CN110226568A - 一种提高蝇蛆抗菌肽抑菌效果的方法及蝇蛆在调控水生动物肠道健康方面的应用 - Google Patents

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Abstract

水产养殖过程中维持水生动物肠道健康至关重要，肠道健康是水产养殖健康发展的基础。本发明属于水产养殖技术领域，尤其涉及一种提高蝇蛆抗菌肽抑菌效果的方法及蝇蛆在调控水生动物肠道健康方面的应用。本发明分别利用普通蝇蛆及嗜水气单胞菌刺激后的蝇蛆喂养水生动物，调节肠道微生物群落结构，调控水产养殖动物肠道健康，降低病原菌的丰度，促进营养物质的吸收和消化，提高生长性能。该方案可操作性强，成本低廉，可有效促进水产养殖动物肠道健康，增强抗病能力，提高生长性能，易于推广使用。

Description

一种提高蝇蛆抗菌肽抑菌效果的方法及蝇蛆在调控水生动物 肠道健康方面的应用
技术领域
本发明属于水产养殖技术领域，尤其涉及一种提高蝇蛆抗菌肽抑菌效果的方法及蝇蛆在调控水生动物肠道健康方面的应用。
背景技术
随着养殖业规模化、集约化养殖进程加快，养殖产业发展呈现良好态势。但是，由于集约化养殖的不断发展，养殖业对于饲料营养、疾病防治、养殖技术的要求也越来越高。一方面饲料价格的不断提高，饲料成本给养殖业带了更大的经济压力。另一方面，集约化养殖规模庞大，数量多，导致疾病易发，感染率高且传染迅速，因此长期面临着产品质量控制要求和巨大经济损失的威胁。近年来，由于细菌、病毒及寄生虫等感染所导致的牲畜、家禽及鱼类养殖疾病频发且损失严重。对于这些疾病的控制，人们普遍采用传统的治疗方法进行治疗，如大量使用疫苗、化学药物及抗生素等，但此类药物的使用存在诸多弊端，例如疫苗虽能靶向预防和控制特异性的疾病，但研制时间长、种类少且价格昂贵，无法大范围推广使用；化学药物和抗生素虽可发挥广谱的预防和治疗作用，但其导致环境及机体的严重残留和污染，影响产品质量安全和人体健康，此外更易促进多种致病菌耐药性的产生，进而导致疾病难愈，损失惨重。因此，为了应对养殖业所面临的一系列问题和挑战，亟待寻找一种新的方法以促进养殖业的健康发展。
肠道是动物营养物质的主要吸收和消化场所，对动物生长发育至关重要，肠道健康有利于生理功能的正常行使。但许多因素易导致肠道健康失衡，如病原微生物入侵导致肠道微生物失调引起肠炎、肠道上皮结构机械性损伤等，这些均能导致肠道消化功能紊乱，免疫失调，鱼体代谢异常，进而抑制动物生长，严重的肠炎甚至能引起肠道大量出血，最终导致动物死亡。在水产养殖过程中，因肠道健康失衡所导致的疾病已造成极大危害，影响养殖水生生物的品质及产量，严重降低了经济效益。因此，维持水生动物肠道健康至关重要，肠道健康是水产养殖健康发展的基础。
蝇蛆(Musca domestica)是家蝇的幼虫，它可以将畜禽粪便及人类生活垃圾的有机质转化为自身高质量的蛋白质及其他营养物质，是完全的环境友好型生物；其含有的丰富的蛋白质及多种氨基酸又可作为畜禽、鱼类及虾蟹的天然饵料，满足多数养殖业对饲料中蛋白源的需求。尤其是，蝇蛆中的抗菌肽被认为是天然的免疫刺激剂，可有效提高养殖物种抗病能力，促进养殖动物的生长。因此，近年来，蝇蛆作为饲料添加剂被广泛推广应用于肉鸡、断奶仔猪、南美白对虾等养殖中，均发现有较好的饲料转化率和增重效果。研究认为认为细菌的刺激会促进抗菌肽的产生，从而会使发挥更大的增重和抗病效果，但目前细菌刺激的蝇蛆工作还很少。
我国水产养殖占据世界养殖的主导地位，但在养殖过程中同样病害频发，来自于生物及非生物的因素刺激引起的疾病对鱼类养殖产业造成了巨大经济损失。黄鳝(Monopterus albus)和中华鳖(Pelodiscus sinensis)是我国重要的养殖鱼类，其均为肉食性动物，养殖饲料对蛋白质含量要求高；近年来，两种鱼类在养殖过程中同样受到炎症性肠炎、出血病等疾病的威胁，严重影响两种鱼类的品质及产量。蝇蛆作为一种天然的饲料饵料和免疫刺激剂，虽在畜禽类养殖中的使用得到较好运用，但蝇蛆在肠道健康中的研究与应用还很不足。此外，鱼类肠道内存在着大量微生物，一方面，这些微生物保持着参与宿主消化道物质代谢与能量代谢的重要功能，另一方面，部分微生物的不稳定增长则导致鱼类严重的肠炎甚至波及全身的细菌性疾病爆发，因此维持肠道微生物群落结构的稳定，对维持鱼类的健康至关重要。细菌刺激的蝇蛆对水产养殖动物的生长和抗病效果还未知。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种提高蝇蛆抗菌肽抑菌效果的方法及蝇蛆在调控水生动物肠道健康方面的应用。本发明的目的在于提供一种可有效将蝇蛆应用于黄鳝养殖的方案及一种将蝇蛆作为饲料添加剂应用于中华鳖养殖的方案，以及利用嗜水气单胞菌刺激蝇蛆，再利用刺激后的蝇蛆喂养水生动物，提高水生动物抗菌和生长性能的方案。该方案可操作性强，成本低廉，可有效促进水生动物的生长及抗病能力，适于推广使用。
本发明是这样实现的，一种提高蝇蛆抗菌肽抑菌效果的方法，使用嗜水气单胞菌培养并刺激蝇蛆。
蝇蛆在鱼类饲料添加剂中的应用，蝇蛆每次用量为鱼类体重的3％，每3天使用一次，所述用量为蝇蛆干重。
进一步，所述蝇蛆为使用嗜水气单胞菌培养并刺激后的蝇蛆。
进一步，所述应用表现为促进鱼类生长。
进一步，所述应用表现为降低鱼类肝脏脂肪积累能力。
进一步，所述应用表现为增加鱼类对病菌的抵抗力。
进一步，所述应用表现为提高鱼类抗氧化能力。
进一步，所述应用表现为影响鱼类IRF10、IL-1β和hepcidin免疫相关基因的表达。
进一步，所述应用表现为改善鱼类肠道微生物群落结构。
进一步，所述应用表现为促进鱼类对高蛋白食物的消化吸收。
进一步，所述应用表现为促进鱼类胆汁分泌。
进一步，所述应用表现为摄食蝇蛆影响与脂代谢、碳水化合物代谢及其酶家族为主的相关代谢通路中基因丰度，以及与感染性疾病及心血管疾病相关的代谢通路基因丰度。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明提供一套完备的蝇蛆作为饲料添加剂应用于两种水生动物养殖的技术方案，该方法弥补了蝇蛆在水生养殖使用中不完善的缺陷，明确了蝇蛆可作为优质的营养源促进两种水生动物的生长，可有效增强黄鳝对嗜水气单胞菌的抗病能力，改善抗氧化能力，调节两种水生动物免疫相关基因的表达，利于降低炎症发生风险，调节肠道微生物结构及功能，增加黄鳝拟杆菌等有利菌丰度而降低假单胞菌等致病菌丰度，提高黄鳝肠道对蛋白质的消化和吸收能力，可高效促进两种鱼的免疫力。同时，利用嗜水气单胞菌刺激蝇蛆，能够提高蝇蛆抗菌肽的抑菌能力；且利用嗜水气单胞菌刺激后的蝇蛆喂养草鱼，能够促进草鱼生长，提高草鱼对嗜水气单胞菌攻毒的抵抗能力。因此，蝇蛆作为天然的动物饵料，营养价值高，无毒副作用，利于环保，可被推广使用于黄鳝、中华鳖及草鱼等水生动物的养殖。
附图说明
图1是不同组黄鳝受嗜水气单胞菌AH1攻毒后的累计死亡率；
图2是采用PD_whole_tree,Observed species,ACE,,Shannon,Simpson五个不同的参数计算各组微生物α多样性；
图3是不同摄食组样品基于Unifrac加权距离的主成分分析；
图4是三组间共有及特有OUT数量；
图5是三组肠道微生物群落在科水平上的分类组成；
图6是在属水平上，采用单因素方差分析和事后检验(Tukey-Kramer)进行多组比较；
图7是LEfSe分析，发现FL3和BD组间细菌丰度存在显著差异；
图8是PICRUST预测与免疫系统和疾病有关的KEGG代谢通路变化；
图9是冷冻肝脏组织的油红染色结果；
图10是采用PD_whole_tree、Observed_species、chaol、ACE、shnnon和Simpson等六个不同参数分析微生物α多样性；
图11是不同摄食组基于加权Unifrac距离的主成分分析；
图12是门水平上不同组中的主要微生物组成；
图13是不同组中厚壁菌门/拟杆菌门的比值；
图14是科水平上不同组中微生物组成；
图15是Kruskal Wallis检验，PBD组丰度显著高于其它两组；
图16是Kruskal Wallis检验，PFL7组丰度显著高于其它两组；
图17是Kruskal Wallis检验，PFL3组丰度显著高于其它两组；
图18是PICRUST预测与疾病及代谢相关的KEGG通路变化。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明披露了一种提高蝇蛆抗菌肽抑菌效果的方法及蝇蛆在调控水生动物肠道健康方面的应用，具体如下各实施例所示。
实施例1嗜水气单胞菌刺激蝇蛆实验
实验组用50ml 1.00×107cfu/ml的嗜水气单胞菌与同等质量麸皮混合24小时，培养蝇蛆。对照组不用嗜水气单胞菌刺激，生产蝇蛆蛋白。
蝇蛆放入组织匀浆器，按蛆体M(mg)∶提取液V(mL)＝1∶3加入蝇蛆蛋白提取液(0.05mol/L乙酸铵缓冲液pH＝5.0 0.35μg/mL PMSF 0.2％β－巯基乙醇0.2mg/L EDTA)现用现配。研磨前在提取液中用剪刀把蛆体剪碎，使蛆体与提取液混合均匀，在冰上用组织匀浆器充分研磨，磨碎后的匀浆液放入－20℃冰箱浸提过夜，并以4℃冰箱浸提过夜作为对照。浸提后的匀浆液于高速冷冻离心机12 000r/min离心30min，弃去沉淀取上清液于沸水中加热超过10min(蝇蛆抗菌肽热稳定性强、加热有利于除去变性杂蛋白)，加热完毕迅速取出放冰上冷却，等温度冷却后置入高速冷冻离心机12000r/min离心30min，弃沉淀后的上清液即为蝇蛆抗菌肽粗提液。
进行蝇蛆抗菌肽提液抑菌试验。将嗜水气单胞菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌接种于琼脂培养基，吸取0.1ml粗提液于普通琼脂培养基，均匀涂抹。采用药敏纸片法，分别将各试验组和对照组药敏片紧贴平板，于37℃恒温箱培养24h。测定抑菌圈大小，结果如表1所示。
表1不同组别抗菌肽粗提液对不同细菌菌株的抑菌活性检测结果(mm)
注:同列不同小写字母表示组间在0.05水平差异显著。
实验结果显示，使用嗜水气单胞菌刺激培养后的蝇蛆，提取的抗菌肽粗提液的抑菌效果明显提升。
实施例2嗜水气单胞菌刺激蝇蛆和普通蝇蛆对草鱼生长、抗病能力的影响实验
1.实验草鱼分为5组：GCBD、PTFL3、PTFL7、GCFL3和GCFL7，每组设置3个平行，每个平行30尾；初始平均体重约为46.36±5.35g。GCBD饲喂常规商品饲料，见表2。
表2实验饲料成分组成及配方
注：1矿物盐预混料(mg/kg)：铁，150；锌，80；铜，4；锰，20；硒，0.1；碘，0.4；钴，0.1；镁，100。
2维生素预混料(mg/kg)：维生素b1，20；核黄素，20；吡哆醇，20；氰钴胺素2；泛酸钙50；烟酸，100；叶酸，5；肌醇，100；维生素H，5；淀粉，226，维生素A(ROVIMIX A-100)，110；维生素D3，20；维生素E，100；维生素K3，10。
将蝇蛆按照上述技术方案进行准备，饲料成分见表2。GCBD组投喂配合饲料；PTFL7组每隔7天投喂普通蝇蛆，其余时间投喂配合饲料；PTFL3组每隔3天投喂普通蝇蛆，其余时间投喂配合饲料；PTFL7组每隔7天投喂嗜水气单胞菌刺激蝇蛆，其余时间投喂配合饲料；GCFL3组每隔3天投喂嗜水气单胞菌刺激蝇蛆，其余时间投喂配合饲料。每次投喂1个半小时后检查并打捞剩余饵料，将剩余饵料于60℃烘干并称重，每日换水1/3，保持水中氨氮含量<0.2mg/L。
本发明该部分实验时间为8周，试验结束后对草鱼进行称重，计算其增重率和特定生长率；采用浓度为1×108CFU/mL的嗜水气单胞菌对草鱼进行攻毒，每尾草鱼胸鳍基部注射0.2ml。统计各组死亡率，计算免疫保护率。
2.对促生长的影响
表3蝇蛆饲料对草鱼生长性能的影响
表中数据表示为平均值±标准差，平均后不同上标表示显著差异(p<0.05)。
表3显示蝇蛆饲料对草鱼生长性能的影响，饲喂嗜水气单胞菌刺激的蝇蛆GCFL3组草鱼增重率和特定生长率均显著高于普通蝇蛆组(PTFL3和PTFL7)，也高于饲喂嗜水气单胞菌刺激的蝇蛆GCFL7组。说明三天饲喂一次嗜水气单胞菌刺激的蝇蛆可显著效促进草鱼的生长性能，效果最好。
3.对嗜水气单胞菌攻毒的抵抗
表4摄食蝇蛆饲料草鱼对嗜水气单胞菌攻毒的抵抗
表4显示摄食蝇蛆饲料草鱼对嗜水气单胞菌攻毒的抵抗效果，攻毒42h后对照组和PTFL7组的草鱼开始死亡，但注射无菌生理盐水的阴性对照组则在整个攻毒过程中无死亡发生。统计数据发现，摄食蝇蛆GCFL3组累计死亡率显著低于其它组；GCFL3组相对成活率显著高于其它组。说明摄食嗜水气单胞菌刺激蝇蛆可有效增加草鱼对病菌的抵抗力，利于草鱼饲养过程中对疾病的控制，尤以三天饲喂一次嗜水气单胞菌刺激的蝇蛆效果最好。
实施例3蝇蛆对黄鳝生长、非特异性免疫及肠道微生物的影响实验
将适量新鲜的蝇蛆称量记录湿重(g)，置于60℃烘箱中24小时烘干水分，称取干重(g)，计算蝇蛆的含水率，计算公式为：含水率(％)＝干重/湿重×100％，根据含水率确定蝇蛆作为饲料添加剂的投喂量。
每次以黄鳝平均体重3％的等量的配合饲料和湿蝇蛆进行投喂。将所述蝇蛆按量每隔7天投喂及每隔三天投喂(每日投喂时间为上(8:00-9:00)下(16:00-17:00)午各一次)，其余时间投喂等量配合饲料。
1.本实验中所用黄鳝为1龄鱼，由长江水产科学研究所赠送，实验前对黄鳝初始体重及体长进行测量并记录。将黄鳝分为3组，每组设置3个平行，分别为BD、FL7、FL3组。
准备饲料，饲料成分组成及配方如下表所示：
表5实验饲料成分组成及配方(g/kg)
注：1维生素预混料(mg/kg)：维生素b1,25；核黄素,50；吡哆醇,20；氰钴胺素0.02；维生素K 50；泛酸钙50；烟酸,150；叶酸,5；维生素H,1；肌醇,500；胆碱,2000。
2矿物盐预混料(mg/kg)：铁，150；锌，20；铜，4；锰，15；硒，0.1；碘，0.6；钴，0.1；镁，500；氯化钠，2500。
将蝇蛆按照上述技术方案进行准备，饲料成分及配方见表5。BD组投喂配合饲料；FL7组每隔7天投喂蝇蛆，其余时间投喂配合饲料；FL3组每隔3天投喂蝇蛆，其余时间投喂配合饲料。每次投喂1个半小时后检查并打捞剩余饵料，将剩余饵料于60℃烘干并称重，每日换水1/3，保持水中氨氮含量<0.2mg/L。
饲养实验维持8周，饲喂结束后，称取黄鳝终末体长和体重并计算生长指标。将黄鳝以MS-222进行麻醉后，用无菌注射器于尾静脉采血；无菌解剖鱼体，用无菌镊子轻轻挤出并收集肠道内容物，取脾脏、肝脏和肠道于无菌冻存管中，并迅速置于液氮中用于荧光定量PCR，称取每鱼肝脏重用于计算肝体比。采取的血液于4℃净置过夜，15000g，4℃离心15min，收集上层血清保存至-80℃冰箱中，待测。
2.采用以下公式对生长指标进行计算：
摄食率(FR,％BW d-1)＝100×摄食量/[天数×(鱼体初重+鱼体末重)/2]
饲料效率(FE,％)＝100×(鱼体末重-鱼体初重)/摄食干重
增重率(WG,％)＝100×(鱼体末重-鱼体初重)/初始体重
特定生长率(SGR,％d-1)＝100×[Ln(鱼体末重)-Ln(鱼体初重)]/天数
肥满度(CF,g cm-3)＝100×鱼体重/鱼体长3
肝体比(HSI,％)＝100×鱼肝脏重/鱼体重
实验结果见下表所示：
表6饲喂蝇蛆对黄鳝生长及饲料利用率的影响
表中数据表示为平均值±标准差，平均后不平上标表示显著差异(p<0.05),BD为对照组，FL7为每隔7天投喂蝇蛆组，FL3为每隔3天投喂蝇蛆组。
FL3组鱼体末重、饲料效率和增重率均显著高于BD和FL7组，而BD和FL7组间无显著差异。说明三天饲喂一次蝇蛆可有效促进黄鳝的生长性能。此外，蝇蛆饲喂组肝体比(HSI)显著低于对照组BD，然而摄食率、特定生长率和肥满度在三组间无显著差异。肝体比可反映黄鳝肝脏的脂肪积累情况，蝇蛆组中显著低水平的肝体比，表示饲喂蝇蛆有降低其肝脏脂肪积累的能力，可潜在降低黄鳝脂肪肝发病的风险，对黄鳝健康有一定的保护效果。
3.嗜水气单胞菌攻毒实验
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是鱼类中最主要的致病菌，可引起出血病导致鱼类死亡。实验用一株嗜水气单胞菌AH1感染各组实验鱼，以评估蝇蛆作为饲料添加剂是否给鱼体带来显著的抗病效果。试验首先将菌种活化后扩大培养，用0.65％的生理盐水连续悬洗三次，将悬洗好的菌悬液保存于无菌离心管中。菌悬液经无菌水稀释，以平板稀释涂布法定量至攻毒浓度为3.065×107cfu/ml。每组取30条鱼，用1ml的无菌注射器以0.3ml/尾的剂量将菌悬液于腹腔注射至鱼体。将攻毒处理的鱼放回实验缸中，观察记录1周内的死亡数目并统计累计死亡率和相对存活率。采用以下公式对累计死亡率(cumulativemortality,CM)和相对成活率(relative survival rate,RS)进行计算：
累计死亡率(CM)＝死亡鱼数目×初始用鱼数-1×100
相对存活率(RS)＝(对照组死亡率-蝇蛆处理组死亡率)/对照组死亡率×100
实验结果如图1所示，其中BD:基础饲料组；FL7：每隔7天饲喂蝇蛆组；FL3:每隔3天饲喂蝇蛆组。结果显示，攻毒68h后对照组和FL7组的黄鳝开始死亡，但注射无菌生理盐水的阴性对照组则在整个攻毒过程中无死亡发生。统计数据发现，摄食蝇蛆组FL7(16.67％)和FL3(6.67％)组累计死亡率明显低于对照组BD(26.67％)；FL3(75％)组相对成活率明显高于FL7(37.5％)组。说明摄食蝇蛆可有效增加黄鳝对病菌的抵抗力，利于黄鳝饲养过程中对疾病的控制。
4.血清生化分析
血清被用于检测血液中丙二醛含量和IgM浓度。采用购买自南京建成的试剂盒进行测定，测定步骤参照试剂盒说明书，每个样本分析三次。检测结果如下表所示：
表7饲喂蝇蛆对黄鳝MDA浓度和IgM含量的影响
表中数据表示为平均值±标准差，平均后不平上标表示显著差异(p<0.05),BD为对照组，FL7为每隔7天投喂蝇蛆组，FL3为每隔3天投喂蝇蛆组。
对黄鳝血清MDA浓度和IgM含量测定发现，蝇蛆饲喂组MDA浓度显著低于对照组BD，说明摄食蝇蛆可有效提高黄鳝体内抗氧化效果，利于机体健康。但是，实验发现摄食蝇蛆组IgM含量无显著影响。
5.免疫相关基因的表达分析
5.1总RNA的提取以及cDNA的合成
使用TRIzol(Takara)法提取脾、肝脏及肠道总RNA，提取的RNA经超微量分光光度计Nannodrop8000检测确定RNA的OD值(OD260/OD280)，通过1.0％的琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA的完整性和质量。根据PrimeScriptTM RT reagent Kit(Takara)试剂盒的说明首先去除多余的DNA，然后将RNA反转录成cDNA。所有的RNA和cDNA样品被保存于-80℃。
5.2实时荧光定量PCR
涉及到的引物序列见下表：
表8 qPCR引物序列
将上述三种组织的cDNA用于实时荧光定量PCR，选用β-actin作为参考基因对定量过程标准化。使用CFX96TouchTM Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad,USA)进行荧光定量PCR反应，使用前人文献所述的引物分别扩增参考基因及目的基因。采用iTaqTMUniversal SYBR Green Supermix(Bio-Rad,USA)试剂盒说明进行操作。荧光定量的反应体系为25μl，每个反应体系中包括12.5μl iTaqTM Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad，USA)，上、下游引物分别为1.0μl(10μM)，cDNA模板2.0μl，无菌蒸馏水8.5μl。荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性30min；95℃变性5s；63℃退火20s；72℃延伸3min，PCR反应40个循环。荧光定量所涉及的引物名称、序列及退火温度列于表8。每个样品重复三次，设置阴性对照以排除污染。每次运行结束时，对PCR产物进性溶解曲线分析，以确保单个产物被扩增。
通过实时荧光定量(qPCR)对脾脏、肠道和肝脏中免疫相关基因进行定量分析，发现IL-1β在肝脏中的表达量在摄食蝇蛆组显著低于对照组BD，此外，同时发现IRF10和hepcidin有与之相同的表达模式。而IRF10在FL7组的脾脏中显著上调，hepcidin在摄食蝇蛆组(FL7和FL3组)的肠道中显著下调。说明摄食蝇蛆对黄鳝免疫相关基因的表达有明显的影响。但是肠道中IRF10，肠道和脾脏中IL-1β，脾脏中hepcidin在三组间无显著变化。IL-1β是一种促炎细胞因子，很多研究发现该基因的下调可相应减轻哺乳动物炎症，因此，摄食蝇蛆可能有潜在的抗炎功能。
6.不同组中肠道微生物群落组成及多样性
6.1 16S rRNA基因测序
为了比较不同组间的微生物群落结构，使用 DNA stool mini kit(Qiagen,Germany)试剂盒按照所给步骤提取了三组共45个肠道内容物样本总DNA，用超微量分光光度计Nannodrop8000测定DNA浓度，DNA置于-20℃保存。接着使用引物515F:5’-GTGYCAGCMGCCGCGGTA-3’和909R:5’-CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3’，分别见SEQ ID NO:9和SEQID NO:10，(正向引物上带有12个碱基的特异性标签)对细菌V4-V5区进行PCR扩增。反应体系总共为25μl，包括12.5μl的2×Go Taq Green Master Mix polymerase(Promega,USA)，50ng的DNA模板和各1μM的正反向引物，无菌蒸馏水补足至25μl。PCR程序为95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，整个PCR运行25个循环，最后72℃延伸5min。获得的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分离，对比约为300bp的条带，紫外光下迅速并准确切取条带，之后使用胶回收试剂盒(Aidlab Biotech,Beijing,China)对目的条带进行回收和纯化。用微量分光光度计Nannodrop8000测定回收DNA的浓度和纯度。将每个样本的DNA以等摩尔质量的标准进行混合，混合后的样品送至诺禾致源构建PCR-free构建文库，之后上机测序，测序平台为Illumina Hiseq 2500(HiSeq Reagent Kit V2，500cycles)，测序策略为PE250。
6.2数据统计及微生物数据生物信息分析
所有生长数据通过SPSS Statistics 24.0(IBM,USA)软件使用单因素方差分析(One-way ANOVA)。显著性水平设为0.05，当显著性水平p<0.05时,则用Duncan’s多重检验进行比较分析。本实验中所有基因的表达水平以β-actin为内参基因，采用2–ΔΔCT法分析不同免疫基因的相对表达量，公式为：ΔΔCT＝(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照组，2–ΔΔCT表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。实验所得数据进行单因素方差分析。所有数据均表示为平均值±标准差。
细菌测序后所得的原始数据通过QIIME Pipeline-Version 1.8.0(http://qiime.org/)平台进行分析。具体步骤为：使用FLASH-1.2.11软件对双端测序序列进行拼接，高质量(长度>250bp,没有模糊碱基，平均碱基质量大于30)的序列被用于进一步的分析；接着基于每条序列头端或者尾端的条形码序列(条形码错配＝0)将所有序列分配给每个样品。使用Uchime算法去除嵌合体后，使用daisychopper.pl脚本将所有样本的非嵌合序列随机抽样至相同的测序深度(本试验中每个样品随机抽取12,570条序列)。使用CD-HIT算法按照97％相似度将序列分配到特定操作分类单元(Operational Taxonomic Units，OTU)。使用UCLUST算法利用Greengenes数据库(版本13.8)对OTU进行注释，最后将未分配及C_Chloroplast序列删除。
对各组微生物群落的α多样性(chaol、ACE、Simpson、Shannon指数、PD_whole_tree和Good’s coverage)和β多样性指数进行了分析。基于加权Unifrac距离，采用主坐标分析(Principle coordinates analysis,PCoA)比较组间样本的相似性；利用R对数据进行非参数多元方差分析(PERMENOVA分析)比较组间群落差异显著性。采用韦恩图(Venn diagram)展示不同组间的共有OTU数目和特有OTU数目，解析蝇蛆对鱼体微生物群落的影响变化。利用R对数据聚类并作热图，分析不同组中不同分类水平微生物的丰度变化。在属水平上，使用线性判别分析(Linear discriminant analysis coupled with effect size,Lefse)分析不同组间微生物群落特征差异。使用PICRUSt 1.0基于16S rRNA基因序列数据库分析预测肠道微生物基因功能。在源于KEGG数据库的功能分类水平levelⅢ，进一步通过STAMP软件分析不同组间微生物功能基因的显著性。使用方差分析(ANOVA)辅助post hoc检验(Tukey-Krumer)对不同分类水平微生物的相对丰度进行差异性分析。两组间的数据比较使用t检验。
6.3通过16S rRNA测序分析黄鳝肠道微生物，三组肠道样品的Good’s coverage值均≥99％。PD_whole_tree(F＝15.344,p＝0.000),Observed_species(F＝11.365,p＝0.000)和ACE(F＝5.480,p＝0.008)指数在三组间显著不同，见图2：其中，摄食蝇蛆组(FL7和FL3组)PD_whole_tree和Observed_species指数显著低于对照组BD，而FL7组中ACE指数显著低于FL3和BD组。同样的，Shannon(F＝10.511,p＝0.000)和Simpson(F＝14.022,p＝0.000)指数在三组间显著不同，且这两个指数在FL7组皆低于对照组BD和FL3组。基于加权Unifrac距离的主成分分析(PCoA)表明摄食蝇蛆的两组样品有相对细微的聚类，但摄食蝇蛆组样品与对照组BD明显分开，见图3。基于加权Unifrac距离的PERMANOVA分析发现三组间微生物群落组成显著不同(F＝5.337,p<0.001)。这说明摄食蝇蛆显著改变了黄鳝肠道微生物群落结构。
7.不同组中肠道微生物分类水平上的组成及多样性
韦恩图分析发现在微生物的分类中共有940个独立OTU,其中278个为三组共有OUT，见图4。门水平上黄鳝肠道微生物主要分为厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)，但这三类细菌在三组间的丰度上并未呈现显著差异。然而，与对照组BD相比，拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度在FL3组中显著升高。在科水平上，梭菌科(Clostridiaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)为主要的优势菌群，见图5。与对照组BD相比，FL3组中Turicibacteraceae丰度显著减少至几乎缺失。而在FL7组中气单胞菌科(Aeromonadaceae)相较于对照组BD则更加丰富。值得注意的是，FL3组中的拟杆菌科(Bacteroidaceae)丰度则显著多于FL7和BD组。在属水平上，鲸杆菌属(Cetobacterium)是三组中均存在的优势菌群，除此之外还有很多属水平上的细菌类群丰度在三组间存在显著差异，见图6。通过方差分析发现，属水平上共有19个微生物类群呈现显著不同，其中包括Microbacterium,Staphylococcus和Pseudomonas在内的13个属的菌群在FL7和FL3组中丰度显著低于BD组；而包括拟杆菌属(Bacteroides)和Plesiomonas在内的5个属的菌群在FL3组中丰度显著升高，仅有Virgibacillus的丰度在FL7组中显著升高。LefSe分析发现在BD和FL3组中微生物的丰度明显不同，但并未发现BD和FL7组间有明显的差异。基于LDA>3.0，共有20个细菌类群在BD和FL3组之间呈现显著不同。FL3组中Bacteroidetes丰度显著多于BD，见图7。
假单胞菌属(Pseudomonas)是一类可经常引起鱼类严重细菌性疾病的细菌，其丰度比例在摄食蝇蛆组显著低于对照组，这表明蝇蛆投喂可以降低黄鳝感染细菌性疾病的风险。其次，拟杆菌属(Bacteroides)是人类肠道中主要的蛋白水解菌群，粪便中高丰度的拟杆菌与食物中高含量蛋白质息息相关。该类细菌的丰度比例增加有利于黄鳝对高蛋白食物的消化吸收。
8.免疫系统和疾病相关的KEGG通路变化
通过PICRUST预测肠道微生物的功能，发现在LevelⅢ水平上有28个主要与免疫系统以及疾病相关的KEGG通路的相对丰度显著受到摄食蝇蛆的影响，见图8。摄食蝇蛆组中与结直肠癌、小肺癌、病毒性心肌炎、阿米巴病、致病性大肠杆菌感染、志贺氏菌病、甲型流感和弓形虫病等相关通路的丰度显著降低，与蛋白质消化和吸收相关通路的丰度则显著升高，而与胆汁分泌相关的通路在FL3组中丰度细微升高，在FL7组中丰度显著升高。这说明蝇蛆摄入可提高黄鳝对部分疾病的抵抗力，可增加蛋白质的消化和吸收能力，促进胆汁的分泌。
综上，根据本发明方案中的蝇蛆应用方法，可有效提高黄鳝的生长性能，促进机体抗氧化能力，提高对病原性疾病的抗病能力，可调节黄鳝免疫相关基因的表达，改善肠道微生物群落结构，提高免疫力，促进机体健康发展。
实施例4蝇蛆对中华鳖生长、非特异性免疫及肠道微生物的影响实验
将适量新鲜的蝇蛆称量记录湿重(g)，置于60℃烘箱中24小时烘干水分，称取干重(g)，计算蝇蛆的含水率，计算公式为：含水率(％)＝干重/湿重×100％，根据含水率确定蝇蛆作为饲料添加剂的投喂量。
每次以中华鳖平均体重3％的等量的配合饲料和湿蝇蛆进行投喂。将所述蝇蛆按量每隔7天投喂及每隔三天投喂(每日投喂时间为上(8:00-9:00)下(16:00-17:00)午各一次)，其余时间投喂等量配合饲料。
1.实验用中华鳖初始平均体重约为65.33±7.35g。实验选用体质健康，规格一致的中华鳖分为三组，每组20只，三组分别为PBD、PFL7和PFL3组。
按照同实施例1中的技术方案配制饲料和蝇蛆，并按照配比分别对三组实验鱼进行投喂。PBD组为对照组，投喂配合饲料，PFL7组每隔7天投喂蝇蛆，PFL3组每隔3天投喂蝇蛆。投喂方式及饲养实验中的条件控制同实施例1。
2.生长指标计算方式同实施例1。
结果见下表所示：
表9投喂蝇蛆对中华鳖生长的影响
表中数据表示为平均值±标准差，平均后不平上标表示显著差异(p<0.05),PBD为对照组，PFL7为每隔7天投喂蝇蛆组，PFL3为每隔3天投喂蝇蛆组。
摄食蝇蛆组(PFL7和PFL3组)中中华鳖的增重率及特定生长率显著高于对照组(PBD)。这说明摄食蝇蛆可显著促进中华鳖的生长。
3.血清生化分析
收集的血清用于检测血液中总胆固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)、谷丙转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALU)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(T-SOD)、总蛋白、溶菌酶和白蛋白含量。采用购自南京建成的试剂盒根据说明进行测定。
结果如下表所示：
表10摄食蝇蛆对中华鳖血清生化指标的影响
表中数据表示为平均值±标准差，平均后不平上标表示显著差异(p<0.05),PBD为对照组，PFL7为每隔3天投喂蝇蛆组，PFL3为每隔3天投喂蝇蛆组。
血清生化指标测定后发现，摄食蝇蛆组总胆固醇(T-CHO)和甘油三酯(TG)含量显著降低；此外，摄食蝇蛆组过氧化氢酶(CAT)含量也随着摄食蝇蛆的含量增加显著升高；血清中溶菌酶含量也随着蝇蛆的摄入呈现上升的趋势，其中，PFL7组中血清溶菌酶含量显著高于PBD和PFL3组。综合可知，不同水平蝇蛆的摄入对中华鳖血清生化指标影响显著，这些指标可反映机体的生理状况。摄食蝇蛆可有利于中华鳖体内胆固醇的蓄积，进而减少脂肪积累；过氧化氢酶和溶菌酶浓度的升高说明摄食蝇蛆促进中华鳖机体的抗氧化能力及抗菌能力；综合结果说明摄食蝇蛆可有效促进中华鳖的机体健康，进而可提高抗病能力。
4.肝脏切片及染色
为了检测肝脏中的脂肪含量，实验对肝脏切片油红染色，然后用Mayger’s苏木精复染，用计算机辅助形态测定系统(Image Pro Plus 6.0，USA)测量油红O阳性区域与内表面的百分比，数据显示每组的平均值±标准差，使用单因素方差分析(one-way ANOVA)计算三组之间的脂肪面积的差异性。
结果见图9，其中(A)PBD组，(B)PFL7组，(C)PFL3组。对照组PBD(6.99±2.22％)中肝脏脂滴面积显著高于PFL7(1.42±0.57％)和PFL3(0.23±0.12％)组，说明摄食蝇蛆有效降低对了中华鳖肝脏脂肪蓄积，可降低脂肪肝发生的风险。
5.不同组间肠道微生物群落结构及多样性
微生物总DNA的提取和基因测序等方法同实施例1。
通过分析α多样性发现，不同组中微生物群落结构组成差异明显，见图10，摄食蝇蛆组(PFL7和PFL3组)中Observed_species、chaol、ACE、shannon指数显著低于PBD组；PFL3组中PD_whloe_tree明显降低，但不显著；Simpson指数在摄食蝇蛆组中明显降低，但不显著。基于加权Unifrac距离的主成分分析(PCoA)表明PFL3组样品与对照组样品明显分开，PFL7组样品与PBD组样本有部分重叠，细微分开，见图11。基于加权Unifrac距离的PERMANOVA分析发现不同摄食组肠道微生物群落结构显著不同(F＝2.6035,p＝0.038)，该结果说明摄食蝇蛆同样显著改变了中华鳖肠道微生物群落结构。
6.不同组中肠道微生物在各分类水平上的组成分析
对不同组中肠道微生物组成进行分析，在门水平上，见图12，中华鳖肠道微生物主要由厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变性菌门(Proteobacteria)组成，其中PFL3组中厚壁菌门丰度显著低于PBD和PFL7组，但这两组间无显著性差异；此外，PFL3组中变形菌门丰度显著高于PBD和PFL7组，但这两组间丰度同样无显著性差异；三组间拟杆菌门丰度虽差异不显著，但摄食蝇蛆组丰度明显高于对照组；比较各组中厚壁菌门/拟杆菌门的比值(Firmicutes/Bacteroidetes,F/B)发现，对照组(14.44)中F/B值高于PFL7(12.39)和PFL3(9.85)，且PFL3组中样品F/B值均保持在相对较低的水平，见图13，已知的研究表明肥胖与高水平的F/B值正相关，该类型的微生物的变化可能代谢了更多的宿主能量，本实验中摄食蝇蛆组中华鳖中较低的F/B值表明蝇蛆摄入可能有助于中华鳖能量代谢，尤其是脂肪代谢，降低肥胖风险，这与前述低水平的总胆固醇、甘油三酯以及脂滴面积结果相符。
在科水平上，见图14，梭菌科(Clostridiaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、Turicibacteraceae等是主要的微生物群，其中PFL7(8.19％)和PFL3组(9.65％)拟杆菌科丰度高于对照组(7.89％)，但差异不显著；PFL7组(33.1％)梭菌科丰度显著高于PBD(11.42％)和PFL3组(22.47％)；除此之外，PFL3组中叶瘤菌科(Phyllobacteriaceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)和丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)丰度显著高于PFL7和PBD组。
对属水平上微生物丰度进行Kruskal-Wallis检验，共有48个分类单元的丰度在三组间呈现出显著不同，其中在PBD组中有11个微生物分类单元丰度显著高于摄食蝇蛆的两个组，见图15，包括螺杆菌属(Helicobacter)、红细菌属(Rhodobacter)等；在PFL7组中有14个微生物分类单元的丰度显著高于PBD和PFL3组，见图16，其中包括益生菌类群中乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)细菌、乳酸菌属(Lactobacillus)以及芽孢杆菌科(Bacillaceae)的几类细菌；在PFL3组中有22个微生物分类单元的丰度显著高于PBD和PFL7组，见图17，包括芽孢杆菌属(Bacillus)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)等，值得注意的是，与蝇蛆对黄鳝肠道微生物属水平丰度相同，中华鳖中PFL3组的拟杆菌属(Bacteroides)丰度显著同样高于PBD和PFL7组，该细菌的增加同样可能促进中华鳖对蛋白的吸收，利于中华鳖的营养利用和生长。
7.与疾病及代谢相关的KEGG通路变化
在LevelⅡ水平对微生物相关功能进行KEGG通路预测，采用Kruskal Wallis检验发现与疾病及代谢相关的10个通路在三组间差异显著，见图18，PFL7和PFL3组明显聚在一起。其中摄食蝇蛆组中与脂代谢、碳水化合物代谢及其酶家族为主的相关代谢通路中基因丰度显著多于对照组，说明摄食蝇蛆可有助于加速中华鳖机体代谢，尤其是脂肪代谢；其次，摄食蝇蛆组中与感染性疾病及心血管疾病相关的代谢通路基因丰度显著低于对照组，说明摄食蝇蛆组可能有助于提高中华鳖对一些感染性疾病的抵抗能力，并可降低患心血管疾病的风险。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院水生生物研究所
苏州腾康环保科技有限公司
<120> 一种提高蝇蛆抗菌肽抑菌效果的方法及蝇蛆在调控水生动物肠道健康方面的应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Hepcidin F)
<400> 1
gcctttatct gcattctgg 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Hepcidin R)
<400> 2
cgcagccctt gtagttct 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(IRF10 F)
<400> 3
acaatggctc gccttcttt 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(IRF10 R)
<400> 4
tgggaccact ccaatacac 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(IL-1β F)
<400> 5
ccaagcactg aagccagacc a 21
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(IL-1β R)
<400> 6
tcccgttggt agaacagaaa tcg 23
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(β-actin F)
<400> 7
gcgtgacatc aaggagaagc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(β-actin R)
<400> 8
ctctgggcaa cggaacctct 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(515 F)
<400> 9
gtgycagcmg ccgcggta 18
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(909 R)
<400> 10
ccccgycaat tcmtttragt 20

Claims (10)

1.一种提高蝇蛆抗菌肽抑菌效果的方法，其特征在于，使用嗜水气单胞菌培养并刺激蝇蛆。
2.蝇蛆在调控水生动物肠道健康方面的应用，其特征在于：蝇蛆每次用量为鱼类体重的3％，每3天使用一次，所述用量为蝇蛆干重。
3.根据权利要求2所述的蝇蛆在调控水生动物肠道健康方面的应用，其特征在于：所述蝇蛆为使用嗜水气单胞菌培养并刺激后的蝇蛆。
4.根据权利要求2或3所述的蝇蛆在调控水生动物肠道健康方面的应用，其特征在于：所述应用表现为促进鱼类生长。
5.根据权利要求2所述的蝇蛆在调控水生动物肠道健康方面的应用，其特征在于：所述应用表现为降低鱼类肝脏脂肪积累能力。
6.根据权利要求2或3所述的蝇蛆在调控水生动物肠道健康方面的应用，其特征在于：所述应用表现为增加鱼类对病菌的抵抗力。
7.根据权利要求2所述的蝇蛆在调控水生动物肠道健康方面的应用，其特征在于：所述应用表现为影响鱼类IRF10、IL-1β和hepcidin免疫相关基因的表达。
8.根据权利要求2所述的蝇蛆在调控水生动物肠道健康方面的应用，其特征在于：所述应用表现为改善鱼类肠道微生物群落结构。
9.根据权利要求2所述的蝇蛆在调控水生动物肠道健康方面的应用，其特征在于：所述应用表现为促进鱼类胆汁分泌。
10.根据权利要求2所述的蝇蛆在调控水生动物肠道健康方面的应用，其特征在于：所述应用表现为摄食蝇蛆影响与脂代谢、碳水化合物代谢及其酶家族为主的相关代谢通路中基因丰度，以及与感染性疾病及心血管疾病相关的代谢通路基因丰度。
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