CN111705041B - 一株哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK22、其噬菌体组合物及其应用 - Google Patents

一株哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK22、其噬菌体组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK22、其噬菌体组合物及其应用，该噬菌体vB_KaS_PK22于2020年05月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心，其保藏编号为CGMCC No.19974。噬菌体组合物包括哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK22和其他相配合的噬菌体。该噬菌体不仅具有宽裂解谱，特异性强，可有效防控水产养殖场哈维氏弧菌病，极大地降低由于哈维氏弧菌引起的各种疾病的病发概率；还可广泛用于水产养殖过程中的容易因哈维氏弧菌感染造成损失的各个环节、养殖环境的日常消毒、以及水产生鲜食品的抑菌等方面，有益于水产养殖业的健康发展。

Description

一株哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK22、其噬菌体组合物及其 应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株哈维氏弧菌噬菌体 vB_KaS_PK22及包含该噬菌体的组合物及其应用。
背景技术
哈维氏弧菌是一种具有发光特性的革兰氏阴性细菌，是正常海水微生物群体，也是海水中常见的一种条件致病菌，主要引起对虾、鱼类和贝类的感染发病。在泰国、印度、澳大利亚、厄瓜多尔、委内瑞拉及中国，哈维氏弧菌是养殖对虾的主要病原菌之一。已有研究显示，在养殖环境恶劣、对虾免疫力下降时，哈维氏弧菌会大量繁殖，从而引起对虾弧菌病的暴发和迅速蔓延。
由于弧菌病对水产养殖业影响甚大，前人对弧菌病作出了大量研究，目前抗生素在预防、治疗弧菌病方面发挥了主要作用，但是由于抗生素的滥用，造成了药物残留、细菌耐药性等种种负面影响，为避免出现“无药可控”的尴尬局面，找寻一种可持续发展的代替药物成为防治弧菌病的关键任务。噬菌体因其较于抗生素有专一性、可持续性、无污染等优点，已逐渐受到研究所及生物技术公司的的重视。
但是，目前还没有出现有效的哈维氏弧菌噬菌体，可用于防治由于哈维氏弧菌感染导致的各类疾病，因此，现有技术有待进一步改进。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一株耐高温性能好的哈维氏弧菌噬菌体 vB_KaS_PK22、由此噬菌体复配产生的噬菌体组合物及其应用。该噬菌体不仅可用于制备预防和治疗哈维氏弧菌感染的疾病的药物，还可用于制备水产饲料添加剂、以及水体消毒剂等。该噬菌体及其噬菌体组合物使用安全、无副作用，用以解决因哈维氏弧菌造成的感染、以及与水体中哈维氏弧菌大量增殖引起的水体问题，避免了因使用抗生素造成的抗生素残留、以及诱发耐药性哈维氏弧菌的问题。
本发明的技术方案具体如下：
第一方面，本发明提供了一株哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK22，该噬菌体自山东省青岛市某海鲜市场采的污水中分离得到的，已于2020年05月15 日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为 CGMCC No.19974，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
电镜下观测到：该噬菌体头部长为75nm，头宽为70nm，可伸缩的尾长为 140nm，根据国际病毒分类委员会第九次报告的分类标准鉴定，可确定该噬菌体属于肌尾噬菌体科，将其命名为vB_KaS_PK22。
第二方面，本申请还提供了上述哈维氏弧菌噬菌体在制备预防和治疗因哈维氏弧菌感染导致疾病的药物中的应用。本文中术语“预防”是指包括通过给予所述噬菌体来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文中术语“治疗”是指包括通过给予所述噬菌体而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。
优选的，上述哈维氏弧菌感染的疾病包括由哈维氏弧菌感染引发的各种水产疾病。优选地，所述哈维氏弧菌选自多种海水鱼类和虾类。其中，哈维氏弧菌病引发的水产病包括对虾发光弧菌病，以及斜带石斑鱼、大菱鲆、大黄花鱼、褐点石斑鱼、花鲈等多种海洋鱼类感染引发的相应疾病。本发明的实施例中仅以对虾为例进行说明。
第三方面，本发明还提供一种噬菌体组合物，包括如上所述的哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK22。这种噬菌体组合物可通过哈维氏弧菌噬菌体
vB_KaS_PK22与其他哈维氏弧菌噬菌体进行复配，用于制备防治水产品哈维氏弧菌病的各类产品。
优选地，上述噬菌体组合物包括哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK22和 vB_KaS_PK08这两株噬菌体。通过实验证明，噬菌体组合物的裂解谱更宽，应用范围更广，能更好地克服单一噬菌体的裂解谱的局限。
其中，哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK08也是申请人自山东省青岛市某海鲜市场采的污水中分离得到的，已于2020年05月15日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.19973，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。经电镜观察发现：噬菌体vB_KaS_PK08的头部长为80nm，头宽为75nm，可伸缩的尾长为140nm，也属于肌尾噬菌体科。
优选地，上述噬菌体组合物还包括噬菌体vB_KaS_PK22的突变体中的一株或多株；所述突变体与对应的噬菌体的同源性不小于90％，且保持基本相同的抑菌活性。
由于噬菌体在复制过程中非常容易发生突变，因而优选的，上述噬菌体的突变体也在本申请请求保护的范围内。通过现有技术中公知的计算机程序可以适当地进行同源性的测定，vB_KaS_PK22的突变体与该噬菌体的天然序列同源性至少达到90％；更优选的，突变体有92％、94％、95％、96％、97％、 98％或99％与各自对应的噬菌体的天然序列相同。其中，vB_KaS_PK22的序列可根据本发明保藏的生物材料通过公知的方法测序得到。上述噬菌体的突变体可为点突变、缺失突变或添加突变，相对于最初的噬菌体序列，有1个、 2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多碱基可发生变化。对于本领域技术人员来说，根据本发明提供的噬菌体筛选出与其性状相似的突变体并不需要付出创造性的劳动。
第四方面，本发明还提供一种噬菌体药物制剂，其有效成分主要为上述的哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK22或上述噬菌体组合物。优选地，所述噬菌体药物制剂还包括其他特定病原菌的噬菌体。
可选地，上述噬菌体药物制剂的剂型为口服给药剂型、浸浴给药剂型，优选地，采用口服给药剂型。上述药物制剂的剂型具体为溶液剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂、冻干剂。浸浴给药剂型是通过将噬菌体制剂直接投放于水产养殖水体中进行给药的方式，操作简单，效果好。
可选地，所述噬菌体药物制剂中还包含药学上可接受的载体。本文所使用的术语“药学上可接受的载体”指不对生物体造成显著刺激且不消除所给予的活性组分的生物活性和特性的载体或稀释剂。为了将所述药物组合物配制成液体制剂，药学上可接受的载体必须适于无菌和生物相容性。实例包括盐水、无菌水、Ringer’s溶液、缓冲生理盐水、白蛋白输注液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油和乙醇。它们可以单独使用或以其任意组合使用。如果需要，可以加入其它常规添加剂，例如，抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂等。当还与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂组合时，还可以将本发明的组合物制备成注射剂(例如，水性溶液、悬浮液和乳液)，或者丸剂、胶囊、粒剂或片剂。
第五方面，本申请还提供一种水产饲料添加剂，其包括如上所述的哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK22或噬菌体组合物，通过与水产饲料进行混拌后，对水产(如对虾)进行饲喂，从而达到预防或治疗哈维氏弧菌病的效果。优选地，饲料中每种噬菌体的效价至少为1×108PFU/g。
第六方面，本申请还提供一种水体消毒剂，其有效成分主要为所述的哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK22或噬菌体组合物；优选地，噬菌体的效价为 1×104PFU/ml以上。水体消毒剂还包含其他用于环境中病毒、细菌抑制或消灭的活性成分或其他助剂，如能延长噬菌体持效期的助剂。
上述水体消毒剂可用于水产养殖场所的环境消毒和饲料消毒防腐，可用于代替抗生素或传统消毒产品，且所述噬菌体及其环境消毒剂的代谢产物不会对人体或其他动物造成损害。所述消毒剂可通过喷雾、浸泡对养殖环境、饲料、饲养器具等进行全面的哈维氏弧菌消毒。所述养殖环境包括池壁和水体等。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于洗涤剂、消毒剂、去污剂等。
第七方面，本发明还提供一种检测试剂盒，其包括如上所述的哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK22或上述噬菌体组合物。本领域技术人员可根据本发明公开内容和本领域常识利用上述哈维氏弧菌噬菌体或其噬菌体组合物制备检测试剂盒，用于检测其特异侵染的哈维氏弧菌、或用于防控由其宿主哈维氏弧菌侵染导致的疾病。
第八方面，本发明还提供用于水产品消毒的生物抑菌剂，其有效成分主要为上述哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK22或噬菌体组合物。生物抑菌剂的使用方法为：对水产品的生鲜产品表面进行浸泡或者喷雾消毒，来抑制产品加工或保鲜过程中哈维氏弧菌的增殖。
本发明具有以下有益效果：
1、该噬菌体vB_KaS_PK22对哈维氏弧菌具有较强的裂解作用，裂解率高达92.3％。该噬菌体vB_KaS_PK22以及有该噬菌体与其他噬菌体(如 vB_KaS_PK08)复配产生的噬菌体组合物，不仅可用于有效防控水产养殖场哈维氏弧菌病，极大地降低由于哈维氏弧菌引起的水产各种疾病的病发概率，如对虾发光弧菌病；还可以用于对水产养殖场环境、饲料、水体等进行全面的哈维氏弧菌的消毒，极大地降低了哈维氏弧菌引起的水产品发病率和死亡率。
2、本发明涉及的上述噬菌体从自然界中获得，易于进行工业化生产，由上述噬菌体制备的药物、消毒剂、饲料添加剂和生物抑菌剂等不仅可降低成本，还具有绿色环保、使用安全的优点，有效避免了因传统使用抗生素造成的抗生素残留、以及诱发耐药性巴氏杆菌的问题。可广泛用于水产养殖过程中的容易因哈维氏弧菌感染造成损失的各个环节、养殖环境的日常消毒、以及水产生鲜食品的抑菌等方面，有益于水产养殖业的健康发展。
附图说明
图1为噬菌体vB_KaS_PK22的电镜照片；
图2为噬菌体vB_KaS_PK22的温度稳定性试验结果；
图3为噬菌体vB_KaS_PK22的pH稳定性试验结果；
图4为噬菌体vB_KaS_PK22的一步生长曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1噬菌体的制备
(一)宿主菌悬液的制备
宿主菌VK02在TCBS平板上分区划线，挑单菌落接种入5ml 2216E液体培养基中，170rpm、37℃条件下培养16～18h，得到新鲜菌液。
(二)噬菌体的分离和纯化
(1)噬菌体的分离
将取自山东省滨州市某海鲜市场采的污水进行11000r/min，5min离心，将离心得到的上清液使用0.22μm滤膜过滤后，加入2216E肉汤培养基与100μl 的宿主菌悬液，在170rpm、37℃的条件下培养16h后，再于11000r/min的条件下离心5min，最后用0.22μm滤膜过滤后，得到噬菌体原液。
将噬菌体原液用1×PBS溶液进行10倍倍比稀释，取上述不同浓度稀释液各100μl与制备好的哈维氏弧菌悬液混合后在37℃孵育5min后，加入5ml 的NB上层培养基中，混匀后迅速倒入2216E培养基平板中，待其凝固后倒置于37℃温箱中培养16h后观察，得到噬菌斑。
(2)噬菌体的纯化
用无菌镊子抠取单个噬菌斑，置于1ml PBS溶液中放置于170rpm，37℃摇床中浸出30min，将浸出液稀释至10-2，按照1:1的比例与哈维氏弧菌混合， 37℃孵育5min，混合液加入5ml NB上层琼脂培养基中，混匀后迅速倒入2216E 琼脂培养基平板中，待其凝固后倒置37℃温箱中培养16h后得到纯化1代噬菌体。纯化3-5代，得到形态一致的噬菌斑。
(3)噬菌体的增殖
取按照上述方法纯化3代后的噬菌体平板，抠取单斑，置于1mlPBS溶液中捏碎，于170rpm、37℃摇床中浸出30min。
将噬菌体浸出液与宿主菌悬液各100μl加入2216E肉汤培养基中，置于 170rpm、37℃摇床中振荡增殖5h，对所得增殖液11000rpm离心5min，上清液用0.22μm细菌滤器过滤，得到噬菌体悬液。
(三)噬菌体效价的测定
将上述噬菌体悬液使用1×PBS缓冲液进行10倍稀释，使用双层平板法测定稀释至10-6与10-7的噬菌体效价，两个平行。37℃条件下过夜培养后对噬菌斑进行计数并计算效价。
测定得到，该噬菌体增殖液的效价为6.8×1010PFU/ml。
实施例2噬菌体的生物学特性测定
(一)噬菌体电镜检测
用上述噬菌体悬液做电镜检测，取20μl的噬菌体悬液滴在铜网上，沉淀 15min，用滤纸吸去多余的液体，用2％的磷钨酸染色30min，干燥后进行电镜观察。
结果如图1所示，该噬菌体头部长为75nm，头宽为70nm，可伸缩的尾长为140nm，可伸缩的尾长为140nm。根据国际病毒分类委员会(The International Committee onTaxonomy of Viruses，ICTV)第九次报告的分类标准鉴定，可确定该噬菌体属于肌尾噬菌体科，将其命名为vB_KaS_PK22。
(二)噬菌体的裂解谱测定
1、实验方法：本实施例采用双层平板法测定噬菌体裂解谱，将噬菌体悬液与哈维氏弧菌菌液各取110μl加入0.5ml离心管中混合，37℃孵育5min后吸取200μl混合液加入5mlNB上层琼脂培养基中混匀，迅速倒入2216E琼脂培养基平板中，待其冷凝后倒置于37℃温箱中培养16h，通过观察平板有无噬菌斑形成来鉴别能否裂解。
通过上述方法检测噬菌体vB_KaS_PK22对30株不同哈维氏弧菌的裂解能力。其中，这30株哈维氏弧菌分别来源于山东滨州、山东青岛、福建漳州、福建厦门的病死鱼虾及水样。对这30株哈维氏弧菌进行PCR毒力基因检测及耐药基因检测，以明确4株毒力基因和9株耐药基因的携带情况，毒力基因分别是vhhAB(VHH溶血素)、Vst(脂酶)、pap6(金属蛋白酶)、PLA2 (磷脂酶)；耐药基因分别是β-内酰胺类：mecA；四环素类：tetA，tetB；磺胺类：sul1，sul2；喹诺酮类：oqxA；大环内酯类(红霉素)：ermA，ermB，ermC。
2、实验结果：结果如表1所示，在30株临床分离哈维氏弧菌菌株中，有 25株含有一种或多种毒力基因，有26株带有所述毒力基因的一种或者多种。噬菌体vB_KaS_PK22能够裂解30株哈维氏弧菌中的28株，噬菌体的裂解率达到93.3％；同时对于26株携带耐药基因哈维氏弧菌可裂解24株，噬菌体的裂解率达到92.3％，证明该噬菌体裂解谱宽，具有优异的裂解性能，对耐药菌具有广谱裂解效果。
表1 vB_KaS_PK22噬菌体裂解谱
Figure BDA0002564700500000081
Figure BDA0002564700500000091
(3)噬菌体组合物的裂解谱测定
A、实验方法：采用由噬菌体vB_KaS_PK08和vB_KaS_PK22以1:1的比例复配形成的噬菌体组合物进行裂解谱测定，实验方法与前述实验方法相同。
表2 vB_KaS_PK08和vB_KaS_PK22噬菌体组合物裂解谱
Figure BDA0002564700500000092
Figure BDA0002564700500000101
B、实验结果及分析：
通过上述方法检测噬菌体vB_KaS_PK08和vB_KaS_PK22组合物对72株不同哈维氏弧菌的裂解能力。其中，这72株哈维氏弧菌分别来源于山东滨州、山东海阳、山东青岛、福建漳州、福建厦门、广东湛江等各地区的病死鱼虾及水样。从表2的结果可知，噬菌体vB_KaS_PK08和vB_KaS_PK22组合物能够裂解72株哈维氏弧菌中的69株，裂解率为95.83％，证明该噬菌体组合物的裂解谱进一步变宽，具有优异的裂解性能。
(三)噬菌体的热稳定性测定
1、实验方法：取测定效价为1×1010PFU/ml的噬菌体悬液500μl于1.5ml 离心管中，分别放置于50℃、60℃、70℃、80℃的恒温水浴锅中并在20min、 40min、60min分别测定效价。
2、实验结果：如图2所示，噬菌体vB_KaS_PK22在50℃、60℃时经过 1h后，其效价并无明显变化；且该噬菌体在70℃下经1h作用后仍然保留一定活性，在80℃处理40min作用后才基本失活，说明vB_KaS_PK22噬菌体对60℃以下温度耐受性强，对高温环境耐受性能强。
(四)噬菌体的PH稳定性测定
1、实验方法：取无菌试管中加入4.5ml的不同pH值(2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13)的PBS，各三支，置于37℃的水浴锅中，待温度稳定之后，各加入500μl 1×1010PFU/ml的噬菌体增殖液，混匀37℃水浴作用1h、 2h、3h。处理结束之后，向混合液中加入适量的HCl或者NaOH使混合液的 pH值约为7，双层平板法测定噬菌体的效价。
2、实验结果：如图3所示，噬菌体vB_KaS_PK22在pH5～10之间能够保持自身稳定性，仍具有裂解能力；在PH为4或11时效价显著降低。因此， vB_KaS_PK08能够耐受较宽的酸碱环境，尤其对碱性环境耐受能力更强。
(五)噬菌体最佳感染复数的测定
采用平板涂布法测定宿主菌浓度，并做两个平行，倒置于37℃温箱中培养 16h，培养完成后进行菌落计数，计算宿主菌浓度。
取宿主菌液100μl于5ml 2216E液体培养基中，按照感染复数分别为1、 0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001的比例加入噬菌体悬液并混匀，170rpm， 37℃振荡培养至液体变清，11000rpm离心5min，测定噬菌体效价。
结果如表3所示，感染复数为0.0001时噬菌体效价最高，最高 6.8×1010PFU/ml。
表3噬菌体最佳感染复数
Figure BDA0002564700500000111
(六)噬菌体一步生长曲线的测定
按照MOI＝0.0001添加噬菌体vB_KaS_PK22增殖液和其宿主菌VK02对数期菌液各1ml，充分混匀并开始计时，37℃温育5min，13000g离心30s，用微量移液器尽量吸去上清，再用1ml2216E液体培养基洗涤1次(13000g 离心30s)，弃上清。用预热的2216E液体培养基混悬沉淀(总体积为5ml) 并充分混匀，迅速置于37℃摇床中170rpm振荡培养，在0时刻和每隔10min 取出150μl，10000rpm离心1min，吸取100μl的上清用生理盐水10倍倍比稀释后用双层平板法测定噬菌体效价，做3个重复，结果取平均值。以感染时间为横坐标，感染体系中噬菌体的效价的对数值为纵坐标，绘制一步生长曲线，得到噬菌体的潜伏期、爆发期。
如图4的噬菌体vB_KaS_PK22的一步生长曲线所示，噬菌体裂解周期时长为80min，噬菌体感染宿主菌后，30min内效价基本稳定，表明噬菌体潜伏期约为30min；噬菌体侵染宿主菌后的60min内，噬菌体数量急剧增加，可见噬菌体的爆发期约为30min；在随后的20min内，噬菌体数量基本不变，进入稳定生长期。噬菌体的裂解量＝4.45×108PFU/ml/1.00×106PFU/ml＝445。噬菌体vB_KaS_PK22潜伏期和裂解期时间较短，同时裂解量高，适合用于噬菌体治疗。
实施例3噬菌体vB_KaS_PK22预防哈维氏弧菌感染南美白对虾效果测定 1、实验方法：
将体重5g左右健康南美白对虾随机分成4组，每组20只，试验组设置双平行，且按照体积与质量比为5％的添加量，将噬菌体vB_KaS_PK22与对虾饲料均匀混合，阴干后以对虾体重3％的剂量饲喂，噬菌体的含量为 1×108PFU/g。对照组(即攻毒组)按照同样剂量用2216E培养基浸泡饲料后饲喂。1h后给试验组1、试验组2和对照组的所有对虾注射哈维氏弧菌，剂量为4.05×106CFU/只；同时设一空白对照组，对该组的对虾不做任何处理。记录各组48h内死亡对虾数目，并计算噬菌体的保护率。具体结果见下表4。
表4噬菌体拌料对发光弧菌病的预防效果
Figure BDA0002564700500000131
2、实验结果及分析：
上述结果显示，2个试验组的保护率都高达95％，这说明噬菌体作为水产饲料添加剂添加入南美白对虾的饲料中，能有效预防对虾感染哈维氏弧菌而导致的发光弧菌病，降低南美白对虾的死亡率，提高虾苗成活率，降低养殖风险。
实施例4噬菌体vB_KaS_PK22对南美白对虾感染哈维氏弧菌病的治疗效果测定
1、实验方法：
将体重5g左右健康南美白对虾随机分成4组，每组15只，分组设置为：双平行设置的试验组1和2、对照组(即攻毒组)和空白对照组。对试验组1、 2和对照组的所有对虾分别注射哈维氏弧菌，剂量为4.05×106CFU/只。上述攻毒处理1h后，试验组中，按照体积与质量比为5％的添加量，将噬菌体 vB_KaS_PK22与对虾饲料均匀混合，阴干后以对虾体重3％的剂量饲喂，同时将虾在含有1×103PFU/ml的海水中浸浴30min。对照组按照同样剂量用2216E培养基浸泡饲料后饲喂，浸浴在无噬菌体的海水中。同时设一空白对照组不做任何处理。记录各组48h内死亡对虾数目，并计算噬菌体的保护率。
表4噬菌体拌料对发光弧菌病的治疗效果
Figure BDA0002564700500000132
Figure BDA0002564700500000141
2、实验结果及分析：
如表4的实验结果显示，给南美白对虾注射致病性哈维氏弧菌1h后，饲喂浸润了噬菌体的饲料同时浸浴在含有噬菌体海水中，可有效控制对虾的死亡率，与未饲喂携带噬菌体的饲料的对照组相比，试验组的对虾存活率得到大幅度地提高。本发明为噬菌体制剂制备、抗哈维氏弧菌的药物提供了一种新来源，从而为治疗哈维氏弧菌感染引起的发光弧菌病提供新的理论依据和实践经验。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一株哈维氏弧菌噬菌体，其特征在于，被命名为vB_KaS_PK22，其保藏编号为CGMCCNo. 19974。
2.如权利要求1所述的哈维氏弧菌噬菌体在制备预防和治疗哈维氏弧菌感染的疾病的药物中的应用。
3.一种噬菌体组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK22。
4.根据权利要求3所述的噬菌体组合物，其特征在于，包括哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK22和vB_KaS_PK08，哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK08的保藏号为CGMCC No. 19973。
5.一种噬菌体药物制剂，其有效成分包括如权利要求1所述的哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK22或如权利要求3或4所述的噬菌体组合物。
6.根据权利要求5所述的噬菌体药物制剂，所述噬菌体药物制剂中还包含药学上可接受的载体，其剂型为溶液剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或冻干剂。
7.一种水产饲料添加剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK22或如权利要求3或4所述的噬菌体组合物。
8.一种水体消毒剂，其特征在于，有效成分包括权利要求1所述的哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK22或权利要求3或4所述的噬菌体组合物；其中还包含其他用于环境中病毒、细菌抑制或消灭的活性成分。
9.如权利要求8的水体消毒剂的应用，其特征在于，所述消毒剂可通过喷雾、浸泡的方式对养殖环境、饲养器具和饲料进行哈维氏弧菌的消毒。
10.一种用于水产品消毒的生物抑菌剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK22或权利要求3或4所述的噬菌体组合物；生物抑菌剂的使用方法为：对水产品产品表面进行浸泡或者喷雾消毒，来抑制产品加工或保鲜过程中哈维氏弧菌的增殖。
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