al.，Biol，Chem.，2001，276(11)：7806-7810)，通过优化选择设计合成特异引物：S1(上游引物：起始密码子ATG前段序列24个bp(含ATG)+2个修饰碱基CG)：CGA AGC AGT CAA ACC CTC CTA AGA TG，A1(下游引物：终止密码子TGA前段序列25个bp)：GAA CCT GCA GCA GAC ACC ACA TCC G。取11μL总RNA加入0.2mL的离心管中，70℃变性10min，立即置于冰上。在上管中加入5×AMV buffer4.0μL、dNTPs(10mM)2.0μL、RNasin(40U/μL)0.5μL、A1(10μM)1.5μL、AMV反转录酶(10U/μL)1.0μL，总体积20μL，42℃延伸60min；95℃，5min灭活AMV反转录酶，置于冰上。

2.2 PCR反应

分别加入10×Mg²⁺free buffer10.0μL、MgCl₂(25mM)8.0μL、dNTPs(10mM)1.0μL、A1(10μM)2.0μL、S1(10μM)2.0μL、cDNA4.0μL、Taq DNA聚合酶(1.0U/μL)0.5μL，用无核酸酶水补齐至总体积100μL。94℃预变性2min；94℃变性40sec，60℃复性45sec，72℃延伸60sec，30个循环；72℃延伸5min进行扩增。得到约300bp特异扩增cDNA条带(见图2)，经测序得到287bp的基因片段hepc；在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)通过Blast分析证实得到的287bp基因hepc可连续编码，与杂交斑纹鲈鱼的抗菌肽hepcidin同源性为90％，并且该基因推导的氨基酸序列C末端也富含hepcidin基因家族特有的八个半胱氨酸的保守序列；为获得该基因全长cDNA序列，进行3’、5’race。

3.5′RACE

3.1反转录反应

根据获得的hepc片段设计合成特异引物GSP2(密码子ATG下游105bp-82bp)作为下游引物：TGG CTC CTC CAG CTC TTG CAC CTC，利用5′-CDS引物((Clontech.))：5′-(T₂₅)N_-1N-3′，N＝A、C、G或T；N_-1＝A、G或C和SMARTIIA oligo(SMART RACE cDNAAmplification Kit，Clontech.)：(5′)AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CGC GGG做为上游引物。取3.0μL总RNA，1.0μL5′-CDS引物和1.0μL SMART IIA oligo加入0.2mL的离心管中，70℃，10min，立即置于冰上，再加入5×First-Strand Buffer2.0μL、DTT(20mM)1.0μL、dNTP(10mM)1.0μL、PowerScript Reverse Transcriptase1.0μL至总体积10μL，42℃延伸90min；72℃温育7min灭活酶；5℃，5min。

3.2 PCR反应

加入10×Advantage PCR5.0μL、dNTP(10mM)1.0μL、50×Advantage Polymerasemix1.0μL、cDNA5.0μL、UPM(2.0μM)1.0μL、A1(10μM)1.0μL，用无核酸酶水补齐至50μL。94℃预变性2min；94℃变性30sec，67℃退火30sec，72℃延伸2min，25个循环；72℃延伸5min。

3.3嵌套PCR

利用UPM(Clontech.)：(5′)CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CAA CGC AGA GT、NUPM(Clontech.)：(5′)AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT和GSP2进行嵌套PCR。取上步反应产物5.0μL，加入10×Advantage PCR5.0μL、dNTP(10mM)1.0μL、50×Advantage Polymerasemix1.0μL、NUMP(2.0μM)5.0μL、GSP2(10μM)1.0μL，用无核酸酶水补齐至50μL。94℃预变性2min；94℃变性30sec，68℃复性30sec，72℃延伸2min，25个循环；72℃延伸5min。扩增得到大约200bp cDNA条带，测序得210bp hepc5`端cDNA片段(见图3)。

4.3′-RACE

4.1反转录反应

取9.0μL总RNA加入0.2mL的离心管中，70℃温育10min，立即置于冰上。在上管中加入10×RNA PCR Buffer2.0μL、MgCl₂(25mM)4.0μL、dNTPs(10mM)2.0μL、RNasin(40U/μL)0.5μL、Oligo dT-3sites Adaptor Primer(2.5μM)1.5μL、AMV反转录酶(10U/μL)1.0μL，总体积：20μL。30℃退火10min；42℃延伸50min；95℃，5min灭活酶；5℃，5min。

4.2 PCR反应

取上步反应产物4.0μL分别加入10×Mg²⁺free buffer10.0μL、MgCl₂(25mM)8.0μL、dNTPs(10mM)1.0μL、3sites Adaptor Primer(20μM)1.0μL、S1(CGA AGC AGT CAA ACCCTC CTA AGA TG)、Taq DNA聚合酶(1.0U/μL)0.5μL，用无核酸酶的水补齐至100μL。94℃预变性2min；94℃变性30sec，60℃复性30sec，72℃延伸2min，25个循环；72℃延伸5min。扩增得到500bp左右的cDNA条带(见图4)。

5.序列分析与基因确定

扩增获得的cDNA产物由上海博亚生物技术有限公司进行DNA核苷酸序列测定。序列同源性比对和相似性搜索用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)BLAST在线软件进行；多序列比较用DNAssist2.0软件；以BLAST2软件辅助进行序列拼接；信号肽预测用SIGNALP在线查找( http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)。

Claims

1.海水养殖鲈鱼的hepcidin抗菌肽基因，其特征在于所说的海水养殖鲈鱼hepcidin抗菌肽基因cDNA(Hepc)共有574nt(不包括poly(A))，其中含有5’端非编码区长102nt(5’UTR)，1个阅读框长258nt，3’非编码翻译区长214nt(3’UTR)，其GenBank系列号为AY604195，全长cDNA序列如下：

10 20 30 40 50 60

cgcggggaga caggagaaga gcagagaagc tgacaagagc caccaaaaga cctgaagaag

70 80 90 100 110 120

ttcagttgat ttaacaactt aaaccactca aaccctccta ag atgaagac attcagtgtt

130 140 150 160 170 180

gcagttgcag tggccgtcgt gctcaccttt atttgtattc aggagagctc tgctgtcccg

190 200 210 220 230 240

gtcactgaag tgcaagagct ggaggagcca atgagcaacg acaatccagt tgctgcacat

250 260 270 280 290 300

gaggagacat cagtggactc atggaagatg ccgtataaca gcagacacaa gcgtgccatt

310 320 330 340 350 360

aagtgcaaat tttgctgcgg ctgctgcacc cccggtgtct gtggagtgtg ctgcagattc

370 380 390 400 410 420

ggattcc tgcaacaaca acaacaacaa ccattaaata tattatttgt tttaaagcaa

430 440 450 460 470 480

attaaacact ttgaattgta ttcatggttg tacacattta aagatctggt cacgctgtag

490 500 510 520 530 540

gtaatgtgtg ctcagtgatg tatcatccac atgttatgat aagtatctgc aaatactgca

550 560 570 580 588

atgattgtta caataaactt caatgttact actgaaaaaa aaaaaaaa

2.如权利要求1所述的海水养殖鲈鱼的hepcidin抗菌肽基因，其特征在于所说的海水养殖鲈鱼的hepcidin抗菌肽cDNA预测编码蛋白氨基酸序列如下：

10 20 30 40 50 60

MKTFSVAVAV AVVLTFICIQ ESS AVPVTEV QELEEPMSND NPVAAHEETS VDSWKMPYNS

70 80 86

RHKRAIKCKF CCGCCTPGVC GVCCRF*

3.如权利要求1所述的海水养殖鲈鱼的hepcidin抗菌肽基因，其特征在于所说的海水养殖鲈鱼的hepcidin抗菌cDNA读码框及预测蛋白氨基酸序列如下：

-24 Met Lys Thr Phe Ser Val-19

-1 +1

361 GGA TTC CTG CAA CAA CAA CAA CAA CAA CCA TTA AAT ATA TTA TTT GTT TTA AAG CAA 420

63*** 63

541 ATG ATT GTT AC A ATA AAC TTC AAT GTT ACT ACT GAA AAA AAA AAA AAA 588

4.如权利要求1所述的海水养殖鲈鱼的hepcidin抗菌肽基因，其特征在于所说的特异引物Sl为起始密码子ATG前段序列24个bp(含ATG)+2个保护碱基CG。引物S1为起始密码子ATG前段序列24个bp(含ATG)+2个保护碱基CG。

5.如权利要求1所述的海水养殖鲈鱼的hepcidin抗菌肽基因，其特征在于所说的特异引物A1为终止密码子TGA前段序列25个bp。

6.如权利要求1所述的海水养殖鲈鱼的hepcidin抗菌肽基因，其特征在于所说的特异引物GSP2为起始密码子ATG下游105bp-82bp。

7、海水养殖鲈鱼的hepcidin抗菌肽基因的克隆方法，其特征在于其步骤为：

1)通过优化选择设计合成特异引物：S1(上游引物)：CGA AGC AGT CAA ACC CTC CTA AGATG，A1(下游引物)：GAA CCT GCA GCA GAC ACC ACA TCC G，以细菌感染后海水养殖鲈鱼肝脏总RNA为模板进行RT-PCR扩增，得到287bp可连续编码的特异扩增DNA条带hepc；

2)根据获得的hepc片段设计合成特异引物GSP2作为下游引物：TGG CTC CTC CAG CTCTTG CAC CTC，利用5′-CDS引物(Clontech.)：5′-(T₂₅)N_-1N-3′，N＝A、C、G或T；N_-1＝A、G或C和SMART II A oligo(SMART RACE cDNA Amplification Kit，Clontech.)：(5′)AAG CAGTGG TAT CAA CGC AGA GTA CGC GGG做为上游引物，以细菌感染后鲈鱼肝脏总RNA为模板，进行5`race；

3)利用UPM(Clontech).：(5′)CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CAA CGC AGA GT、NUPM(Clontech)：(5′)AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT和GSP2进行嵌套PCR扩增得到210bp hepc5`端cDNA片段；

4)利用引物S1和0ligo dT-3sites Adaptor Primer(3’-Full RACE Core Set，TaKaRaBio)，以细菌感染后鲈鱼肝脏总RNA为模板，进行3`race及PCR扩增出509bp hepc 3`端cDNA片段，经5’race和3’race的测序结果拼接得全长鲈鱼Hepcidin cDNA。