CN114272298A - 一种柳树皮提取物、其复方制剂及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种柳树皮提取物、其复方制剂及应用。所述柳树皮提取物中原药浓度为1g/mL，溶剂为水或乙醇‑水混合液。该柳树皮提取物可用于制备产β‑内酰胺酶细菌抑制剂或杀菌剂，并且将该柳树皮提取物与抗生素联用对于产NDM‑5型猪大肠杆菌有很好的协同抑菌作用，有望进一步开发成该超级耐药菌株的有效抑菌剂或杀菌剂。

Description

一种柳树皮提取物、其复方制剂及应用

技术领域

本发明属于抑菌药物开发技术领域，具体涉及一种柳树皮提取物、其复方制剂及应用。

背景技术

产房仔猪腹泻一直是养猪生产中危害产房仔猪的一种严重性消化道性疾病。在集约化规模化猪场、中小规模猪场以及农村散养户猪场，产房仔猪腹泻是养猪生产中常见的疾病，该病不仅导致仔猪生长缓慢，饲料报酬低、体型大小不一致，料肉比升高，成为僵猪甚至死亡，并且死亡率高，能达到100％死亡率。严重影响了规模化猪场的运营状况，给养猪业带来极大危害和造成重大经济损失。引起产房仔猪腹泻的原因主要有以下几个方面：细菌、病毒、霉菌等。其主要原因为大肠杆菌引起的黄白痢和断奶仔猪腹泻。

仔猪黄痢，潜伏期短，生后12h以内即可发病，长的也仅1～3d，日龄更长者少见。仔猪白痢，病猪突然发生腹泻，排出乳白色或灰白色的浆状、糊状粪便，味腥臭，性黏腻。腹泻次数不等。病程2～3d，长的1周左右。猪水肿病，是小猪的一种肠毒血症，其特征为胃壁和其他某些部位发生水肿。发病率虽不很高，但病死率很高。主要发于断乳仔猪，小至数日龄，大至4月龄也偶有发生。体况健壮、生长快的仔猪易于发病。其发生与饲料和饲养方法的改变、气候变化等有关。初生时发生过黄痢的仔猪一般不发生本病。病猪突然发病，精神沉郁，食欲减少或口流白沫。体温无明显变化，心跳疾速，呼吸初快而浅，后慢而深。常便秘，但发病前一两天常有轻度腹泻。

随着细菌耐药的增强，细菌耐药性已成为全球关注的焦点。细菌耐药机制的产生主要原因在于细菌基因在菌体内外及高浓度的抗生素环境的压力下发生变异，使细菌产生各种抗菌药物的灭活酶或者修饰酶，改变了抗生素对细菌的作用靶位，使细菌的细胞膜能阻止甚至外排抗菌药物的进入，使其具有了生成生物膜的能力。其中，细菌产生灭活酶或修饰酶是耐药菌的重要耐药机制，而β-内酰胺酶是此类酶中数量最多者。到目前为止，细菌产生的β-内酰胺酶已近500种。新德里金属β-内酰胺酶(New Delhi Metallo-β-lactamase，NDM)是在一患者的泌尿道肺炎克雷伯菌分离株中所检测到，从此，NDM酶迅速传播并在多个国家的病例中有发现。携带产NDM基因的菌株被称为“超级耐药菌”。NDM型金属酶可高效水解除替加环素和多粘菌素外的所有抗生素，携带有该酶的菌株对几乎所有的抗生素均耐药，包括碳青霉烯类在内的多类抗菌药物，所以被称为“超级细菌”。NDM基因的主要包括NDM-1到 NDM-50的几十个亚型，其中动物源大肠杆菌上NDM-5基因的流行率呈递增趋势。

临床上NDM阳性菌的感染和治疗，还主要依靠抗生素。首先是针对该菌株进行药物敏感性试验，选择对该菌株敏感的非β-内酰胺类药物进行治疗。但是抗生素的长期使用，有可能使NDM菌株激发或者诱发更强的耐药性，几乎突破了临床抗感染治疗的最后一道防线。因此，研发新型药物或者寻找一种有效的抗生素替代疗法成为摆在全球科学工作者面前的重要科学问题。所以从天然药物或中草药中筛选毒副作用小的高效抑菌中草药及其有效成分的复配物刻不容缓。中药是我国的“天然医药宝库”，具有多成分、多途径、多靶点、不易产生耐药性等优点。中草药中含有复杂抑菌成分，如多糖、生物碱、氨基酸、酚类、肽类等天然活性成分，中药不但具有广谱抗病毒、抗菌、抗氧化、清除自由基、抗寄生虫、抗肿瘤、促进动物生长、提高机体免疫力、增强抗病力的功效，而且对提高机体的免疫功能有奇效，还具有抗菌谱广、不易产生耐药性、可以联合应用等优点。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种柳树皮提取物、其复方制剂及应用，本发明从10多位中药水提物和乙醇提取物中筛选出一种柳树皮提取物，对产NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌株具有优异的体外抑菌活性。本发明的技术方案为：

第一方面，本发明提供一种柳树皮提取物，所述柳树皮提取物中原药浓度为1g/mL，溶剂为水或乙醇-水混合液。

进一步地，所述柳树皮提取物中至少包括单宁、黄铜中的一种。

第二方面，本发明提供上述柳树皮提取物在制备产β-内酰胺酶细菌抑制剂或杀菌剂上的应用。

进一步地，所述产β-内酰胺酶细菌包括产NDM酶细菌。

进一步地，所述产NDM酶细菌包括一株产NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌株，所述菌株命名为：大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2021年8月26日，保藏编号为CGMCC No.23303。

第三方面，本发明提供一种含柳树皮提取物的复方制剂，所述复方制剂还包括抗生素。

进一步的，所述抗生素包括以下中的一种：青霉素G、氨苄西林、海他西林、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢西丁、头孢克洛、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢噻呋、头孢比肟、头孢喹肟。

优选地，所述抗生素为青霉素G，青霉素G与柳树皮提取物按照0.1g：1mL 的比例进行组合。

可选地，所述复方制剂中柳树皮提取物和抗生素分别成为独立给药单元。

可选地，所述复方制剂中柳树皮提取物和抗生素共同形成组合给药单元。

第四方面，本发明提供上述复方制剂制备产β-内酰胺酶细菌抑制剂或产β- 内酰胺酶细菌杀菌剂的应用。

进一步地，所述产β-内酰胺酶细菌包括产NDM酶细菌。

进一步地，所述产NDM酶细菌包括一株产NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌株，所述菌株命名为：大肠埃希氏菌，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.23303。

相较于现有技术，本发明的技术效果是：

1)本发明通过对11种中药提取物进行研究，发现柳树皮提取物对产 NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌株有较好的抑制作用，有望开发成该超级耐药菌株的有效抑菌剂或杀菌剂。

2)本发明还通过对柳树皮提取物的成分分析，找到柳树皮中抑制产 NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌的主要活性成分为单宁和黄铜。

3)本发明将柳树皮提取物分别与β-内酰胺类药物中的青霉素G、氨苄西林、海他西林、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢西丁、头孢克洛、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢噻呋、头孢比肟、头孢喹肟等21种β- 内酰胺类抗生素联合使用，对于产NDM-5型猪大肠杆菌抑制均有协同作用，但柳树皮提取物和青霉素G联合使用时，对于产NDM-5型猪大肠杆菌抑制活性呈现显著的协同增效功效。

附图说明

图1为本发明实施例1中对产NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌株的16S rRNA 琼脂糖凝胶电泳分析图，其中：以DNA为模板进行扩增，M：DNA Marker， 1-2：16S rRNA扩增产物。

图2为本发明实施例1中对产NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌株的琼脂糖凝胶电泳分析图，其中：以DNA为模板进行扩增，M：DNA Marker，1-2：NDM-5 扩增产物。

图3为本发明实施例1中产NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌株的核基因组圈图。

具体实施方式

本发明实施例采用的金银花、连翘、紫花地丁、蒲公英、板蓝根、射干、山豆根、黄药子、白药子、穿心莲购自张仲景大药房，柳树皮采自柳树的皮，并且晒干后备用。

在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解，本发明的保护范围包括但不限于以下实施例，在不偏离本申请的精神和范围的前提下任何对本发明的技术方案的细节和形式所做出的修改均落入本发明的保护范围内。

实施例1

一株产NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌株的提取及鉴定

1.材料

1.1菌株来源

本实验室留存从产房仔猪腹泻病例中分离出的亚胺培南敏感性减低的87株细菌，使用药敏纸片法表型对这87株细菌进行筛选，得到1株产新德里金属β- 内酰胺酶(NDM-5)阳性菌株，所述菌株命名为：大肠埃希氏菌，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.23303。

1.2试剂及仪器设备

大豆酪蛋白琼脂培养基、大豆酪蛋白培养基、生理盐水、培养箱、冰箱、移液抢、酒精灯、平皿、试管等。

2.方法

2.1菌种鉴定

菌种鉴定采用大肠杆菌16S rRNA基因扩增测序鉴定。该方法为本领域常规鉴定方法，对其具体操作过程及控制参数这里不作详细描述，扩增引物及引物序列信息见表1。

表1菌种鉴定基因扩增引物序列信息

2.2耐药基因筛查

根据文献查阅(Hornsey M,Phee L,Wareham DW.A novel variant,NDM-5,of theNew Delhi metallo-beta-lactamase in a multidrug-resistant Escherichia coliST648 isolate recovered from a patient in the United Kingdom.AntimicrobAgents Chemother 2011；55(12):5952-5954.)碳青霉烯酶耐药基因，然后采用大肠杆菌进行碳青霉烯酶耐药基因扩增测序鉴定，基因引物信息见表2。

表2 NDM-5耐药基因引物序列

2.3药敏试验

采用药敏纸片法对产NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌株进行β-内酰胺类药物中的青霉素G、氨苄西林、海他西林、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢西丁、头孢克洛、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢噻呋、头孢比肟、头孢喹肟等21种β-内酰胺类抗生素耐药表型测定。

2.4基因组测序及质粒生物信息学分析

应用第三代测序技术进行测序，并对质粒序列进行拼接，应用BLAST软件等对序列进行深入分析。

3.结果分析

3.1菌种鉴定及菌株耐药特征

16S rRNA和碳青霉烯酶耐药基因(NDM-5)扩增测序鉴定结果显示 ZFX2105为大肠埃希氏菌(如图1所示)，该株菌携带碳青霉烯酶基因blaNDM-5 基因(如图2所示)。

3.2药敏试验

采用药敏纸片法对携带NDM-5型耐药基因菌株进行β-内酰胺类药物中的青霉素G、氨苄西林、海他西林、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢西丁、头孢克洛、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢噻呋、头孢比肟、头孢喹肟等21种β-内酰胺类抗生素耐药表型测定。结果如表3所示，表明21种β- 内酰胺类抗生素全部耐药。

表3产NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌抑菌结果

注：R表示耐药。

3.3全基因组测序及生物信息学分析

首先用Qiagen试剂盒提取产NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌高质量的DNA，其次用Nanopore测序技术对ZFX2105进行高通量测序。该菌株的全基因组测序结果显示ZFX2105基因组大小为5 270 080bp，平均G+C含量为50.63％。将基因组测序深度、GC分布、GC-skew以及基因组结构注释进行整合，绘制核基因组圈图，如图3所示，由外到内依次为编码基因(正义链)、编码基因(负义链)、tRNA和rRNA、CRISPR和基因岛、GC比、GC-skew、测序深度。

3.4质粒分析

质粒是普遍存在于原核生物细胞内独立于核DNA的可自主复制的DNA分子，对组装结果中的质粒情况进行分析，发现有两个质粒，其中一个质粒包含一个携带NDM-5基因，为pLY ZFX2105，该质粒大小为216,628bp，平均G+C 含量为45.60％。另外一个质粒大小为159,194bp，平均G+C含量为50.86％。

综上，对分离自产房仔猪腹泻携带NDM-5基因的碳青霉烯类耐药猪源大肠杆菌(ZFX2105)进行特征性分析。为临床耐药菌株感染的防治和新药物研发提供理论基础。采用16S rDNA基因序列分析，PCR方法筛选鉴定产新德里金属β-内酰胺酶(New delhimetallo-β-lactamase，NDM-5)和全基因组测序以及生物信息学分析。结果显示，确定该分离菌株为产NDM-5型新德里金属β-内酰胺酶大肠埃希氏菌，以该菌的基因组为模板，PCR扩增获得的16S rDNA和NDM-5 序列长度分别为为1800bp和480bp。该序列与GenBank数据库中大肠杆菌的 16S rDNA和NDM-5的基因序列相似性高达100％，确定菌株ZFX2105为大肠埃希氏菌并携带NDM-5型耐药基因。全基因组测序结果显示ZFX2105包含一个携带NDM-5的质粒，为pLYZFX2105，该质粒大小为216.628kb。

实施例2

针对实施例1的产NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌株抑菌的中药提取物的筛选

1.提取物制备

1.1中药提取物的制备

选取金银花、连翘、紫花地丁、蒲公英、板蓝根、射干、山豆根、黄药子、白药子、穿心莲、柳树皮这11味中药的水提物和/或乙醇提取物的合并液体，取回收乙醇并浓缩后的提取液。具体为：

称取每味中药各100g，加8倍量的水浸泡3h，加热煮沸后改为文火煎煮 0.5h，然后过滤，收集上清液，残渣再加6倍量65％的乙醇，加热煮沸后，改为文火煎煮，过滤，合并两次提取的上清液，用旋转蒸发仪回收乙醇，并浓缩至浓度含原药1g/mL。

1.2柳树皮水杨苷水提取液的制备

称取柳树皮100g，加8倍量的水浸泡3h，加热煮沸后改为文火煎煮0.5 h，然后过滤，收集上清液，用旋转蒸发仪浓缩至浓度含原药1g/mL，将上清液用大孔树脂吸附和洗脱，用香草醛-高氯酸显色法检测水杨苷。

1.3柳树皮单宁乙醇-水提取液的制备

称取柳树皮100g，加8倍量65％的乙醇，浸泡3h后，加热煮沸，改为文火煎煮，过滤，用旋转蒸发仪回收乙醇，并浓缩至浓度含原药1g/mL。然后用有机溶剂甲醇、乙醇和丙酮，进行轮流萃取，用香草醛-盐酸紫外分光光度法进行单宁的测定。

1.4柳树皮黄铜乙醇-水提取液的制备

称取柳树皮100g，加8倍量65％的乙醇，浸泡3h后，加热煮沸，改为文火煎煮，过滤，用旋转蒸发仪回收乙醇，并浓缩至浓度含原药1g/mL。然后用聚酰胺吸附法进行黄酮类物质的提取，过聚酰胺柱，用95％乙醇洗脱，采用 Fe³⁺反应检测黄酮。

2.柳树皮中抗产NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌成分的确定

将得到的柳树皮水杨苷、单宁和黄铜提取液分别针对实施例1的产NDM-5 型猪大肠杆菌超级耐药菌进行琼脂扩散抑菌试验。在超净工作台内无菌操作，用移液抢吸取50μL1×10⁹cfu/mL的菌液均匀涂布于大豆酪蛋白琼脂培养基表面上，再用直径为6mm的打孔器在琼脂培养基上等距离打孔，每个平板打四个孔，加入对应的无菌中药提取液100μL，每个平板用一孔加入0.9％生理盐水作为对照，置培养箱中37℃培养24h，观察有无抑菌圈，并测量其直径。

并且11种中药提取液对多重耐药菌株均做3个平行试验，抑菌圈大小取3 次结果的平均值。抑菌效果判定按照如下标准：抑菌圈≥20mm为敏感，10～20 mm为中敏，≤10为耐药。

3.产NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌中药的筛选方法

3.1菌种活化剂浓度测定

试验前将低温冻干保存的菌种接种于大豆酪蛋白培养基使其活化，在培养箱中37℃培养24h，用微量移液器吸取100μL菌液加入500μL大豆酪蛋白培养基中进行扩培，在二氧化碳培养箱中37℃培养24h，然后用比浊管比浊法进行活菌计数，测定后配制成1×10⁹cfu/mL的菌液。

3.2中药提取液最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定

采用试管倍比稀释法测定中草药提取液对产NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌株的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。在无菌条件下，将中药提取液分别倍比稀释成含药量为1、0.5、0.25、0.125、0.063、0.031、 0.016、0.008、0.004、0.002、0.001g/mL的药液，然后分别加入扩培好的50μL 菌液，并设置相应的对照组，置培养箱中37℃培养24h，通过观察试管内浑浊情况来判断细菌的生长情况。为了避免中草药提取液颜色对结果判定的影响，再将各试管内的培养液接种至大豆酪蛋白琼脂培养基平板上，置培养箱中 37℃培养24h，通过观察细菌在培养基上的生长情况来判定最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。培养基上有少量细菌生长即为该种药物对该菌株的最小抑菌浓度 (MIC)，培养基上没有细菌生长即为该种药物对该菌株的最小杀菌浓度 (MBC)。

4.结果分析

4.1抗产NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌中药的筛选结果

选取金银花、连翘、紫花地丁、蒲公英、板蓝根、射干、山豆根、黄药子、白药子、穿心莲、柳树皮等11味中药的水提物和乙醇提取物的合并液体回收乙醇并浓缩后的提取液，携带NDM-5型耐药基因大肠菌株超级耐药菌株的体外抗菌活性。对携带NDM-5型耐药基因大肠菌株超级耐药菌株采用琼脂扩散法和倍比稀释法，分别测定了上述11味中药的合并提取液对产NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌株的体外抗菌活性，筛选出对产NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌株抗菌活性较好的中草药。

结果显示，11种中草药中，柳树皮提取物对产NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌株有较好的抑制作用，其余10种中草药的提取物对产NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌株均无抑制作用，抑菌圈直径为0。11种中草药提取物对产 NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌株的抑菌圈直径见表4。

表4中药提取物对NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌株的抑菌圈直径(mm)

从表4可以看出，柳树皮提取物对NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌株的抑菌圈直径为30mm，其余10味中草药的抑菌圈直径为0。然后进一步对柳树皮提取物进行最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定。

采用试管倍比稀释法测定柳树皮提取液对NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌株的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。结果如表5所示。

表5柳树皮提取物对NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌株的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度

由表5可以看出，柳树皮单宁提取液最小抑菌浓度为0.008g/mL，最小杀菌浓度为0.016g/mL，柳树皮黄酮提取液最小抑菌浓度为0.002g/mL，最小杀菌浓度为0.004g/mL。

4.2柳树皮中抗产NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌成分的确定

实施例2的第1小节已经阐述将柳树皮提取液采用不同的提取方法、处理方法和检测方法，分别制得柳树皮水杨苷成分、单宁成分和黄酮成分。

将得到的柳树皮水杨苷成分、单宁成分和黄酮成分分别对产NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌进行琼脂扩散试验，分别进行水杨苷、单宁和黄酮对产 NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌抑菌圈测定，抑菌圈直径分别为0mm、28 mm和29mm。采用采用试管倍比稀释法测定柳树皮提取液对NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌株的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。柳树皮单宁提取液最小抑菌浓度为0.008g/mL，柳树皮黄酮提取液最小抑菌浓度为0.002g/mL。所以得出柳树皮提取液中抗NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌株的主要成分是单宁和黄酮，而水杨苷无抗菌活性，因此，在制作柳树皮提取液主要成分含量检测标准时，应把单宁和黄铜的成分作为检测指标和抑菌活性成分。

综合以上结果，可以看出，柳树皮单宁提取液和柳树皮黄酮提取液对 NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌株有显著的抑菌活性。

实施例3

含柳树皮提取物的复方制剂确定

1.复方制剂的确定

1.1体外复方制剂配方的确定

将原药浓度为1g/mL的柳树皮提取物分别与β-内酰胺类药物中的青霉素 G、氨苄西林、海他西林、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢西丁、头孢克洛、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢噻呋、头孢比肟、头孢喹肟等21种β-内酰胺类抗生素联合应用，对产NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌进行琼脂扩散试验，观察有无抑菌圈，并测量其直径，具体方法见实施例2的第2小节。

1.2体内复方制剂配方的确定

利用产NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌在产房仔猪体内进行病理模型的复制，其对产房仔猪的LD50为1×10⁹cfu/mL。将柳树皮提取物分别与青霉素G、氨苄西林、海他西林、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢西丁、头孢克洛、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢噻呋、头孢比肟、头孢喹肟 (药物比例为1mL:0.1g)制成复合物(即混合给药)。每只仔猪颈部肌肉注射菌液1×10⁹cfu/mL 0.5mL，然后连续灌药7d，每天三次，观察10d，记录仔猪的死亡情况。

2.试验结果与讨论

2.1柳树皮提取物与β-内酰胺类药物体外抑菌试验

选取柳树皮提取物(含单宁、黄铜等所有成分)分别与β-内酰胺类药物中的青霉素G、氨苄西林、海他西林、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢西丁、头孢克洛、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢噻呋、头孢比肟和头孢喹肟对NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌株进行琼脂扩散试验(1mL:0.1 g)，结果表明，柳树皮提取物分别与青霉素G、氨苄西林、海他西林、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢西丁、头孢克洛、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢噻呋、头孢比肟和头孢喹肟对NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌株的抑菌圈直径分别为38、29、30、28、31、30、30、29、30、28、30、31、 30、30、31、30、29、30、29、30、30。只有青霉素G和柳树皮提取物共同使用时，抑菌圈最大并且差异显著。

2.2柳树皮提取物与β-内酰胺类药物体内抗菌试验

利用产NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌在产房仔猪体内进行病理模型的复制，其对产房仔猪的LD50为1×10⁹cfu/mL。将柳树皮提取物分别与青霉素G、氨苄西林、海他西林、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢西丁、头孢克洛、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢噻呋、头孢比肟、头孢喹肟 (药物比例为1mL:0.1g)制成复合物。每只仔猪颈部肌肉注射菌液1×10⁹cfu/mL 0.5mL，然后连续灌药7d，每天三次，观察10d，记录仔猪的死亡情况。实验结果见表6。

表6柳树皮提取物与β-内酰胺类抗生素的药效学比较实验

从以上实验结果可以看出，相比于单独的抑菌实验，从体内外实验结果可以看出将柳树皮提取物和青霉素G配伍在一起使用时具有显著的协同增效抑制产NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌的功效。

综上所述，本发明通过对多种中药提取物的研究分析，发现了柳树皮提取物对抑制产NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌有较好功效，并且发挥药效的活性成分为柳树皮提取物中的单宁和黄铜，并且柳树皮提取物与β-内酰胺类药物联用均有协同作用，和青霉素G联合时抑制效果最显著，该研究对进一步开发出猪大肠杆菌超级耐药菌株的有效抑菌剂和杀菌剂具有很好的指导价值。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种柳树皮提取物，其特征在于：所述柳树皮提取物中原药浓度为1g/mL，溶剂为水或乙醇-水混合液。

2.根据权利要求1所述的一种柳树皮提取物，其特征在于：所述柳树皮提取物中至少包括单宁、黄铜中的一种。

3.权利要求1或2所述的一种柳树皮提取物在制备产β-内酰胺酶细菌抑制剂或杀菌剂上的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述产β-内酰胺酶细菌包括产NDM酶细菌。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述产NDM酶细菌包括一株产NDM-5型猪大肠杆菌超级耐药菌株，所述菌株命名为：大肠埃希氏菌，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.23303。

6.一种含权利要求1或2所述的柳树皮提取物的复方制剂，其特征在于：所述复方制剂还包括抗生素。

7.根据权利要求6所述的一种含权利要求1或2所述的柳树皮提取物的复方制剂，其特征在于：所述抗生素包括以下之一：青霉素G、氨苄西林、海他西林、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢西丁、头孢克洛、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢噻呋、头孢比肟、头孢喹肟。

8.根据权利要求6或7所述的一种含权利要求1或2所述的柳树皮提取物的复方制剂，其特征在于：所述复方制剂中抗生素为青霉素G，青霉素G与柳树皮提取物按照0.1g：1mL的比例进行组合。

9.根据权利要求6所述的一种含权利要求1或2所述的柳树皮提取物的复方制剂，其特征在于：所述复方制剂中柳树皮提取物和抗生素分别成为独立给药单元，或者所述复方制剂中柳树皮提取物和抗生素共同形成组合给药单元。

10.权利要求6～9任意一项所述的复方制剂制备产β-内酰胺酶细菌抑制剂或产β-内酰胺酶细菌杀菌剂的应用。

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