CN108148815A - 一株鱼类细菌的噬菌体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株鱼类细菌的噬菌体及其应用，该噬菌体命名为舒氏气单胞菌SD04株(Aeromonas schubertii bacteriophage SD04)。本发明首次用噬菌体SD04治疗斑鳢感染舒氏气单胞菌引起的内脏白点病，并模拟该细菌的自然感染模式然后通过泼洒噬菌体来预防此病，打破以往滥用抗生素和化学药品的治病模式，降低养殖业将来可能面临的多重耐药细菌感染甚至“超级细菌”的威胁以及对养殖环境和生态环境的污染及破坏，为后期研究噬菌体作为一种生物制剂治疗细菌性疾病奠定了基础。

Description

一株鱼类细菌的噬菌体及其应用

技术领域

本发明涉及一株鱼类细菌的噬菌体及其应用。

背景技术

斑鳢(Channamaculata)又称本地生鱼，隶属于鲈形目(Perciformes)鳢科(Ophiocephalidae)醴属(Chann)，主要分布于长江流域以南，该品种生长快、经济效益高。目前广东省的养殖面积约2.5万亩，亩产高达2500～4000kg。但是随着高密度集约化的养殖模式，病害频频发生，其危害程度也日趋加剧^[1-3]。初步调查，广东省自2006年起每年5～8月份部分鱼塘都有大批斑鳢发生暴发性死亡，肝脾肾长有白点，池塘发病率6％～9％，死亡率高达50％～60％，养殖户损失惨重。已有研究者报道该病是由舒氏气单胞菌感染所致，并筛选出了一些药物可暂时缓解其带来的损失，但有效期短、用药量大，易引起水产品质量安全和产生环境污染问题；并且随着耐药菌株的产生，其治疗效果也大打折扣，因此，当务之急是研发出一种有效的生物方法来防治该病。噬菌体是一类细菌性病毒，能在菌体细胞内利用宿主的遗传物质快速复制增殖，最终导致细菌裂解达到抗菌的效果。其特异性强，大量存在于自然界中，作为一种替代抗生素的抗菌制剂，备受关注。与传统治疗方法相比，噬菌体治疗细菌性感染有着极大的优势：特异性强；无副作用；指数增殖；无残留；成本低，利用噬菌体治疗细菌性疾病逐渐成为人们关注的焦点问题。

噬菌体的最早发现是在1918年，法国巴斯德研究所的D’Herelle在培养大便标本中的志贺菌时发现培养基上的小面积透明区，从而发现噬菌体并命名为“bacteriophage”。噬菌体治疗细菌感染最早报道于19世纪30年代。从20世纪20年代开始，在东欧尤其是俄国、波兰等国家，噬菌体疗法得到持续应用和深入研究；在美国有些噬菌体产品已被划为安全制剂类别，并被环境保护局注册或被农业部批准使用。作为有效的抑菌制剂，噬菌体已成功应用到医疗、畜牧、水产养殖以及食品防控和检测等各领域。Wu等分别于1981和1982年用其治疗鱼嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌病，这是水产界首次应用噬菌体来治疗细菌性疾病的报道。近年来，研究发现噬菌体能有效防治水产动物细菌性疾病，如利用噬菌体防治泥鳅出血性败血症、鲑鳟鱼类疖点病、鳗鱼爱德华氏菌病、鲶鱼柱形病、虹鳟幼鱼综合症、鰤鱼格式乳球菌、淡水鲶鱼皮肤溃疡病、香鱼冷水病、比目鱼海豚链球菌病、对虾哈氏弧菌病等。关于利用噬菌体防治水产动物细菌病的专利，国内已有多项，专利申请号201110050243.2报道了哈氏弧菌噬菌体防治刺参腐皮综合症；专利申请号201210018632.1报道了一种弧菌噬菌体与生物防治宿主菌的方法；专利申请号201410108994.9报道了一种溶藻弧菌噬菌体及其在海参疾病预防中的应用；专利申请号201410506817.6报道了一株中华鳖气单胞菌噬菌体及其应用。但关于舒氏气单胞菌噬菌体的研究国内外至今未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一株鱼类细菌的噬菌体及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

一株鱼类细菌的噬菌体，其命名为舒氏气单胞菌(Aeromonas schubertiibacteriophage)SD04。

上述所述噬菌体SD04株在制备抗鱼类舒氏气单胞菌药剂中的应用。

上述所述噬菌体SD04株在制备防治鱼类内脏白点病药剂中的应用。

上述内脏白点病为舒氏气单胞菌引发的脏白点病。

上述噬菌体SD04株在提高鱼类抗鱼类舒氏气单胞菌能力中的应用。

进一步的，所述鱼类包括斑鳢。

进一步的，所述应用的具体方法为，用含噬菌体SD04的水体浸泡鱼体。

一种防治鱼类内脏白点病的药剂，该药剂含有上述所述噬菌体SD04株。

一种抗鱼类舒氏气单胞菌药剂，该药剂含有上述所述噬菌体SD04株。

一种提高鱼类抗鱼类舒氏气单胞菌能力的方法，用含噬菌体SD04的水体浸泡鱼体。

进一步的，所述噬菌体SD04的浓度为10⁹～10¹⁰PFU mL^-1。

本发明的有益效果是：

本发明首次分离、纯化出可高效裂解斑鳢源舒氏气单胞菌的高滴度噬菌体SD04株，并对其对宿主菌GC₁株的最佳感染复数、一步生长曲线、电镜形态特征等生物学特性以及基因组信息进行研究，为气单胞菌噬菌体家族增添了新成员，同时为噬菌体的进一步开发利用提供理论基础。

本发明首次尝试用噬菌体SD04治疗斑鳢感染舒氏气单胞菌引起的内脏白点病，并模拟该细菌的自然感染模式然后通过泼洒噬菌体来预防此病，打破以往滥用抗生素和化学药品的治病模式，降低养殖业将来可能面临的多重耐药细菌感染甚至“超级细菌”的威胁以及对养殖环境和生态环境的污染及破坏，为后期研究噬菌体作为一种生物制剂治疗细菌性疾病奠定了基础。

附图说明

图1为噬菌体SD04对舒氏气单胞菌GC₁的裂解效果；

图2为噬菌体SD04一步生长曲线；

图3为噬菌体SD04电镜图片；

图4为斑鳢注射不同剂量噬菌体SD04的保护率；

图5为浸泡舒氏气单胞菌后感染组和预防组斑鳢的存活率。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1噬菌体SD04的分离、纯化

方法：于感染舒氏气单胞菌的斑鳢养殖鱼塘采集450mL新鲜水样，5000rpm/min离心20min，向上清中加入10倍浓缩的营养肉汤培养基50mL以及培养至对数生长早期的舒氏气单胞菌GC₁ 2mL，28℃摇床过夜培养。取培养过夜的样品液10mL，10 000rpm离心10min,上清经0.22μm滤膜过滤后于56℃水浴1h，将滤液进行10倍梯度稀释至10^-9。参照文献报道的双层琼脂平板法稍作改动，检查噬菌斑的形成，取各梯度的稀释液0.2mL与对数早期的GC₁悬液0.2mL混匀后室温静置15min，再与6mL融化并冷却至50℃左右的琼脂混匀，并迅速倒在已凝固的营养琼脂平板上，铺成双层平板，28℃培养8-12h，观察噬菌斑的生长情况。随后挑取大小均匀、透明度高的单斑于5mL营养肉汤中，加入0.2mL宿主菌28℃摇床培养过夜。培养液10 000rpm离心10min,上清经0.22μm滤膜过滤后进行10倍梯度稀释，采用双层琼脂平板法培养后再次挑取单斑于营养肉汤中培养增殖。如此反复5次对所分离的噬菌体进行纯化。

结果：由图1可见，纯化后的噬菌体在以GC₁为宿主菌的双层琼脂平板上形成大小均一，直径约为0.1cm的噬菌斑。

实施例2噬菌体SD04的效价测定

方法：采用实施例1中所述的双层琼脂平板法测定噬菌体SD04株效价。以SM缓冲液作为稀释液，将纯化后的噬菌体SD04株连续10倍稀释，稀释至10^-9，每个稀释度分别做3个平行重复。计数时，选取噬菌斑个数在30-300的平板，然后取该稀释度3个平行重复的平均数，计算噬菌体的滴度。噬菌体的效价(PFU mL^-1)＝稀释倍数×平均噬菌斑数×5。

结果：噬菌体SD04作10^-9稀释后双层琼脂平板检测可形成大小均一的噬菌斑，3个平行处理的平板噬菌斑个数分别为90、88和93，介于30-300之间，可作为计数之用。根据上述公式计算后所得该舒氏气单胞菌噬菌体的效价约为4.5×10¹⁰PFU mL^-1。

实施例3噬菌体SD04感染复数(multiplicity of infection,MOI)的测定

方法：培养宿主菌舒氏气单胞菌GC₁株至对数前期，用比浊仪调至菌浓度为1.5×10⁸PFU mL^-1。按照感染复数MOI分别0.001、0.01、0.1、1、10、100和1000的比例，加入噬菌体纯培养液和宿主菌，最后加入肉汤培养液使各管总体积均为15mL。28℃摇床中160r/min培养12～16h后10 000×g离心10min，收集上清，0.22μm滤器过滤，采用双层琼脂培养法测定噬菌体滴度。各组均做双份复管培养取平均值，同时以不加噬菌体的宿主菌和不加宿主菌的噬菌体为对照，以产生最高噬菌体滴度的MOI为最佳感染复数。

结果：加入噬菌体和宿主菌培养12-16h后，宿主菌被充分裂解，培养液变得澄清，计数各测定管中的噬菌体滴度，结果见表1。根据表中实验结果，当MOI＝10时，噬菌体SD04感染其宿主菌GC₁产生的子代噬菌体滴度为6×10¹⁰PFU mL^-1，在6个感染复数中，此感染率最高。因此，SD04感染其宿主菌GC₁的最佳感染复数为10。

表1 SD04最佳感染复数的测定

实施例4噬菌体SD04一步生长曲线

方法：将噬菌体SD04按最适MOI与培养至对数生长早期的宿主菌混合，28℃温育15min至大量吸附后13000g离心1min，弃上清，沉淀用10mL28℃预热的肉汤培养基悬浮并充分混匀，迅速置于28℃摇床振荡培养。前25分钟每隔5min取样，之后每隔25min取样，从0时刻开始，连续取样3.5h，每次取500μl，0.22μm滤膜过滤，10倍稀释后采用双层琼脂培养法(如实施例1中所述)测定滤液中噬菌体效价，各时间点均作双份复管取平均值。以培养时间为横坐标，噬菌体滴度的对数值为纵坐标，绘制一步生长曲线，并根据一步生长曲线确定噬菌体的潜伏期、爆发期和裂解量。其中，从噬菌体吸附细菌开始，到细菌被裂解释放出新的噬菌体为止的过程称为潜伏期；潜伏期过后，直至所有受感染细菌都被裂解的过程，称为爆发期；平均每个受感染细菌所释放的新噬菌体数称为裂解量。裂解量计算公式：裂解量＝裂解末期噬菌体效价/感染初期宿主菌浓度。

结果：噬菌体SD04的一步生长曲线显示(图2)，其感染舒氏气单胞菌GC₁的潜伏期为20min，爆发期大约持续85min，裂解量约为333pfu/Cell。

实施例5噬菌体SD04电镜观察

方法：取50μL含噬菌体粗制颗粒的液体滴于铜网上，自然沉淀15min，用2％磷钨酸(PTA)滴染1-2min，然后用滤纸从侧面吸去染色液，待样品干燥后于Hitachi-7700型透射电子显微镜下观察噬菌体形态并拍照。

结果：通过透射电镜观察噬菌体SD04株，头部是二十面体的立体对称，直径大约为60nm，有一可伸缩的长尾，长约116nm(图3)。按照国际病毒分类委员会分类标准，其属于有尾噬菌体目(Caudovirales)，肌尾噬菌体科(Myoviridae)。

实施例6噬菌体SD04宿主范围的测定

方法：实验所用宿主菌包括2010～2017年间从珠三角顺德、南海、中山、江门、患病斑鳢肝、脾、肾中分离的舒氏气单胞菌20株、ATCC43700、嗜水气单胞菌5株、温和气单胞菌2株、维氏气单胞菌1株、哈氏弧菌1株以及无乳链球菌1株总共31个菌株作为指示菌，取滴度达到1×10¹⁰PFU/mL的噬菌体液10μL，滴于铺有指示菌的平板上，晾干后于28℃温箱倒置培养过夜，观察噬菌体对菌株的裂解情况。

结果：如表2所示，在参与检测的31株菌株中(其中气单胞菌29株，舒氏气单胞菌21株)，噬菌体SD04能裂解所有20株分离自斑鳢的舒氏气单胞菌，而不能裂解其它9株气单胞菌(包括1株来自人源的舒氏气单胞菌标准菌株、5株嗜水气单胞菌、2株温和气单胞菌、1株维氏气单胞菌)、哈氏弧菌以及链球菌。说明该噬菌体具有高度特异性，仅裂解分离自斑鳢的舒氏气单胞菌。

表2噬菌体SD04株宿主范围测定

实施例7噬菌体SD04株对斑鳢的安全性

方法：试验用斑鳢(体长15-18cm，体重约100g)购自广东省佛山市顺德区某养殖场，经镜检无虫，细菌分离、检测无舒氏气单胞菌，暂养一周后，选择状态良好、体表无伤的健康斑鳢90尾，随机分为3组，即噬菌体注射组、稀释液SM注射组和空白对照组，每组30尾。噬菌体注射组每尾腹腔注射噬菌体0.2mL(含噬菌体10⁹PFU)，对照组每尾注射稀释液SM0.2mL。试验期间控制水温(28±2)℃，连续观察14d。不同时间内分别进行3次独立重复试验。

结果：每日早、中、晚3次观察试验鱼的健康状况和死亡个体数，整个试验期间，噬菌体注射组、SM注射组和空白对照组均无死鱼，鱼体健活、摄食正常，存活率为100％，说明注射高剂量的噬菌体不会对斑鳢健康状况产生影响。

实施例8噬菌体SD04株对治疗斑鳢内脏白点病的有效性

方法：选取210尾健康斑鳢作为生物模型来测试噬菌体治疗舒氏气单胞菌感染的有效性，随机分为7组，每组30尾鱼。参照预实验的致死浓度，除对照组外，其余6个试验组的斑鳢分别注射舒氏气单胞菌2×10⁵CFU/尾进行感染，其中5个组在感染的同时分别按照MOI＝10、100、1000、10000和100000的剂量注射噬菌体SD04株进行治疗，剩余1组作为感染对照组。每日观察鱼体存活情况，记录发病、死亡数量，连续观察14d。在不同时间内分别进行3次独立重复试验。

结果：至试验后第14d，感染舒氏气单胞菌的同时分别按照MOI＝10、100、1000、10000和100000的剂量注射噬菌体SD04株治疗组、感染对照组及空白对照组斑鳢的累积死亡数分别为28、18、6、6、5、30和0尾，治疗组的有效保护率与感染组相比分别提高了6.7％、40％、80％、80％和83.3％。由此可见，斑鳢感染舒氏气单胞菌后，按照MOI＝1000、10000和100000的剂量注射噬菌体SD04进行治疗，有效保护率均可达到80％以上，MOI越大，保护率越高(图4)。

实施例9噬菌体SD04株对斑鳢抵抗GC₁感染的有效性

方法：选取90尾健康斑鳢，随机分为3组，每组30尾鱼。分别设置3个试验组：斑鳢+细菌浸泡感染+噬菌体泼洒预防组、斑鳢+细菌浸泡感染组和斑鳢空白对照组，细菌感染及噬菌体治疗均采用浸泡泼洒的方式，为确保感染及预防治疗的效果，二者均选取最高剂量，即10⁹CFU mL^-1和10¹⁰PFU mL^-1(MOI＝10)。分别于试验开始后1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d记录试验组鱼体存活数(图5)。

结果：由图5可知，高浓度浸泡舒氏气单胞菌后，感染组斑鳢于第3天开始出现死亡，至第6天全部死完，存活率为0；泼洒噬菌体预防组在试验前6天内均无死鱼，第7天存活率降为86.7％，随后3天内至第10天稳定在83.3％；整个试验期间对照组无死鱼，鱼体存活率为100％。说明泼洒噬菌体SD04株可显著提高斑鳢抵抗舒氏气单胞菌感染的能力，不仅鱼体开始死亡时间推迟4天，同时也极大程度地提高了斑鳢的存活率。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株鱼类细菌的噬菌体，其命名为舒氏气单胞菌(Aeromonas schubertiibacteriophage)SD04。

2.权利要求1所述噬菌体SD04株在制备抗鱼类舒氏气单胞菌药剂中的应用。

3.权利要求1所述噬菌体SD04株在制备防治鱼类内脏白点病药剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述内脏白点病为舒氏气单胞菌引发的脏白点病。

5.权利要求1所述噬菌体SD04株在提高鱼类抗鱼类舒氏气单胞菌能力中的应用。

6.根据权利要求2～5任一项所述的应用，其特征在于，所述鱼类包括斑鳢。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用的具体方法为，用含噬菌体SD04的水体浸泡鱼体。

8.一种防治鱼类内脏白点病的药剂，其特征在于，该药剂含有权利要求1所述噬菌体SD04株。

9.一种抗鱼类舒氏气单胞菌药剂，其特征在于，该药剂含有权利要求1所述噬菌体SD04株。

10.一种提高鱼类抗鱼类舒氏气单胞菌能力的方法，其特征在于，用含噬菌体SD04的水体浸泡鱼体。