CN102134558B - 一株枯草芽孢杆菌及其在仿刺参育苗过程中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株枯草芽孢杆菌的分离及其在仿刺参育苗中的应用方法，能有效抑制弧菌等致病菌繁殖并促进海参苗的生长。该菌株从大连海域捕获鱼类腮部分离获得，经中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：CGMCC No.3498。本发明可以广泛运用于渔业的养殖和生产环节，可以降解，转化，代谢养殖和生产过程中的代谢产物，营造良好的生态环境，改良、保全、修复水资源的生态环境，达到消减自身污染，减少药物损害，降低成本，减轻养殖业对整体生态环境的污染，提高养殖产品品质。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其在仿刺参育苗过程中的应用
技术领域
本发明涉及一株枯草芽孢杆菌的分离及其在仿刺参育苗中的使用方法，该菌株能有效抑制水产生物养殖过程海水中，弧菌等致病菌繁殖并能促进仿刺参苗的生长。
背景技术
目前，随着高密度海水养殖业快速发展和环境污染的加剧，养殖动物的病害已成为我国乃至全世界海水养殖业发展的主要问题。公认的养殖动物的病害防治由药物来控制，由于抗生素的使用，养殖动物的生态环境受到破坏，养殖动物的生长受到抑制，食品安全无法保障，因此抗生素的使用受到严格限制。弧菌作为重要的病原菌，可引起多种海水养殖品种的病害爆发。使用微生物制剂可以提高养殖动物的免疫力，抑制病原微生物，从而减少疾病的发生，同时具有无残毒、无抗药性等优点。
发明内容
本发明所涉及枯草芽孢杆菌(编号Sn，保藏单位：中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心；保藏日期2009年12月03日；保藏编号3498)，系2008年4月从大连海域捕获鱼类腮部分离获得。分离方法为：取大连黑石礁海域捕获的黑鲪(许氏平鱿)活体，剪取腮部匀浆，将匀浆置于80℃恒温水浴中20分钟后均匀涂布于LB培养基上，待长出菌落后，在LB培养基上对菌落进行进一步分离纯化。纯化后的菌落进行16SrDNA扩增测序，经过序列比对和生理生化鉴定，得到纯化一株细菌，经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。实验室对其检测结果如下：
(1)形态特征菌体呈杆状，革兰氏阳性，可运动，周生鞭毛。芽孢中生，椭圆形，孢子囊不膨大，无伴孢晶体。在LB平板上，菌落淡乳白色，圆形，边缘整齐，表面湿润，菌落粘稠。液体静止培养时产生菌膜和菌环。
(2)生理生化特征过氧化氢酶和接触酶阳性，明胶液化，水解淀粉，能在3-7％NaCl及45℃下生长，可利用柠檬酸盐、葡萄糖、蔗糖、木糖、果糖、甘露醇，不能利用半乳糖、鼠李糖、甲酸盐、乙酸盐和丙酸盐。根据《伯杰细菌鉴定手册》等有关资料的描述，确定Sn菌株属于枯草芽孢杆菌。
(3)16SrDNA序列比对运用通用引物，经PCR扩增得到该菌的16SrDNA序列，将所得结果在Genbank中进行同源比对，结果Sn菌株与Bacillus subtilis d的16SrDNA序列的同源性达到100％，说明Sn菌株属于枯草芽孢杆菌。
(4)Sn菌株的抑菌特征用牛津杯法检测Sn菌株对刺参的主要病原菌哈氏弧菌(Vibrioharveyi)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)和灿烂弧菌(V.splendidus)的抑菌性，结果显示，Sn菌株对上述3种弧菌均产生抑菌圈，即Sn菌株对这些病原有抑制作用。
在海参育苗中，通过大量实践和科学化研究观察，Sn能抑制有害微生物的增殖，特别是抑制海洋弧菌等致病菌的繁殖，由此达到防治疾病和提高海参苗免疫力的目的。通过这种芽孢杆菌的使用，不但避免了病原菌耐药性的产生和药物的残留，而且菌体本身就是海参苗的饵料，具有促进海参苗的生长及提高海参苗产品质量的效果，更科学，更环保。同时本发明可以广泛运用于渔业的养殖和生产的其他环节，可以降解，转化，代谢养殖和生产过程中的代谢产物，营造良好的生态环境，改良、保全、修复水资源的生态环境，达到消减自身污染，减少药物损害，降低成本，减轻养殖业对整体生态环境的污染，提高养殖产品品质。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：在育苗过程中根据仿刺参不同发育阶段的生活特点，采取不同的方式使用该菌。在仿刺参浮游幼体阶段使用该菌时，向仿刺参幼体培育池中均匀泼洒该菌菌液，菌液使用量为20ml/m3，以达到抑制致病菌并促进仿刺参幼体生长发育的目的。在参苗附着变态后，以膨润土为载体，将菌液与膨润土充分混合后，将混合物投入参苗培育池内，菌液使用量为20ml/m3，菌液与膨润土的比例为3∶1。
上述枯草芽孢杆菌Sn采用液体发酵技术制成菌液，其活菌含量大于109cfu/ml。上述载体为粒径小于200目的钙基膨润土，市场有售。
本发明的有益效果是：枯草芽孢杆菌Sn能抑制海洋弧菌等致病菌的生长，同时该菌也为参苗提供营养，对促进海参苗生长发育效果显著。仿刺参幼体浮游阶段，个体浮游于培育水体中，直接泼洒菌液能使菌体均匀分布于水体中，直接抑制水体中的致病菌并能被仿刺参幼体摄食；而仿刺参幼体附着后，主要栖息于附着基上。膨润土对细菌有吸附作用，以膨润土为载体，可以使菌体快速沉降到附着基上，在抑制附着基上致病菌繁殖的同时容易被仿刺参摄食。
本发明具有实际操作性强，工艺简便，将渔业养殖中的代谢产物和有害物质快速代谢，同时提供养殖过程中所需的营养成分，起到环保和节约的双层效果。
具体实施方式
实施例1
在海参育苗的浮游幼体阶段，能有效抑制弧菌等致病菌及促进海参苗生长的枯草芽孢杆菌(Sn)单独使用方法是：将上述枯草芽孢杆菌Sn制成活菌含量大于109cfu/ml的菌液，均匀泼洒到海参浮游幼体培育池中，测量海参浮游幼体的生长情况并用TCBS培养基检测弧菌数量。
试验设计、管理、测定与结果
选用刚孵化出的海参浮游幼体，随机分为2个试验组，每组设3个平行样。分别为空白组、Sn益生菌组。养殖池为0.4m3/个的水槽，海参浮游幼体饵料按海洋酵母2-3ml/m3投喂，各试验组投喂量及其它试验条件相同，每日投喂1次。水温20-22℃，盐度31-32‰，pH7.9-8.15溶解氧5.4-7.1mg/L，氨氮20-60mg/m3。每天换水1/3量。试验日期为6天，测定其起始、终止每池海参浮游幼体体长及水中弧菌量。
A枯草芽孢杆菌Sn组：海洋酵母2-3ml/m3投喂，Sn益生菌每天按20ml/m3投喂。
B空白组：海洋酵母2-3ml/m3投喂。
统计结果显示：A组海参浮游幼体平均体长增长率显著高与B组(P＜0.01)，体长增长率比对照组高13.4个百分点，并提前2天进入变态期。A组弧菌量显著低与B组(P＜0.01)，仅为B组弧菌量的1/200。说明枯草芽孢杆菌Sn及其这种使用方法，能有效抑制弧菌等致病菌的繁殖并可促进海参浮游幼体的生长。
实施例1数据
  实验前平均体长(μm)   试验后平均体长(μm)   增长率(％)   水体中弧菌数(cfu/ml)
 A组(实验组)   500.3   723.7   44.6   3.2×102
 B组(对照组)   486.6   641.7   31.2   6.3×104
实施例2
将本发明涉及的枯草芽孢杆菌以及添加载体的使用方法运用于仿刺参苗种生产，观察实验组和对照组的生长情况并用TCBS培养基检测弧菌数量。将上述枯草芽孢杆菌Sn与载体均匀混合，制成活菌组合物。其方法为：3份菌液置于干净容器中，将1份钙基膨润土缓慢倾倒于菌液中，边倾倒边搅拌，使膨润土与菌液充分混合。
试验设计、管理、测定与结果
选用体长0.5-2cm，体重为0.01-0.017g(3-5万头/500g)参苗，随机分为2个试验组，每组设3个平行样。分别为对照组、枯草芽孢杆菌Sn与载体组。养殖池为水泥池，25m3/个。参苗饵料按参苗体重4-8％投喂，各试验组投喂量及其它试验条件相同，每日投喂1次。水温22～24℃，盐度30-32‰，pH8.1-8.5溶解氧5-7.2mg/L，氨氮30-80mg/m3。每天换水1/5量。试验周期为20天，测定其起始、终止每池参苗重量。试验终止时，用TCBS弧菌培养基分别测定实验组和对照组附着基上的弧菌数量。
A枯草芽孢杆菌Sn与载体组：取菌液500ml，与163克膨润土均匀混合，将混合物均匀泼洒于一个育苗池中。
B对照组：参苗饵料按参苗体重4-8％投喂。
统计结果显示：A组参苗体重显著高于B组(P＜0.05)，增重率平均比B组提高22.5个百分点。A组附着基上弧菌量显著低于B组(P＜0.01)，平均仅为B组的1％。说明Sn益生菌与载体组合物在海参育苗中能有效抑制弧菌等致病菌及促进海参苗的生长。
实施例2数据
  实验前平均重量(kg)   试验后平均重量(kg) 增重率   水体中弧菌数(cfu/ml)
  A组(实验组) 12.0 20.7 72.5％ 5.6×104
  B组(对照组) 12.0 18.6 55％ 5.3×106
以上所述，仅是本发明的实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是对本发明做非实质性修改，均仍属于本发明范围内。

Claims (3)

1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Sn，其保藏号为CGMCC NO：3498，能有效抑制弧菌等致病菌并促进仿刺参苗的生长发育。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在仿刺参育苗过程中的用途，其特征是：在仿刺参浮游幼体阶段使用该菌时，向参苗培育池中均匀泼洒该菌菌液，菌液浓度大于1×109cfu/ml，菌液使用量20ml/m3，以达到抑制致病菌并促进仿刺参幼体生长发育的目的。
3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在仿刺参育苗过程中的用途，其特征是：在仿刺参附着后阶段，以膨润土为载体，将菌液与膨润土充分混合后投入参苗培育池内，菌液浓度大于1×109cfu/ml，菌液使用量为20ml/m3，菌液与膨润土的比例为3∶1。
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