CN1641025A - 真鲷抗菌肽基因和重组酵母表达载体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种真鲷抗菌肽基因和重组酵母表达载体及其制备方法，通过文库筛选和EST序列分析，克隆出真鲷抗菌肽(hepcidin)基因，将该基因重组到酵母表达载体pPICZαA，构建成抗菌肽基因表达质粒pPICZ－rsbHEPC1，转化毕赤酵母后，获得了稳定表达真鲷抗菌肽的酵母菌株。细菌生长抑制实验表明重组抗菌肽对大肠杆菌，绿脓杆菌和嗜水气单胞菌等4种细菌均具有剂量依存的抑制活性。本发明首次构建了鱼类抗菌肽(hepcidin)基因酵母表达质粒并研制了重组抗菌肽表达产物，该表达质粒在酵母体内表达稳定，重组抗菌肽分子量小，抑菌活性明显，适宜用作鱼类等水产动物的饲料添加剂。本发明适用于各种鱼类抗菌肽基因克隆和表达载体的构建，生产的基因工程鱼类抗菌肽可作为饲料添加剂，用于鱼类等水产动物的疾病防治。

Description

真鲷抗菌肽基因和重组酵母表达载体及其制备方法

技术领域：

本发明属于生物技术领域中的鱼类基因工程范畴，是一种能在鱼类病害防治中应用的鱼类抗菌肽基因与酵母重组表达载体及其制备方法。

背景技术：

鱼类是特异性免疫和非特异性免疫并存的脊椎动物。但与哺乳类相比，鱼类的特异免疫系统尚不够发达，特异性免疫机制还不完善。因此，在鱼类对外界刺激及病原生物侵袭的防御反应中，非特异性免疫起着重要作用。现已知参与鱼类非特异性免疫反应的因子主要包括巨噬细胞、粒细胞和细胞毒性细胞等一些具有吞噬作用的细胞，以及介导一系列免疫或应激反应的蛋白分子，如补体、细胞因子、趋化因子及溶菌酶和抗菌肽等。

抗菌肽是一类可以抵抗多种病原菌感染的非特异性免疫因子。过去几年，抗菌肽在植物和小鼠上研究较多，并得到成功应用。研究表明，抗菌肽基因转移明显提高了植物(Liu et al.，1994)和小鼠的抗病能力(Reedet al.，1997)；相类似，抗菌肽在鱼、虾抵抗病原感染过程中也起着重要作用。美国和法国科学家在虹鳟、泥鳅和对虾抗菌肽分离纯化上做了一些工作(Park et al.，1997；Destoumieux et al.，1997)。

鱼类的肝脏、皮肤、腮、头肾、肠和皮肤分泌物里含有大量的抗菌肽物质存在。已经得到多种具有抗菌活性蛋白。目前已分离到的鱼类类组蛋白抗菌肽类似物主要rainbow trout的oncorhyncinI、II(MezquitaJ，1984；Fernandes JMO，2004)，brown trout的H1(Macleod AR，1977)，coho salmon的HDSF(Patrzykat A，2001)，Atlantic salmon的H1(Richards RC，2001)，Atlantic halibut的Hipposin(BirkemoGA，2003)，Parasilurus asotus的ParasinI(Park IY，1998)等。除此以外，国内外已经分离到的其他鱼天然抗菌肽蛋白有：Misgurnin(Park，CB.，1997)、Plerocidin(Patrzykat A.，2003)、Moronecidin(Lauth，X.，2002)、Hepcidin(Shike，H.，2002；Douglas，SE.，2003)以及HFS-1(Hwang，EY.，1999)等。已克隆的鱼类抗菌肽基因比较少，多数通过电子克隆的方法通过数据库检索得到的。

鱼类抗菌肽基因工程开展的比较晚。Kelly等(1990，1992)发现化学合成的抗菌肽cecropinB的类似物LSB-37和Shiva-1对多种鱼类的革兰氏阴性菌都有作用。并且在channel catfish上的实验发现LSB-37以提高其抗Edwardsiella ictaluri侵染的的能力。转抗菌肽cecropinB的channel catfish亲代和子代抗E.ictaluri和Flavobacteriumcolumnare的能力明显提高，而且子代和亲代不存在明显差异(DunhamRA.，2002)。抗菌肽B和P1被转入鲑鱼胚胎CHSE-214细胞系后，用RT-PCR和southern杂交都可以检测到转基因的存在，同时表达分离的产物具有很强的抗菌活性(Sarmasik A.and Chen T.T.，2003)。1996年，Oren等从豹鳎体上分离到一种33个氨基酸残基的抗菌肽并命名为Paradaxin，研究发现它具有比蜂毒素更强的抗菌活性和更低的人红血球溶血活性。Park等从泥鳅体上分离到一个21氨基酸的抗菌肽misgurin，具有较强的体外广谱抗菌活性且没有明显的溶血作用。但有关鱼类抗菌肽基因重组表达载体构建及其在酵母中的表达研究，迄今国际上均未见报道。

发明内容：

本发明的目的是为了构建基因重组鱼类抗菌肽(Hepcidin)表达载体，建立将基因重组抗菌肽作为鱼类饲料添加剂的技术，为鱼类抗病机理研究和病害防治提供基因材料和技术方法。

本发明其技术内容如下：一、真鲷抗菌肽(hepcidin)基因的克隆；二、重组真鲷抗菌肽基因酵母表达载体的构建；三、重组抗菌肽的发酵生产。

一、真鲷抗菌肽(hepcidin)基因的克隆：

主要包括cDNA文库构建、EST序列测定和DNA序列分析与比对。

1、cDNA文库构建：TRIzol试剂盒从真鲷脾脏中提取总RNA，用Oligotex^TM离心柱试剂盒分离Poly-(A)RNA，用pBluescript II XR cDNA文库试剂盒构建cDNA文库。

2、EST序列测定：用快速微量制备方法制备质粒DNA，质粒制备在96孔板上完成；用T3定序试剂盒测定cDNA片段的序列，用T3和T7引物从cDNA片段的两端分别进行测序，从而获得全长序列。

该基因的cDNA全长为596个碱基，包括255个碱基的开放阅读框，该阅读框编码85个氨基酸的前体，该前体又由3个区组成，24个氨基酸组成的信号肽，39个氨基酸组成的前区和22个氨基酸组成的成熟肽，该成熟肽包括8个半光胺酸残基。

3、DNA序列分析与比对：在测定EST序列后，用Cross-Match软件掩盖载体序列，然后将从cDNA文库中获得的序列与美国GENBANK序列数据库中已存的DNA序列进行比对，用PHRAP聚类程序鉴定共同序列和单一序列；用BLASTN和BLASTX程序计算我们获得的cDNA克隆片段与GENBANK序列数据库中已存的DNA序列的同源性。

二、重组真鲷抗菌肽酵母表达载体的构建：

根据测定出的真鲷抗菌肽成熟肽基因的序列，设计含有适当酶切位点的特异引物，从脾脏提取的cDNA中扩增抗菌肽成熟肽序列，经酶切后连接到用同样的酶消化的酵母表达载体pPICZαA，构建成真鲷抗菌肽基因酵母表达质粒。

三、重组抗菌肽的发酵生产

1、表达载体向酵母细胞的转化：将大量制备的真鲷抗菌肽基因酵母表达载体用SacI酶切，使其线性化，制备新鲜的感受态酵母细胞，通过电穿孔方法将线性化的抗菌肽基因酵母表达质粒转化到巴氏毕赤酵母X-33细胞内，800μl转化后的酵母细胞涂布在YPDS平板上。

2、含外源抗菌肽基因的重组酵母的筛选：通过在不同培养基MD和删平板上的选择性培养筛选甲醇利用正表型的菌株和甲醇利用慢表型的酵母菌株；设计特异的引物，通过PCR方法鉴定整合了外源抗菌肽基因的酵母菌落。

3、重组抗菌肽表达的诱导：首先对筛选出的阳性菌落进行增殖培养，挑取阳性单菌落，接种于BMGY培养基中进行扩大培养。采用甲醇诱导法诱导酵母表达抗菌肽，即将稀释后的酵母培养液放于250ml的培养瓶中，用灭好菌的四层棉花塞塞住瓶口，28-30℃诱导培养5天。每天补加甲醇，补加甲醇的量根据所诱导的培养基的体积具体计算，但必须使甲醇终浓度维持在0.5-1％之间。

4、重组抗菌肽抑菌活性的测定：通过诱导培养后，将含真鲷抗菌肽基因的重组酵母培养液添加到不同细菌培养物中，测定重组抗菌肽的抑菌活性，表明重组抗菌肽对大肠杆菌(E.coli DH5a和E.coliATCC25922)，绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophia)均具有剂量依存的抑制活性。

本发明与已有技术对比其特点是：本发明以真鲷为材料首次构建了鱼类抗菌肽(hepcidin)基因酵母表达载体并研制了重组抗菌肽表达产物，该表达载体在酵母体内表达稳定，重组抗菌肽分子量小，抑菌活性明显，适宜用作鱼类等水产动物的饲料添加剂，用于鱼类等水产动物的疾病防治.本发明的技术方法可在其它鱼类上进行应用。

附图说明：

图1：真鲷Hepeidin基因cDNA和推导的氨基酸序列；

图2：真鲷抗菌肽Hepeidin基因表达载体；

图3：真鲷重组抗菌肽抑菌活性：

A：用大肠杆菌DH5a作为受试菌；

B：用大肠杆菌ATCC25922作为受试菌；

c：用绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa作为受试菌；

D：用嗜水气单胞菌Aeromonas hydromonas作为受试菌。

实施方式：

下面以真鲷抗菌肽hepcidin基因的克隆和表达载体构建为例，结合附图，对本发明的实施方式进行详细说明。

1、cDNA文库构建：cDNA文库于2002年4月-7月在黄海水产研究所构建。用TRIzol试剂盒从真鲷脾脏中提取总RNA，用Oligotex^TM离心柱试剂盒分离Poly-(A)RNA，用pBluescript II XR cDNA文库试剂盒构建cDNA文库，该文库含有1.5×10⁶克隆。

2、EST序列分析与真鲷抗菌肽基因序列：用快速微量制备方法制备质粒DNA，质粒制备在96孔板上完成；用T3定序试剂盒测定cDNA片段的序列，用T3和T7引物从cDNA片段的两端分别进行测序，从而获得全长序列。从真鲷脾脏cDNA文库中随机挑取2000个EST进行序列分析，经过与美国GENBANK序列数据库中已存的DNA序列进行比对，发现那2000个EST中有17EST克隆与其他鱼类和哺乳类抗菌肽Hepcidin具有高度同源性，属于抗菌肽Hepcidin基因。该基因全长为1216个碱基，由3个外显子和2个内含子组成。该基因的cDNA全长为596个碱基，包括255个碱基的开放阅读框，该阅读框编码85个氨基酸的前体，该前体又由3个区组成，24个氨基酸组成的信号肽，39个氨基酸组成的前区和22个氨基酸组成的成熟肽，该成熟肽包括8个半光胺酸残基(附图1、序列表)

3、表达载体的构建：根据测定出的真鲷抗菌肽成熟肽基因的序列，设计含有适当酶切位点的特异引物，从真鲷脾脏提取的cDNA中扩增抗菌肽成熟肽序列，经酶切后连接到用同样的酶消化的酵母表达载体pPICZαA，构建成鱼类抗菌肽基因酵母表达质粒。根据真鲷抗菌肽hepcidin成熟肽基因序列，设计特异引物Hepc N(5’-ATC  CTC GAG  AAA AGA CGC TGTCGC TTT TGC TGT-3’，Xho I+Kex蛋白酶切位点+18碱基)和Hepc C(5’-ATC  TCT AGA TCA ACG CCT CTG GCA GCA-3’，Xba I+18碱基)，用常规PCR方法进行扩增，对扩增的PCR产物进行回收，经过适当的酶切后，与用同样的酶消化的pPICZαA载体进行连接，产生真鲷抗菌肽基因表达载体pPICZ-rsbHEPC1(附图2)。

4、表达载体向酵母细胞的转化：将大量制备的真鲷抗菌肽Hepcidin基因酵母表达载体pPICZ-rsbHEPC1用Sac I酶切，使其线性化，通过电穿孔方法将线性化的抗菌肽基因酵母表达质粒转化到巴氏毕赤酵母X-33胞内，简言之，80μl新鲜制备的感受态酵母细胞，与5-10μg线性化的质粒混匀，放入电转杯。冰浴5min后，在1500V，200Ω，25μF条件下，电击4-5ms；加入1ml冰冷的1M Sortitol，轻轻混匀后，放入15ml的离心管中。30℃培养1-2h；然后800μl涂布在含100μg/mlZeocin抗生素的YPDS平板上，30℃培养1-2天。

5、含真鲷抗菌肽基因的重组酵母的筛选和确认：通过在不同培养基MD和删平板上的选择性培养筛选甲醇利用正表型的菌株和甲醇利用慢表型的酵母菌株；通过使用特异的引物进行PCR，进一步证实所筛选出来的、整合了外源抗菌肽基因的酵母菌落。所用PCR引物为5’AOX(5-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3)和3’AOX(5-GCAAATGGCATTCTGACA TCC-3)。

6、重组抗菌肽表达的诱导：首先对筛选出的阳性菌落进行增殖培养，挑取阳性单菌落，接种于BMGY培养基中进行扩大培养。采用甲醇诱导法诱导酵母表达抗菌肽，即将稀释后的酵母培养液放于250ml的培养瓶中，用灭好菌的四层棉花塞塞住瓶口，28-30℃诱导培养5天。每天补加甲醇，补加甲醇的量根据所诱导的培养基的体积具体计算，但必须使甲醇终浓度维持在0.5-1％之间。每24小时取样。整个操作过程保持无菌操作。诱导培养结束后，将培养液以最大速度离心5-10min。将上清以及离心后的菌液放于-80℃备用。取适量的菌体，加入含蜗牛酶(30mg/ml)的SCE消化溶液(ph7.0)(0.9M山梨醇，0.1M柠檬酸钠，0.06M EDTA，PH8.0)，37℃消化3小时。离心取上清进行蛋白质电泳分析。首先经过小规模的诱导培养，从所获得的6个pPICZαA-rsbHEPC阳性转化子中得到了1个可以表达hepcidin的菌株。

7、重组抗菌肽抑菌活性的测定：通过诱导培养后，将含真鲷抗菌肽基因的重组酵母菌株和阴性对照菌株分别进行大规模的培养，然后将各组的培养上清分别超滤浓缩10倍，然后将不同量的浓缩液(0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 or 2.0ml)添加到10ml不同细菌培养物中，受试细菌分别为大肠杆菌E.coli DH5a和E.coli ATCC25922，绿脓杆菌Pseudomonasaeruginos和嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophia。在37℃培养10小时后，测定细菌培养物的OD值，计数细菌的数量，结果表明重组真鲷抗菌肽对上述四种细菌的生长均具有剂量依存的抑制活性(附图3)。

                         序列表

<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120>真鲷抗菌肽基因和重组酵母表达载体及其制备方法

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>596

<212>DNA

<213>真鲷(Chrysophrys major)

<220>

<221>CDS

<222>(72)..(329)

<223>

<400>1

gaaaggagct gacgagagtc accaaaagaa tcaaaggact gaacaagtta aagcagtcaa    60

agcctcctaa g atg aag aca ttc agt gtt gca gtt gca gtg gcc gtc gtg    110

             Met Lys Thr Phe Ser Val Ala Val Ala Val Ala Val Val

             1               5                   10

ctc acc ttt att tgc ctt cag gag agc tct gct gcc tca ttc act gag     158

Leu Thr Phe Ile Cys Leu Gln Glu Ser Ser Ala Ala Ser Phe Thr Glu

    15                  20                  25

gtg caa gag ctg gag gag cca atg agc aat ggc agc cca gtt gct gca     206

Val Gln Glu Leu Glu Glu Pro Met Ser Asn Gly Ser Pro Val Ala Ala

30                  35                  40                  45

gat gaa gag atg tca gag gag tcc tgg aag atg ccg tat gcc agc aga     254

Asp Glu Glu Met Ser Glu Glu Ser Trp Lys Met Pro Tyr Ala Ser Arg

                50                  55                  60

cgc tgg cgc tgt cgc ttt tgc tgt cgt tgc tgt cct cgc atg aga gga     302

Arg Trp Arg Cys Arg Phe Cys Cys Arg Cys Cys Pro Arg Met Arg Gly

            65                  70                  75

tgt ggt ctc tgc tgc cag agg cgt tga ggattcctgc tgcagcctgg            349

Cys Gly Leu Cys Cys Gln Arg Arg

        80                  85

gatttacaca acgaccacta aatattttat tttaagattt ttactttaaa agcaaatctt    409

tccaaatttc aatagtggtt gtaaatatct gaggatgttt ctggatttgg tcatgctgca    469

gagaatgtgt gctaactgat gtatcatcct gatattttgt taaaaatctc atgtgtgatc    529

aataaagttg cttgtttcta taatatataa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaacaaaaa    589

aaaaaaa                                                              596

<210>2

<211>85

<212>PRT

<213>真鲷(Chrysophrys major)

<400>2

Met Lys Thr Phe Ser Val Ala Val Ala Val Ala Val Val Leu Thr Phe

1               5                   10                  15

Ile Cys Leu Gln Glu Ser Ser Ala Ala Ser Phe Thr Glu Val Gln Glu

            20                  25                  30

Leu Glu Glu Pro Met Ser Asn Gly Ser Pro Val Ala Ala Asp Glu Glu

        35                  40                  45

Met Ser Glu Glu Ser Trp Lys Met Pro Tyr Ala Ser Arg Arg Trp Arg

    50                  55                  60

Cys Arg Phe Cys Cys Arg Cys Cys Pro Arg Met Arg Gly Cys Gly Leu

65                  70                  75                  80

Cys Cys Gln Arg Arg

                85

Claims (4)

1、一种真鲷抗菌肽基因和重组酵母表达载体及制备方法，其特征在于它的真鲷抗菌肽基因的克隆主要包括cDNA文库构建、EST序列测定和DNA序列分析与比对：

cDNA文库构建：用TRIzol试剂盒从真鲷脾脏中提取总RNA，用Oligotex^TM离心柱试剂盒分离Poly-(A)RNA，用pBluescript II XR cDNA文库试剂盒构建cDNA文库；

EST序列测定：用快速微量制备方法制备质粒DNA，质粒制备在96孔板上完成；用T3定序试剂盒测定cDNA片段的序列，用T3和T7引物从cDNA片段的两端分别进行测序，从而获得全长序列；

DNA序列分析与比对：在测定EST序列后，用Cross-Match软件掩盖载体序列，然后将从cDNA文库中获得的序列与美国GENBANK序列数据库中已存的DNA序列进行比对，用PHRAP聚类程序鉴定共同序列和单一序列；用BLASTN和BLASTX程序计算我们获得的cDNA克隆片段与GENBANK序列数据库中已存的DNA序列的同源性。

2、根据权利要求1所述的真鲷抗菌肽基因和重组酵母表达载体及制备方法，其特征在于所述的cDNA序列：该基因的cDNA全长为596个碱基，包括255个碱基的开放阅读框，该阅读框编码85个氨基酸的前体，该前体又由3个区组成，24个氨基酸组成的信号肽，39个氨基酸组成的前区和22个氨基酸组成的成熟肽，该成熟肽包括8个半光胺酸残基；真鲷Hepeidin基因cDNA和推导的氨基酸序列为：

GAAAGGAGCTGACGAGAGTCACCAAAAGAATCAAAGGACTGAACAAGTTAAAGCAGTCAAAGCCTCCTAAGATGAAGACATTCAGTGTTG    90

                                                                      M  K  T  F  S  V  A    7

CAGTTGCAGTGGCCGTCGTGCTCACCTTTATTTGCCTTCAGGAGAGCTCTGCTGCCTCATTCACTGAGGTGCAAGAGCTGGAGGAGCCAA    180

  V  A  V  A  V  V  L  T  F  I  C  L  Q  E  S  S  A  A  S  F  T  E  V  Q  E  L  E  E  P  M  37

     Signal peptide

TGAGCAATGGCAGCCCAGTTGCTGCAGATGAAGAGATGTCAGAGGAGTCCTGGAAGATGCCGTATGCCAGcAGACGcTGGC GCTGTCGCT   270

  S  N  G  S  P  V  A  A  D  E  E  M  S  E  E  S  W  K  M  P  Y  A  S  R  R  W  R  C  R  F  67

              prodomain

TTTGCTGTCGTTGCTGTCCTCGCATGAGAGGATGTGGTCTCTGCTGCCAGAGGCGTTGAGGATTCCTGCTGCAGCCTGGGATTTACACAA    360

  C  C  R  C  C  P  R  M  R  G  C  G  L  C  C  Q  R  R  *

85

               Mature peptide

CGACCACTAAATATTTTATTTTAAGATTTTTACTTTAAAAGCAAATCTTTCCAAATTTCAATAGTGGTTGTAAATATCTGAGGATGTTTC    450

TGGATTTGGTCATGCTGCAGAGAATGTGTGCTAACTGATGTATCATCCTGATATTTTGTTAAAAATCTCATGTGTGATCAATAAAGTTGC    540

TTGTTTCTATAATATATACAAAAAAAAAAAA                                                               596

3.一种真鲷抗菌肽基因和重组酵母表达载体及制备方法，其特征在于所述的酵母表达载体的构建是根据测定出的鱼类抗菌肽成熟肽基因的序列，设计含有适当酶切位点的特异引物，从脾脏提取的cDNA中扩增抗菌肽成熟肽序列，经酶切后连接到用同样的酶消化的酵母表达载体pPICZαA，构建成鱼类抗菌肽基因酵母表达载体。

4.一种真鲷抗菌肽基因和重组酵母表达载体及制备方法，其特征在于所述的重组抗菌肽的发酵生产技术，其制备方法是：

1)、表达载体向酵母细胞的转化：将大量制备的抗菌肽基因酵母表达质粒用Sac I酶切，使其线性化，制备新鲜的感受态酵母细胞，通过电穿孔方法将线性化的抗菌肽基因酵母表达质粒转化到巴氏毕赤酵母X-33细胞内，取800μl转化后的酵母细胞涂布在YPDS平板上；

2)、含外源抗菌肽基因的重组酵母的筛选：通过在不同培养基MD和MM平板上的选择性培养筛选甲醇利用正表型的菌株和甲醇利用慢表型的酵母菌株；设计特异的引物，通过PCR方法鉴定整合了外源抗菌肽基因的酵母菌落；

3)、重组抗菌肽表达的诱导：首先对筛选出的阳性菌落进行增殖培养，挑取阳性单菌落，接种于BMGY培养基中进行扩大培养；采用甲醇诱导法诱导酵母表达抗菌肽，即将稀释后的酵母培养液放于250ml的培养瓶中，用灭好菌的四层棉花塞塞住瓶口，28-30℃诱导培养5天；每天补加甲醇，补加甲醇的量根据所诱导的培养基的体积具体计算，但必须使甲醇终浓度维持在0.5-1％之间；

4)、重组抗菌肽抑菌活性的测定：通过诱导培养后，将含抗菌肽基因的重组酵母培养液添加到不同细菌培养物中，测定重组抗菌肽的抑菌活性，表明重组抗菌肽对大肠杆菌(E.coli DH5a和E.coli ATCC)，绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)和嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophia)均具有剂量依存的抑制活性。

Images