CN110713955A

CN110713955A - 一株乳酸菌及其在水产养殖中的应用

Info

Publication number: CN110713955A
Application number: CN201911130575.4A
Authority: CN
Inventors: 姚嘉赟; 沈锦玉; 尹文林; 潘晓艺; 蔺凌云; 曹铮; 夏炎春; 刘忆翰
Original assignee: Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries
Current assignee: Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries
Priority date: 2019-11-19
Filing date: 2019-11-19
Publication date: 2020-01-21

Abstract

本发明属于水产养殖技术及病害防控技术领域，涉及一种干酪乳杆菌及其在水产养殖中的应用，乳杆菌名称为干酪乳杆菌GCGR‑16，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年09月26日，保藏编号为CCTCC NO：M2019755，代替抗生素，克服抗生素过度使用、药物残留、耐药性、食品安全以及环境污染等一系列缺陷，改善水产动物的免疫功能，增强其抗病功能，减少药物的使用量，推动水产养殖业绿色、生态发展。

Description

一株乳酸菌及其在水产养殖中的应用

技术领域

本发明涉及一种干酪乳杆菌及其在水产养殖中的应用，属于水产养殖技术及病害防控技术领域。

背景

动物疫病的防控是现代养殖业抵御风险的关键，是预防和控制传染性疫病的重要武器，是解决目前水产养殖中存在的抗生素过度使用、药物残留、耐药性、食品安全以及环境污染等一系列问题的关键手段。目前我国的水产药物已经不能满足人民群众对优质蛋白不断增长的需求，对安全、放心、绿色食品的保障需求。在当前推动水产养殖业绿色、生态发展及产业转型升级过程中也迫切需要研制新型的抗生素替代产品。

乳酸菌是人与动物胃肠道的常见菌和共生菌，很久以来，乳酸菌作为重要的益生菌己广泛地用于食品、饮料和微生态制剂等行业中，被公认为是安全级微生物。是近年发展起来的新型绿色添加剂，具有改善养殖动物消化道有益菌群，抑制或杀死有害菌，提高动物健康水平，促进动物生长发育及提高饲料利用率等功效。此外，其还具有无残留、无毒副作用等特点，改善养殖生态环境，达到生态防治的目的，使养殖生产良性发展，取得更好的经济效益和生态效益。利用乳酸菌具有以下优点：安全、没有内毒素；可直接口服，不需注射、操作简单；能够调控、保护并修复肠道功能；具定植能力，能在肠道黏膜定居，可以顺利呈递抗原；能够容纳大量外源基因，并且对外源基因的表达具有高效的调控系统，且可以源源不断在肠道中产生并起到相应的作用。近年来，随着对乳酸菌研究的深入了解，其具有增强免疫力、抗感染、抗虫、预防癌症、减肥等等方面的功能，但目前在水产养殖中增强免疫力，抗病毒和抗寄生虫等方面的研究极少。本专利即是在此背景下提出的。

发明内容

本发明提供一种干酪乳杆菌，名称为干酪乳杆菌GCGR-16，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年09月26日，保藏编号为CCTCC NO：M2019755。

干酪乳杆菌GCGR-16从罗氏沼虾肠道组织分离而得。

本发明还提供上述干酪乳杆菌的应用，用于增强水产动物免疫功能。

本发明还提供上述干酪乳杆菌的另一应用，用于增强水产动物抗病功能。

本发明还提供上述干酪乳杆菌的另一应用，用于制备增强水产动物免疫增强制剂。

病原包括：小瓜虫、虹彩病毒中的任一种或几种。

本发明还提供一种水产动物饲料，含有上述干酪乳杆菌。

本发明还提供一种水产动物饲料添加剂，含有上述干酪乳杆菌。

本发明的优点在于：采用乳酸菌代替抗生素，克服抗生素过度使用、药物残留、耐药性、食品安全以及环境污染等一系列缺陷，改善水产动物的免疫功能，增强其抗病功能，减少药物的使用量，推动水产养殖业绿色、生态发展。

附图说明

附图1为干酪乳杆菌对罗氏沼虾抗副溶血弧菌能力验证结果；

附图2为检测发病鱼的蛙虹彩病毒感染情况双重PCR电泳图。

具体实施方式

一、干酪乳杆菌的分离及鉴定

1.1 菌株的分离纯化

将罗氏沼虾肠道组织匀浆用无菌生理盐水采用10倍稀释法进行稀释后，取10^-5～10^-8稀释范围的稀释液涂布于MRS固体培养基平板上。30℃恒温培养48h，挑取典型单菌落，反复划线分离至获得纯菌株。

1.2 生理生化鉴定

对菌株菌落形态进行观察，革兰氏染色，显微镜观察。并参照文献提供的常规方法对菌株进行过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、甲基红试验（MR试验）、吲哚试验、硫化氢试验、糖发酵试验（微量发酵管法）。

1.3 16S rRNA序列分析

应用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，按说明书操作。应用引物27F(AGAGTTT-

GATCCTGGCTCAG)和1492R( TACCTTGTTACGACTT)扩增细菌的16S rDNA 基因，扩增体系参照文献进行。扩增程序：95 ℃预变性5 min后进入PCR循环，95 ℃变性30 s，50 ℃退火60s，72 ℃延伸30 s，40 个循环，72 ℃延伸5 min。扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳并进行回收纯化，引物合成和序列测定委托上海英骏生物工程技术有限公司完成。将序列提交GenBank 数据库，利用BLASTN 搜索同源序列，下载同源序列，应用软件Meg 4．0进行系统发育分析，BioEdit 软件分析同一性，鉴定菌株。

结果与分析

2.1 菌株分离

应用MRS培养基从罗氏沼虾肠道中分离到一株乳酸菌，菌落成乳白色半透明凸起，边缘整齐光滑；革兰氏染色镜检呈革兰氏阳性，杆状，有酸味，将其编号为GCGR-16。

2.2 生理生化特征

菌株GCGR-16的生理生化鉴定结果见表1，参考《伯杰氏细菌鉴定手册》（第8版），初步鉴定其为干酪乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。

表1 菌株GCGR-16和标准菌株的生理生化特性

注：+表示阳性反应，-表示阴性反应，（+）表示迟钝反应。

2.3 16S rRNA 基因的PCR 扩增结果与系统发育分析

经PCR扩增得到16S rRNA片段，经测序为1453bp。应用BLASTN 比对，Clustal X 构建Neighbor-Joining 树，菌株GCGR-16的16S rRNA与已知的干酪乳杆菌( L.casei)聚在一个分支上，相似性为100%。综合形态特征观察、生理生化试验、分子生物学测序结果，从罗氏沼虾肠道中分离得到干酪乳杆菌GCGR-16( L.casei GCGR-16)。

二．干酪乳杆菌对罗氏沼虾免疫功能的影响试验

1．试验目的

本试验报告旨在评价干酪乳杆菌对罗氏沼虾免疫功能的影响，为其在罗氏沼虾上的应用提供基础数据。

2．试验时间与地点

试验于2019年5-8月，在浙江省湖州某罗氏沼虾养殖场进行。

试验期间每天进行水温、溶解氧、pH、氨氮、亚硝酸盐氮等检测，测定方法为：pH采用GB6920水质pH值的测定-玻璃电极法；溶氧采用GB7489水质溶解氧的测定碘量法；氨氮采用GB7479水质铵的测定纳氏试剂分光光度法；亚硝酸氮采用GB 7493水质亚硝酸盐氮的测定分光光度法。试验期间：溶氧大于5.0 mg/L，氨氮0.04-0.21，亚硝酸盐氮0.01-0.10，水温随季节变动。

3. 试验方法

3.1 样品来源

干酪乳杆菌，由本实验室分离保存并进行富集培养并经冷冻干燥成粉末状。

副溶血弧菌，由本实验室保存，对罗氏沼虾具有较强的致死作用。

3.2 试验方案

试验分2个试验组，分别为基础饲料组（添加罗氏沼虾专用饲料）和干酪乳杆菌组（罗氏沼虾专用饲料加乳酸菌），干酪乳杆菌的添加量为每公斤料添加0.5 g。每个试验组分别含3个重复试验池塘。于试验后0 d，7 d，14 d，28 d，42 d，5 6d和84 d后随机采集池塘中30尾罗氏沼虾的血液和肝胰腺进行非特异性免疫指标的测定，研究干酪乳杆菌对罗氏沼虾非特异性免疫指标的影响。

3.3 样品的收集

在试验过程中的0 d，7 d，14 d，28 d，42 d，56 d，84 d分别从各试验组随机取样(n=30)。分别断肢取血，同时采集肝胰腺，进行各项指标测定。

3.4免疫指标的测定

溶菌酶(LZM)活性由比浊法测定。超氧化物歧化酶活性（SOD），过氧化氢酶活性(CAT)，碱性磷酸酶活性(AKP)的测定均按照试剂盒（南京建成生物工程研究所）相应操作参照说明书进行，其中，SOD活力按黄嘌呤氧化酶法，活力单位定义为每毫升反应液中SOD抑制率达50%时，所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)。

吞噬活性的测定

在抗凝血中加入 0.25 mL 金黄色葡萄球菌悬液，充分混匀后于 28℃下水浴 1 h，水浴期间每隔10 min摇匀 1次。再加入 0.15 mol/L 冷NaCL溶液0.8 mL，2000 r/min离心4min，弃去上清液。然后用吸管吸取血细胞涂片，每个血样涂5片，甲醇固定5~ 7m in，蒸馏水冲洗，Giemsa染1-5 h，水洗晾干后镜检。吞噬活性分别以吞噬百分比( PhagocyticPercentixge, PP)和吞噬指数 ( Phagocytic index, PI)表示：

吞噬百分比 ( PP) = ( 100个吞噬细胞中参与吞噬的细胞数/100) ×100%；

吞噬指数 ( PI) = (吞噬细胞内的细菌总数/参与吞噬的吞噬细胞数)×100%。

3.5 免疫增强剂免疫保护力的测定

投喂干酪乳杆菌84天后，随机采集各试验组池塘中的罗氏沼虾30尾，进行攻毒试验，攻毒试验在本实验室进行，注射剂量为10倍LD₅₀（1.5×10⁵cfu/g），注射部位为每尾虾的腹尾交接的柔软处各注射0.1 mL菌液，对照组注射相同剂量的生理盐水，连续观察7天，记录结果并统计死亡率，计算免疫保护率。

免疫保护率(%)=[1-(受免虾死亡尾数/对照鱼死亡尾数)]×100

3.6 数据处理

均数士标准误(Mean±S.E)表示，处理间显著性用t检验，显著差异性以P<0.05或P<0.01计。所有统计采用 SPSS16.0统计软件。

4．结果

4.1 干酪乳杆菌对罗氏沼虾超氧化物歧化酶活性（SOD）的影响

干酪乳杆菌对罗氏沼虾血液和肝胰腺中超氧化物歧化酶活性（SOD）的影响结果如表2。由表2可知：肝胰腺和血液中SOD的含量在投喂干酪乳杆菌后开始逐渐升高，并在第14天达到峰值。而乳杆菌组的含量在达到峰值后有所下降，至28天后趋于平稳，但均显著高于对照组（p<0.05）；而肝胰腺中SOD的含量与血液中投喂干酪乳杆菌后的变化趋势基本相似，但肝胰腺中SOD的含量显著高于血液中的含量（p<0.05）。

表2 饲喂干酪乳杆菌后罗氏沼虾血液和肝胰腺中SOD (U/ml) 的含量变化

注：不同字母表示不同处理间差异显著（p<0.05）。比较只在同一时间点进行两两比较，未进行其他比较。

4.2 干酪乳杆菌对罗氏沼虾过氧化氢酶活性(CAT)的影响

干酪乳杆菌对罗氏沼虾血液和肝胰腺中CAT的影响结果如表3。由表3可知：肝胰腺和血液中CAT含量（以蛋白含量计算）均随着投喂时间的延长呈先增加后降低在趋于平稳的趋势，但肝胰腺中CAT的含量明显高于血液中的含量，且两者均在28 d达到峰值。其中，对照组血液的CAT含量为1.9-2.6 U/ml，而药物组随着干酪乳杆菌的加入其含量不断升高并于28天即达到峰值，至28天后稍有下降，至42天后趋于平稳，且均显著高于对照组（p<0.05）；投喂干酪乳杆菌后肝胰腺中CAT的含量与血液中含量趋势基本相似，其含量在28天达到峰值，至56天后趋于平稳，且均显著高于对照组（p<0.05）。

表3 饲喂干酪乳杆菌后罗氏沼虾血液和肝胰腺中CAT (U/ml) 的含量变化

4.3 干酪乳杆菌对罗氏沼虾溶菌酶活性(LZM)的影响

干酪乳杆菌对罗氏沼虾血液和肝胰腺中溶菌酶活性(LZM)的影响结果如表4。由表4可知：对照组血液和肝胰腺LZM含量相对稳定，两者在试验期间LZM的含量分别为0.6-1.1 U/ml和3.3-4.1 U/ml。而投喂干酪乳杆菌试验组血液中LZM的含量在投喂干酪乳杆菌后迅速上升，在第7d时即达到峰值，之后迅速下降并达到稳定，但各时间段LZM的含量均显著高于对照组（p<0.05）。而肝胰腺中LZM的含量与血液中投喂干酪乳杆菌后的变化趋势基本相似，但肝胰腺中LZM的含量显著高于血液中的含量，其含量在7天达到峰值，至42天后趋于平稳，且均显著高于对照组（p<0.05）。

表4 饲喂干酪乳杆菌后罗氏沼虾血液和肝胰腺中LZM (U/ml) 的含量变化

4.4 干酪乳杆菌对罗氏沼虾吞噬细胞吞噬活性的影响

干酪乳杆菌对罗氏沼虾血液吞噬细胞吞噬活性的影响结果如表5。由表5可知：吞噬细胞吞噬的活性（吞噬百分之和吞噬指数）均随着投喂时间的延长呈先增加后降低在趋于平稳的趋势，并在7d达到峰值。其中，对照组血液的吞噬百分比（PP）为19.5-23.8，且在试验期间稳定在这一水平。药物组随着干酪乳杆菌的加入其吞噬百分比迅速升高，在第7天边达到峰值，之后平稳下降，但与对照组相比其在各时间点均显著提高（p<0.05）。而对照组吞噬指数在各时间点内为3.6-4.0，且基本维持稳定在这一水平。而干酪乳杆菌组吞噬指数与吞噬百分比的变化趋势基本相似，其在7d时达到最高峰7.3，之后缓慢下降趋于稳定，且均高于对照组（p<0.05）。

表5 饲喂干酪乳杆菌后罗氏沼虾血液中吞噬活性的含量变化

注：不同字母表示不同处理间差异显著（p<0.05）。比较均在同一时间点之间进行比较。

4.5 干酪乳杆菌对罗氏沼虾抗副溶血弧菌能力的研究

投喂干酪乳杆菌84天后，随机采集各试验组池塘中的罗氏沼虾30尾，按照前期预实验确定的副溶血弧菌对罗氏沼虾的半数致死浓度确定攻毒剂量为10倍LD₅₀（1.5×10⁵cfu/g），攻毒7d后各组的死亡率如图1，由图可知：投喂干酪乳杆菌注射生理盐水组和对照组注射生理盐水组的死亡均为0。而投喂干酪乳杆菌注射副溶血弧菌组的死亡率为53.3%，投喂基础饲料组注射副溶血弧菌组的死亡率86.6%。根据公式计算干酪乳杆菌对罗氏沼虾副溶血弧菌的保护率为39.9%。

三、口服干酪乳杆菌GCGR-16增强草鱼多子小瓜虫的功能研究

1 材料与方法 1.1 干酪乳杆菌将干酪乳杆菌GCGR-16活化培养后，以4%接种量接种于MRS液体培养基中，30℃静置培养到稳定期（36h～48h），使用时用平板计数法测定制剂中细菌数量。

1.2 草鱼

购自湖州市某苗种繁育场，体重为25.6±4.8g，实验前于本实验室循环养殖系统用基础饲料进行适应性养殖1周，并随机抽取10尾鱼进行镜检观察，确定没有感染寄生虫。

1.3 口服干酪乳杆菌增强对草鱼抗多子小瓜虫的研究

在草鱼粉状饲料中分别加入 1×10⁷、1×10⁸ 和1×10⁹cfu/g饲料的干酪乳杆菌，40℃烘干。草鱼适应性养殖1周后，随机分成5组放置在养殖水槽中，水温25±1℃，每个水槽放置10只，每个水槽放置经曝气的自然水50L及网片，试验设置3个水平重复。每个水槽每天投喂2次，对照组投喂等量的正常饲料。投喂时间为每天上午9:00-9:30，以及每天下午16:00。投喂28天后进行体内杀灭小瓜虫攻毒试验。经上述各组进行投喂后的草鱼放置在18升的水桶中，并在桶里加入10升水，放入600000个小瓜虫幼虫进行感染，感染6h后，继续放回养殖槽进行饲养观察鱼体的死亡情况，并统计鱼体鳃部和鳍条上的虫体数量。试验pH 7.0～7.5，水温25±1℃。

鱼平均死亡率(%)=(投放的鱼数量-镜检时的鱼存活数量)/投放的鱼数量×100%

1.4数理统计方法

试验数据以均值±标准误 (Mean±SE) 表示。用SPSS11.5 软件进行单因子方差分析(One-way ANOVA)，以检验不同实验组间各指标平均值是否存在显著性差异。如有显著差异(P<0.05)，则作Duncan 多重比较分析。

2. 结果

使用乳酸菌后，草鱼体表和鳃上的小瓜虫数量明显减少。攻虫后第三天，对照组草鱼体表、尾鳍等均可见明显的白点（小瓜虫）。第5天即开始出现死鱼。而口服乳酸菌组草鱼则在第4天可见明显白点。同时其在第6天才发现死鱼现象，说明口服乳酸菌延缓了小瓜虫病的爆发。

1×10⁷、1×10⁸ 和1×10⁹cfu/g浓度的死亡率以及虫体的感染虫数见表6。由表6可知：口服干酪乳杆菌后对草鱼具有显著的抗小瓜虫感染的作用。10⁷cfu/g浓度组的死亡率为83.3%，其鳃上和鳍条的小瓜虫数为321.7±25.8。而对照组的草鱼死亡率为100%，鳃和鳍条上小瓜虫的数量为458.4±43.5，1×10⁹cfu/g浓度组的保护作用效果最佳，其攻毒后的死亡率为60.0%，其鳃上和鳍条的小瓜虫数为186.4±36.2，其对草鱼抗小瓜虫的保护率为40%。结果表明口服乳酸菌对草鱼具有较强的抗小瓜虫作用。

表6 口服乳酸菌对小瓜虫的体内杀虫效果

注：不同字母表示差异显著（p＜0.05）

四、口服干酪乳杆菌GCGR-16增强鲈鱼抗虹彩病毒的功能研究

1.2 鲈鱼

购自湖州市某鲈鱼苗种繁育场，体重为12.5±3.2g，实验前于本实验室循环养殖系统用基础饲料进行适应性养殖1周，并随机抽取10尾鱼进行PCR检测确保本批次鱼并未感染虹彩病毒。

1.3 口服干酪乳杆菌增强对鲈鱼抗虹彩病毒的研究

在鲈鱼粉状饲料中分别加入 1×10⁷、1×10⁸ 和1×10⁹cfu/g饲料的干酪乳杆菌，40℃烘干。鲈鱼适应性养殖1周后，随机分成5组放置在养殖水槽中，水温25±1℃，每个水槽放置10尾，每个水槽放置经曝气的自然水50L及网片，试验设置3个水平重复。每个水槽每天投喂2次，对照组投喂等量的正常饲料。投喂时间为每天上午9:00-9:30，及每天下午16:00。投喂28天后进行攻毒试验：将各组鱼分别放入独立已消毒的水泥池中，实验组和对照组全部进行攻毒实验，每尾背鳍肌肉注射剂量为 10 ^2.5 LD ₅₀/0.2 mL，每天观察记录各组鱼的死亡情况，并取各组攻毒后鱼的肝、脾、肾进行RT-PCR验证。

保护效率(%)=(对照组发病率－接种组发病率)/ 对照组发病率×100%。

1.4数理统计方法

2 结果

大口黑鲈投喂1×10⁷、1×10⁸ 和1×10⁹cfu/g 的干酪乳杆菌4周后进行攻毒实验，检测口服干酪乳杆菌对大口黑鲈的抗虹彩病毒的作用。攻毒结果表明：攻毒后第5天除1×10⁹cfu/g浓度组外，各组均有鱼开始发病死亡，且在7-9天时出现死亡高峰期；而1×10⁹cfu/g浓度组是在攻毒后第 7 天开始出现发病死亡，在第10天出现死亡高峰期，累积死亡率为60%；而对照组死亡率为100%。1×10⁷和1×10⁸浓度组的累积死亡率分别为80%，73.3%.进而计算1×10⁷、1×10⁸ 和1×10⁹cfu/g浓度组的免疫保护率分别为：20%/26.7%和40%。

经双重PCR 检测，攻毒后的发病鱼均感染了 LBUSV（见图2）。

Claims

1.一种干酪乳杆菌，其特征在于，名称为干酪乳杆菌GCGR-16，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年09月26日，保藏编号为CCTCC NO：M2019755。

2.根据权利要求1所述的一种干酪乳杆菌，其特征在于，从罗氏沼虾肠道组织分离而得。

3.如权利要求1所述的一种干酪乳杆菌的应用，用于增强水产动物免疫功能。

4.如权利要求1所述的一种干酪乳杆菌的应用，用于增强水产动物抗病功能。

5.根据权利要求4所述一种干酪乳杆菌的应用中，抗病的病原为小瓜虫、虹彩病毒中的任一种或几种。

6.如权利要求1所述的一种干酪乳杆菌的应用，用于制备增强水产动物抗病药物、饲料添加剂或者饲料。

7.根据权利要求6所述一种干酪乳杆菌的应用中，抗病的病原为小瓜虫、虹彩病毒中的任一种或几种。

8.一种水产动物饲料，含有权利要求1所述的一种干酪乳杆菌。

9.一种水产动物饲料添加剂，含有权利要求1所述的一种干酪乳杆菌。