CN111676197B - 一株哈维氏弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用 - Google Patents

一株哈维氏弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111676197B
CN111676197B CN202010619525.9A CN202010619525A CN111676197B CN 111676197 B CN111676197 B CN 111676197B CN 202010619525 A CN202010619525 A CN 202010619525A CN 111676197 B CN111676197 B CN 111676197B
Authority
CN
China
Prior art keywords
phage
vibrio harveyi
bacteriophage
kas
vibrio
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010619525.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111676197A (zh
Inventor
潘强
任慧英
孙虎芝
闫艳新
王春阳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao Phagepharm Bio Tech Co ltd
Original Assignee
Qingdao Phagepharm Bio Tech Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao Phagepharm Bio Tech Co ltd filed Critical Qingdao Phagepharm Bio Tech Co ltd
Priority to CN202010619525.9A priority Critical patent/CN111676197B/zh
Publication of CN111676197A publication Critical patent/CN111676197A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111676197B publication Critical patent/CN111676197B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K61/00—Culture of aquatic animals
    • A01K61/10—Culture of aquatic animals of fish
    • A01K61/13—Prevention or treatment of fish diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/40—Viruses, e.g. bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23B—PRESERVING, e.g. BY CANNING, MEAT, FISH, EGGS, FRUIT, VEGETABLES, EDIBLE SEEDS; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES; THE PRESERVED, RIPENED, OR CANNED PRODUCTS
    • A23B4/00—General methods for preserving meat, sausages, fish or fish products
    • A23B4/14—Preserving with chemicals not covered by groups A23B4/02 or A23B4/12
    • A23B4/18—Preserving with chemicals not covered by groups A23B4/02 or A23B4/12 in the form of liquids or solids
    • A23B4/20—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23B4/22—Microorganisms; Enzymes; Antibiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/80—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for aquatic animals, e.g. fish, crustaceans or molluscs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/34—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
    • A23L3/3454—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23L3/3571—Microorganisms; Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10111—Myoviridae
    • C12N2795/10121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10111—Myoviridae
    • C12N2795/10131—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10111—Myoviridae
    • C12N2795/10132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
    • Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)

Abstract

本发明公开了一株哈维氏弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用，该噬菌体被命名为vB_KaS_PK08，于2020年05月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心，其保藏编号为CGMCC No.19973。该噬菌体不仅具有宽裂解谱，特异性强，可有效防控家水产养殖场哈维氏弧菌病，极大地降低由于哈维氏弧菌引起的各种疾病的病发概率；还可广泛用于水产养殖过程中的容易因哈维氏弧菌感染造成损失的各个环节、养殖环境的日常消毒、以及水产生鲜食品的抑菌等方面，有益于水产养殖业的健康发展。

Description

一株哈维氏弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株哈维氏弧菌噬菌体及包含该噬菌体的组合物及其应用。
背景技术
细菌性疾病在水产养殖过程中是十分常见的疾病类型，哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)是在海洋及盐湖环境中分布极为广泛的一种致病菌。存在于近岸的海水、海底沉积物以及各种海洋生物之中。哈维氏弧菌是鱼虾贝类等水产经济动物的主要致病菌之一，近年来由于哈维氏弧菌的爆发造成的水产动物病害也频频出现，而噬菌体为解决这一问题提出了方案。
在过去的几十年时间中抗生素一直被认为是解决细菌感染的最好办法，但是随着近几年抗生素滥用现象的日益严重，细菌耐药性的问题也日趋严重，甚至出现了能够抵抗几乎所有抗生素的“超级细菌”。并且由于大剂量使用抗生素，抗生素在水产经济动物体内的残留日益严重，不仅造成经济损失，且严重威胁人类健康。因而噬菌体走进了人们的视野。
噬菌体是一种依赖细菌生存的病毒，裂解性噬菌体能够在宿主菌体内迅速增殖，并在很短的时间后使宿主菌裂解，释放出很多子代噬菌体，子代噬菌体也可以继续参与裂解宿主菌，效率极高。噬菌体具有极强的专一性，可以做到特异性感染并裂解水体中的哈维氏弧菌而不对水体中其他有益菌种造成影响，因而既可以作为消毒剂控制水体中的哈维氏弧菌的浓度，也可以作为水体改良剂与益生菌等混合使用。由于噬菌体具有特异性裂解，且裂解产物并无任何毒副作用，因而可以安全的应用于食品等生产当中，具有良好的开发和应用价值。
但是，目前还没有出现有效的哈维氏弧菌噬菌体，可用于防治由于哈维氏弧菌感染导致的各类疾病，因此，现有技术有待进一步改进。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一株宽裂解谱的哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK08及其应用；该噬菌体不仅可用于制备预防和治疗哈维氏弧菌感染的疾病的药物，还可用于制备水产饲料添加剂、以及水体消毒剂等。该噬菌体及其噬菌体组合物使用安全、无副作用，用以解决因哈维氏弧菌造成的感染、以及与水体中哈维氏弧菌大量增殖引起的水体问题，避免了因使用抗生素造成的抗生素残留、以及诱发耐药性哈维氏弧菌的问题。
本发明的技术方案具体如下：
第一方面，本发明提供了一株哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK08，该噬菌体自山东省青岛市某海鲜市场采的污水中分离得到的，已于2020年05月15 日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，中国北京，保藏号为 CGMCC No.19973。
电镜下观测到：该噬菌体头部长为80nm，头宽为75nm，可伸缩的尾长为 125nm，根据国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)第九次报告的分类标准鉴定，可确定该噬菌体属于肌尾噬菌体科，将其命名为vB_KaS_PK08。
第二方面，本申请还提供了上述哈维氏弧菌噬菌体在制备预防和治疗因哈维氏弧菌感染导致疾病的药物中的应用。本文中术语“预防”是指包括通过给予所述噬菌体来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文中术语“治疗”是指包括通过给予所述噬菌体而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。
优选的，上述哈维氏弧菌感染的疾病包括由哈维氏弧菌感染引发的各种水产疾病。优选地，所述哈维氏弧菌选自多种海水鱼类和虾类。其中，哈维氏弧菌病引发的水产病包括对虾发光弧菌病，以及斜带石斑鱼、大菱鲆、大黄花鱼、褐点石斑鱼、花鲈等多种海洋鱼类感染引发的相应疾病。本发明的实施例中仅以对虾为例进行说明。
第三方面，本发明还提供一种噬菌体组合物，包括如上所述的哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK08。这种噬菌体组合物可通过哈维氏弧菌噬菌体 vB_KaS_PK08与其他哈维氏弧菌噬菌体进行复配，用于制备防治水产品哈维氏弧菌病的各类产品。
优选地，上述噬菌体组合物还包括噬菌体vB_KaS_PK08的突变体中的一种或多种；所述突变体与对应的噬菌体的同源性不小于90％，且保持基本相同的抑菌活性。
由于噬菌体在复制过程中非常容易发生突变，因而优选的，上述噬菌体的突变体也在本申请请求保护的范围内。通过现有技术中公知的计算机程序可以适当地进行同源性的测定，vB_KaS_PK08的突变体与该噬菌体的天然序列同源性至少达到90％；更优选的，突变体有92％、94％、95％、96％、97％、 98％或99％与各自对应的噬菌体的天然序列相同。其中，vB_KaS_PK08的序列可根据本发明保藏的生物材料通过公知的方法测序得到。上述噬菌体的突变体可为点突变、缺失突变或添加突变，相对于最初的噬菌体序列，有1个、 2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多碱基可发生变化。对于本领域技术人员来说，根据本发明提供的噬菌体筛选出与其性状相似的突变体并不需要付出创造性的劳动。
第四方面，本发明还提供一种噬菌体药物制剂，其有效成分主要为上述的哈维氏弧菌噬菌体或上述噬菌体组合物。优选地，所述噬菌体药物制剂还包括其他特定病原菌的噬菌体。
可选地，上述噬菌体药物制剂的剂型为口服给药剂型、浸浴给药剂型，优选地，采用口服给药剂型。上述药物制剂的剂型具体为溶液剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂、冻干剂。浸浴给药剂型是通过将噬菌体制剂直接投放于水产养殖水体中进行给药的方式，操作简单，效果好。
可选地，所述噬菌体药物制剂中还包含药学上可接受的载体。本文所使用的术语“药学上可接受的载体”指不对生物体造成显著刺激且不消除所给予的活性组分的生物活性和特性的载体或稀释剂。为了将所述药物组合物配制成液体制剂，药学上可接受的载体必须适于无菌和生物相容性。实例包括盐水、无菌水、Ringer’s溶液、缓冲生理盐水、白蛋白输注液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油和乙醇。它们可以单独使用或以其任意组合使用。如果需要，可以加入其它常规添加剂，例如，抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂等。当还与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂组合时，还可以将本发明的组合物制备成注射剂(例如，水性溶液、悬浮液和乳液)，或者丸剂、胶囊、粒剂或片剂。
第五方面，本申请还提供一种水产饲料添加剂，其包括如上所述的哈维氏弧菌噬菌体或噬菌体组合物，通过与水产饲料进行混拌后，对水产(如对虾)进行饲喂，从而达到预防或治疗哈维氏弧菌病的效果。优选地，饲料中每种噬菌体的效价至少为1×108PFU/g。
第六方面，本申请还提供一种水体消毒剂，其有效成分主要为所述的哈维氏弧菌噬菌体或噬菌体组合物；优选地，噬菌体的效价为1×108PFU/ml以上。水体消毒剂还包含其他用于环境中病毒、细菌抑制或消灭的活性成分或其他助剂，如能延长噬菌体持效期的助剂。
上述水体消毒剂可用于水产养殖场所的环境消毒和饲料消毒防腐，可用于代替抗生素或传统消毒产品，且所述噬菌体及其环境消毒剂的代谢产物不会对人体或其他动物造成损害。所述消毒剂可通过喷雾、浸泡对养殖环境、饲料、饲养器具等进行全面的哈维氏弧菌消毒。所述养殖环境包括池壁和水体等。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于洗涤剂、消毒剂、去污剂等。
第七方面，本发明还提供一种检测试剂盒，其包括如上所述的哈维氏弧菌噬菌体或噬菌体组合物。本领域技术人员可根据本发明公开内容和本领域常识利用上述哈维氏弧菌噬菌体或其噬菌体组合物制备检测试剂盒，用于检测其特异侵染的哈维氏弧菌、或用于防控由其宿主哈维氏弧菌侵染导致的疾病。
第八方面，本发明还提供用于水产品消毒的生物抑菌剂，其有效成分主要为上述哈维氏弧菌噬菌体或噬菌体组合物。生物抑菌剂的使用方法为：对水产品的生鲜产品表面进行浸泡或者喷雾消毒，来抑制产品加工或保鲜过程中哈维氏弧菌的增殖。
本发明具有以下有益效果：
1、该噬菌体对哈维氏弧菌具有较强的裂解作用(裂解率高达90.48％)，可以有效防控家水产养殖场哈维氏弧菌病，极大地降低由于哈维氏弧菌引起的各种疾病的病发概率，如对虾发光弧菌病；还可以用于对水产养殖场环境、饲料、水体等进行全面的哈维氏弧菌的消毒，极大地降低了哈维氏弧菌引起的水产品发病率和死亡率。
2、本发明涉及的上述噬菌体从自然界中获得，易于进行工业化生产，由上述噬菌体制备的药物或消毒剂不仅可降低成本，还具有绿色环保的优点。可广泛用于水产养殖过程中的容易因哈维氏弧菌感染造成损失的各个环节、养殖环境的日常消毒、以及水产生鲜食品的抑菌等方面，有益于水产养殖业的健康发展。
附图说明
图1为噬菌体vB_KaS_PK08的电镜照片；
图2为噬菌体vB_KaS_PK08的热稳定性结果；
图3为噬菌体vB_KaS_PK08的pH稳定性结果；
图4为噬菌体vB_KaS_PK08的一步生长曲线；
图5为噬菌体vB_KaS_PK08的体外裂解实验结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1噬菌体的分离培养
(一)宿主菌悬液的制备：
宿主菌K005在TCBS平板上分区划线，挑单菌落接种入5ml 2216E液体培养基中，170rpm、37℃条件下增殖至对数生长期，得到新鲜菌液。
(二)噬菌体的分离和纯化
(1)噬菌体的分离
将取自山东省青岛市某海鲜市场采的污水进行11000r/min，5min离心，将离心得到的上清液使用0.22μm滤膜过滤后，加入2216E培养基与100μl的宿主菌悬液，在170rpm、37℃的条件下培养16h后，再于11000r/min的条件下离心5min，最后用0.22μm滤膜过滤后，得到噬菌体原液。
将噬菌体原液用1×PBS溶液进行10倍倍比稀释，得到10-2、10-4、10-6、 10-8稀释液后，分别取上述不同浓度稀释液各100μl与制备好的哈维氏弧菌悬液混合后在37℃孵育5min后，加入5ml的NB上层培养基中，混匀后迅速倒入2216E培养基平板中，待其凝固后倒置于37℃温箱中培养16h后观察，得到噬菌斑。
(2)噬菌体的纯化
用无菌镊子抠取单个噬菌斑，置于1ml PBS溶液中放置于170rpm，37℃摇床中浸出30min，将浸出液稀释至10-2，按照1:1的比例与哈维氏弧菌混合， 37℃孵育5min，混合液加入5ml NB上层培养基中，混匀后迅速倒入2216E 培养基平板中，待其凝固后倒置37℃温箱中培养16h后得到纯化1代噬菌体。纯化3-5代，得到形态一致的噬菌斑。
(3)噬菌体悬液的制备
取按照上述方法纯化3代后的噬菌体平板，抠取单斑，置于1ml PBS溶液中捏碎，于170rpm、37℃摇床中浸出30min。
取宿主菌悬液100μl加入5ml2216E液体培养基中，将噬菌体浸出液与宿主菌悬液按照1:1的比例加入上述培养基中，置于170rpm、37℃摇床中振荡增殖4h，对所得增殖液11000rpm离心5min，上清液用0.22μm细菌滤器过滤，得到噬菌体悬液。
(三)噬菌体效价的测定
将上述噬菌体悬液使用PBS缓冲液进行10倍稀释，使用双层平板法测定稀释至10-6与10-7的噬菌体效价，两个平行。培养后对噬菌斑进行计数并计算效价。测定得到，所述噬菌体悬液效价为3.22×1010PFU/ml。
实施例2噬菌体的生物学特性测定
(一)噬菌体的电镜检测
取20μl的效价为1010PFU/ml的噬菌体滴在铜网上，沉淀15min，用滤纸吸去多余的液体，用2％的磷钨酸染色30min，干燥后电镜观察。
结果如图1所示，该噬菌体头部长为80nm，头宽为75nm，可伸缩的尾长为125nm，根据国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)第九次报告的分类标准鉴定，可确定该噬菌体属于肌尾噬菌体科，将其命名为vB_KaS_PK08。
(二)噬菌体的裂解谱测定
实验方法：本实施例采用双层平板法测定噬菌体裂解谱，将噬菌体悬液分别与哈维氏弧菌菌液各取100μl加入0.5ml离心管中混合，37℃孵育5min后加入5ml NB上层培养基中混匀，迅速倒入2216E培养基平板中，待其冷凝后倒置于37℃温箱中培养16h，培养完成后取出平板观察有无噬菌斑形成来鉴别能否裂解。
通过上述方法检测噬菌体vB_KaS_PK08对42株不同哈维氏弧菌的裂解能力。其中，这42株哈维氏弧菌分别来源于山东滨州、山东海阳、山东青岛、福建漳州、广东湛江病死鱼虾及水样；对这42株哈维氏弧菌进行PCR毒力基因检测，分别检测其是否携带闭锁小带毒素(zot)、热稳定性溶血素(tdh)、热相关溶血素(trh)、热不稳定溶血素(tlh)这四种毒力基因，和对42株哈维氏弧菌进行药敏试验，药敏片包括硫酸粘杆菌素、庆大霉素、四环素、氨苄西林、复方新诺明和阿莫西林6种，结果见下表1。
从表1的结果可知，42株临床分离的哈维氏弧菌菌株中，35株携带有上述检测的毒力基因的一种或者多种，42株哈维氏弧菌对常见6种抗生素耐药，而且呈现多重耐药的现象，噬菌体vB_KaS_PK08能够裂解42株哈维氏弧菌中的38株，噬菌体的裂解率达到90.48％，裂解谱宽，具有优异的裂解性能。
表1噬菌体vB_KaS_PK08的裂解谱
Figure BDA0002564706100000081
Figure BDA0002564706100000091
Figure BDA0002564706100000101
(三)噬菌体的最佳感染复数的测定
采用平板涂布法测定宿主菌浓度，并进行两个平行，倒置于37℃温箱中培养16h，培养完成后进行菌落计数，计算宿主菌浓度。
取宿主菌液100μl于5ml 2216E液体培养基中，按照感染复数分别为1、 0.1、0.01、0.001、0.0001的比例加入噬菌体悬液并混匀，170rpm，37℃振荡培养至液体变清，11000rpm离心5min，测定噬菌体效价。
结果如表2所示，感染复数为0.001时，噬菌体的效价最高，最高 3.22×1010PFU/ml。
表2噬菌体最佳感染复数
Figure BDA0002564706100000111
(四)噬菌体的热稳定性测定
取测定效价为1×1010PFU/ml的噬菌体悬液500μl于1.5ml离心管中，分别放置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的恒温水浴锅中并在20min、40min、 60min分别测定效价。
结果如图2所示，噬菌体vB_KaS_PK08在30℃、40℃与50℃时经过1h 后，其效价并无明显变化；而该噬菌体在60℃下经1h作用后存活率显著降低， 70℃时仅经过20min作用后便基本失活，说明vB_KaS_PK08噬菌体能够耐受一定程度的高温，50℃以下较稳定。
(五)噬菌体的PH稳定性测定
取无菌试管中加入4.5ml的不同pH值(2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13)的PBS，各三支，置于37℃的水浴锅中，待温度稳定之后，各加入500μl 1010PFU/ml的噬菌体增殖液，混匀37℃水浴作用1h、2h、3h。处理结束之后，向混合液中加入适量的HCl或者NaOH使混合液的pH值约为7，双层平板法测定噬菌体的效价。
结果如图3所示，噬菌体vB_KaS_PK08在pH＝6～10之间能够保持自身稳定性，仍具有裂解能力；而该噬菌体对强酸强碱较为敏感，在pH低于4或高于11的强酸强碱条件下，噬菌体基本完全失活。因此，vB_KaS_PK08能够耐受一定的酸碱环境。
(六)噬菌体一步生长曲线的测定
按照MOI＝0.001添加噬菌体vB_KaS_PK08增殖液和其宿主菌对数期菌液各1ml，充分混匀并开始计时，37℃温育5min，13000g离心30s，用微量移液器尽量吸去上清，再用1ml2216E液体培养基洗涤1次(13000g离心30s)，弃上清。用预热的2216E液体培养基混悬沉淀(总体积为5ml)并充分混匀，迅速置于37℃摇床中170rpm振荡培养，在0时刻和每隔10min取出150μl， 10000rpm离心1min，吸取100μl的上清用生理盐水10倍倍比稀释后用双层平板法测定噬菌体效价，做3个重复，结果取平均值。以感染时间为横坐标，感染体系中噬菌体的效价的对数值为纵坐标，绘制一步生长曲线，得到噬菌体的潜伏期、爆发期。
如图4的噬菌体vB_KaS_PK08的一步生长曲线所示，噬菌体裂解周期时长为70min，噬菌体感染宿主菌后，20min内效价基本稳定，表明噬菌体潜伏期约为20min；噬菌体侵染宿主菌后的50min内，噬菌体数量急剧增加，可见噬菌体的爆发期约为30min；在随后的20min内，噬菌体数量基本不变，进入稳定生长期。噬菌体的裂解量＝5.00×108PFU/ml/1.50×106PFU/ml＝333。噬菌体vB_KaS_PK08潜伏期和裂解期时间较短，同时裂解量较高，适合用于噬菌体治疗。
实施例3噬菌体体外裂解实验
将噬菌体悬液与宿主菌按照MOI0.01的比例加入100ml 2216E液体培养基中，临床分离致病性哈维氏弧菌菌株KO11的终浓度为5.00×106CFU/ml，噬菌体的终浓度分别为5.00×104PFU/ml，对照组加入与噬菌体溶液相同量的无菌2216E培养基，菌液和噬菌体混合后在37℃，170rpm的摇床内振荡培养, 每隔一定的时间测定OD值直至混合液变清亮。
结果如图5所示：噬菌体能够有效抑制宿主菌，2h后OD600明显下降，说明菌浓度急剧下降，在3h时OD600已降至0.3，而此时对照组宿主菌OD600值已上升至1.0以上，作用至5.5h时加入噬菌体悬液的混合液已经显著澄清，而对照组菌液十分浑浊。
实施例4噬菌体拌料饲喂后虾体内代谢过程
实验方法：选择体重5g左右健康的南美白对虾，空腹过夜。分别设置实验组和对照组，按照体积与质量比为5％的添加量，将噬菌体vB_KaS_PK08 与对虾饲料均匀混合，噬菌体拌料后效价为5×108PFU/g，将饲料阴干，再以对虾体重3％的剂量饲喂实验组的对虾，对照组按照同样剂量用2216E培养基浸泡饲料后饲喂。喂食后0.5、6、24、48、72、96、120、144h检测虾肠、肝胰腺以及空白对照组正常对虾体内噬菌体的含量。
实验结果说明：饲喂浸泡过噬菌体vB_KaS_PK08的虾料0.5h后，实验组的虾体肠道、肝胰腺内即检测到噬菌体的存在，效价可达7.35×106PFU/g，噬菌体可以通过喂食进入虾体内，且噬菌体可持续存在2天以上，这对噬菌体作为水产饲料添加剂具有指导作用，且可用于预防和治疗水生动物的发光性弧菌病。实验结果还表明，噬菌体对南美白对虾的健康没有影响，不影响对虾正常活动，说明噬菌体安全性很好。
实施例5噬菌体vB_KaS_PK08预防哈维氏弧菌感染南美白对虾效果测定(一)噬菌体拌料饲喂南美白对虾预防哈维氏弧菌的效果测定
实验方法：准备体重5g左右健康的南美白对虾，空腹过夜。每组50只，试验组设置双平行，且按照体积与质量比为5％的添加量，将噬菌体与对虾饲料均匀混合，阴干后以对虾体重3％的剂量饲喂，噬菌体的含量为 1×108PFU/ml。对照组(即攻毒组)按照同样剂量用2216E培养基浸泡饲料后饲喂。1h后给所有对虾注射哈维氏弧菌，剂量为4.05×106CFU/只，同时设一空白对照组不做任何处理。记录各组48h内死亡对虾数目，并计算噬菌体的保护率。具体结果见下表3。
表3噬菌体拌料对发光弧菌病的预防效果
Figure BDA0002564706100000131
Figure BDA0002564706100000141
上述结果显示，实验组的保护率高于80％，这说明噬菌体作为水产饲料添加剂添加入南美白对虾的饲料中，能有效预防对虾感染哈维氏弧菌而导致的早发光弧菌病，降低南美白对虾的死亡率，提高虾苗成活率，降低养殖风险。
(二)噬菌体vB_KaS_PK08治疗南美白对虾感染哈维氏弧菌效果测定
实验方法：体重5g左右健康的南美白对虾，空腹过夜。每组50只，试验组设置双平行，给所有对虾注射哈维氏弧菌，剂量为4.05×106CFU/只。攻毒 1h后，按照体积与质量比为5％的添加量，将噬菌体与对虾饲料均匀混合，阴干后以对虾体重3％的剂量饲喂。对照组按照同样剂量用2216E培养基浸泡饲料后饲喂。同时设一空白对照组不做任何处理。记录各组48h内死亡对虾数目，并计算噬菌体的保护率。具体测试结果见表4。
表4噬菌体拌料对发光弧菌病的治疗效果
Figure BDA0002564706100000142
实验结果显示：给南美白对虾注射致病性哈维氏弧菌1h后，饲喂浸润了噬菌体的饲料，可有效控制对虾的死亡率，与未饲喂携带噬菌体的饲料的攻毒组相比，试验组的对虾存活率得到大幅度地提高。本发明为噬菌体制剂制备、抗哈维氏弧菌的药物提供了一种新来源，从而为治疗哈维氏弧菌感染引起的发光弧菌病提供新的理论依据和实践经验。
实施例6噬菌体vB_KaS_PK08的水体消毒试验
实验方法：准备3L无菌海水，每桶放入5尾南美白对虾，28℃水浴，小气泵通氧。向体系中加入一定体积的致病性哈维氏弧菌，调整终浓度至 1×106CFU/ml，1h后分别向海水中加入噬菌体，使其终感染复数为1:1和0.1:1，每组设置平行，攻毒组加入等体积2216E培养基，详细分组情况见表5。于1、 7、10、25h后用涂布平板法检测水体中哈维氏弧菌的数量，具体残留哈维氏弧菌数据见表6。
表5水体消毒实验分组
Figure BDA0002564706100000151
表6水体消毒试验哈维氏弧菌残留量CFU/ml
Figure BDA0002564706100000152
上述测试结果表明：噬菌体vB_KaS_PK08在养殖水体中能够显著降低哈维氏弧菌的活菌数量，最高降低了4个数量级。显然，噬菌体可作为有效的水体消毒剂(或改良剂)，用于杀灭养殖场水体中的哈维氏弧菌。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (12)

1.一株哈维氏弧菌噬菌体，其特征在于，被命名为vB_KaS_PK08，其保藏编号为CGMCCNo.19973。
2.如权利要求1所述的哈维氏弧菌噬菌体在制备预防和治疗哈维氏弧菌感染的疾病的药物中的应用。
3.一种噬菌体组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK08。
4.一种噬菌体药物制剂，其有效成分包括如权利要求1或3所述的哈维氏弧菌噬菌体或噬菌体组合物。
5.根据权利要求4所述的噬菌体药物制剂，其特征在于，所述噬菌体药物制剂还包括其他特定病原菌的噬菌体。
6.根据权利要求4所述的噬菌体药物制剂，其特征在于，所述噬菌体药物制剂中还包含药学上可接受的载体，其剂型为溶液剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或冻干剂。
7.一种水产饲料添加剂，其特征在于，包括如权利要求1或3所述的哈维氏弧菌噬菌体或噬菌体组合物。
8.根据权利要求7所述的水产饲料添加剂，其特征在于，饲料中每种噬菌体的浓度至少为1×108PFU/g。
9.一种水体消毒剂，其特征在于，有效成分包括权利要求1或3所述的哈维氏弧菌噬菌体或噬菌体组合物。
10.根据权利要求9所述的水体消毒剂，其特征在于，还包含其他用于环境中细菌抑制或消灭的活性成分，噬菌体的使用浓度为1×104PFU/ml以上。
11.如权利要求9所述的水体消毒剂的应用，其特征在于，所述水体消毒剂可通过喷雾、浸泡的方式对养殖环境、饲养器具和饲料进行哈维氏弧菌的消毒，所述养殖环境包括棚舍、料槽、地面、墙壁、粪便和垫料。
12.一种用于水产品消毒的生物抑菌剂，其特征在于，包括如权利要求1或3所述的哈维氏弧菌噬菌体或噬菌体组合物；生物抑菌剂的使用方法为：对水产品产品表面进行浸泡或者喷雾消毒，来抑制产品加工或保鲜过程中哈维氏弧菌的增殖。
CN202010619525.9A 2020-07-01 2020-07-01 一株哈维氏弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用 Active CN111676197B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010619525.9A CN111676197B (zh) 2020-07-01 2020-07-01 一株哈维氏弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010619525.9A CN111676197B (zh) 2020-07-01 2020-07-01 一株哈维氏弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111676197A CN111676197A (zh) 2020-09-18
CN111676197B true CN111676197B (zh) 2021-12-14

Family

ID=72437597

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010619525.9A Active CN111676197B (zh) 2020-07-01 2020-07-01 一株哈维氏弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111676197B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112063595B (zh) * 2020-09-24 2021-11-26 瑞科盟(青岛)生物工程有限公司 一株裂解性哈维弧菌噬菌体rdp-vp-19012及其应用
CN113201505B (zh) * 2021-04-02 2023-12-29 青岛诺安百特生物技术有限公司 一株具备跨种裂解能力的溶藻弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102356817A (zh) * 2011-07-11 2012-02-22 大连理工大学 两株裂解性哈维弧菌噬菌体制剂的制备及其应用
CN107988312A (zh) * 2017-11-27 2018-05-04 厦门昶科生物工程有限公司 一种利用烈性哈维氏弧菌噬菌体快速鉴定哈维氏弧菌的方法及试剂盒
CN108048410A (zh) * 2017-11-20 2018-05-18 深圳先进技术研究院 裂性弧菌噬菌体VspSw-1及包含该噬菌体的杀菌组合物及其应用
CN109207440A (zh) * 2018-10-10 2019-01-15 江苏省农业科学院 弧菌噬菌体及其杀菌组合物制备方法和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CL2012002902A1 (es) * 2012-10-17 2013-05-03 Univ Chile Cepas de bacteriofagos especifica contra bacterias pertenecientes al genero vibrio para la profilaxis y terapia de vibrio anguillarum; y composicion antibacteriana que comprende dicha cepas.

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102356817A (zh) * 2011-07-11 2012-02-22 大连理工大学 两株裂解性哈维弧菌噬菌体制剂的制备及其应用
CN108048410A (zh) * 2017-11-20 2018-05-18 深圳先进技术研究院 裂性弧菌噬菌体VspSw-1及包含该噬菌体的杀菌组合物及其应用
CN107988312A (zh) * 2017-11-27 2018-05-04 厦门昶科生物工程有限公司 一种利用烈性哈维氏弧菌噬菌体快速鉴定哈维氏弧菌的方法及试剂盒
CN109207440A (zh) * 2018-10-10 2019-01-15 江苏省农业科学院 弧菌噬菌体及其杀菌组合物制备方法和应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Efficacy of potential phage cocktails against Vibrio harveyi and closely related Vibrio species isolated from shrimp aquaculture environment in the south east coast of India;Nattan Stalin et al.;《Veterinary Microbiology》;20171231;第207卷;第83-96页 *
Isolation and Characterization of Large Marine Bacteriophage (Myoviridae), VhKM4 Infecting Vibrio harveyi;Tamrin M. Lal;《Journal of Aquatic Animal Health》;20171231;第29卷;第26-30页 *
Molecular characterization of Vibrio harveyi bacteriophages isolated from aquaculture environments along the coast of India;Mockshanath M. Shivu et al.;《Environmental Microbiology》;20071231;第9卷(第2期);第322-331页 *
哈维弧菌对水产动物的致病性及其噬菌体防控研究进展;张美霞 等;《中国抗生素杂志》;20171231;第42卷(第09期);第717-723页 *
噬菌体在水产养殖中应用的研究进展;李新宇 等;《中国农业科技导报》;20161231;第18卷(第5期);第187-192页 *
噬菌体控制主要水产养殖类致病菌的研究进展;李振 等;《畜牧与兽医》;20151231;第47卷(第8期);第138-143页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111676197A (zh) 2020-09-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI459951B (zh) 新穎噬菌體及含該噬菌體之抗菌組成物
CN111909904B (zh) 一株巴氏杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
CN111718907B (zh) 新型溶藻弧菌噬菌体、其组合物及其应用
CN111705042B (zh) 一株巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS02、其噬菌体组合物及其应用
CN111254121B (zh) 一种沙门氏菌噬菌体及在防治沙门氏菌感染的疾病的药物中的应用
JP6314250B2 (ja) 新たなバクテリオファージ及びこれを含む組成物
CN111690620B (zh) 一株魏氏梭菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
CN111676197B (zh) 一株哈维氏弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
CN113201505B (zh) 一株具备跨种裂解能力的溶藻弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
CN111705041B (zh) 一株哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK22、其噬菌体组合物及其应用
CN111363724B (zh) 一种新型噬菌体、噬菌体混合制剂及其在防治水貂出血性肺炎的药物中的应用
CN114480302B (zh) 一株海藻希瓦氏菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
CN116286671A (zh) 一株沙门氏菌噬菌体sp8、噬菌体组合物及其应用
JP6262881B2 (ja) 新たなバクテリオファージ及びこれを含む組成物
CN111363723B (zh) 新型霍乱弧菌噬菌体及其应用
CN115247155B (zh) 一株美人鱼发光杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
CN115181731B (zh) 一株坎贝氏弧菌噬菌体、制备方法及其应用
CN114736877B (zh) 一株杀鱼爱德华氏菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
CN114763539B (zh) 一株弗氏柠檬酸杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
CN115820569A (zh) 一株奥氏弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
CN117264910B (zh) 耐高温广谱沙门氏菌的噬菌体及其临床应用
CN114736875B (zh) 一种鸭疫里默氏杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
JP2583473B2 (ja) ビブリオ感染症の治療剤と、これを用いた治療及び予防法
CN114703151B (zh) 一株巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07、其噬菌体组合物及其应用
WO2023022080A1 (ja) 新規微生物、新規微生物等を含有する抗ホワイトスポットウイルス剤およびその製造方法、並びに抗ホワイトスポットウイルスの防除方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant