CN112391357A - 温和气单胞菌高效裂解性噬菌体vB_AsoP-yong及其应用 - Google Patents

温和气单胞菌高效裂解性噬菌体vB_AsoP-yong及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112391357A
CN112391357A CN201910792954.3A CN201910792954A CN112391357A CN 112391357 A CN112391357 A CN 112391357A CN 201910792954 A CN201910792954 A CN 201910792954A CN 112391357 A CN112391357 A CN 112391357A
Authority
CN
China
Prior art keywords
phage
asop
yong
culture
aeromonas sobria
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910792954.3A
Other languages
English (en)
Inventor
秦伟南
李登峰
孙智同
童贻刚
许丽华
林威
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ningbo University
Original Assignee
Ningbo University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ningbo University filed Critical Ningbo University
Priority to CN201910792954.3A priority Critical patent/CN112391357A/zh
Publication of CN112391357A publication Critical patent/CN112391357A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10311—Siphoviridae
    • C12N2795/10321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10311—Siphoviridae
    • C12N2795/10331—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10311—Siphoviridae
    • C12N2795/10332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10311—Siphoviridae
    • C12N2795/10351—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种温和气单胞菌高效烈性噬菌体vB_AsoP‑yong及其应用，涉及温和气单胞菌污染和感染的生物处理。vB_AsoP‑yong保藏于微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17097。vB_AsoP‑yong1是首株以致病性温和气单胞菌LY‑23株为靶标分离获得的噬菌体vB_AsoP‑yong可专一性裂解温和气单胞菌，其最适MOI为0.001，潜伏期约为50min，裂解期为50min‑150min，爆发量为7665 PFU/Cell；对温度、pH、氯仿等因素有着较好的耐受能力；对动物有保护作用。

Description

温和气单胞菌高效裂解性噬菌体vB_AsoP-yong及其应用
技术领域
本发明涉及一种病原菌的噬菌体，尤其是涉及一种温和气单胞菌高效烈性噬菌体vB_AsoP-Yong及其应用。
背景技术
为了防控疾病，抗生素和消毒剂被长期、广泛使用。然而，滥用抗生素使细菌产生耐药性，超级细菌不断产生，严重威胁人类和动物健康；抗生素和消毒剂没有专一性，破坏我们依赖的正常菌群，损害健康并危害环境的微生态平衡；养殖产品中残留的抗生素等残留药物一旦被人体摄入，会影响肠道细菌群落、抑制免疫系统，危害人类健康。
噬菌体(phage)是感染细菌、真菌的病毒。根据生命周期的不同，噬菌体可以分为裂解性噬菌体(lytic phage)和温和性噬菌体(temperate phage)。裂解性噬菌体又可以称为烈性噬菌体或者毒性噬菌体(virulent phage)。裂解性噬菌体进入宿主菌体内后，开始了自己的生命循环，进行不断地复制、增殖得到大量的子代噬菌体，宿主菌被裂解；温和性噬菌体进入宿主菌后，将自身的基因组整合于宿主菌的基因组中，并随着宿主菌的不断分裂传递给子代。噬菌体安全性高，是最具潜力的抗生素替代品。烈性噬菌体在抗菌药物研发方面具有巨大的潜力和优势。烈性噬菌体特异性侵染目标细菌，将其裂解，并且不感染人和动、植物，也不会对正常微生物群落和环境造成污染，噬菌体具有宿主依赖性，随宿主的清除而消亡，不会残留在动物体内。
温和气单胞菌(Aeromonas sobria)属于弧菌科，产气单胞菌属。其分布广泛，存在于淡水、污水、供水系统、土壤，食物尤其水产品中，可致使人、畜禽、鱼、甚至两栖类、爬行类动物患病。温和气单胞菌主要的毒力因子有溶血素、气溶素、细胞毒性肠毒素、脂酶和蛋白酶等外毒素。感染人类可导致的常见疾病有剧烈水样腹泻或慢性腹泻(持续10天或以上)、蜂窝性组织炎、败血症等，非常见疾病有肌肉溶解、出现坏疽、腹膜炎、败血症肺炎、胆囊炎和骨髓炎等。近年来，有许多水产动物感染温和气单胞菌的报道。温和气单胞菌感染鱼类，可引起内脏器官水肿、组织出血、溃烂等症状，往往给养殖业带来惨重的损失。研发能够高效裂解温和气单胞菌的噬菌体具有重要的现实意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可特异、高效、快速地裂解致病性温和气单胞菌的噬菌体及其应用。该噬菌体特异性感染、裂解温和气单胞菌，对动物有保护作用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种以致病性温和气单胞菌LY-23株为靶标分离获得的特异侵染温和气单胞菌的裂解性噬菌体，命名为vB_AsoP-Yong(vB_AsoP 即Virus of bacteria，Aeromonas sobria，Podoviridae的缩写；Yong为株号代表“甬”)， vB_AsoP-Yong分类上属于短尾科Podoviridae。vB_AsoP-Yong于2019年1月22日保藏于微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17097，保藏机构地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。vB_AsoP-Yong 对动物有保护作用，对锦鲫的相对保护率为30.1％。
该噬菌体的生物学特征如下：噬菌体vB_AsoP-Yong是首株以致病性温和气单胞菌LY-23 株为靶标分离获得噬菌体，具有呈现二十面体近似球形的头部，直径约为55nm，以及不可收缩的尾部，长度约为20nm；噬菌体vB_AsoP-Yong在温和气单胞菌的菌平板上可以形成透明的噬菌斑；噬菌体vB_AsoP-Yong可裂解温和气单胞菌，使菌液澄清化；噬菌体 vB_AsoP-Yong的宿主范围具有种特异性；vB_AsoP-Yong在MOI为0.1、0.01、0.001、0.0001 的条件下对温和气单胞菌均有很好的抑菌效果，MOI＝0.001时，噬菌体增殖的滴度最高，故 vB_AsoP-Yong的最适MOI为0.001；潜伏期约为50min，裂解期为50min-150min，爆发量为7665PFU/Cell。vB_AsoP-Yong对环境因子包括温度、pH等有着较好的耐受能力。
上述噬菌体vB_AsoP-Yong的分离纯化方法，具体包括如下步骤：
(1)温和气单胞菌LY-23的活化、培养
温和气单胞菌LY-23由渤海大学食品科学与工程学院，辽宁省食品安全重点实验室白凤翎教授课题组由发病大菱鲆鱼体分离鉴定，并惠赠。本专利取LY-23菌种划线接种于含1.5％ (W/V)琼脂的LB固体培养基平板上，29℃倒置培养过夜。从平板上挑取单菌落，接种到装有 5mL LB液体培养基的试管内，摇床(29℃、180rpm)培养12小时。从试管中取1mL液体培养液1∶100(V/V)稀释至装有100mL LB液体培养基的锥形瓶中，放置于摇床(29℃、180rpm) 上扩大培养至菌液OD600≈0.6，即得到对数期菌液。
(2)噬菌体的富集
噬菌体vB_AsoP-Yong分离自浙江省宁波市慈城镇官山河水(North latitude：29.9699719； East longitude：121.4543285)。从河中采集表层水样，置冰盒内，并立即带回实验室处理。将采集的水样离心(4℃，10000g，10min)后取40mL上清液于锥形瓶中，瓶中添加20mL 3 ×LB液体培养基与1mL对数期LY-23菌液(OD600≈0.6)，混匀后放置于摇床(29℃、180rpm) 上培养3小时进行噬菌体富集。将培养液离心(4℃，10000g，10min)，取上清液依次经过 0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤。取一支试管，加入4mL上述过滤液、2mL3×LB 液体培养基和100μL对数期LY-23菌液混匀，作为实验组。另取一支试管加入6mL LB液体培养基、100μL对数期LY-23菌液混匀，作为对照组。将实验组、对照组试管放置于摇床(29℃、 180rpm)上培养至实验组与对照组液体有肉眼可见差异，即实验组培养液变澄清、出现细菌碎片，将实验组培养液离心(4℃，10000g，10min)取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm 孔径硝酸纤维素滤膜过滤。过滤液4℃避光保存，作为后续操作的噬菌体原液。
(3)噬菌体的分离纯化
将步骤(2)获得的噬菌体原液用LB液体培养基做10倍梯度稀释，取各个稀释度的稀释液100μL分别与200μL对数期LY-23菌液混合，放置于29℃恒温培养箱中孵育10min使噬菌体吸附。从45℃水浴中取出一份5mL/管分装的含0.7％(W/V)琼脂的LB培养基，立刻与孵育后的噬菌体-菌混合液漩涡震荡3秒混匀，倒于已于29℃预热半小时以上的LB固体培养基平板上，均匀铺平。待凝固后将双层平板置于29℃培养箱中过夜培养，至平板上有噬菌斑形成。选取噬菌斑密度合适的平板，挑取单个噬菌斑中心位置琼脂置于5mL对数期LY-23菌液中，摇床(29℃、180rpm)上培养至宿主菌裂解澄清。将培养液离心(4℃，10000g，10min) 后取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，过滤液即为新一代噬菌体原液。新噬菌体原液继续使用上述双层平板法重复进行三代噬菌体纯化实验，即得到纯化的噬菌体vB_AsoP-Yong原液。
(4)噬菌体的扩大培养
将步骤(3)纯化得到的噬菌体-菌培养裂解液离心(4℃，10000g，10min)，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，将过滤液与20mL对数期LY-23菌液按体积比1∶100的比例混合作为实验组，设置20mL对数期LY-23菌液作为对照组，一起放置于摇床(29℃，180rpm)上培养，至实验组与对照组液体出现肉眼可见差异时停止培养。将噬菌体-菌培养裂解液置于4℃保存。
(5)噬菌体悬液制备
取步骤(4)制备的噬菌体-菌培养裂解液离心(4℃，10000g，10min)，取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，即为噬菌体vB_AsoP-Yong悬液。
上述裂解性噬菌体vB_AsoP-Yong的应用，用于抑制温和气单胞菌生长、杀死温和气单胞菌。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：本发明公开了一种新的温和气单胞菌裂解性噬菌体vB_AsoP-Yong及其分离方法和应用，是首株感染裂解致病性温和气单胞菌LY-23的噬菌体，此裂解病毒具有高复制率、高感染率的特点；该病毒具有高特异性，专一性感染、裂解温和气单胞菌，这是保证生态安全的重要前提；成本低，病毒的复制率极高，爆发量达到7665PFU/Cell，是迄今为止发现的爆发量最高的噬菌体，培养大量vB_AsoP-Yong 较为容易；操作简单，且不会造成环境污染；是一种新型的控制温和气单胞菌的技术，具有良好的发展前景。
综上所述，本发明提供一种新的温和气单胞菌裂解性噬菌体vB_AsoP-Yong及其分离方法和应用，该噬菌体可高效、快速、专一地感染、杀死温和气单胞菌。
附图说明
图1为噬菌体vB_AsoP-Yong在温和气单胞菌LY-23双层平板上的噬菌斑形态
图2左侧试管为温和气单胞菌LY-23对照菌液，右侧试管中的LY-23菌液因添加了噬菌体vB_AsoP-Yong而变澄清。
图3为负染的噬菌体vB_AsoP-Yong的透射电镜图
图4为噬菌体vB_AsoP-Yong的一步生长曲线
图5为动物保护实验中实验组与对照组锦鲫的解剖图，上部为添加了噬菌体 vB_AsoP-Yong的实验组，下部为因温和气单胞菌LY-23感染而肿胀的对照组。
图6为动物保护实验各组锦鲫累积死亡率折线图
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述
实施例1
噬菌体vB_AsoP-Yong的分离纯化
水样采自浙江省宁波市慈城镇官山河水(North latitude：29.9699719；Eastlongitude： 121.4543285)；靶标宿主菌为温和气单胞菌(Aeromonas sobria)LY-23，具体制备方法如下：
(1)温和气单胞菌LY-23的活化、培养
温和气单胞菌LY-23由渤海大学食品科学与工程学院，辽宁省食品安全重点实验室白凤翎教授课题组由发病大菱鲆鱼体分离鉴定，并惠赠。本专利取LY-23菌种划线接种于含1.5％ (W/V)琼脂的LB固体培养基平板上，29℃倒置培养过夜。从平板上挑取单菌落，接种到装有 5mL LB液体培养基的试管内，摇床(29℃、180rpm)培养12小时。从试管中取1mL液体培养液1∶100(V/V)稀释至装有100mL LB液体培养基的锥形瓶中，放置于摇床(29℃、180rpm) 上扩大培养至菌液OD600≈0.6，即得到对数期菌液。
(2)噬菌体的富集
噬菌体vB_AsoP-Yong分离自浙江省宁波市慈城镇官山河水(North latitude：29.9699719； East longitude：121.4543285)。从河中采集表层水样，置冰盒内，并立即带回实验室处理。将采集的水样离心(4℃，10000g，10min)后取40mL上清液于锥形瓶中，瓶中添加20mL 3 ×LB液体培养基与1mL对数期LY-23菌液(OD600≈0.6)，混匀后放置于摇床(29℃、180rpm) 上培养3小时进行噬菌体富集。将培养液离心(4℃，10000g，10min)，取上清液依次经过 0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤。取一支试管，加入4mL上述过滤液、2mL3×LB 液体培养基和100μL对数期LY-23菌液混匀，作为实验组。另取一支试管加入6mL LB液体培养基、100μL对数期LY-23菌液混匀，作为对照组。将实验组、对照组试管放置于摇床(29℃、 180rpm)上培养至实验组与对照组液体有肉眼可见差异，即实验组培养液变澄清、出现细菌碎片，将实验组培养液离心(4℃，10000g，10min)取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm 孔径硝酸纤维素滤膜过滤。过滤液4℃避光保存，作为后续操作的噬菌体原液。
(3)噬菌体的分离纯化
将步骤(2)获得的噬菌体原液用LB液体培养基做10倍梯度稀释，取各个稀释度的稀释液100μL分别与200μL对数期LY-23菌液混合，放置于29℃恒温培养箱中孵育10min使噬菌体吸附。从45℃水浴中取出一份5mL/管分装的含0.7％(W/V)琼脂的LB培养基，立刻与孵育后的噬菌体-菌混合液漩涡震荡3秒混匀，倒于已于29℃预热半小时以上的LB固体培养基平板上，均匀铺平。待凝固后将双层平板置于29℃培养箱中过夜培养，至平板上有噬菌斑形成。选取噬菌斑密度合适的平板，挑取单个噬菌斑中心位置琼脂置于5mL对数期LY-23菌液中，摇床(29℃、180rpm)上培养至宿主菌裂解澄清。将培养液离心(4℃，10000g，10min) 后取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，过滤液即为新一代噬菌体原液。新噬菌体原液继续使用上述双层平板法重复进行三代噬菌体纯化实验，即得到纯化的噬菌体vB_AsoP-Yong原液。
(4)噬菌体的扩大培养
将步骤(3)纯化得到的噬菌体-菌培养裂解液离心(4℃，10000g，10min)，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，将过滤液与20mL对数期LY-23菌液按体积比1∶100的比例混合作为实验组，设置20mL对数期LY-23菌液作为对照组，一起放置于摇床(29℃，180rpm)上培养，至实验组与对照组液体出现肉眼可见差异时停止培养。将噬菌体-菌培养裂解液置于4℃保存。
(5)噬菌体悬液制备
取步骤(4)制备的噬菌体-菌培养裂解液离心(4℃，10000g，10min)，取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，即为噬菌体vB_AsoP-Yong悬液。
将纯化的噬菌体vB_AsoP-Yong与对数生长期的温和气单胞菌LY-23混合，进行噬菌斑实验，可以得到透明的圆形噬菌斑，其周围无晕环，边缘清晰规则(图1)。将噬菌体 vB_AsoP-Yong添加至温和气单胞菌LY-23菌液后，菌体裂解菌液变得澄清(图2)。
其中LB培养基的配方如下：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用蒸馏水定容至1L，调pH至7.0，121℃高压灭菌20min。
该纯化的噬菌体保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为： CGMCC No.17097，保藏日期2019年1月22日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
实施例2
噬菌体vB_AsoP-Yong的形态观察
取实施例1所分离纯化的噬菌体-菌培养裂解液低速离心(4℃，12000g，15min)弃沉淀，取1mL上清液高速离心(4℃，58000g，1h)弃上清，沉淀加入200μL的0.01M PBS 悬浮，得到噬菌体悬液。用移液枪取一滴噬菌体悬液至铜网上，静置10min后用中性滤纸从侧面吸去多余水分。在铜网上滴一滴3％乙酸双氧铀，染色20s后，用中性滤纸从侧面吸去染色剂。静置10min晾干后使用透射电镜(日立H-7650)观察噬菌体形态。
结果如图2所示，该噬菌体vB_AsoP-Yong具有呈现二十面体近似球形的结构的头部，直径约为55nm，以及不可收缩的尾部，长度约为20nm。
实施例3
噬菌体vB_AsoP-Yong的宿主范围检定
将温和气单胞菌LY-23株、温和气单胞菌ATCC43979株及其他待试菌株(详见表1)分别培养至对数期(OD600≈0.6)。将这些对数期菌液与噬菌体vB_AsoP-Yong悬液分别按按体积100∶1混合作为实验组，对照组用LB代替噬菌体，各组均置摇床上培养(29℃，180rpm)过夜。每组设两个平行。用酶标仪测出组OD600值，取平行组平均值，计算对照组与实验组平均值的比值，若比值大于1.2认为噬菌体可感染该菌，为阳性结果；反之则认为噬菌体不能感染该菌，为阴性结果；肉眼、显微镜观察感染、裂解情况，确认OD600法判定的结果。结果vB_AsoP-Yong对宿主感染有种特异性，只感染、裂解温和气单胞菌；无株特异性，两株温和气单胞菌均可感染。
表1噬菌体vB_AsoP-Yong的宿主范围检定结果
Figure BSA0000188845140000071
“+”代表感染，“-”代表不感染
实施例4
噬菌体滴度测定
使用双层平板法进行噬菌体vB_AsoP-Yong的滴度测定，具体操作如下：将融化后的LB 半固体培养基，即含有0.7％(W/V)琼脂的LB培养基分装成5mL/管，置于45℃恒温水浴中 30min以上至温度恒定，同时将LB固体培养基平板放置于37℃恒温培养箱中预热30min。将噬菌体原液用LB液体培养基做10倍梯度稀释，根据实施例1噬菌体纯化实验的结果推算出便于噬菌斑计数的稀释度，取107、108、109稀释度的稀释液100μL分别与200μL对数期LY-23菌液混合，混合液放置于29℃恒温培养箱中孵育10min使噬菌体吸附。从45℃水浴中取出一份5mL的LB半固体培养基，立刻与孵育后的噬菌体-菌混合液混合，漩涡震荡 3s混匀后倾倒于已预热好的LB固体培养基单层平板上，均匀铺平。每个稀释度做3个平行平板，凝固后的双层平板置于29℃培养箱中过夜培养，至平板上有噬菌斑形成。数出每板的噬菌斑数，选取每板100个左右噬菌斑的稀释度，同一稀释度平板的平均噬菌斑数乘以稀释度再乘以10即得到每mL噬菌体原液的噬菌体数，即噬菌体滴度(PFU/mL)。
实施例5
噬菌体vB_AsoP-Yong增殖特性研究-一步生长实验
首先进行噬菌体最佳感染复数实验：取噬菌体原液按照实施例4测定噬菌体滴度后，稀释成系列稀释液：2.56×107、2.56×106、2.56×105、2.56×104PFU/mL，每个稀释度各取500μL (即每份分别含有1.28×107、1.28×106、1.28×105、1.28×104PFU的噬菌体)，分别与5mL含有1.28×108CFU的LY-23菌液混合，即每组的感染复数MOI分别是0.1、0.01、0.001、0.0001。将各混合液置于29℃恒温培养箱中孵育10min使噬菌体吸附，将孵育后的混合液4℃下 10000g离心10min弃上清液，沉淀用5mL LB液体培养基重悬。在29℃、120rpm下培养 4h后分别测定噬菌体滴度。结果，各组均能使温和气单胞菌LY-23菌液裂解澄清。MOI为 0.1、0.01、0.001、0.0001时，培养液的最终噬菌体滴度分别为1.3×109PFU/mL、2.67×109 PFU/mL、4.51×109PFU/mL、6.49×108PFU/mL，MOI＝0.001组的滴度最高，故vB_AsoP-Yong 的最适MOI为0.001。
一步生长实验：取温和气单胞菌-噬菌体裂解液于4℃下10000g离心10min后取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径一次性针头过滤器过滤，过滤液作为一步生长实验的噬菌体原液。原液按实施例4中的滴度测定方法测出噬菌体滴度为7×1010PFU/mL。取40mL新鲜培养的LY-23菌液(浓度为2.27×107CFU/mL)与400μL噬菌体稀释液(稀释至2.27×106 PFU/mL)混合(即混合了9.08×108CFU的LY-23与9.08×105PFU的vB_AsoP-Yong， MOI＝0.001)，置于29℃恒温培养箱中孵育10min使噬菌体吸附。然后将混合液4℃下10000g 离心10min，弃上清液，向离心管中缓慢加入LB液体培养基至没过管口，然后立刻倒出培养基。用此方法清洗沉淀2次，去除未吸附的噬菌体。将沉淀用LB液体培养基浸泡15分钟，在漩涡振荡器上低速混匀。最后将重悬后的LY-23菌液置于摇床(29℃，180rpm)上培养，在第0、10、20、30、40、50、60、90、120、150、180、210、240分钟分别取样。采用实施例4的双层平板法测定每个时间点的噬菌体滴度。以测定的每个时间点的噬菌体滴度绘制一步生长曲线，结果如图3。噬菌体vB_AsoP-Yong在感染LY-23后50min内数量未显著增长，此阶段处于潜伏期。在感染后50min-150min，噬菌体数量呈现快速增长，此阶段为噬菌体暴发期。因此噬菌体vB_AsoP-Yong的潜伏期约为50min，裂解期约为150min。噬菌体在感染后150min时的爆发量为7665PFU/Cell，计算方法为暴发期结束时游离的噬菌体数与潜伏期开始时感染的细菌细胞数的比值。该爆发量为迄今所有已知噬菌体的最高值。
实施例6
不同温度、pH及氯仿对噬菌体vB_AsoP-Yong稳定性的影响
取噬菌体悬液，分装后分别置于于40℃、60℃、80℃温育，在30min、60min、120min时分别取样并测定噬菌体滴度，每个时间点做2次平行测定；取噬菌体悬液，分装后分别与PH为2-12的0.01M PBS等体积混合，29℃孵育2h后，分别测定各组的噬菌体滴度，每组做2次平行测定；取噬菌体悬液分为2组，实验组加入终浓度为2.5％的氯仿，对照组加入等体积的0.01M PBS，置于摇床(29℃，180rpm)孵育30min。将每组取的培养液样品均在 4℃下10000g离心10min后取上清液，测定噬菌体滴度，每组做2次平行测定。结果：40℃下处理120min后vB_AsoP-Yong的滴度仍未发生明显下降；在60℃下处理60min后其滴度下降一半；在80℃处理30min后滴度降为1PFU/mL；在pH为4-10的范围内，vB_AsoP-Yong 滴度基本维持不变，有优良的稳定性，在pH 11-12的范围内滴度出现轻微下降，在pH 2-3 处理2小时后滴度接近于零；氯仿处理后，噬菌体滴度未有变化。结果显示噬菌体 vB_AsoP-Yong对40℃的较高温度显示良好的耐受性；耐酸碱，在pH4-12的条件下活性稳定；对氯仿不敏感。
实施例7
噬菌体vB_AsoP-Yong对的动物保护实验
购买体长7-8厘米的健康锦鲫作为实验对象，将锦鲫分为三组，分别为实验组、对照组、空白组。实验组每条锦鲫首次注射107CFU温和气单胞菌LY-23攻毒液，3小时内再次注射 106PFU的噬菌体vB_AsoP-Yong。对照组每条锦鲫首次注射107CFU温和气单胞菌LY-23 攻毒液，3小时内再次注射0.01M PBS。空白组每条锦鲫首次注射0.01M PBS，3小时内再次注射0.01M PBS。注射位置为腹腔，体积为50μL/条。每日投饲两次。注射24小时内死亡者视为注射损伤，不计入实验结果。
实验进行到第五天后，锦鲫不再死亡，各组锦鲫存活数见表2。各组累积死亡率见图6。
截至实验结束，空白组累积死亡率为5.9％，对照组累积死亡率为94.4％，而实验组累积死亡率为64.3％。实验组累积死亡率比对照组小30.1％，即噬菌体vB_AsoP-Yong对斑马鱼的相对保护率为30.1％。
取实验第三天死亡的对照组、实验组锦鲫各2条进行解剖观察，发现对照组的锦鲫腹水多、内脏发黑、鱼鳔透明度降低，实验组则与健康鱼较为接近。取两组锦鲫的肾研磨悬浮， 10倍梯度稀释，混合倒平板法测定肾脏含菌量。对照组平均值为1.5×105CFU/mg，实验组平均值为2.5×104CFU/mg。与对照组相比，实验组鱼肾内含菌量显著降低。
表2噬菌体vB_AsoP-Yong动物保护实验锦鲫存活数表
Figure BSA0000188845140000101
上述结果显示，噬菌体vB_AsoP-Yong对受温和气单胞菌LY-23感染的锦鲫有明显的保护作用。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (8)

1.温和气单胞菌的一种烈性噬菌体vB_AsoP-yong，该噬菌体于2019年1月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17097。
2.根据权利要求1所述的温和气单胞菌的一种烈性噬菌体vB_AsoP-yong，该噬菌体具有如下生物学特征：是首株以致病性温和气单胞菌LY-23为靶标分离获得的噬菌体，命名为vB_AsoP-yong；vB_AsoP-yong可感染并裂解温和气单胞菌，使菌液澄清化，在温和气单胞菌的菌平板上可以形成透明的噬菌斑。
3.根据权利要求1所述的温和气单胞菌的一种烈性噬菌体vB_AsoP-yong，该噬菌体具有如下生物学特征：呈现二十面体近似球形的头部，直径约为55nm，以及不可收缩的尾部，长度约为20nm；最适MOI为0.001，潜伏期约为50min，裂解期为50min-150min；爆发量极高，达到7665PFU/Cell；对温度、pH、氯仿等因素有着较好的耐受能力，在40℃、pH 4-10或2.5％的氯仿胁迫下活性均稳定。
4.根据权利要求1所述的温和气单胞菌的一种烈性噬菌体vB_AsoP-yong，其特征包括：分离自浙江省宁波市慈城镇官山河水，水样采集的位置为North latitude：29.9699719，East longitude：121.4543285；具体制备方法如下：
(1)温和气单胞菌LY-23的活化、培养
取LY-23菌种划线接种于含1.5％琼脂的LB固体培养基平板上，29℃倒置培养过夜。从平板上挑取单菌落，接种到装有5mL LB液体培养基的试管内，在摇床内于29℃、180rpm培养12小时后，从试管中取1mL培养液稀释至装有100mL LB液体培养基的锥形瓶中，放置于摇床内于29℃、180rpm培养至菌液OD600≈0.6，即得到对数期菌液；
(2)噬菌体的富集
噬菌体vB_AsoP-yong分离自浙江省宁波市慈城镇官山河水，从河中采集表层水样，置冰盒内，并立即带回实验室处理，将采集的水样于4℃、10000g离心10min后，取40mL上清液于锥形瓶中，在瓶中加入20mL 3×LB液体培养基与1mL对数期即OD600≈0.6的LY-23菌液，混匀后放置于摇床于29℃、180rpm培养3小时以进行噬菌体富集；将富集培养液于4℃、10000g离心10min，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤；取一支试管，依次加入4mL过滤液、2mL 3×LB液体培养基、100μL对数期LY-23菌液混匀，作为实验组；另取一支试管加入6mL LB液体培养基、100μL对数期LY-23菌液混匀，作为对照组；将实验组、对照组试管放置于摇床于29℃、180rpm培养至实验组与对照组液体有肉眼可见差异，即实验组培养液变澄清、出现细菌碎片后，将实验组培养液于4℃、10000g离心10min，取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤；过滤液4℃避光保存，作为后续操作的噬菌体原液；
(3)噬菌体的分离纯化
将步骤(2)获得的噬菌体原液用LB液体培养基做10倍梯度稀释，取各个稀释度的稀释液100μL分别与200μL对数期LY-23菌液混合，放置于29℃恒温培养箱中孵育10min使噬菌体吸附；从45℃水浴中取出一份5mL分装的含0.7％琼脂的LB培养基，立刻与孵育后的噬菌体-菌混合液混合，漩涡震荡3秒混匀后，倒于已于29℃预热半小时的LB固体培养基平板上，均匀铺平；待凝固后将双层平板置于29℃培养箱中过夜培养，至平板上有噬菌斑形成；选取噬菌斑密度合适的平板，挑取单个噬菌斑中心位置的琼脂置于5mL对数期LY-23菌液中，摇床内于29℃、180rpm培养至宿主菌裂解澄清；将培养液于4℃、10000g离心10min，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，过滤液即为新一代噬菌体原液；新噬菌体原液继续使用上述双层平板法重复进行三代噬菌斑纯化实验，即得到纯化的噬菌体vB_AsoP-yong原液；
(4)噬菌体的扩大培养
将步骤(3)纯化得到的噬菌体-菌培养裂解液于4℃，10000g离心10min，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，将过滤液与对数期LY-23菌液按体积200μL：20mL的比例混合作为实验组，设置20mL对数期LY-23菌液作为对照组，一起放置于摇床于29℃、180rpm培养，至实验组与对照组液体出现肉眼可见差异时停止培养，将噬菌体-菌培养裂解液置于4℃保存；
(5)噬菌体悬液制备
取步骤(4)制备的噬菌体-菌培养裂解液于4℃、10000g离心10min，取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，即为噬菌体vB_AsoP-yong悬液。
5.根据权利要求1所述的温和气单胞菌的一种烈性噬菌体vB_AsoP-yong的应用，
其特征在于宿主具有特异性，专一性感染、裂解温和气单胞菌。
6.根据权利要求5所述的温和气单胞菌的一种烈性噬菌体vB_AsoP-yong的应用，其特征在于对温和气单胞菌具有强烈的裂解作用，可用于抑制、杀死温和气单胞菌。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的温和气单胞菌的一种烈性噬菌体vB_AsoP-yong的应用，其特征在于对动物具有保护作用。
8.根据权利要求1-7任意一项所述所述的温和气单胞菌的一种烈性vB_AsoP-yong的应用，其特征在于可用于但不限于制备生物制剂，这些生物制剂可用于病害防控和食品包括水产品、生产环境或生产器具的消毒。
CN201910792954.3A 2019-08-14 2019-08-14 温和气单胞菌高效裂解性噬菌体vB_AsoP-yong及其应用 Pending CN112391357A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910792954.3A CN112391357A (zh) 2019-08-14 2019-08-14 温和气单胞菌高效裂解性噬菌体vB_AsoP-yong及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910792954.3A CN112391357A (zh) 2019-08-14 2019-08-14 温和气单胞菌高效裂解性噬菌体vB_AsoP-yong及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112391357A true CN112391357A (zh) 2021-02-23

Family

ID=74603661

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910792954.3A Pending CN112391357A (zh) 2019-08-14 2019-08-14 温和气单胞菌高效裂解性噬菌体vB_AsoP-yong及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112391357A (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104073469A (zh) * 2014-05-20 2014-10-01 天津科技大学 裂解水产致病菌噬菌体的分离与筛选方法
GB201712733D0 (en) * 2017-08-08 2017-09-20 Snipr Tech Ltd Methods & cells
PL416716A1 (pl) * 2016-04-03 2017-10-09 Proteon Pharmaceuticals Spółka Akcyjna Szczepy bakteriofagów i ich zastosowania
CN108103031A (zh) * 2018-01-10 2018-06-01 浙江省淡水水产研究所 一种水产养殖用宽谱噬菌体制剂及其制备方法
CN108148815A (zh) * 2017-12-11 2018-06-12 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一株鱼类细菌的噬菌体及其应用
CN109097339A (zh) * 2017-06-21 2018-12-28 宁波大学 一种裂解性噬藻体macpnoa1及其应用
GB201907242D0 (en) * 2019-05-22 2019-07-03 Snipr Biome Aps Dna methods etc ii

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104073469A (zh) * 2014-05-20 2014-10-01 天津科技大学 裂解水产致病菌噬菌体的分离与筛选方法
PL416716A1 (pl) * 2016-04-03 2017-10-09 Proteon Pharmaceuticals Spółka Akcyjna Szczepy bakteriofagów i ich zastosowania
CN109097339A (zh) * 2017-06-21 2018-12-28 宁波大学 一种裂解性噬藻体macpnoa1及其应用
GB201712733D0 (en) * 2017-08-08 2017-09-20 Snipr Tech Ltd Methods & cells
CN108148815A (zh) * 2017-12-11 2018-06-12 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一株鱼类细菌的噬菌体及其应用
CN108103031A (zh) * 2018-01-10 2018-06-01 浙江省淡水水产研究所 一种水产养殖用宽谱噬菌体制剂及其制备方法
GB201907242D0 (en) * 2019-05-22 2019-07-03 Snipr Biome Aps Dna methods etc ii

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GORSHKOV等: "ISOLATION AND STUDY OF BIOLOGICAL PROPERTIES OF BACTERIOPHAGES AEROMONAS SOBRIA", 《VESTNIK OF ULYANOVSK STATE AGRICULTURAL ACADEMY》 *
林业杰等: "温和气单胞菌噬菌体的分离及其诊断应用", 《中国人兽共患病杂志》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106995803B (zh) 一株用于防治对虾副溶血弧菌病的噬菌体及其扩培方法
CN103898015B (zh) 一种溶藻弧菌噬菌体及其在海参疾病预防中的应用
CN107779439B (zh) 新的葡萄球菌噬菌体及其组合物、制备方法和应用
CN112481221A (zh) 迟钝爱德华氏菌高效裂解性噬菌体vB_EtaM-IME523及其应用
Smith Toxic effects of blooms of marine species of Oscillatoriales on farmed prawns (Penaeus monodon, Penaeus japonicus) and brine shrimp (Artemia salina)
CN103981154B (zh) 一种铜绿假单胞菌噬菌体及其在水貂出血性肺炎预防中的应用
CN112143709B (zh) 一株嗜水气单胞菌噬菌体及其应用
CN115612675A (zh) 一株沙门氏菌噬菌体nct1及其应用
CN113293143B (zh) 一株可降低鸡白痢沙门氏菌垂直传播的沙门氏菌噬菌体及其应用
CN114561363A (zh) 一种具有跨种裂解能力的弧菌噬菌体PC-Liy1、制备方法及应用
CN109880766B (zh) 一种银鲳美人鱼发光杆菌菌株及灭活疫苗
CN117050954B (zh) 一种宽谱沙门氏菌噬菌体vB-SenS-S1及包含该噬菌体的组合物
CN103992990A (zh) 一种嗜环弧菌噬菌体及其在海参疾病预防中的应用
CN112391357A (zh) 温和气单胞菌高效裂解性噬菌体vB_AsoP-yong及其应用
CN109517804B (zh) 一种具有跨种裂解特性的拟态弧菌噬菌体oy-1、制备方法及其应用
CN115197919B (zh) 弧菌噬菌体组合物及其制备方法和应用
CN104138597A (zh) 一种鳗弧菌二价疫苗及其制备和使用方法
CN101575592A (zh) 鸭疫里氏杆菌敏感的烈性噬菌体及应用
CN113444695B (zh) 一株发酵效率高且临床效果好的大肠杆菌噬菌体及其应用
CN110129282B (zh) 溶藻弧菌噬菌体和噬菌体组合物及其应用
CN111187757A (zh) 大肠杆菌噬菌体及其应用与杀菌组合物及其应用
Gratzek et al. Ornamental fish: diseases and problems
CN112391355B (zh) 哈维氏弧菌高效裂解性噬菌体vB_VhaS-yong3及其应用
CN114807058B (zh) 一种金黄色葡萄球菌噬菌体SapYZUalpha及其应用
CN110819549B (zh) 一株线纹海马致病菌株及肠炎病灭活疫苗

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20210223