CN104450629A - 一株中华鳖气单胞菌噬菌体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种中华鳖气单胞菌噬菌体，保藏号为CGMCC：No.9623,该噬菌体核酸部分序列片段与气单胞菌噬菌体同源性达到75%以上,能对中华鳖嗜水气单胞菌形成噬菌斑,对致病性气单胞菌具有裂解作用,可用于对气单胞菌所导致的疾病采用生物疗法治疗和预防。本发明的有益效果在于：特异性强、副作用小、增殖能力强、不易产生抗性、病原菌依赖性、使用方便，对中华鳖烂脖子病和白点病等具有显著的治疗作用。采用本发明治疗中华鳖烂脖子病和白点病等能达到特异性强、副作用小、增殖能力强、不易产生抗性、病原菌依赖性、使用方便的目的。

Description

一株中华鳖气单胞菌噬菌体及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种中华鳖气单胞菌噬菌体及其应用。 

背景技术

中华鳖(Trionyx sinensis)是我国淡水养殖名优产品中的主要种类，病害一直是鳖养殖业健康持续发展的重要限制因素，其中细菌性疾病是我国中华鳖养殖的主要疾病。目前已经报道了气单胞菌、爱德华氏菌、变形杆菌等致病细菌，可引起腹水病、红底板病、白斑(点)病、红脖子病、腐皮穿孔病、白底板病、胃肠炎病、疖疮病、烂尾(爪、颈)病等。其中以气单胞菌最多，可引起甲鱼肠道出血性败血症、鳖穿孔病（疖疮病）、红脖子红底板病等疾病，是迄今为止对中华鳖养殖业危害最大的病原菌。这类细菌可长期潜伏在鳖体内而不致病，但当环境突变或受污染、鳖体抵抗力下降时则可迅速导致疾病发生或流行。目前龟鳖病害防控主要采用抗生素、消毒剂等，虽能在一定程度上起到防治作用，但用药量大、有效期短，特别是抗生素的长期使用存在诱导耐药菌、引发水产品质量安全和产生环境污染等问题。 

噬菌体是细菌的病毒，其中的烈性噬菌体可在敏感菌细胞内增殖并使之裂解，是细菌的“天然杀手”，噬菌体也因此成为细菌性病害的防治途径之一。与抗生素相比，噬菌体还具有特异性强、副作用小、增殖能力强、不易产生抗性、病原菌依赖性以及使用方便等特点，是一种绿色的生物防治措施。 

文献《中华鳖嗜水气单胞菌病的研究》（陈建酬，佛山科学技术学院学报，2000）指出随着中华鳖集约化养殖规模的发展，由气单胞菌引起的中华鳖疾病也日益成为中华鳖养殖的主要病害，其中以嗜水气单胞菌引起的病害较为常见。文献《不同来源嗜水气单胞菌的抗菌素耐药性及耐药机制分析》（宋铁英，福建农业学报，2008）对分离到12株具有1个以上多拷贝质粒的菌株中，有11株呈现高度耐药性，多次使用抗生素会大幅加强菌株的耐药强度而使抗生素失去药效。文献《中华鳖致病性嗜水气单胞菌分离鉴定与药敏试验》采用K-B法药敏试验和96孔微型板二倍稀释法测定9种抗菌药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC)来分析抗菌效果，发现该菌对其中5种头孢类药物、加替沙星和恶喹酸等药物表现高度敏感,对磷霉素和氟甲喹中度敏感,头孢类药物优于喹诺酮类药物,锋哌螂磕抗菌效果最好，而长期使用抗菌药物会污染水质，同时增强嗜水气单胞菌的耐药性。文献《嗜水气单胞菌感染现状及耐药分析》（童照威，中国微生态学杂志，2008）分离到34株嗜水气单胞菌，发现其对哌拉西林、替卡西林、阿莫西林/克拉维酸、妥布霉素、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢他啶、环丙沙星、复方新诺明耐药率为52.9%～73.5%。文献《谷氨酰胺对嗜水气单胞菌致病中华鳖的保护作用》（杜宗君，四川动物，2014）发现注射Gln可缓解嗜水气单胞菌对中华鳖的致病作用,有效恢复机体抗氧化及非特异免疫力,降低死亡率，但是并不能治愈被嗜水气单胞菌感染致病的中华鳖，仅起到缓解作用。中国专利CN1112022公开了一种治疗嗜水气单胞菌病的高免血清及制备方法，通过菌种提取、抗原制备、动物免疫、采血制备血清、配制等过程制造出的高免血清，可对嗜水气单胞菌病有较好疗效，但是制作过程复杂，成本极高，不适用于大规模养殖业。中国专利CN102240323A公开了一种用于防控水生动物嗜水气单胞菌病的中药及其使用方法，以适当中药配比制成提取物计量入药，可提高水生动物的免疫力，对致病性嗜水气单胞菌有明显抑制功效，但是长久使用会产生病菌耐药性，且制药成本较高，不利于大规模养殖行业。中国专利CN103320365A公开了一株鱼源嗜水气单胞菌拮抗菌株及其应用，将一株鱼源嗜水气单胞菌拮抗菌株通过培养作为益生菌添加制剂添加入饲料或药物中，可防治大宗大水鱼类养殖中嗜水气单胞菌引起的爆发性出血病，但是其工艺复杂，普适性差，特别是对于中华鳖的治疗效果较差，且暂不明其毒副作用。美国专利US20100221286A1公开了一种对水生动物嗜水气单胞菌活体疫苗的修饰（Modified live aeromonas hydrophila vaccine for aquatic animals），通过将突变株NRRL-B-50040 和 NRRL-B-50041一定质量配比后作为新的嗜水气单胞菌疫苗，可以有效治疗嗜水气单胞菌病，但是其生产工艺非常复杂，对生产要求极高，且国内无法市购，不能用于大规模养殖。美国专利US20040077067A1公开了一种从嗜水气单胞菌表面蛋白中分离得到的治疗药（Therapeutic and prophylactic agents derived from aeromonas hydrophila bacterial surface proteins），可通过与嗜水气单胞菌表面蛋白拮抗来抑制嗜水气单胞菌，但是生产工艺复杂，对生产要求高，仅适用于小规模实验，而无法用于大规模生产。 

发明内容

为了解决养殖过程中由于中华鳖气单胞菌病常引起多种中华鳖病害，从而导致养殖户大量用药，引发食品安全和生态安全的问题，我们提出了一种中华鳖气单胞菌噬菌体及其应用，本发明的噬菌体对多个中华鳖气单胞菌临床分离株均有良好的裂解能力,对中华鳖烂脖子病和白点病等具有良好的治疗作用。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

为实现上述目的，本发明提供一种中华鳖气单胞菌噬菌体，命名为NTHP01，属于细菌病毒双股DNA病毒（dsDNA virus, no RNA stage）群尾病毒目（Caudovirales）肌尾噬菌体科（Myoviridae）T4样噬菌体属（T4-like viruses），保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日2014年8月28日，保藏号：CGMCC：No. 9623，分类命名为（Pelodiscus sinensis Aeromonas phage）。

本发明提供的中华鳖气单胞菌噬菌体是通过以下步骤获得的： 

（1）采用随机引物扩增法获得中华鳖气单胞菌噬菌体DNA序列。

（i）取中华鳖肝、脾、肾、肺、肠组织匀浆，12000rpm/min离心20min； 

（ii）取上清液0.22μm过滤，从滤液中提取DNA。

（iii）以该DNA为模板， 94℃变性3 min，冰上冷却退火延伸2 min，加入0.5μL 3’-5 ' exo-Klenow DNA Polymerase 后置于37℃水浴1h，重复一次上述变性、退火及延伸过程，将DNA末端补平。反应体系如下表： 

10×Klenow Buffer	3μL
		dNTP (2.5 mM)	4μL
FR26RV-N引物（1 0 μM）(GCCGGAGCTCTGCAGATATCNNNNNN)	2μL
		3’-5’ exo-Klenow DNA Polymerase	1μL
DNA模板	3μg
		ddw	to 30μL

（iv）反应产物即为双链cDNA和补平的双链DNA，作为后续扩增模板。

（v）上述后续扩增模板应用FR20R-V单引物进行随机PCR扩增，反应体系如下表： 

10×ExTaq Buffer	5μL
		MgCl2 (2.5 mM)	5μL
dNTP(2.5 mM)	4μL
		FR20R-V引物(10μM) (GCCGGAGCTCTGCAGATATC)	4μL
ExTaq	0.5μL
		后续扩增模板	5μL
ddw	26. 5μL

PCR反应程序为94 ℃ 预变性2min，之后进入94 ℃ 1min，65 ℃100 s，72℃ 2min循环扩增，循环数40次，最后72℃延伸10min。

（vi）取5μL 反应（v）中PCR产物，经琼脂糖电泳检测后回收，用PCR 产物纯化试剂盒进行纯化。 

（vii）用限制性内切酶EcoRV 切除纯化后产物中的引物。酶切反应体系如下表： 

PCR产物	20μL
		EcoRV	2.5 μL
Buffer	2.5 μL

反应条件为37℃，作用时间3 h 。

（viii）酶切产物1 % 的琼脂糖凝胶的条件下进行琼脂糖凝胶电泳，切取D N A大小范围在600 ~1500bp的凝胶，回收目的片段。 

（ix）将回收的DNA片段和pSIMPLE 18 EcoRV /BAP Vector进行连接，连接体系10μL，16℃条件下连接6 h。 

（x）将10μL的连接产物加入100μL大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30 min后，42℃ 水浴热击90 s，迅速置于冰上2 ~ 3 min。 

（xi）向EP管中加入1 mL无抗性液体LB培养基，然后将其置于37℃，转速为180r/ min的摇床中震荡培养复苏1 h。 

（xii）2000 r /min 离心2 min收集转化后培养的感受态细胞，弃掉大部分上清，将管底细胞轻轻吹打混匀后，均匀涂于氨苄青霉素抗性的LB平板上，37℃培养箱中培养16 h。 

（xiii）挑取单克隆进行菌液PCR鉴定，筛选500bp以上片段大小不等的96个阳性克隆进行测序。测得的序列拼接后去除载体序列，并在NCBI数据库中，应用Blastn和Blastx工具分别进行核苷酸序列和框架阅读翻译的氨基酸序列比对。 

（2）序列比对结果：与中华鳖组织同源序列76个，与其他细菌同源或未知的序列有72个，与噬菌体同源的序列有20个。其中与噬菌体同源的这20个部分序列的比对结果均显示与气单胞菌噬菌体有较高同源性，同源性达75-97%不等。 

（3）噬菌体部分核酸序列。20个噬菌体序列片段如附表1。 

（4）噬菌体培养与收获，步骤如下： 

（a）培养新鲜气单胞菌菌液至OD₅₅₀为0.25；

（b）加入MgCl₂使之终浓度达4mM, 静置吸附20-30min，摇动5个小时后收获；

（c）将培养液移入离心管中，以10,000 rpm离心10分钟，以沉淀寄主细菌；

（d）将上清液移至新管中，以0.22μm孔径之过滤器去除残余菌体，即得不含寄主细菌之噬菌体原液；

（e）双层平板法测定其效价。

优选地，该噬菌体核酸部分序列片段与噬菌体同源性达到75-95%（图1）。 

优选地，该噬菌体能对中华鳖嗜水气单胞菌形成噬菌斑，步骤如下： 

（1）配制2%LB琼脂培养基和0.7%半固体LB培养基，将融化后的2% LB琼脂培养基倾注培养皿底层，凝固后为底层培养基，将0.7%半固体LB培养基融化后于48℃保温；

（2）将噬菌体与中华鳖嗜水气单胞菌混合，吸附30min；

（3）将噬菌体与中华鳖嗜水气单胞菌混合液体与0.7%半固体LB培养基混合，倾注在底层培养基上；

（4）28℃培养8小时，可见透亮的噬菌斑，其直径约为1-2mm，周围无晕环（图2）。

本发明同时提供一种中华鳖气单胞菌噬菌体的应用，对致病性嗜水气单胞菌具有裂解作用。通过双层平板法，将该噬菌体对临床分离的气单胞菌TSZO1、NTH01、NXJB02、TSL01、XHO1等多株临床分离致病性气单胞菌共同培养，发现该噬菌体对气单胞菌TSZ01、NTH01、NXJB02、TSL01、XH01等多株临床分离致病性气单胞菌均具有良好的裂解作用。 

优选地，这种中华鳖气单胞菌噬菌体可用于对气单胞菌所导致的疾病采用生物疗法治疗和预防。 

优选地，所述气单胞菌所导致的疾病为中华鳖烂脖子病和白点病。 

优选地，所述对中华鳖烂脖子病和白点病治疗方法如下： 

（a）将已患烂脖子病或白点病的中华鳖放入水中；

（b）每升水中泼洒1×10⁹噬菌体液0.1~10mL， 每2日泼洒1次；

（c）连续泼洒3-4次， 7天左右痊愈。（图3）

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：特异性强、副作用小、增殖能力强、不易产生抗性、病原菌依赖性、使用方便，对中华鳖烂脖子病和白点病等具有显著的治疗作用。

附图说明

图1为中华鳖气单胞菌噬菌体部分DNA序列Blast对比图； 

图2为中华鳖气单胞菌噬菌体在气单胞菌临床分离株培养物上形成透明噬斑现象图；

图3为经中华鳖气单胞菌噬菌体治疗烂脖子病后痊愈的中华鳖图。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通或改变都落入本发明保护范围；且下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。 

实施例1：

一种中华鳖气单胞菌噬菌体，获得方法如下：

（1）从患烂脖子病的中华鳖身上分离得到气单胞菌，培养新鲜气单胞菌菌液，使菌液OD₅₅₀为0.25；

（2）加入MgCl₂使之终浓度达4mM, 静置吸附20-30min，震荡培养5个小时后收获；

（3）将培养液移入离心管中，以10,000 rpm离心10分钟，以沉淀寄主细菌；

（4）将上清液移至新管中，以0.22μm孔径之过滤器去除残余菌体，即得不含寄主细菌之噬菌体原液；

（5）双层平板法测定其效价，步骤如下：

（a）配制2%LB琼脂培养基和0.7%半固体LB培养基，将融化后的2% LB琼脂培养基倾注培养皿底层，凝固后为底层培养基，将0.7%半固体LB培养基融化后于48℃保温；

（b）将噬菌体与中华鳖嗜水气单胞菌混合，吸附15-30min；

（c）将噬菌体与中华鳖嗜水气单胞菌TSZ01混合液体与0.7%半固体LB培养基混合，倾注在底层培养基上；

（d）28℃培养8小时，测量噬菌斑的直径。

该中华鳖气单胞菌噬菌体对中华鳖烂脖子病治疗步骤如下： 

（1）将已患烂脖子病的中华鳖放入水中；

（2）每升水中泼洒1×10⁹噬菌体液0.1~10mL， 每2日泼洒1次；

（3）连续泼洒3-4次，7天左右痊愈。

实施例2：

获得步骤和治疗步骤与实施例1基本相同，不同之处在于治疗对象为患白点病的中华鳖。

对比例：

采用市购氟苯尼考药物，以相同方式治疗患病中华鳖。

通过以下对比试验来表明本发明的效果： 

1、概况

2013年3月~2014年6月，分别使用实施例1、实施例2和对比例治疗患烂脖子病或白点病的中华鳖，通过双层平板法评价其效价，同时进行噬菌谱检测，并统计患病中华鳖的治愈比例。

2、实验分组 

在2013年3月~2014年6月共获得38只患烂脖子病或白点病的中华鳖，分别使用实施例1、实施例2和对比例来进行治疗，治疗结束后观察15天放回原养殖池，实验分为3组，分组情况如下：

A组：随机选取13只病鳖，使用实施例1进行治疗；

B组：随机选取13只病鳖，使用实施例2进行治疗；

C组：随机选取12只病鳖，使用对比例进行治疗。

3、实验条件 

恒定水温24℃，每日日照16小时，每日投喂市购软颗粒饲料两次，发现死鳖及时打捞。

4、指标检测 

（1）将实施例1和实施例2进行双层平板法测量噬菌斑直径；

（2）将实施例1和实施例2进行噬菌谱检测；

（3）治疗7天内病鳖烂脖子病或白点病结痂甚至脱落，且观察15天内不复发为痊愈；

（4）治疗7天内病鳖烂脖子病或白点病未完全结痂消失，且在观察15天内完全消失结痂且不复发为基本痊愈；

（5）治疗7天及观察15天内病鳖烂脖子病或白点病未消失或死亡为无效。

5、实验结果 

表1为实施例1和实施例2进行双层平板法测量得到的噬菌斑直径，由表1可知，实施例1和实施例2获得的噬菌体对5株中华鳖气单胞菌临床分离株产生良好的抗菌效果。

表2为实验结束各组痊愈、基本痊愈和无效的统计。由表3可知，该噬菌体能有效治疗中华鳖烂脖子病和白点病，基本达到100%治愈率；而市购氟苯尼考药物前期治疗效果显著，后可能由于出现病菌耐药性，导致氟苯尼考药物药效大减，最终治愈率仅为58.3%。 

表1：噬菌谱及噬菌斑直径测定 

菌株名称	实施例1噬菌斑检测	实施例2噬菌斑检测
			TSZ01	出现1-2mm直径的噬菌斑	出现1-2mm直径的噬菌斑
NTH01	出现1-2mm直径的噬菌斑	出现1-2mm直径的噬菌斑
			NXJB02	出现1-2mm直径的噬菌斑	出现1-2mm直径的噬菌斑
TSL01	出现1-2mm直径的噬菌斑	出现1-2mm直径的噬菌斑
			XH01	出现1-2mm直径的噬菌斑	出现1-2mm直径的噬菌斑

表2：噬菌体治疗中华鳖烂脖子病和白点病

	实施例1	实施例2	对比例
				痊愈	13	12	7
基本痊愈	0	1	0
				无效	0	0	5
总数	13	13	12

附表1：

                         SEQUENCE LISTING

<110>  浙江省淡水水产研究所

<120>  一种中华鳖气单胞菌噬菌体及其应用

<130>  1111

<160>  20    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  597

<212>  DNA

<213>  中华鳖(Trionyx sinensis)

<400>  1

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<210>  2

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<213>  中华鳖(Trionyx sinensis)

<400>  2

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<210>  4

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<210>  5

<211>  851

<212>  DNA

<213>  中华鳖(Trionyx sinensis)

<400>  5

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gattcaaatc gacaaagaag ctaacgaaat cgctcgtcaa actggtcgtg gtgctggtaa    600

cttcatcatc gcttctcgta acgtcgtttc tgctctggct ccgatcgata ccaacatcag    660

ccctgctgct caaggtatgg cttctggcct gaatgccgac accactaaag gcgtattcgc    720

tggcgttctg ggtggtcgct acaaggtcta tatcgaccag tacgctcgtc aagattactt    780

caccatgggt taccgcggtg ctaacaacct ggatgccggt atctactact gcccatacgt    840

tgcactgact c                                                         851

<210>  6

<211>  407

<212>  DNA

<213>  中华鳖(Trionyx sinensis)

<400>  6

caggatccaa ggccgttggt gctgccgccg aggctaaact gtacgaagat gctgtccaat     60

tcaacggcta ccgcgcccag tttttcgctg gattcagcca gcagtttatc tttcagggac    120

attggttttt cctttagttc aacattgaag ccatattttt agccatttgg ctgagtctca    180

tgttaacgaa attgctgaat ctgccgaagc tcgtttggct gaaggtgttg aagccgctgg    240

tgctgccgcc gaagctaaac tgtacgaaga tgctgtccaa ttcaacggct accgcgccca    300

gtttttcgaa tctgttcaac tggacgaatc cgtaaaagcc aatgtttcta ctgcgtttga    360

gcaagctgtt cgtgccgccg ctgtgaccct ggctgagtcg gatcctg                  407

<210>  7

<211>  755

<212>  DNA

<213>  中华鳖(Trionyx sinensis)

<400>  7

caggatccac tagccctata attgagtata ctgtaaagct agaaatggcg attaagaaaa     60

ggaagcctaa attaaggttc gcaagtggga atggtattgg tagtggtatt caaactgata    120

gggctagtaa tagggcaagg gttggggcaa ggataaatag tataggggat ggcgatatcc    180

atcacccgga aaataaaaaa gggagcccga aggctccctt gaccgtcctt ggtaaaacca    240

agtccttttg aattacagac ctttaaccca tacacggcgg aagtaagcgt tcttacctac    300

gctgttaaca cctggcatac cgctggagat gcgggatacc ggagcttgag tgcgagactc    360

agcgaacggg ttaacaccga ttgcgtaacg ggtcttaaag cccatgaccg gttggaagtt    420

cttcggatca gcgccacgca gaggagtcag tgcaacgtat gggcagtagt agataccggc    480

atccaggttg ttagcaccgc ggtaacccat ggtggagtaa tcttgacgag cgtactggtc    540

gatatagacc ttgtagcgac cacccagaac gccagcgaat acgcctttag tggtgtcggc    600

attcaggcca gaagccatac cttgagcagc agggctgatg ttggtatcga tcagagccag    660

agcagaaacg acgttacgag aagcgatgat gaagttacca gcaccacgac cagtttgacg    720

agcgatttcg ttagcttcgt tgtccattga tcctg                               755

<210>  8

<211>  849

<212>  DNA

<213>  中华鳖(Trionyx sinensis)

<400>  8

caggatctgt cgcgaagcta aactgtacga agatgctgac aaattcctgt cacacctcgg     60

taatacctgg ctggctgaaa acaagcaagc cgtacaaacc tctattaaag ctgaactgtt    120

tgaatcaatg accatcggtc ttaaagaact gttcatcgaa aataatgtgt ccgtccccga    180

cgaacaagta aatgttgttg ccgaacttga aactgaactc gacgaaacca ccgccgaagt    240

taagtctttg tttgacaaga acctggctct ggaagagcaa attgcagcac tgcaaaaaga    300

aaaagctctg tccgaagcca ccatggactt gaccgagtcc cagaaggaaa aagttctgaa    360

cctggtcgaa ggcctggaat tcggtgataa attcaccggc aaactgtctg cgatcgttga    420

aatggtcact gcttcaagcg ccaaaactga taccggcctt caagaaagtg cattaaatat    480

agatgaatct gcagctgctg gtaatttcgg acctgaagtt gttattaacg agcaaaaaga    540

aaagcaggca aatgatccca tggccgccta cctggccgct gcttcccgta tgtcttaatt    600

tttaaaaggt caataaacca tgtctctgaa aaacaaagaa atcctgaaca agtggacccc    660

tctgctggaa ggcgaaggcc tgccggaaat tgcgggtaag aacaagcaag ctctggttgc    720

tcaaatcctg gaagctcagg aaaagatgct accactgatc cagtataccg cgacgacaaa    780

ctgatcgaag cctttggtca atctctgcga gaagctgatc ctgatttcag cacactggcg    840

gccgttact                                                            849

<210>  9

<211>  633

<212>  DNA

<213>  中华鳖(Trionyx sinensis)

<400>  9

caggatcaac taccgacaat catttctggg ctgatgttca atagacgcaa gatacttgga     60

tacagagatg tcaagtcgaa actcaaacca taacgatagg cgcctgggac aggttcctta    120

acgtatgcgc cagggaaact ctgctttgga ctcgccttca tcgctggaat aacaatgttc    180

tgttcagcca gtgagttgaa gatgattgaa tcccaaactt taatggtacc caacaccatg    240

tcgtaagtaa tcttggcata atacgacagt gacagaatca ggtcaataaa gcaacgacgg    300

ccgtcaatca gcaagataat atcagtatct cgtacgcaat aatcaacata acgctggtgg    360

tctgctgctc ggaacttgtt gattggacct tcgtaatcca atttgtcagc tttaacttct    420

cgataaccta cgttacccaa tttataatcg ggcgtcggag tgaaactgaa tttcttgaac    480

acatccatat aatccataag cgcaatgcca tgaattttgt aaatgatctt ctcaccgtaa    540

aggttgttga cggttttgga tgtgattttg ccgtacggac taagttgatt tgctgctttt    600

tcacccagaa tattggttat gcgggtgatc ctg                                 633

<210>  10

<211>  560

<212>  DNA

<213>  中华鳖(Trionyx sinensis)

<400>  10

caggatccgc tggaggtaat ttatgtcgga aatacccgag ctcgcgaaaa cgttggtttc     60

gtataagtat cctaaaagtc gtatatttag accgggagaa ccggtctatt ttatccacga    120

cggataccgc tatgcgggaa ctgtgataca attcaaattc ggaaagtatc gaatcgatta    180

caacggcgac gtaaagttcg taaacgcaaa tcaagtagag agaagatatg aatattgatc    240

aatatgacgt aaatgatttt gtattggact gggaaactat gggcaacgct ccggaaggcg    300

caattgtcga cctggcgatg gttgtattca atcacaaccc ttacaaactt ccaacctttg    360

aagagctgtg ccaaaaagct gttcgtttca agtttgacct gaaatcccaa aagggtcggc    420

gcattttcga ccaaggaaca atggattggt ggaagaagca agaccctgaa gcccaaaagc    480

atcttaaagc atctcccgaa gatattgact acactgagtt ctatccaaag atgatggaat    540

tcctgaacac tatgatcctg                                                560

<210>  11

<211>  854

<212>  DNA

<213>  中华鳖(Trionyx sinensis)

<400>  11

caggatctcc attgactccg agacttacaa tgtctccggt gaccacccgc agttcatgga     60

aatcatcggt cttctgcgtg aagaaaaata cgatgaagca atggaaatgt tgaatatcaa    120

acgcggtctt gagcgttata tctccggcga cctagttgtc gagggcggca ccctgaagta    180

caaagacctt atcatcgatt caggtcttac tcgccggatc gtagaaaaaa tgcagaatgg    240

cgaacctttc gaaccgcttg tcgcattctt cgaaaatctg atggccaacc caagccggcg    300

agcagtatat caactgtacg acttcctgga acacaacgat attgaaatta ccgatgacgg    360

ctatttcatt gcatggaagc gcgttaatac cgatttcact gacaagtaca ccggcaaatt    420

cgataattct cctgggacga tcgttgcagt gaaccggttc caagttgatg aagaccccaa    480

cgtcacctgt tctcacggtc tccatgttgc tgcaaaatcc tatatccctc attacggcgg    540

cggttccgga aaaataattg catgcaaggt caaccctgct gatgtagtcg ctattccgac    600

tgattacaac aatgccaaaa tgcgttgcgc tggctatgaa gttctttacg aagtaaccag    660

ttcatttaaa gaaatgaatc actattaatt cataagccct cttcggaggg cttatttgta    720

aggagattta aatgattccg atgaacgtcg agcgcgacga atttaacgct ttacgccata    780

tccaaccgtt tgatattgac attattcatt tgcaaatatg cgatcagttg aaaaagcaac    840

ccgatattcg aacc                                                      854

<210>  12

<211>  761

<212>  DNA

<213>  中华鳖(Trionyx sinensis)

<400>  12

caggatcctc tcaacccgcg acatatcgtc aaaacgagtt ttaagtttca atggactaac     60

aattttgtaa ccttcggttc cggtattaac ttcggcgtga gtcgcaatag ccgcgatacc    120

ggttcgagct tcttgagcag ttcggtcatt cagcttcttc ggagttattg cgcgggtatc    180

atcagcacca gcattagttt cggcttgcgt ggcaatttca atcaaaccat ggtttgactc    240

agaagctcgg cgagctgcta agcgttcagc ggtaacaaga agaggcccgt tggaatcggt    300

cgatccaccg tcaacttcaa gctgagtcgc gatatatcct acacccttag ctgtttcagt    360

tgctacgaac tcatccagag ttgctggagt tacagcccgg agatggtcgg cacggttata    420

aacaccgact ccggccaaat tgcgagcagt tcccggagtt ccggattttt tgacaattgc    480

caagatacca gtcaatgttt cagatgcaac acggttatgc aactttttag gagttacaat    540

tgttgtgtcg tcagttgaac cgtttgcttc accttgtgtt gcgatttcgg cgaggcctcg    600

acgggtttcg gtcgcggttc gcgcattcaa ctctttcggt gtaacaatga catcatctag    660

gtatgtcgct gtcgaaattt ggctaacttc accggttgtt gcaatgcgag caataccacg    720

acgggtttca gtagcagttt ttctcgacaa aggcgatcct g                        761

<210>  13

<211>  619

<212>  DNA

<213>  中华鳖(Trionyx sinensis)

<400>  13

caggatctcg ctaccaattt tatatttatc gggccacgct ttgtttgacg cgatatatac     60

atatccttct ttaattccag ccgctttatt accattacga taatacttaa cacgcaaaag    120

ggataagcga gtgtaattca attgagtagc tatagctttg aaatagcctc gatttcgttt    180

gatgtgcatc aacttagttg atgggtatat gtatttaaaa aatacaagtt ttaccaaatc    240

gtcagaaatt tcaaaatcgg cttgatcgat accttcattt atcaaataat tattgtatcg    300

ttcaacaatt gaatttactt cttcttgcgt cataatatga atctcacata aattgatttt    360

ggcggttgat tcccgactcg aacgggagac ccgcgggtta acagtccgcc gctctaacca    420

actgagctaa tcaaccccaa aatcaacttg ttttaatcga tgagataata atatctcatt    480

tctggcaaat ctaaacaata tgcttcagaa ttaatgggtg ctggtaggat tcgaacctac    540

gatacgcttt cgtatgtccc gttctgggac cgccttaagc cactcggctc acagcaccac    600

aatttggagg aagatcctg                                                 619

<210>  14

<211>  721

<212>  DNA

<213>  中华鳖(Trionyx sinensis)

<400>  14

caggatcagc ttatgccgaa atcaagaacg aaccaatgtt cttcaacagc gatcttgagt     60

ttgcgtacga gaacggcggc cctatcacca gaagttttat cgaaaatctt ccgggagatt    120

ggttgttcgg cggcgacatg atctttgatt cccgtgttca catgcttatg cctggatggt    180

atcccgcgat tcccggttat caccatgacg atgtacctcg gcctccgatt ccagttgggc    240

aacactttgc cacagctggt cagcctgact atgataaccc acgttatctg tctcagcata    300

ttttgggatt ggttaacgct gatgtatgcc caacgcattt tgcagtagga caatcagaat    360

tcagccaaat tccggacggc gaacttgtct accgacagtg gcaccaggaa gtcatggcta    420

aacttgagtc tggtgagttg agtaaacaca ttgcacctga tcgaactctt gtagagtttg    480

actggcaaac ttggcacacc ggttcaaaag cggttagcaa tggatggcgt tggtttgggc    540

gagtttctcg caataccgat cgagttctta ctccgtccaa tgaaattcgc cggcaagttc    600

aagtttacat ggaattcccg atggagggtt ggtgatggaa ttaacacttg aacaagcatt    660

ggctagaatc gcatctatgg atgatgagga gattctcgca cgcctagacg acatgatcct    720

g                                                                    721

<210>  15

<211>  209

<212>  DNA

<213>  中华鳖(Trionyx sinensis)

<400>  15

caggatccat cgtaccgatt caccacgttt tcgagaataa tatggatact tgaaatccac     60

cccggcccct tcgatgcctt cgtcatgcca ggcttccata agatgctgtt cacccgagtt    120

gctcatataa gaaatgaacc attctttcag atgtgctggc aattttacaa caacagtttc    180

catttcaaat ctcctgagca cggatcctg                                      209

<210>  16

<211>  380

<212>  DNA

<213>  中华鳖(Trionyx sinensis)

<400>  16

cagggccgga gctctgcaga tatccggtaa gccgctttaa ggacagagtg ccggagctct     60

gcagatatca agtctatcct agaaaacccg atggataaag ctgaagccca gcaagctatc    120

cgcaagttga attctatggc cgaggaattc gaatcgatcg cccaggctgt tgccgatcga    180

ttctgcattt ccttctcaac tggtgattat ggctatggcc gcacttacta tcccaaaggt    240

catgactact gggaagaaag tcgagctgaa gattatggcc aaggcgccga ccatggctac    300

tgcctcagct cctctgatat gtgttaagga gaaaagaaat ggctcgttct aatgaattgg    360

tagaaaaggc gatcctgaat                                                380

<210>  17

<211>  813

<212>  DNA

<213>  中华鳖(Trionyx sinensis)

<400>  17

caggatcgcg gaaggagaaa aagttatggt tttgccgctt cgcgacagga acccatttaa     60

cgaagcgtgt tttgcttggc cgtccggcac tgcgattcca gatgcagtag ctggtgacgt    120

gttaaaatac atggacatca acaagttgtt tgaaaaaaca ttcgttaagc ctttgagctc    180

aatctgtgaa gcaacaaaga ctgattacga attccgcaat aaccttttcg atatgtttga    240

catttaagga ataaaaatgc aatatatgac aactaaaaat atccgtgacg aactcgcaca    300

taaattcgtg aaaggtgaat tcattaccga caagtccggt gttaaaacta tcgaactcgc    360

cccagttatg ttcaaggccg atgaggcctt gattttcgac aaactcaacg aagattatat    420

cgagcgcgaa ttggcttggt atctttcgga atctcgttac gttgccgata ttccaggtaa    480

aactccagcc atttgggaag ctgtggctga tgaaaatgga atgatcaact cgaattatgg    540

ctgggcaatt ttttccgaag acaatggtaa ccaattcgcc aacgttctca tgcatctggc    600

caatgatcca aacactcgtc gtgcaaacat gatttatact cggccgtcga tgcacaccga    660

ttataacggt ggaccgatat ctgcagagct ccggcaaggg atgttgcgga ggttcaagat    720

gttattgctg tggatatttt gttggtctct aatagtttga ttgttaatag tattgttgta    780

gttaaggtaa tgtatgtata aaaggttaat aat                                 813

<210>  18

<211>  285

<212>  DNA

<213>  中华鳖(Trionyx sinensis)

<400>  18

caggatcccg cgttgtagac gtcccgaata tagggtcatg ctcaattgac gggattaccg     60

acaaaacaga atgtatcact attggaggcc gttggacagc aacgcaccaa tcagtcgagc    120

cgccgcgcgg tacagcaatg tctattgata tgggcgatgg ttatttgtgg gaatatttgt    180

acactattcc gcctgatgtt tcaatcaacc gatgcactaa tgaatacatt gttgttccat    240

ttagtgatga gctcaaagac gatccagccc gttggggcga tcctg                    285

<210>  19

<211>  520

<212>  DNA

<213>  中华鳖(Trionyx sinensis)

<400>  19

caggatcgcc gatgaagttg gcgcaaaact gatggttgat atggcacatt ttgctgggtt     60

tgttgctgcc aaattgcaca ccaatccatt gaccgttgca gatgtcgtca caaccactac    120

tcataaaaca ttgagaggcc cgcgtggcgg acttattctt accaacgacg ctgaaatcgc    180

gaaaaagata aattcagctg tcttcccggg tattcagggt ggcccgcttg tgcatgttat    240

cgcagcaaaa gccgtttgct ttggagaagc gcttactccc gaatatcgtg agtatatgaa    300

acaggttgcc gaaaatgcta aagcaatgca tgccgccttt aatgcttcag attgctatct    360

tgtcggcggt atcggaaatc accaggttct tttgaacaca cagcgcagct tcggtatttc    420

gggtcgtgaa gccgaacaat tgctggagaa agaaggtatc atcgtcaata agaatatgtt    480

gcctaatgat cctcttcctc cggttgttcc tcggatcctg                          520

<210>  20

<211>  634

<212>  DNA

<213>  中华鳖(Trionyx sinensis)

<400>  20

caggatcaca gacggtttag cgccggcagt atgcatcgtc ggccatttcg caaaagaggt     60

cttgatctcc agattaaaat cgggtgttgg cacgtcaaag gtgatgttat cattgtccaa    120

ccaatcgaat acaccctgaa taccacctag gatataggca acacccatct cagcattgag    180

agaatgaatt gttcggtcga taatatcctg ccgaggtatg tctagtcctt gcgcttcatt    240

gatagcatat ttgattgtgt cgtcatatcg tgttgcacgt ttgtcaaaca aatcggttcg    300

aatatcgggt tgctttttca actgatcgca tatttgcaaa tgaataatgt caatatcaaa    360

cggttggata tggcgtaaag cgttaaattc gtcgcgctcg acgttcatcg gaatcattta    420

aatctcctta caaataagcc ctccgaagag ggcttatgaa ttaatagtga ttcatttctt    480

taaatgaact ggttacttcg taaagaactt catagccagc gcaacgcatt ttggcattgt    540

tgtaatcagt cggaatagcg actacatcag cagggttgac cttgcatgca attatttttc    600

cggaaccgcc gccgtaatga gggataagat cctg                                634

Claims (7)

1.一种中华鳖气单胞菌噬菌体，其特征在于，中华鳖气单胞菌噬菌体命名为NTHP01，属于细菌病毒双股DNA病毒（dsDNA virus, no RNA stage）群尾病毒目（Caudovirales）肌尾噬菌体科（myoviridae）T4样噬菌体属（T4-like viruses），保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏日2014年8月28日，保藏号：CGMCC：No. 9623。

2.如权利要求1所述的一种中华鳖气单胞菌噬菌体，其特征在于，该噬菌体核酸部分序列片段与气单胞菌噬菌体同源性达到75%以上。

3.如权利要求1所述的一种中华鳖气单胞菌噬菌体，其特征在于，该噬菌体能对中华鳖嗜水气单胞菌形成噬菌斑，步骤如下：

（1）配制2%LB琼脂培养基和0.7%半固体LB培养基，将融化后的2% LB琼脂培养基倾注培养皿底层，凝固后为底层培养基，将0.7%半固体LB培养基融化后于48℃保温；

（2）将噬菌体与中华鳖嗜水气单胞菌混合，吸附15-30min；

（3）将噬菌体与中华鳖嗜水气单胞菌混合液体与0.7%半固体LB培养基混合，倾注在底层培养基上；

（4）28℃培养8小时，可见透亮的噬菌斑，其直径约为1-2mm，周围无晕环。

4.一种中华鳖气单胞菌噬菌体的应用，其特征在于，对致病性气单胞菌具有裂解作用。

5.如权利要求4所述的一种中华鳖气单胞菌噬菌体的应用，其特征在于，可用于对气单胞菌所导致的疾病采用生物疗法治疗和预防。

6.如权利要求4和5所述的一种中华鳖气单胞菌噬菌体的应用，其特征在于，所述气单胞菌所导致的疾病为中华鳖烂脖子病和白点病。

7.如权利要求4、5和6所述的一种中华鳖气单胞菌噬菌体的应用，其特征在于，所述对中华鳖烂脖子病和白点病治疗方法如下：

（a）将已患烂脖子病或白点病的中华鳖放入水中；

（b）每升水中泼洒1×10⁹噬菌体液0.1~10mL， 每2日泼洒1次；

（c）泼洒3-4次，7天左右痊愈。