CN102864137B

CN102864137B - 养殖水体水质净化的微生物颗粒制剂及制备方法

Info

Publication number: CN102864137B
Application number: CN201210367357.4A
Authority: CN
Inventors: 刘成圣; 陈西广; 党奇峰; 高辉; 郭孝波; 范冰
Original assignee: QINGDAO AORUN BIOTECHNOLOGY Co Ltd; Ocean University of China
Current assignee: QINGDAO AORUN BIOTECHNOLOGY Co Ltd; Ocean University of China
Priority date: 2012-09-26
Filing date: 2012-09-26
Publication date: 2014-08-06
Anticipated expiration: 2032-09-26
Also published as: CN102864137A

Abstract

一种养殖水体水质净化的微生物颗粒制剂及制备方法，其特征是该制剂是由枯草芽孢杆菌经菌种活化、种子液制备、发酵培养、浓缩等步骤后，以沸石为核，以附菌基将枯草芽孢杆菌包裹在沸石的外层制成具有内外双层结构的灰白色不规则颗粒。其生产成本低，易于保存和运输，所含活菌数≥2×10¹⁰个/g，广泛用于淡水和海水的水质净化，投水后快速沉于水底，枯草芽孢杆菌在水中大量繁殖，与沸石协同发挥净水作用，迅速分解水中的残饵、腐殖质等有机物，并利用水中的硝酸盐和亚硝酸盐，进一步净化水质，降低养殖动物病害而提高品质和产量，且制备简单、成本低、制备工艺稳定，便于工业化生产，常温储存无需冷藏，有很好的社会效益和经济效益。

Description

养殖水体水质净化的微生物颗粒制剂及制备方法

技术领域

本发明属于水产养殖技术领域的养殖水体水质净化的微生物颗粒制剂及制备方法。

背景技术

随着水产养殖业的迅速发展，集约式工业化养殖的规模日益扩大。养殖过程中由于池底粪便、残饵等有机物质的积累，造成氨氮、硫化氢等有毒物质在水中的积累，引起养殖动物的大量发病死亡。抗生素是目前防治养殖动物病害的主要药物，抗生素的大量使用不仅干扰了益生菌群的繁殖，引起微生态的失调，而且增强了病菌的耐药性。为了保护生态环境和人类健康，寻求抗生素的有效替代品势在必行。

微生物水质净化剂是指从自然界中提取分离出微生物，对其进行培养扩增后，制备而成的有益菌制剂。将其用于水产养殖水质改良，具有无毒副作用、无农药残留、不会产生抗药性等优点，因此成为国内外研究的热点。近年来，虽然微生物水质净化剂得到了一定的发展，但仍然存在很多问题，例如：目前市场上的微生物水质净化剂一般为液态、固态粉状和固态片状，在水深大于1米使用时，很容易被冲走，不能有效达到分解去除有机淤泥，净化水质的目的；使用菌种盐度适应范围窄，不能海水、淡水通用；产品无法在常温下保存，必须在一定的温度下进行冷藏，达到一定温度后微生物会由于生长繁殖而失效，给储存和运输带来很多不便等。因此在水产养殖领域，提供具有好的沉底效果，应用范围广，保存时间长，运输方便的高效水质净化剂是非常必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供养殖水体水质净化的微生物颗粒制剂及其制备方法，以解决水产养殖水体进行净化处理过程中存在的缺陷，弥补原有技术的不足。

本发明的颗粒制剂由内外两层构成，内层为具有吸附性能的沸石，外层以无机物为附菌基，包覆有枯草芽孢杆菌。其中沸石为一类铝硅酸矿石，由于其内部充满细微的孔穴和通道而对水体中的氨态氮、有机物和重金属离子具有有效的吸附作用，并能提供水产养殖动物所需的多种常量和微量元素。而包裹在外层的枯草芽孢杆菌可通过自身合成的α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等降解水体中的残饵、粪便、腐殖质等，并且可以直接利用硝酸盐和亚硝酸盐，起到净化水质的作用，同时菌体生长过程中产生大量枯草菌素、制霉菌素、多粘菌素和短杆菌肽等活性物质，可有效抑制水产养殖中的弧菌、大肠杆菌和杆状病毒的生长。枯草芽孢杆菌的生命力极强，在温度为6-37℃，淡水和海水中均能快速生长繁殖，短时间内形成优势菌群。且该菌具有耐氧化、耐高压、耐高温、耐酸碱等特点，其耐盐度能达到10%。

本产品以沸石为核，以无机物为附菌基将枯草芽孢杆菌包覆在沸石周围，制备成颗粒制剂，具有以下优势：（一）能同时发挥沸石和菌体在水质净化方面的作用；（二）产品密度高，可快速沉降到池底，分解堆积在池底的有机淤泥，消除恶臭；（三）以无机物为附菌基包覆微生物使菌体处于休眠状态，可长时间常温保存，只有投入养殖水体后才能迅速生长繁殖成优势菌群；（四）使用的菌种具有广盐耐受性，无论海水还是淡水都能使用。

该制剂是具有内外双层结构的灰白色颗粒，内层是作为核的沸石，外层为附菌基，且附菌基包覆枯草芽孢杆菌，含活菌量≥200亿个/g，不规则颗粒直径在2~5 mm 范围内。附菌基为无机物，可以是快粘粉、滑石粉或两者以任意比例的混合物。该制剂的制备工艺包括以下几个步骤：（1）挑取经斜面活化后的枯草芽孢杆菌菌种一环接种于三角瓶中的种子培养基，置30~37℃恒温摇床中，120~150 rpm震荡培养18~24 h，得到枯草芽孢杆菌液体一级种子，其含菌量至少达到1×10⁸个/ml；（2）将上述液体一级种子按种子液：种子培养基为1%的比例接入种子罐中的种子培养基，接种后在温度为30~37℃、罐压为0.05 MPa、通气量比例为1:1、搅拌转速为150~200 rpm的条件下培养10~12h，得到枯草芽孢杆菌液体二级种子，其含菌量至少达到2×10⁸个/ml；（3）将上述菌液二级种子按种子液：发酵培养基为4%~7%的比例接种于发酵罐中的发酵培养基，培养条件：温度30~37℃，搅拌转速150~200 rpm，罐压0.05 MPa，接种后前5 h内通气量为1:0.7~1:0.8，5 h后增大至1:1，培养时间36~40 h，获得发酵菌液，其含菌量达到2.0~2.8×10¹⁰个/ml；（4）将上述发酵菌液用孔径为0.45μm的微滤膜包进行浓缩，至浓度为2.0~2.8×10¹¹个/ml；（5）最后，将上述浓缩后的发酵菌液与沸石颗粒混合，20~30℃搅拌10~15 min，转速60~120 rpm，然后加入附菌基，继续搅拌10~15 min，即得养殖水体水质净化的微生物颗粒制剂，其中沸石颗粒粒度为2.0~3.6 mm，菌液：沸石：附菌基=1~0.7：5~5.2：4~4.1。

本发明中用于三角瓶和种子罐中的种子培养基配方为：蛋白胨10g/L、牛肉粉3 g/L、NaCl 5 g/L、葡萄糖1 g/L，该培养基用1 mol/L的HCl与1 mol/L的NaOH调节pH至7.2~7.4；用于发酵罐中的发酵培养基配方为玉米粉3.17 g/L、大豆粉5.80 g/L、蛋白胨3.62 g/L、MnSO₄·H₂O 1.06 g/L、葡萄糖5 g/L、尿素3 g/L、MgSO₄·7H₂O1.5 g/L、KH₂PO₄ 3 g/L，该培养基用1 mol/L的HCl与1 mol/L的NaOH调节pH至7.2~7.4；种子罐和发酵罐中培养基灭菌后总体积为罐容积的65%~70%。

本发明的颗粒制剂是以投料比为300~400g/m²养殖水面积应用于淡水和海水养殖水体的水质净化。

本发明以沸石为核，以附菌基将枯草芽孢杆菌包裹在沸石的外层，制备成的微生物颗粒制剂投入水体后可快速沉降于水底，包裹在沸石外层的枯草芽孢杆菌从沸石上脱落并在水体中大量繁殖，与沸石协同发挥作用，有效地降低水中的化学需氧量（COD）、生化耗氧量（BOD）、固体悬浮物（SS）含量、全氮（T-N）含量和全磷（T-P）含量，达到改良水质、降低水产动物发病率、提高产品品质和产量的目的。本发明是具有极强净水功能的微生物颗粒制剂，制备简单、成本低廉、制备工艺稳定、便于实施工业化生产，使用安全，可常温储存无需冷藏，运输方便，具有很好的社会效益和经济效益。

具体实施方式

一种养殖水体水质净化的微生物颗粒制剂制备方法，其具体方法包括以下几个步骤：（1）挑取经斜面活化后的枯草芽孢杆菌菌种一环接种于三角瓶中的种子培养基，置30~37℃恒温摇床中，120~150 rpm震荡培养18~24 h，得到枯草芽孢杆菌液体一级种子，其含菌量至少达到1×10⁸个/ml；（2）将上述液体一级种子按种子液：种子培养基为1%的比例接入种子罐中的种子培养基，接种后在温度为30~37℃、罐压为0.05 MPa、通气量比例为1:1、搅拌转速为150~200 rpm的条件下培养10~12 h，得到枯草芽孢杆菌液体二级种子，其含菌量至少达到2×10⁸个/ml；（3）将上述菌液二级种子按种子液：发酵培养基为4%~7%的比例接种于发酵罐中的发酵培养基，培养条件：温度30~37℃，搅拌转速150~200 rpm，罐压0.05 MPa，接种后前5 h内通气量为1:0.7~1:0.8，5 h后增大至1:1，培养时间36~40 h，获得发酵菌液，使其含菌量至少达到2.0~2.8×10¹⁰个/ml；（4）将上述发酵菌液用孔径为0.45μm的微滤膜包进行浓缩，至浓度为2.0~2.8×10¹¹个/ml；（5）最后，将上述浓缩后的发酵菌液与沸石颗粒混合，20~30℃搅拌10~15min，转速60~120 rpm，然后加入附菌基，继续搅拌10~15 min，即得养殖水体水质净化用微生物颗粒制剂，其中沸石颗粒粒度为2.0~3.6 mm，菌液：沸石：附菌基=1~0.7：5~5.2：4~4.1。

其中步骤（1）和（2）中三角瓶和种子罐中种子培养基的配方为：蛋白胨10 g/L、牛肉粉3 g/L、NaCl 5 g/L、葡萄糖1 g/L，用1mol/L的HCl与1 mol/L的NaOH调节pH至7.2~7.4。

步骤（3）中发酵培养基配方为：玉米粉3.17 g/L、大豆粉5.80 g/L、蛋白胨3.62 g/L、MnSO₄·H₂O 1.06 g/L、葡萄糖5 g/L、尿素3 g/L、MgSO₄·7H₂O 1.5 g/L、KH₂PO₄ 3 g/L，用1 mol/L的HCl与1 mol/L的NaOH调节pH至7.2~7.4。

步骤（2）和（3）中种子罐和发酵罐中培养基灭菌后总体积为罐容积的65%~70%。

步骤（5）中附菌基可以是快粘粉、滑石粉或者两者以任意比例的混合物。

以下几个具体实施例进一步给出本发明的制备方法。

实施例1．

挑取经斜面活化后的枯草芽孢杆菌菌种一环接种于三角瓶，（培养基配方：蛋白胨10 g/L、牛肉粉3 g/L、NaCl 5 g/L、葡萄糖1 g/L，用1 mol/L的HCl与1 mol/L的NaOH调节pH至7.4），置35℃恒温摇床中，于140 rpm震荡培养24 h，得到枯草芽孢杆菌液体一级种子，菌液浓度达到10⁸个/ml；将液体一级种子按种子液：种子培养基为1%的比例接入种子罐（培养基：蛋白胨10 g/L、牛肉粉3 g/L、NaCl5 g/L、葡萄糖1 g/L，用1 mol/L的HCl与1 mol/L的NaOH调节pH至7.4，灭菌后总体积为种子罐容积的69%），接种后在温度为35℃、罐压为0.05 MPa、通气量比例为1:1、搅拌转速为200 rpm的条件下培养11 h，得到的枯草芽孢杆菌二级种子液菌体生长整齐，无杂菌污染，含菌量达到2×10⁸个/ml；菌液二级种子按种子液：发酵培养基为5%的比例接种于发酵罐，培养基配方：玉米粉3.17 g/L、大豆粉5.80g/L、蛋白胨3.62 g/L、MnSO₄·H₂O 1.06 g/L、葡萄糖5 g/L、尿素3 g/L、MgSO₄·7H₂O 1.5 g/L、KH₂PO₄ 3 g/L，用1 mol/L的HCl与1 mol/L的NaOH调节pH7.4，灭菌后总体积为发酵罐容积的68%；培养温度35℃，搅拌速度200 rpm，罐压0.05 MPa，接种后前5h内通气量1:0.7，5 h后增大至1:1，培养39 h，获发酵菌液，含菌量2.4×10¹⁰个/ml；将发酵液用孔径为0.45μm的微滤膜包进行浓缩至浓度为2.4×10¹¹个/ml，然后与沸石颗粒混合，25℃、60 rpm下搅拌12 min，然后加入快粘粉，继续搅拌10min，得产品。其中菌液：沸石：快粘粉=0. 83(ml)：5.1(g)：4.07(g)。得到的产品呈灰白色不规则粒状，粒度分布2.0~5.0 mm，破碎率小于1.0%，含活菌量≥200亿个/g。按投料比为340 g/m²养殖水面积投料，7天后COD由9.37 mg/L下降到5.31 mg/L，BOD由7.84 mg/L下降到2.82 mg/L，SS含量由7.7 mg/L下降到0.9 mg/L，T-N含量由4.15 mg/L下降到3.47 mg/L，T-P含量由0.097 mg/L下降到0.048 mg/L。

实施例2.

挑取经斜面活化后的枯草芽孢杆菌菌种一环接种于三角瓶，（培养基配方：蛋白胨10 g/L、牛肉粉3 g/L、NaCl 5 g/L、葡萄糖1 g/L，用1 mol/L的HCl与1 mol/L的NaOH调节pH至7.2），置37℃恒温摇床中，于150 rpm震荡培养18 h，得到枯草芽孢杆菌液体一级种子，菌液浓度达到10⁸个/ml；将液体一级种子按种子液：种子培养基为1%的比例接入种子罐（培养基：蛋白胨10 g/L、牛肉粉3 g/L、NaCl5 g/L、葡萄糖1 g/L，用1 mol/L的HCl与1 mol/L的NaOH调节pH至7.2，灭菌后总体积为种子罐容积的70%），接种后在温度为37℃、罐压为0.05 MPa、通气量比例为1:1、搅拌转速为150 rpm的条件下培养10 h，得到的枯草芽孢杆菌二级种子液菌体生长整齐，无杂菌污染，含菌量达到2×10⁸个/ml；菌液二级种子按种子液：发酵培养基为4%的比例接种于发酵罐，培养基配方：玉米粉3.17 g/L、大豆粉5.80g/L、蛋白胨3.62 g/L、MnSO₄·H₂O 1.06 g/L、葡萄糖5 g/L、尿素3 g/L、MgSO₄·7H₂O 1.5 g/L、KH₂PO₄ 3 g/L，用1 mol/L的HCl与1 mol/L的NaOH调节pH7.2，灭菌后总体积为发酵罐容积的65%；培养温度37℃，搅拌速度180 rpm，罐压0.05 MPa，接种后前5h内通气量1:0.8，5 h后增大至1:1，培养38 h，获发酵菌液，含菌量2.5×10¹⁰个/ml；将发酵液用孔径为0.45μm的微滤膜包进行浓缩至浓度为2.5×10¹¹个/ml，然后与沸石颗粒混合，20℃、120 rpm下搅拌15 min，然后加入滑石粉，继续搅拌15 min，得产品。其中菌液：沸石：滑石粉=0. 8 (ml)：5.12(g)：4.08(g)。得到的产品呈灰白色不规则粒状，粒度分布2.0~5.0 mm，破碎率小于1.5%，含活菌量≥200亿个/g。按投料比为300 g/m²养殖水面积投料，7天后COD由8.22 mg/L下降到4.47 mg/L，BOD由6.56 mg/L下降到1.74 mg/L，SS含量由5.9 mg/L下降到1.1 mg/L，T-N含量由3.52 mg/L下降到2.87 mg/L，T-P含量由0.082 mg/L下降到0.051 mg/L。

实施例3.

挑取经斜面活化后的枯草芽孢杆菌菌种一环接种于三角瓶，（培养基配方：蛋白胨10 g/L、牛肉粉3 g/L、NaCl 5 g/L、葡萄糖1 g/L，用1 mol/L的HCl与1 mol/L的NaOH调节pH至7.4），置30℃恒温摇床中，于120 rpm震荡培养24h，得到枯草芽孢杆菌液体一级种子，菌液浓度达到10⁸个/ml；将液体一级种子按种子液：种子培养基为1%的比例接入种子罐（培养基：蛋白胨10 g/L、牛肉粉3 g/L、NaCl 5g/L、葡萄糖1 g/L，用1 mol/L的HCl与1 mol/L的NaOH调节pH至7.4，灭菌后总体积为种子罐容积的67%），接种后在温度为30℃、罐压为0.05 MPa、通气量比例为1:1、搅拌转速为200 rpm的条件下培养12 h，得到的枯草芽孢杆菌二级种子液菌体生长整齐，无杂菌污染，含菌量达到2×10⁸个/ml；菌液二级种子按种子液：发酵培养基为6%的比例接种于发酵罐，培养基配方：玉米粉3.17 g/L、大豆粉5.80g/L、蛋白胨3.62 g/L、MnSO₄·H₂O 1.06 g/L、葡萄糖5 g/L、尿素3 g/L、MgSO₄·7H₂O 1.5 g/L、KH₂PO₄ 3 g/L，用1 mol/L的HCl与1 mol/L的NaOH调节pH7.4，灭菌后总体积为发酵罐容积的70%；培养温度30℃，搅拌速度200 rpm，罐压0.05 MPa，接种后前5h内通气量1:0.8，5 h后增大至1:1，培养40 h，获发酵菌液，含菌量2.1×10¹⁰个/ml；将发酵液用孔径为0.45μm的微滤膜包进行浓缩至浓度为2.1×10¹¹个/ml，然后与沸石颗粒混合，30℃、90 rpm下搅拌10 min，然后加入滑石粉与快粘粉的混合物，继续搅拌12 min，得产品。其中菌液：沸石：滑石粉：快粘粉=0.96 (ml)：5.02(g)：1.5（g）: 2.52(g)。得到的产品呈灰白色不规则粒状，粒度分布2.0~5.0 mm，破碎率小于1.2%，含活菌量≥200亿个/g。按投料比为380 g/m²养殖水面积投料，7天后COD由6.84 mg/L下降到4.11 mg/L，BOD由7.09 mg/L下降到2.24 mg/L，SS含量由9.13 mg/L下降到1.6mg/L，T-N含量由2.95 mg/L下降到2.32 mg/L， T-P含量由0.091 mg/L下降到0.055 mg/L。

实施例4.

挑取经斜面活化后的枯草芽孢杆菌菌种一环接种于三角瓶，（培养基配方：蛋白胨10 g/L、牛肉粉3 g/L、NaCl 5 g/L、葡萄糖1 g/L，用1 mol/L的HCl与1 mol/L的NaOH调节pH至7.3），置34℃恒温摇床中，于130 rpm震荡培养22 h，得到枯草芽孢杆菌液体一级种子，菌液浓度达到10⁸个/ml；将液体一级种子按种子液：种子培养基为1%的比例接入种子罐（培养基：蛋白胨10 g/L、牛肉粉3 g/L、NaCl5 g/L、葡萄糖1 g/L，用1 mol/L的HCl与1 mol/L的NaOH调节pH至7.3，灭菌后总体积为种子罐容积的65%），接种后在温度为35℃、罐压为0.05 MPa、通气量比例为1:1、搅拌转速为180 rpm的条件下培养11 h，得到的枯草芽孢杆菌二级种子液菌体生长整齐，无杂菌污染，含菌量达到2×10⁸个/ml；菌液二级种子按种子液：发酵培养基为7%的比例接种于发酵罐，培养基配方：玉米粉3.17g/L、大豆粉5.80 g/L、蛋白胨3.62 g/L、MnSO₄·H₂O 1.06 g/L、葡萄糖5 g/L、尿素3 g/L、MgSO₄·7H₂O 1.5 g/L、KH₂PO₄3 g/L，用1 mol/L的HCl与1 mol/L的NaOH调节pH7.3，灭菌后总体积为发酵罐容积的70%；培养温度37℃，搅拌速度150 rpm，罐压0.05 MPa，接种后前5 h内通气量1:0.7，5 h后增大至1:1，培养36h，获发酵菌液，含菌量2.8×10¹⁰个/ml；将发酵液离心浓缩用孔径为0.45μm的微滤膜包进行浓缩至浓度为2.8×10¹¹个/ml，然后与沸石颗粒混合，25℃、90 rpm下搅拌11 min，然后加入滑石粉与快粘粉的混合物，继续搅拌10 min，得产品。其中菌液：沸石：滑石粉：快粘粉=0.7 (ml)：5.2 (g)：2.9（g）:1.2 (g)。得到的产品呈灰白色不规则粒状，粒度分布2.0~5.0 mm，破碎率小于1.3%，含活菌量≥200亿个/g。按投料比为400 g/m²养殖水面积投料，7天后COD由7.25mg/L下降到3.96 mg/L，BOD由8.15 mg/L下降到1.70 mg/L，SS含量由8.6 mg/L下降到1.2 mg/L，T-N含量由3.26 mg/L下降到2.61 mg/L，T-P含量由0.098 mg/L下降到0.039 mg/L。

Claims

1.养殖水体水质净化的微生物颗粒制剂的制备方法，其具体步骤为：(1)挑取经斜面活化后的枯草芽孢杆菌菌种一环接种于三角瓶中的种子培养基，置30～37℃恒温摇床中，120～150rpm震荡培养18～24h，得到枯草芽孢杆菌液体一级种子，其含菌量至少达到1×10⁸个/ml；

(2)将上述液体一级种子按种子液：种子培养基为1％的比例接入种子罐中的种子培养基，接种后在温度为30～37℃、罐压为0.05MPa、通气量比例为1:1、搅拌转速为150～200rpm的条件下培养10～12h，得到枯草芽孢杆菌液体二级种子，其含菌量至少达到2×10⁸个/ml；

(3)将上述菌液二级种子按种子液：发酵培养基为4％～7％的比例接种于发酵罐中的发酵培养基，培养条件：温度30～37℃，搅拌转速150～200rpm，罐压0.05MPa，接种后前5h内通气量为1:0.7～1:0.8，5h后增大至1:1，培养时间36～40h，获得发酵菌液，其含菌量达到2.0～2.8×10¹⁰个/ml；

(4)将上述发酵菌液用孔径为0.45μm的微滤膜包进行浓缩，至浓度为2.0～2.8×10¹¹个/ml；

(5)最后，将上述浓缩后的发酵菌液与沸石颗粒混合，20～30℃搅拌10～15min，转速60～120rpm，然后加入附菌基，继续搅拌10～15min，即得养殖水体水质净化的微生物颗粒制剂，其中沸石颗粒粒度为2.0～3.6mm，菌液：沸石：附菌基＝1～0.7：5～5.2：4～4.1；所述附菌基是快粘粉、滑石粉或两者以任意比例的混合物。

2.根据权利要求1所述的养殖水体水质净化的微生物颗粒制剂的制备方法，其特征在于上述权利要求1的步骤(1)和(2)中三角瓶和种子罐中种子培养基的配方为：蛋白胨10g/L、牛肉粉3g/L、NaCl 5g/L、葡萄糖1g/L，该种子培养基用1mol/L的HCl与1mol/L的NaOH调节pH至7.2～7.4。

3.根据权利要求1所述的养殖水体水质净化的微生物颗粒制剂的制备方法，其特征是上述权利要求1的步骤(3)中发酵培养基配方为：玉米粉3.17g/L、大豆粉5.80g/L、蛋白胨3.62g/L、MnSO₄·H₂O 1.06g/L、葡萄糖5g/L、尿素3g/L、MgSO₄·7H₂O 1.5g/L、KH₂PO₄ 3g/L，该发酵培养基用1mol/L的HCl与1mol/L的NaOH调节pH至7.2～7.4。

4.根据权利要求1所述的养殖水体水质净化的微生物颗粒制剂的制备方法，其特征是上述权利要求1的步骤(2)和(3)中种子罐和发酵罐中培养基灭菌后总体积为罐容积的65％～70％。