CN108949616B - 产脂肪酶且抑制灿烂弧菌的枯草芽孢杆菌及使用方法 - Google Patents

产脂肪酶且抑制灿烂弧菌的枯草芽孢杆菌及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株枯草芽孢杆菌ZF003(Bacillus subtilis s)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15645，保藏日期为2018年4月26日。本发明还公开了所述的枯草芽孢杆菌的应用，将所述枯草芽孢杆菌应用于刺参的养殖，包括两种方法：（1）采用所述枯草芽孢杆菌发酵刺参饲料；（2）将所述枯草芽孢杆菌的菌液泼洒在刺参养殖池中。所述菌株一方面能向细胞外分泌脂肪酶，所述脂肪酶可以分解饲料中的脂肪；另一方面能有效抑制刺参腐皮综合征的主要致病菌——灿烂弧菌。

Description

产脂肪酶且抑制灿烂弧菌的枯草芽孢杆菌及使用方法
技术领域
本发明属于生物学领域，涉及一株枯草芽孢杆菌，具体涉及一株产脂肪酶而且抑制弧菌的芽孢杆菌及使用方法。
背景技术
随着水产养殖业的飞速发展，高密度的集约化养殖规模日益扩大，水产养殖的环境恶化和疾病的危害对水产养殖业的经济损失也愈加明显。而传统的解决办法是采用抗生素；众所周知，抗生素的使用容易产生耐药性菌株的问题，并且会在体内残留。益生菌是一定浓度范围内可以对动物体产生有益作用的活的微生物。益生菌通过增强动物对肠内有害微生物群落的抑制作用，或者通过增强非特异性免疫功能来预防疾病，起到了促进动物生长的作用。因此，近些年来，作为抗生素的部分领域的替代品，益生菌得到迅速的发展。目前益生菌已经广泛应用于鱼类、贝类、虾类以及刺参的养殖中。
Bagheri等(2008)研究了将不同浓度的复合芽孢杆菌制剂添加到虹鳟饲料中进行两个月的投喂，结果发现高浓度的复合益生菌制剂可以明显促进虹鳟生长。Doeschate等(2008)研究证明南非鲍分离得到的土著益生菌群可以提高其消化酶活力，促进生长。Iehata等(2009)证明乳酸菌对鲍鱼肠道消化酶活性提高有一定的作用。
发明专利申请201510896838.8提供了“一株地衣芽孢杆菌及包含该菌株的饲料添加剂”。该发明专利申请具体提供了一株新型地衣芽孢杆菌DN29(Bacillus licheniformisDN29)，其保藏编号为CCTCCNO：M2015482。所述的地衣芽孢杆菌DN29，能有效抑制灿烂弧菌和假交替单胞菌等病原菌，减少养殖动物病害发生的几率，同时还能作为饲料添加剂，显著提高养殖动物对饲料的利用率，促进动物生长。所述地衣芽孢杆菌DN29可作为益生菌应用于刺参的养殖生产过程中，对刺参的生长具有显著的促进作用，还可以有效提高刺参的免疫力及对灿烂弧菌的抵抗能力。
发明专利ZL201410519541.5公开了“枯草芽孢杆菌H4及其制备的腐熟菌剂、腐熟菌剂的应用”。该发明提供一株新菌株--枯草芽孢杆菌H4，利用该菌株制备的腐熟菌剂具有耐高温，分泌蛋白酶、脂肪酶以高效发酵动物类废弃物的优点，利用所述腐熟菌剂堆肥具有环境污染小、经济易行等优点，堆肥处理后的产品经过后续处理，可以作为有机肥料达到变废为宝的目的。
综上可知，现有技术中报道的芽孢杆菌菌株，有些提高刺参生长和抗病力或免疫力，有些可以分泌脂肪酶。但目前还没有报道同时可以抑制主要致病菌和分泌脂肪酶的菌株。
发明内容
本发明提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，所述菌株一方面能向细胞外分泌脂肪酶，所述脂肪酶可以分解饲料中的脂肪；另一方面能有效抑制刺参腐皮综合征的主要致病菌——灿烂弧菌。
本发明的技术方案：
一株产脂肪酶且抑制弧菌的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌命名为枯草芽孢杆菌ZF003(Bacillus subtilis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15645，保藏日期为2018年4月26日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述枯草芽孢杆菌ZF008 16S rDNA序列如SEQ NO.4所示。
所述的枯草芽孢杆菌的活化方法，将枯草芽孢杆菌接种到LB培养基中，在20-28℃的温度条件下培养8-10小时。其中，所述LB培养基的配方为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L。
所述的枯草芽孢杆菌的应用，将所述枯草芽孢杆菌应用于刺参的养殖。所述枯草芽孢杆菌应用于刺参的养殖包括两种方法：(1)采用所述枯草芽孢杆菌发酵刺参饲料；(2)将所述枯草芽孢杆菌的菌液泼洒在刺参养殖池中。
其中，所述方法(1)具体为：(A)将所述枯草芽孢杆菌菌株活化(细菌含量为1.0*108cfu/ml-1.0*109cfu/ml)，然后取适量，投入到初始刺参养殖饲料中，混合均匀，得到混合刺参养殖饲料；所述枯草芽孢杆菌菌液的重量分数为3-10％。(B)向混合刺参养殖饲料中加入适量水，所述水的量为初始刺参养殖饲料重量的1.5-3倍，然后在20-28℃的温度条件下发酵12-32小时，即发酵刺参饲料。发酵后得到的刺参饲料为浆状液体，具有发酵香味。用该菌株发酵刺参饲料，能使饲料中的脂肪分解为脂肪酸，更加有利于刺参的消化吸收。
其中，所述方法(2)具体为：将活化好的菌液，均匀投放在刺参养殖池中，使菌液的浓度为10-20PPM；并根据消耗量定期补充以维持该浓度。具体步骤为：将活化好的菌液(细菌含量为1.0*108cfu/ml-1.0*109cfu/ml)稀释10倍，然后再均匀投放到刺参养殖池中。5天补充投放一次，每次倒池(即将池中刺参连同刺参的附着基一起移至一个经过清理消毒的养殖池)后补充投放一次。在养殖水体中泼洒该菌株，可以有效抑制养殖刺参以及水体环境中的致病菌，提高刺参成活率，起到提高养殖效益的作用。
一种包括所述的枯草芽孢杆菌的发酵刺参饲料，通过上述方法(1)制备得到。
所述发酵刺参饲料的使用方法，其特征在于：将所述发酵刺参饲料与海泥(海底的浮泥，是海水中的泥沙和少数动植物碎屑及底栖硅藻等的混合物)，按照1:4-1:6的重量比混合均匀，然后将其投放在刺参养殖水中；所述每日的投放量为待喂养刺参总重量的1-3％。
本发明的有益效果：
(1)本发明中的枯草芽孢杆菌ZF003分泌的脂肪酶可以分解饲料的脂肪，提高饲料的利用率；另一方面能有效抑制刺参腐皮综合征的主要致病菌——灿烂弧菌，避免了刺参腐皮综合征带来的经济损失。
(2)采用本发明所述的菌株发酵的刺参饲料养殖刺参，可以使饲喂2个月的刺参的增重率提高近55个百分点；同时抑制刺参养殖过程中的灿烂弧菌，减少发病率，成活率可以提高9个百分点；一方面降低了致病菌所导致的刺参养殖过程中的损失，另一方面增加了生长速度而产生了巨大的经济效益，对于刺参养殖产业的发展具有重要的意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：菌株的分离与筛选
1.1有益菌的分离
(1)初筛：
采用溴甲酚紫油脂同化平板变色圈法初筛产脂肪酶的菌株。配油脂同化平板培养基，调pH至6.5，灭菌后加入0.04％溴甲酚紫指示剂和乳化橄榄油。用接种环刮取少量菌体点种于平板上，倒置于28恒温培养3天后观察变色圈大小，产生变色圈即说明该菌有分泌脂肪酶的能力，变色圈越大，产酶能力越强。
初筛培养基为油脂同化平板培养基，配方如下(％，w/w)：
乳化橄榄油12，磷酸二氢钾0.1，硫酸镁0.05，硫酸铁0.001，硫酸铵0.2，氯化钾0.05琼脂2.0，0.04％溴甲酚紫指示剂1(v/v)
(2)复筛：
将经过初筛的菌种接种到发酵培养基上，培养12小时后以1％(v/v)的比例再转接到发酵培养基中，28℃、180rpm培养3天后，将菌液于4℃、10000rpm下离心15min,去上清液测定酶活力。
酶活力定义：1ml酶溶液在30℃和pH7.0条件下，1min水解乳化橄榄油产生1μmol的可滴定脂肪酸，即为1个酶活力单位
复筛用发酵培养基，配方如下(％，w/w)：
乳化橄榄油1.0，蛋白胨1.0，磷酸二氢钾0.2，硫酸镁0.05，硫酸铁0.001，氯化钾0.05硫酸铵0.2。
实施例2：菌株的鉴定
提取菌液总DNA，作为菌液PCR模板，以27F和1492R引物进行PCR扩增。PCR反应体系(10μl)：cDNA 1μl、10×Buffer1μl、2.5mM dNTP 0.8μl、10μM正反引物各0.5μl，0.05μlrTaq酶、2H2O 6.15μl。
PCR引物：
Figure GDA0001776202040000041
PCR反应条件为：
Figure GDA0001776202040000042
整个反应结束后，反应产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。在凝胶成像系统下将目的条带切回，按照上海生工SanPrep柱式试剂盒说明书进行DNA回收、纯化。回收DNA-20℃保存或用于转化链接。将回收产物与PMD18-T克隆载体进行连接，16℃连接过夜，获得目的菌株基因序列PMD18-T重组载体。
连接体系如下：
回收产物 4.5ul
PMD18-T 0.5ul
SolutionI 5ul
将连接产物全部转入已制备好的大肠杆菌感受态DH5α中，碎冰浴30min，42℃热激30s，置于冰上。加入650μL已经预热至37℃的LB培养基，37℃震荡培养1h。然后5000rpm离心3min，弃大部分上清，将剩余约150μL上清与沉淀吹打混匀，涂布于含有100mg/mL氨苄青霉素钠(Amp)的LB平板上，37℃正置培养1h后，再倒置培养12-16h。
挑取平板上长势良好的单菌落，37℃培养6h后，用特异引物27F和1492R进行阳性克隆的筛选，将连接正确的菌液送至上海桑尼生物公司测序。最后，将目的菌株的cDNA序列进行Blast比对，确定菌株种属。
实施例3：菌株活化条件
将所述枯草芽孢杆菌菌株，接种到LB培养基中，在20-28℃的温度条件下培养8-10小时，得到活化后的枯草芽孢杆菌。所述LB培养基的配方为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L。
实施例4所述枯草芽孢杆菌，对灿烂弧菌的抑制作用
把扩大培养后的灿烂弧菌(细菌含量为1.0*105cfu/ml-1.0*107cfu/ml)，无菌操作下准确稀释10倍，分别吸取20μL在LB固体培养基上用涂布棒涂板，每个菌株涂3个平板。然后用灭菌的滤纸片吸取本发明所述枯草芽孢杆菌，放置于涂布灿烂弧菌的平板上每个菌三次重复。培养12小时后，经观察，有清晰透明圈出现，证明所述枯草芽孢杆菌对灿烂弧菌具有拮抗作用。
实施例5：采用所述枯草芽孢杆菌发酵刺参饲料，并喂养刺参
(1)取500g活化后的枯草芽孢杆菌菌液(细菌含量为1.0*108cfu/ml-1.0*109cfu/ml)，投入到10kg初始刺参养殖饲料中，混合均匀，得到混合刺参饲料。
(2)向10kg混合刺参饲料中加入20kg水，然后在25℃的温度条件下发酵12小时，即得到发酵刺参饲料。发酵后的刺参饲料为浆状液体，具有发酵香味。
(3)喂养刺参：选取约500头/500g，大小基本相同的刺参，随机放入3个大小为15立方米水体池中，每个池内放5kg。将所述发酵刺参饲料与海泥(海底的浮泥，是海水中的泥沙和少数动植物碎屑及底栖硅藻等的混合物)，按照1:5的重量比混合均匀，然后将其投放在刺参养殖水中。
所述每日的投放量为待喂养刺参总重量的3％。即实验开始时投喂0.15kg饲料/池，于第二天上午检查剩料情况，并根据摄食情况调整饲料的投喂量。饲喂持续60天后，全池称重并计数，计算增重率和成活率。三个池重量分别为19.1kg、19.6kg和18.9kg，平均为19.2kg。增重率分别为282.0％、292.0％和278.0％，平均为284.0％。成活率分别为93.0％、89.0％和94.0％，平均为92.0％。
对照组1(未使用本发明菌株饲料饲喂刺参)：
选取约500头/500g，大小基本相同的刺参，随机放入3个大小为15立方米水体池中，每个池内放5kg。饲喂普通商品饲料，饲喂比率为刺参的3％/天，即实验开始时投喂0.15kg饲料/池，于第二天上午检查剩料情况，并根据摄食情况调整饲料的投喂量。饲喂时间为60天后，全池称重，三个池重量分别为15.3kg，16.4kg和17.5kg，平均为16.4kg。增重率分别为206％、228％和250％，平均为228％；成活率为80％、82％和80％，平均为80.7％。
实施例6：采用所述枯草芽孢杆菌发酵刺参饲料，并喂养刺参
与实施例5不同的是，
(1)取300g活化后的枯草芽孢杆菌液，投入到10kg初始刺参养殖饲料中，混合均匀，得到混合刺参饲料；
(2)向10kg混合刺参饲料中加入30kg水，然后在25℃的温度条件下发酵22小时，即得到发酵刺参饲料。发酵后的刺参饲料为浆状液体，具有发酵香味。
(3)喂养刺参：将所述发酵刺参饲料与海泥(海底的浮泥，是海水中的泥沙和少数动植物碎屑及底栖硅藻等的混合物)，按照1:6的重量比混合均匀，然后将其投放在刺参养殖水中。
所述每日的投放量为待喂养刺参总重量的2％，即实验开始时投喂0.05kg饲料/池，于第二天上午检查剩料情况，并根据摄食情况调整饲料的投喂量。饲喂持续60天后，全池称重并计数，计算增重率和成活率。三个池重量分别为19.7kg、18.5kg和19.2kg，平均为19.1kg。增重率分别为294％、270％和284％，平均为282.7％。成活率分别为92％、91％和89％，平均为90.7％。
对照组2(未使用本发明菌株饲料饲喂刺参)：
饲喂普通商品饲料，饲喂比率为刺参的1％/天，即实验开始时投喂0.05kg饲料/池，于第二天上午检查剩料情况，并根据摄食情况调整饲料的投喂量。饲喂时间为60天后，全池称重，三个池重量分别为16.0kg，17.3kg和15.7kg，平均为16.3kg。增重率分别为220％、246％和214％，平均为226.7％。成活率为82％、86％和83％，平均为83.7％。
实施例7：采用所述枯草芽孢杆菌发酵刺参饲料，并喂养刺参
与实施例5不同的是，
(1)取800g活化后的枯草芽孢杆菌液，投入到10kg初始刺参养殖饲料中，混合均匀，得到混合刺参饲料。
(2)向10kg混合刺参饲料中加入15kg水，然后在30℃的温度条件下发酵32小时，即得到发酵刺参饲料。发酵后的刺参饲料为浆状液体，具有发酵香味。
(3)喂养刺参：将所述发酵刺参饲料与海泥(海底的浮泥，是海水中的泥沙和少数动植物碎屑及底栖硅藻等的混合物)，按照1:4的重量比混合均匀，然后将其投放在刺参养殖水中。
所述每日的投放量为待喂养刺参总重量的2％，即实验开始时投喂0.1kg饲料/池，于第二天上午检查剩料情况，并根据摄食情况调整饲料的投喂量。饲喂持续60天后，全池称重并计数，计算增重率和成活率。三个池重量分别为20.3kg、19.3kg和18.1kg，平均为19.2kg。增重率分别为306％、286％和262％，平均为284.7％。成活率分别为91％、93％和91％，平均为91.7％。
对照组3(未使用本发明菌株饲料饲喂刺参)：
饲喂普通商品饲料，饲喂比率为刺参的1％/天，即实验开始时投喂0.05kg饲料/池，于第二天上午检查剩料情况，并根据摄食情况调整饲料的投喂量。饲喂时间为60天后，全池称重，三个池重量分别为17.2kg，16.1kg和16.5kg，平均为16.5kg。增重率分别为244％、222％和230％，平均为232.0％。成活率为83％、82％和85％，平均为83.3％。
实施例8：采用所述枯草芽孢杆菌发酵刺参饲料，并喂养刺参
与实施例5不同的是，
(1)取1000g活化后的枯草芽孢杆菌液，投入到10kg初始刺参养殖饲料中，混合均匀，得到混合刺参饲料；
(2)向10kg混合刺参饲料中加入25kg水，然后在20℃的温度条件下发酵18小时，即得到发酵刺参饲料。发酵后的刺参饲料为浆状液体，具有发酵香味。
(3)喂养刺参：将所述发酵刺参饲料与海泥(海底的浮泥，是海水中的泥沙和少数动植物碎屑及底栖硅藻等的混合物)，按照1:5.5的重量比混合均匀，然后将其投放在刺参养殖水中。
所述每日的投放量为待喂养刺参总重量的2％，即实验开始时投喂0.05kg饲料/池，于第二天上午检查剩料情况，并根据摄食情况调整饲料的投喂量。饲喂持续60天后，全池称重并计数，计算增重率和成活率。三个池重量分别为19.7kg、19.3kg和18.5kg，平均为19.2kg。增重率分别为294％、286％和270％，平均为283.3％。成活率分别为90.0％、91.0％和87.0％，平均为89.3％。
对照组4(未使用本发明菌株饲料饲喂刺参)：
饲喂普通商品饲料，饲喂比率为刺参的1％/天，即实验开始时投喂0.05kg饲料/池，于第二天上午检查剩料情况，并根据摄食情况调整饲料的投喂量。饲喂时间为60天后，全池称重，三个池重量分别为15.6kg，16.0kg和17.8kg，平均为16.5kg。增重率分别为212％、220％和256％，平均为229.3％。成活率为83％、85％和80％，平均为82.7％。
表1有益菌株发酵饲料对刺参生长及成活率的影响
初重，kg 末重，kg 增重率,％ 成活率,％
实施例5 5.0 19.2 284.0 92.0
对照组1 5.0 16.4 228.0 80.7
实施例6 5.0 19.1 282.7 90.7
对照组2 5.0 16.3 226.7 83.7
实施例7 5.0 19.2 284.7 91.7
对照组3 5.0 16.5 232.0 83.3
实施例8 5.0 19.2 283.3 89.3
对照组4 5.0 16.5 229.3 82.7
实施例9：将所述枯草芽孢杆菌的菌液泼洒在刺参养殖池中
(1)将所述枯草芽孢杆菌菌株，按照实施例3所述方法活化。
(2)将活化好的菌液(细菌含量为1.0*108cfu/ml-1.0*109cfu/ml)先用养殖池的海水稀释10倍，然后再均匀投放到刺参养殖池中。使用浓度为10-20PPM，每5天补充投放一次，每次倒池(即将池中刺参连同刺参的附着基一起移至一个经过清理消毒的养殖池)后补充投放一次。在养殖水体中泼洒该菌株，一方面，可明显降解水体中残饵和粪便中的脂肪，净化水质；另一方面可以有效抑制养殖刺参以及水体环境中的致病菌，提高刺参成活率，起到提高养殖效益的作用。
所试验的三个养殖中，初始重量都为5kg，用普通未发酵饲料饲喂60天后，重量分别为18.2kg、18.1kg和17.2kg，平均为17.8kg；增重率分别为264％、262％和244％，平均为256.7％；成活率分别为90％、91％和93％，平均为91.3％。
对照组5：(如发酵饲料的对照)
选取约500头/500g，大小基本相同的刺参，随机放入3个大小为15立方米水体池中，每个池内放5kg。饲喂普通商品饲料，饲喂比率为刺参的2％/天，即实验开始时投喂0.1kg饲料/池，于第二天上午检查剩料情况，并根据摄食情况调整饲料的投喂量。饲喂时间为60天后，全池称重，三个池重量分别为15.8kg，16.7kg和17.5kg，平均为16.7kg；增重率分别为216％、234％和250％，平均为233.3％；成活率为82％、83％和80％，平均为81.7％。
表2有益菌株泼洒水体对刺参生长、成活率的影响
初重，kg 末重，kg 增重率,％ 成活率,％
对照组5 5.0 16.7 233.3 81.7
实施例8 5.0 17.8 256.7 91.3
提高 1.1 23.4 9.6
实施例10：所述枯草芽孢杆菌的对致病菌感染的保护率
在9个70L的玻璃水槽中，每个槽中投放30头规格为每头10g的刺参，经过7天暂养后，随机选择6个在水体中泼洒刺参腐皮综合征的致病菌——灿烂弧菌，浓度为10PPM，另外的3个留作对照。然后在该泼洒了致病菌的6个槽中，随机选择3个，泼洒15PPM的本发明所述的枯草芽孢杆菌，在处理后的第2天、第4天和第7天观察刺参的发病率，计算对致病菌感染的保护率。
所述的3个泼洒了致病菌的水槽，第2天即有5头发病，症状为首先表现为嘴部肿胀和部分刺变白，摇头、吐肠。然后是部分表皮溃烂，继而大部分溃烂，而同时泼洒了本发明枯草芽孢杆菌的3个槽中仅有2头有发病症状，经计算，对灿烂弧菌感染的保护率为60％。第4天时，3个泼洒了致病菌的水槽中的发病刺参发展为29头，发病率达到35.6％，而同时泼洒了本发明枯草芽孢杆菌的3个槽中仅有4头发病，发病率为4.4％，保护率为87.5％。到第7天，3个泼洒了致病菌的水槽中的发病刺参发展为36头，发病率达到40.0％，而同时泼洒了本发明枯草芽孢杆菌的3个槽中仍仅有4头发病，发病率为4.4％，保护率为88.9％。
表3.实施例10中枯草芽孢杆菌对致病菌感染的保护率
Figure GDA0001776202040000091
由表1可知，采用本申请所述的枯草芽孢杆菌发酵刺参饲料，并喂养刺参；60天后增重率为282.7％-284.7％，成活率为89.3％-92.0％；而对照组的刺参，增重率为226.7％-232.0％，成活率为80.7％-83.7％。与对照组相比，采用本申请所述的枯草芽孢杆菌发酵的刺参饲料喂养的刺参，增重率上涨了近55个百分点，而成活率也增加了近9个百分点。
由表2可知，将本申请所述的枯草芽孢杆菌的菌液泼洒在刺参养殖池中，采用普通养殖饲料喂养海参，60天后，刺参增重率为256.7％，成活率为91.3％；而对照组(未泼洒菌液)的刺参增重率为233.3％，成活率为81.7％。与对照组相比，将苏云金芽孢杆菌的菌液泼洒在刺参养殖池中的刺参，增重率上涨了23.4个百分点，成活率增加了9.6个百分点。
综上可知，本申请所述的枯草芽孢杆菌，用于刺参的饲养，可以使刺参的生长速度加快，提高刺参的成活率。
此外，如表3所示，所述的3个泼洒了致病菌的水槽，第2天有5头发病，而同时泼洒了本发明枯草芽孢杆菌的3个槽中仅有2头有发病症状，经计算，对灿烂弧菌感染的保护率为60％。第4天时，3个泼洒了致病菌的水槽中的发病刺参发展为29头，发病率达到35.6％，而同时泼洒了本发明枯草芽孢杆菌的3个槽中仅有4头发病，发病率为4.4％，保护率为87.5％。到第7天，3个泼洒了致病菌的水槽中的发病刺参发展为36头，发病率达到40.0％，而同时泼洒了本发明枯草芽孢杆菌的3个槽中仍仅有4头发病，发病率为4.4％，保护率为88.9％。充分说明，本申请所述的枯草芽孢杆菌对于灿烂弧菌具有抑制作用，可以有效的保护刺参不受致病菌的侵害。
综上所述，本发明中的枯草芽孢杆菌ZF008一方面通过其分泌的脂肪酶可以分解饲料的脂肪，提高饲料的利用率，增加刺参的生长速度；另一方面能有效抑制刺参腐皮病的主要致病菌——灿烂弧菌，避免了刺参腐皮病带来的经济损失。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 产脂肪酶且抑制灿烂弧菌的枯草芽孢杆菌及使用方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 1567
<212> DNA
<213> 产脂肪酶的菌株的16S r(A strain of lipase)
<400> 2
agctcggtac ccggggatcc tctagagatt agagtttgat cctggctcag gacgaacgct 60
ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta 120
gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga 180
aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcaaacataa aaggtggctt 240
cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aatggctcac 300
caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg 360
gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgaca 420
gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga 480
acaagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa 540
ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg 600
taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctt aaccggggag 660
ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc ccgtgtagcg 720
gtgaaatgcg tagagaatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa 780
ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg 840
ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc 900
attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg 960
gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg 1020
tcttgacatc ctctgacaat cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg 1080
tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 1140
caacccttga tcttagttgc cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca 1200
aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca 1260
cgtgctacaa tggacagaac aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa 1320
tctgttctca gttcggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta 1380
atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1440
accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc ttttaggagc cagccgccga 1500
aggtgggaca gatgattggg gtgaagtcgt aacaaggtaa ccaatcgtcg acctgcaggc 1560
atgcaag 1567

Claims (10)

1.一株产脂肪酶且抑制弧菌的枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) ZF003 ，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.15645，保藏日期为2018年4月26日。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌ZF003 16SrDNA 序列如SEQ ID NO.1 所示。
3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的活化方法，其特征在于：将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，接种到培养基中，在20-30℃的温度条件下培养8-10小时。
4.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：将所述枯草芽孢杆菌应用于刺参的养殖。
5.根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌应用于刺参的养殖包括两种方法：（1）采用所述枯草芽孢杆菌发酵刺参饲料；（2）将所述枯草芽孢杆菌的菌液泼洒在刺参养殖池中。
6.根据权利要求5所述的枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述方法（1）具体为：(A)将所述枯草芽孢杆菌菌株活化，然后取适量，投入到初始刺参养殖饲料中，混合均匀，得到混合刺参养殖饲料；（B）向混合刺参养殖饲料中加入适量水，在适宜的温度条件下发酵一段时间，得到最终产物，即发酵刺参饲料。
7.根据权利要求6所述的枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：步骤（A）中所述枯草芽孢杆菌菌株的重量分数为3-10%；步骤（B）中水的加入量为初始刺参养殖饲料重量的1.5-3倍；所述的温度条件为20-28℃，所述发酵的时间为12-32小时。
8.根据权利要求5所述的枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述方法（2）具体为：将活化好的菌液，均匀投放在刺参养殖池或刺参保苗池中，使菌液的浓度为10-20 ppm ；并根据消耗量定期补充以维持该浓度。
9.一种包括如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的刺参养殖饲料，其特征在于：所述刺参养殖饲料通过权利要求6或权利要求7所述的所述方法（1）制备得到。
10.根据权利要求9所述的刺参养殖饲料的使用方法，其特征在于：将所述刺参养殖饲料与海泥，按照1:4-1:6的重量比混合均匀，然后将其投放在刺参养殖水中；每日的投放量为待喂养海参总重量的1-3%。
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