CN104367597B - 用于防治仿刺参腐皮综合症的微生态制剂及制备方法 - Google Patents

用于防治仿刺参腐皮综合症的微生态制剂及制备方法 Download PDF

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Abstract

一种用于防治仿刺参腐皮综合症的微生态制剂及制备方法，属于水产微生物领域，其活性成分为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H1的菌体和它的胞外代谢产物；该菌株是从山东蓬莱健康养殖的仿刺参肠道粪便分离获得，通过安全性、抑菌活性、毒性检测以及人工拮抗灿烂弧菌实验，证实巨大芽孢杆菌H1菌株能拮抗灿烂弧菌，有效地保护仿刺参稚参，用于防治由灿烂弧菌引起的仿刺参“腐皮综合症”，提高仿刺参保苗期的成活率。

Description

用于防治仿刺参腐皮综合症的微生态制剂及制备方法
技术领域：
本发明属于水产微生物领域，具体涉及一种用于防治仿刺参“腐皮综合症”的微生态制剂及制备方法。
背景技术：
仿刺参(Apostichopus japonicas Selenka)养殖以其单种类产值最高和每年20％的增长速度，成为我国水产养殖业的重要支柱之一。2011年度，山东省仿刺参的养殖面积达5.3万公顷，年产量7.1万吨(超过全国总产量一半)，年产值达160亿元。然而，近年来随着刺参养殖规模的不断扩大，各种病害接踵而至，严重制约了该产业的健康、可持续发展。仿刺参保苗期和养成期发生的“腐皮综合症”波及面广，传染性强，死亡率极高，造成了惨重的经济损失。其症状主要表现为：厌食、摇头、肿嘴、排脏、身体萎缩、口部溃烂乃至体表大面积溃疡；每年的1-4月份养殖水体温度较低时(＜8℃＝是发病高峰，这种病在育苗场多发生在2、3月份，池塘养殖则多发生在3、4月份，其高感染率通常引起成参50％的死亡率和稚参的全部死亡，属于急性死亡。而灿烂弧菌(Vibrio splendidus)是引起养殖刺参“腐皮综合症”的主要病原菌之一，其致病力强，既能引起仿刺参表皮溃疡，也能诱发稚参烂胃病。
为了控制仿刺参病害的发生，许多养殖户选择大量使用抗生素，而长期使用抗生素会导致药物的残留、养殖环境恶化、病原耐药性增强等负面影响。近年来，抗生素已经陆续被许多国家明令禁止作为饲料添加剂来使用，并严禁直接向养殖水域中泼洒抗生素。因此，通过益生菌抑制病原微生物，调节养殖动物肠道微生态平衡，增强养殖动物免疫力以及安全环保的生物防治手段在水产养殖业中得到越来越多的关注。
发明内容：
本发明要解决的技术问题是提供一种用于防治仿刺参“腐皮综合症”的微生态制剂及制备方法，所述微生态制剂的是包括巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H1及其胞外代谢产物，该菌株是从山东蓬莱健康养殖的仿刺参肠道粪便分离获得，通过安全性、抑菌活性、毒性检测以及人工拮抗灿烂弧菌实验，证实巨大芽孢杆菌H1菌株能拮抗灿烂弧菌，有效地保护仿刺参稚参，用于防治由灿烂弧菌引起的仿刺参“腐皮综合症”，提高仿刺参保苗期的成活率。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种用于防治仿刺参“腐皮综合症”的微生态制剂，其活性成分为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H1的菌体和它的胞外代谢产物；
巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H1分离自山东蓬莱健康养殖的仿刺参(Apostichopus japonicas Selenka)肠道粪便。该菌株于2014年10月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.9883,保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
进一步，上述微生物制剂为液体制剂。
本发明还提供一种上述微生态制剂的制备方法，具体包括如下步骤：菌种活化、种子液制备和发酵培养；
(1)菌种活化：将保存的巨大芽孢杆菌H1菌株在胰蛋白胨大豆琼脂培养基上划线活化，再挑取单菌落接种于胰蛋白胨大豆琼脂斜面培养基上，28℃培养24小时，获得活化巨大芽孢杆菌H1菌株；
(2)种子液制备：无菌条件下将步骤(1)活化的巨大芽孢杆菌H1菌株接种至无菌胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中，在28-30℃、摇床转速150-170rpm条件下培养20-24小时，获得巨大芽孢杆菌H1种子液；
(3)发酵培养：按照体积比0.1％的比例将步骤(2)的巨大芽孢杆菌H1种子液接入用海水配制的发酵培养基；所述发酵培养基的成分及其重量百分比为豆粕粉0.5％，玉米浆0.2％，酵母膏0.01％，KH2PO40.02％，磷酸高铁0.005％；所述发酵培养基的pH7.5-8.0；在28-30℃、搅拌机转速120-140rpm条件下培养20-24小时，获得巨大芽孢杆菌H1菌株的液体制剂，活菌数1010～1011CFU/ml，也即用于防治仿刺参“腐皮综合症”的微生态制剂。
进一步，所述步骤(3)将巨大芽孢杆菌H1种子液接入发酵培养基后用搅拌机以120-140rpm的转速进行搅拌，同时向发酵罐中通入过滤无菌空气，通气量与发酵液体积的比值1:1，通气单位L/min，罐压为0.03-0.05Mpa。
本发明还提供一种巨大芽孢杆菌H1在防治仿刺参“腐皮综合症”的微生态制剂中的应用；
本发明还提供一种巨大芽孢杆菌H1在防治仿刺参“腐皮综合症”中的应用，具体为将上述所得微生态制剂泼洒于仿刺参养殖水体中，水体中最终活菌数为105～106CFU/ml。
进一步，所述的巨大芽孢杆菌H1在防治仿刺参“腐皮综合症”中的应用为将所述的微生态制剂与仿刺参饲料混合后进行投喂，用量与泼洒使用的量相同。
巨大芽孢杆菌H1菌株的分离筛选
H1菌株分离自山东蓬莱健康养殖的仿刺参肠道粪便。2011年10月，无菌采集健康的仿刺参肠道粪便，用10倍体积的无菌海水对肠道粪便进行稀释混匀后置于15ml离心管中，直接静置15min取上清。分别将上清液配制成0、10-1、10-2、10-3四个不同的稀释浓度，每个浓度设置3个平行组；并各取100μl涂布于胰蛋白胨大豆琼脂培养基；于28℃恒温培养箱中倒置培养，进行细菌的分离和纯化。
以由灿烂弧菌引起的仿刺参的排脏和死亡作为靶标，结合安全性、抑菌活性和毒性的检测，进行生防菌的筛选。结果中筛选出一株对靶标病害具有显著防治效果的菌株，定名为H1菌株。
H1菌株的分类鉴定
H1菌株能在胰蛋白胨大豆琼脂培养基上生长，形成圆或不规则形的菌落，表面干燥不透明，培养后期起皱，呈奶黄色且具有一定粘性；孢子中生；革兰氏阳性，运动性弱，菌体呈杆状，大小为(1.2～1.8)μm×(2.0～3.5)μm。该菌株革兰氏染色呈阳性，能够水解明胶、淀粉，硝酸盐还原阴性。Biolog鉴定，H1菌株与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)具有最高相似率为98％。与《伯杰氏细菌鉴定手册》第九版中描述的Bacillus megaterium种属特征相符。该菌16S rDNA全长序列(见序列表SEQ1，长度为1518bp)通过NCBI的BLAST检索系统(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)与Bacillus megaterium C1(AJ491841)进行同源序列比对，相似性达100％；通过用MEGA4.0作进化树(图1)。因此H1鉴定为Bacillusmegaterium，根据中文命名规则，命名为巨大芽孢杆菌H1。
巨大芽孢杆菌H1菌株的安全性、抑菌活性和毒性的检测
将分离纯化获得的巨大芽孢杆菌H1菌株接种至绵羊血琼脂平板(购自青岛奕维生物科技有限公司)上；置于28℃恒温培养18-24小时后观察菌落形态及溶血情况。以大肠杆菌JM109(Escherichia coli)为阴性对照。巨大芽孢杆菌H1菌株无溶血性。
与中国海洋大学海洋生命学院海洋微生物实验室保藏的仿刺参致病弧菌灿烂弧菌(Vibrio splendidus)LJ08在2216E平板上进行牛津杯法抑菌实验，28℃恒温培养24小时后，巨大芽孢杆菌H1呈现明显的抑菌圈(图2)。
毒性试验于预先消毒的盛有3L砂滤海水的玻璃烧杯中进行。挑选个体大小相当的健康稚参(平均体质量为1.07±0.08g)用于试验，每20头一组，设3个平行。巨大芽孢杆菌H1菌株以107CFU/ml的浸泡浓度，对仿刺参进行毒性试验。整个试验期间不投喂任何饲料，水温保持在18-20℃，充气培养。每隔3天，彻底换水一次，补加菌悬液一次，保持107CFU/ml的浸泡浓度，连续两周，观察仿刺参排脏情况。巨大芽孢杆菌H1菌株对稚参均无刺激排脏的作用，且实验期间无稚参死亡，说明巨大芽孢杆菌H1对仿刺参是安全的，可以作为潜在的有益菌(图3)。
对灿烂弧菌的拮抗实验挑选个体大小相当的健康稚参养殖(平均体质量为1.07±0.08g)于预先消毒的盛有3L砂滤海水的玻璃烧杯中，每20头一组，每组设3个平行。其中空白对照组未做任何处理，阳性对照组仅添加浓度为1010CFU/ml的灿烂弧菌菌悬液3ml。拮抗组同时添加浓度为1010CFU/ml的H1菌株和灿烂弧菌菌悬液各3ml。整个试验期间不投喂任何饲料，水温保持在18-20℃，充气培养。每隔3天，彻底换水一次，补加菌悬液一次，保持原有的浸泡浓度。连续观察两周，统计稚参排脏率，并计算保护率(％)＝{(阳性对照组平均排脏率－试验组平均排脏率)/阳性对照组平均排脏率}×100％。在拮抗实验的第14天，取1ml各实验组换水前的稚参养殖海水进行系列稀释，定量涂布TCBS琼脂平板检测实验水体中灿烂弧菌数量的变化。采用SPSS 17.0统计软件Duncan法对实验数据进行方差分析。在实验的第14天，添加巨大芽孢杆菌H1拮抗组实验水体中的灿烂弧菌数量为(1.55±0.5)×105CFU/ml，而阳性对照组灿烂弧菌数量为(2.16±0.6)×107CFU/ml，巨大芽孢杆菌H1拮抗组与阳性对照组差异显著(p＜0.05)，进一步证实H1对灿烂弧菌具有明显的抑菌作用，与牛津杯抑菌试验结果一致。经过两周的人工拮抗实验，空白对照组的累计排脏率为0％；仅添加灿烂弧菌的阳性对照组累计排脏率为(43.33±5.77)％；而巨大芽孢杆菌H1拮抗组的累计排脏率为(3.33±2.89)％(图3)。统计分析显示：H1拮抗组和阳性对照组差异显著(p＜0.05)，说明巨大芽孢杆菌H1具有很好的保护仿刺参稚参的作用。经计算获得的巨大芽孢杆菌H1对仿刺参稚参的排脏保护率为92.7％。
本发明与现有技术相比的有益效果
(1)本发明微生态制剂的主要成分为巨大芽孢杆菌菌株H1及其胞外代谢物，该微生态制剂对由灿烂弧菌引起的仿刺参“腐皮综合症”特异性强，且防效高，对仿刺参稚参的排脏保护率为92.7％。(2)利用本发明微生态制剂防治由灿烂弧菌引起的仿刺参“腐皮综合症”不易产生抗药性,对人、畜安全，无环境污染。(3)本发明制备方法简单、成本低、使用方便。
附图说明
图1根据16S rRNA基因序列构建的H1菌株及与其亲源关系较近的Bacillusmegaterium代表菌株的系统进化树。进化距离的计算采用P-distance计算模型，树的拓扑形状采用neighbor-joining方法构建，分支上的数字为1000次bootstrap分析所得值，标尺0.0002代表此长度为万分之2的核苷酸序列替换。
图2巨大芽孢杆菌H1菌株体外拮抗灿烂弧菌LJ08(牛津杯法)
图3巨大芽孢杆菌H1菌株对灿烂弧菌LJ08的拮抗实验
巨大芽孢杆菌H1，拉丁文名称为Bacillus megaterium H1，于2014年10月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.9883,保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
具体实施方式：
下面通过实施例对本发明的技术方案做进一步的解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
实施例1
一种巨大芽孢杆菌H1生产的微生物制剂，其活性成分为巨大芽孢杆菌H1的菌体和它的胞外代谢产物。其制备方法按照如下步骤进行：
(1)菌种活化：将保存于-80℃的巨大芽孢杆菌H1菌株在胰蛋白胨大豆琼脂培养基上划线活化，28℃培养至长出单菌落，再挑取单菌落接种于胰蛋白胨大豆琼脂培养基斜面培养基上，28℃培养24小时，得到活化菌株。
(2)种子液制备：按常规方法制备胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基，其成分及组成：胰蛋白胨1.5％(g/100ml)、大豆蛋白胨0.5％(g/100ml)、氯化钠0.5％(g/100ml)；在500mL锥形瓶中装入胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基200mL，pH为7.6。置高压蒸气灭菌器中，在121℃，105kPa下灭菌20分钟。待培养液温度降至30℃后，于瓶中接入步骤(1)活化好的一接种环菌苔，在摇床上进行振荡培养，培养条件为转速170rpm，28℃培养24小时，获得种子液。
(3)发酵罐培养基的制备：用海水配制的发酵培养基，按重量百分比将豆粕粉0.5％，玉米浆0.2％，酵母膏0.01％，KH2PO40.02％，磷酸高铁0.005％加入海水中，于316L不锈钢发酵罐中搅拌均匀，在121℃，105kPa下灭菌20分钟，降温至30℃以下备用。
(4)发酵培养：向发酵罐中按体积比0.1％的比例接入步骤(2)的巨大芽孢杆菌H1种子液，搅拌机转速为120rpm，通入过滤无菌空气，通气量与发酵液体积的比值1:1，通气单位L/min，罐压为0.04Mpa，pH 7.6，28℃下培养24小时。每隔2小时取样镜检，菌数达1010～1011CFU/ml后即停止发酵培养，所得菌液为巨大芽孢杆菌H1液体微生物制剂。
实施例2
2012年1月至3月，我们在山东安源水产股份有限公司进行了为期2个月的仿刺参保苗养殖实验。巨大芽孢杆菌H1微生态制剂按照实施例1的方法经发酵罐生产，活菌数达3.5×1010CFU/ml，菌液呈浅棕色状，于室温保存。实验在该公司实验车间6个仿刺参保苗池进行，设对照组和泼洒巨大芽孢杆菌H1微生态制剂的实验组，每组3平行，其中每池水体为8立方米。选取健康稚参个体(平均体质量为0.81±0.37g，体长1.3-2.1cm)，个体投放密度为0.5kg/方水体，进行24小时充气养殖。保证水体溶解氧>5mg/L，水温16～18℃，避光，每天换水量50-100％。饲料和添加剂按正常生产投喂，初始饲料投喂量按参苗体湿重的5％，每天早晨投喂一次。仿刺参致病弧菌灿烂弧菌LJ08每天早晨按养殖水体最终活菌数104CFU/ml的量进行各池拌料投喂。实验组巨大芽孢杆菌H1微生态制剂用法为每天换水后泼洒一次，每立方米水体泼洒4毫升，保持巨大芽孢杆菌H1在养殖水体的最终活菌数为1.4×105CFU/ml。每4至7天倒池，在参苗框换池时统计各池底参苗死苗和有腐皮症状的个数。结果表明，2月内泼洒巨大芽孢杆菌H1微生态制剂的实验组池底参苗腐皮及死苗数平均为75.67±7.59只/池，对照池的参苗腐皮及死苗数平均为287.33±52.64只/池。加本发明微生态制剂有效地控制了由灿烂弧菌引起腐皮症，提高了仿刺参稚参的成活率，可应用于仿刺参大规模的保苗生产。
实施例3
2013年12月，我们在青岛贝宝海洋科技股份有限公司进行了为期3个月的仿刺参保苗越冬养殖实验。巨大芽孢杆菌菌株H1由公司按照实施例1的方法二级发酵罐生产，菌数达8.6×1010CFU/ml，于室温保存。实验在该公司循环水车间9个仿刺参保苗池进行，设对照组、投喂巨大芽孢杆菌H1微生态制剂实验组和投喂枯草芽孢杆菌菌液实验组，枯草芽孢杆菌菌液为市售(标称1011CFU/ml)，每组3个平行，其中每池水体为6立方米。选取健康稚参个体(平均体质量为3.12±0.97g，体长3.01-4.12cm)，个体投放密度为0.5kg/方水体。养殖池24小时充气，溶解氧>5mg/L，水温14～16℃，避光，每天换水量80％。初始饲料投喂量按参苗体湿重的5％，每天早晨投喂一次。仿刺参致病弧菌灿烂弧菌LJ08每天换水后按养殖水体最终活菌数为104CFU/ml进行各池泼洒。实验组巨大芽孢杆菌H1微生态制剂和枯草芽孢杆菌菌液的用量分别为每立方米水体3毫升，拌饲料投喂。每5至7天倒池，参苗框换池时统计各池池底参苗死苗和有腐皮症状的个数，并于3个月后进行各池称重。结果表明，投喂巨大芽孢杆菌H1微生态制剂的实验组池底参苗腐皮及死苗数平均为35.33±1.70只/池，对照组的参苗腐皮及死苗数平均为187.33.06±31.67只/池，投喂枯草芽孢杆菌菌液实验组的参苗腐皮及死苗数平均为142.67±15.97只/池。投喂巨大芽孢杆菌H1微生态制剂的实验组参苗体质量比对照组和投喂枯草芽孢杆菌菌液实验组分别增重38.75％和26.51％。结果证明在仿刺参冬季低温保苗期投喂巨大芽孢杆菌H1微生态制剂可有效降低参苗腐皮症的发生，并显著提高产量，巨大芽孢杆菌H1微生态制剂适宜于仿刺参冬季保苗大规模养殖时应用。

Claims (6)

1.一种用于防治仿刺参“腐皮综合症”的微生态制剂，其特征在于其活性成分为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）H1的菌体和它的胞外代谢产物；
所述的巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）H1 分离自山东蓬莱健康养殖的仿刺参（Apostichopus japonicas Selenka）肠道粪便。该菌株于2014年 10月 29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No. 9883 , 保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
2.根据权利要求1所述的一种用于防治仿刺参“腐皮综合症”的微生态制剂，其特征在于所述微生态制剂为液体。
3.根据权利要求1所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于它的具体步骤如下：
(1)菌种活化：将保存的巨大芽孢杆菌H1菌株在胰蛋白胨大豆琼脂培养基上划线活化，再挑取单菌落接种于胰蛋白胨大豆琼脂培养基斜面培养基上，28oC培养24小时，即可获得活化巨大芽孢杆菌H1菌株；
(2)种子液制备:无菌条件下将步骤(1)活化的巨大芽孢杆菌H1菌株接种至无菌胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中，在28-30oC、摇床转速150-170rpm条件下培养20-24小时，获得巨大芽孢杆菌H1种子液；
(3)发酵培养：按照体积比0.1%的比例将步骤(2)的巨大芽孢杆菌H1种子液接入用海水配制的发酵培养基；所述发酵培养基的成分及其重量百分比为豆粕粉0.5%，玉米浆0.2%，酵母膏0.01%，KH2PO4 0.02%，磷酸高铁 0.005%；所述发酵培养基的pH7.5-8.0；在28-30oC、搅拌机转速120-140rpm条件下培养20-24小时，获得巨大芽孢杆菌H1菌株的液体制剂，活菌数1010～1011CFU/ml，也即用于防治仿刺参“腐皮综合症”的微生态制剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤(3)将菌种接入发酵培养基后用搅拌机以120-140rpm的转速进行搅拌，同时向发酵罐中通入过滤无菌空气，通气量与发酵液体积的比值1:1，通气单位L/min，罐压为0.03-0.05Mpa。
5.一种巨大芽孢杆菌H1在制备防治仿刺参“腐皮综合症”的制剂中的应用，其特征在于，将权利要求1所述的微生态制剂泼洒于仿刺参养殖水体，或者将所述的微生态制剂与仿刺参饲料混合后进行投喂，水体中最终活菌数为105～106CFU/ml。
6.一种巨大芽孢杆菌H1在制备防治仿刺参“腐皮综合症”的微生态制剂中的应用，其特征在于：所述的巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）H1 分离自山东蓬莱健康养殖的仿刺参（Apostichopus japonicas Selenka）肠道粪便。该菌株于2014年 10月 29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No. 9883 , 保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
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