CN102172248A - 防治刺参腐皮综合症的噬菌体及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种噬菌体防治刺参腐皮综合症的应用，属于生物工程领域。其特征是通过特异性弧菌培养基以及回接感染试验筛选致病性弧菌，对具有致病性的弧菌进行生理生化以及分子生物学鉴定；鉴定该菌株为哈维氏弧菌，利用分离得到的病原菌进行噬菌体的分离，对分离得到的两株不同大小噬菌斑的噬菌体进行透射电镜扫描，抑菌试验。通过试验可以得出分离得到的两株噬菌体对哈维氏弧菌具有强烈的裂解作用。本发明可以专一性裂解目标病原微生物，不会破坏水环境中的正常菌群。噬菌体能够自我复制增殖，可保持长期持续作用，且其感染发生在水溶液状态中，噬菌体不会残留在动物体内；安全无毒副作用，降解后的终产物是氨基酸和核酸片段，对人和动物安全。
Description
技术领域
本发明涉及对两种噬菌体及其应用，尤其能特异性裂解哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)的噬菌体及其应用。属于生物工程领域。
背景技术
哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是在海洋及盐湖环境中分布极为广泛的一种致病性嗜盐细菌。存在于近海岸的海水、海底沉积物以及鱼类、贝类之中。哈维氏弧菌是鱼虾贝等水产经济动物的主要致病菌之一，已经被证实是刺参弧菌病的主要致病菌。近年来由哈维氏弧菌造成的水产动物病害也频频出现。目前，控制水产动物弧菌病的主要手段是抗菌药物治疗(链霉素、氯霉素、强力霉素)。面对日益严重的耐药毒株的出现，利用抗生素来防止细菌污染已经不是最佳防控方法。耐药毒株会在环境中进化并产生，抗生素的开发远不及耐药毒株出现的速度。因此，由细菌污染食品引起的中毒检测表明，导致疾病产生的源头来自于抗生素滥用所产生的耐药细菌。
噬菌体是病毒的一种，其特别之处是专以细菌为宿主。噬菌体是一种普遍存在的生物体，而且经常都伴随着细菌。通常在一些充满细菌群落的地方，如：泥土、动物的内脏里，都可以找到噬菌体的踪影。目前世上蕴含最丰富噬菌体的地方就是海水。在海平面，平均每毫升的海水即含有109个病毒粒子(virions)，并使海水中70％的细菌受到噬菌体的感染。裂解性噬菌体感染细菌后，可在宿主菌内快速增殖，并使之裂解，故又称毒性噬菌体。哈维氏弧菌噬菌体可以特异性感染并裂解哈维氏弧菌，因而具有杀菌作用。在感染模型中，噬菌体能够特异杀死哈维氏弧菌；而在水产生产中，噬菌体能够作为抗菌剂来控制细菌污染， 具有潜在的开发价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对目前人们在防止哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)引起的刺参腐皮综合症时，使用抗生素容易导致细菌耐药性的产生，提供一种新的能够特异性裂解哈维氏弧菌的噬菌体及其应用。
本发明的目的是这样实现的：
通过特异性弧菌培养基以及回接感染试验筛选致病性弧菌，对具有致病性的弧菌进行生理生化以及分子生物学鉴定。鉴定该菌株为哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)，利用分离得到的病原菌进行噬菌体的分离，对分离得到的两株不同大小噬菌斑的噬菌体进行透射电镜扫描，抑菌试验。通过试验可以得出分离得到的两株噬菌体对哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)具有强烈的裂解作用。
本发明的效果和益处是：
(1)专一性裂解目标病原微生物，不会破坏水环境中的正常菌群。传统的抗生素治疗在杀灭致病菌的同时，也破坏了水体中正常的浮游微生物，引起微生态失衡，并导致机会性感染；
(2)噬菌体是宿主依赖性的，只在细菌感染部位发生作用，随着宿主菌的清除而消亡，不会残留在动物体内；
(3)噬菌体能够自我复制增殖，可保持长期持续作用，且其感染发生在水溶液状态中；
(4)安全无毒副作用，噬菌体由蛋白质和核酸组成，降解后的终产物是氨基酸和核酸片段，对人和动物安全。
附图说明
图1是分离得到两种哈维氏弧菌噬菌体示意图。
图2是两种哈维氏弧菌噬菌体的体外抑菌示意图。
具体实施方式
以下结合技术方案详细叙述本发明的实施例。
实施例1、哈维氏弧菌噬菌体分离制备
本发明样品采自刺参养殖厂的养殖污水，经双层滤纸过滤，8000rpm，离心20min，再用0.22μm滤膜过滤上清。取50ml滤液，加入2ml噬菌体宿主菌过夜培养物，再加入CaCl2母液(已过0.22μm滤膜除菌)至终浓度1mM混匀后，加入Zobell2216E培养基，室温作用1h，再放置于37℃培养24h。取上述培养物以10000rpm离心10min，取上清，再用0.22μm滤膜过滤，滤液形成噬菌体原液。取噬菌体原液0.1ml，进行10倍梯度稀释，取102、104、106、108稀释液各0.1ml与对数生长期的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)1ml混合，室温作用15min后，加入10ml 0.7％的2216固体培养基，混匀后迅速倾倒入2216E培养基平板上层，摇匀平置5min，待其凝固，置于28℃温箱培养12h后观察，获得形成噬菌斑的双层平板。
实施例2、噬菌体的纯化培养和浓缩
在形成噬菌斑的双层平板上挑取形态大小一致的单个噬菌斑，用接种针穿刺目的噬菌斑，将穿刺后接种针伸入3-5ml 2216E培养基中，重复3-5次后，加入噬菌体宿主菌液1ml，混匀，室温作用15min，37℃培养20-24h，14000×g.min-1，4℃，离心10min，取上清，无菌过滤(0.22μm)上清液。再次双层平板检测纯化噬菌体。将宿主菌单菌落接入到50mL液体2216E培养基的锥形瓶中，28℃振荡培养10h；取过夜培养的宿主菌液20mL，接到200mL液体2216E中，37℃振荡培养至对数生长初期，约为4h；加入噬菌体液，使感染复数约为1(MOI＝1)，室温静置15min，以使噬菌体吸附于宿主菌表面，28℃继续振荡培养6h，转数为150rpm；将上述 混合液于4℃8000rpm离心20min，以除去细菌碎片，然后量取上清液，在其中加入DNase I和RNaseA至终浓度为1μg/mL，室温温育30min；按500ml培养物加入29.2g固体NaCl，搅拌使其溶解，然后冰浴1小时，加NaCl后可促使噬菌体颗粒和细菌碎片分离，也是噬菌体颗粒有效沉淀所必需的；4℃，8300rpm离心10min以去除细胞碎片，收集上清。测定所收集上清液的总体积，然后按照500mL上清加50g的比例加入固体PEG8000，于室温用玻璃棒慢慢搅拌溶解，然后冰浴24h以使噬菌体颗粒发生沉淀；4℃，8300rpm离心10min回收沉淀的噬菌体颗粒，弃上清，将离心管倒置5分钟，使残余液体流干，用移液器除去残余液体；用2mL的SM保存液重悬噬菌体沉淀，放于4℃保存。
实施例3、噬菌体效价测定法
将指定之寄主细菌以2216E液体培养基于28℃下培养，150转/分钟，16-24小时。以PBS为稀释液，将噬菌体原液做10倍序列稀释，一般稀释至109倍即可。取噬菌体稀释液200μl与寄主菌液500μl均匀混合，静置10分钟使其感染。将上述混合液加入5ml冷却至45℃的0.7％琼脂2216E培养基中，均匀混合后立即平铺于已凝固的1.5％琼脂培养基上。将平板置于适合的温度下，一般培养8～24小时，待溶菌斑产生后观察并计算其数目。噬菌体效价(pfu/ml)＝噬菌斑×稀释倍数×取样量折算数，例如：噬菌体原液稀释倍数为106，取样量测定量为0.2ml(则取样量折算数为20)，三个平板的溶菌斑数目分别为275、252、263，则噬菌体原液的效价为：2×106×20＝4×107(pfu/ml)。
实施例4、噬菌体治疗及效果评估
将幼龄海参、体重约5～8g左右的大连刺参40只随机分成4组，每组10只，均体腔注射哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)，接种剂量为1×109CFU/只。第1组，体腔注射前3h体腔注射为1×109pfu/mL的哈维氏弧菌噬菌体悬液(感染复数为1)。 第2组，在体腔注射的同时注射哈维氏弧菌噬菌体悬液(感染复数为1)。第3组，在体腔注射接种3h后注射哈维氏弧菌噬菌体悬液(感染复数为1)。第4组为对照组，只体腔注射哈维氏弧菌。
Claims (1)
1.一种噬菌体防治刺参腐皮综合症的应用，其特征在于，通过特异性弧菌培养基以及回接感染试验筛选致病性弧菌，对具有致病性的弧菌进行生理生化以及分子生物学鉴定；鉴定该菌株为哈维氏弧菌，利用分离得到的病原菌进行噬菌体的分离，对分离得到的两株不同大小噬菌斑的噬菌体进行透射电镜扫描，抑菌试验；通过试验可以得出分离得到的两株噬菌体对哈维氏弧菌具有强烈的裂解作用。
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| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110907 |