CN114561363A - 一种具有跨种裂解能力的弧菌噬菌体PC-Liy1、制备方法及应用 - Google Patents
一种具有跨种裂解能力的弧菌噬菌体PC-Liy1、制备方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114561363A CN114561363A CN202210099365.9A CN202210099365A CN114561363A CN 114561363 A CN114561363 A CN 114561363A CN 202210099365 A CN202210099365 A CN 202210099365A CN 114561363 A CN114561363 A CN 114561363A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- vibrio
- phage
- liy1
- vibrio phage
- fermentation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 title claims abstract description 133
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 title abstract description 11
- 241000607594 Vibrio alginolyticus Species 0.000 claims abstract description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 238000005336 cracking Methods 0.000 claims abstract description 16
- 241000607272 Vibrio parahaemolyticus Species 0.000 claims abstract description 11
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 claims abstract description 8
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 241000607253 Vibrio mimicus Species 0.000 claims abstract description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 20
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 18
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 18
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 16
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 16
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 206010047400 Vibrio infections Diseases 0.000 claims description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 13
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 claims description 12
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 10
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 7
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 6
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 4
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 239000013535 sea water Substances 0.000 claims description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 3
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 claims 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 7
- 241000701553 Myoviridae Species 0.000 abstract description 6
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 abstract description 4
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 24
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 2
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 2
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 2
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000235342 Saccharomycetes Species 0.000 description 2
- 101100483030 Salmonella phage ViI tail sheath gene Proteins 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 208000011140 intestinal infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 235000014102 seafood Nutrition 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 241000216674 Armillaria tabescens Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 241000863430 Shewanella Species 0.000 description 1
- 241000607618 Vibrio harveyi Species 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000007888 film coating Substances 0.000 description 1
- 238000009501 film coating Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000009364 mariculture Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 238000001066 phage therapy Methods 0.000 description 1
- IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxotungsten Chemical compound O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.OP(O)(O)=O IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/40—Viruses, e.g. bacteriophages
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10111—Myoviridae
- C12N2795/10121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10111—Myoviridae
- C12N2795/10131—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种具有跨种裂解能力的弧菌噬菌体PC‑Liy1及其制备方法及应用。该噬菌体属于肌尾噬菌体科（Myoviridae）。本发明所述弧菌噬菌体具有广泛的宿主范围和较高的裂解率，可裂解溶藻弧菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、拟态弧菌、新喀里多尼亚弧菌及希瓦氏弧菌。该噬菌体的环境适应能力强、具有稳定且良好的生物特性，该噬菌体制备的生物抑菌剂能够有效控制水体及其他环境中弧菌的生长。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种弧菌噬菌体PC-Liy1、弧菌噬菌体 PC-Liy1所制备的生物抗菌剂及其应用。
背景技术
弧菌是一种需氧兼性厌氧的革兰氏阴性菌，在海洋环境中最常见的细菌类群 之一，广泛存在于近岸海域的海水和海洋生物体中。近年来，随着人类对海产品 需求量和消费量的不断增加，我国水产养殖业蓬勃发展，集约化水产养殖程度越 来越高，养殖密度的扩大使养殖动物的发病率不断升高。海水养殖动物常见的且 危害性最大的细菌性疾病主要是因弧菌引起的弧菌病。弧菌病可导致虾、鱼类、 贝类及甲壳类的大量死亡。霍乱弧菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌和哈维氏弧菌等 都是常见的条件致病菌。霍乱弧菌所引起的霍乱烈性肠道传染病具有发病急、传 播速度快、传染范围广等特点，一旦感染，给水产养殖业带来巨大经济损失。霍 乱弧菌也是人类食用海鲜产品而食物中毒的主要元凶，严重影响许多国家的健康 和安全。溶藻弧菌是一种食源性致病菌，可危害鱼类、虾类等多种水生动物，对人也有致病性。副溶血性弧菌是一种嗜盐菌，通常存在于水产品中，进食含有该 菌的食物可致食物中毒。
当前对于海水养殖环境中弧菌的控制，及由弧菌引起的水产养殖动物疾病的 防治主要以抗生素和消毒剂为主，抗生素的不合理使用导致细菌出现耐药性，这 些耐药菌株的产生对人类健康形成潜在危险，此外，抗生素在环境中残留也会破 坏生态环境。抗生素和消毒剂能够抑制或杀死有益微生物，破坏水生动物体内外 微生态平衡，降低自身免疫力。因此，寻求一套有效的抑制致病性弧菌的方法迫 在眉睫。
弧菌噬菌体广泛存在于海水中，是天然的生物抑菌剂，具有研发周期短、研 发成本低、增殖能力强等优势。近年来，噬菌体疗法已在医学、制药、水产养殖、 食品加工等领域被广泛关注。在水产养殖上，弧菌噬菌体对控制弧菌的研究取得 一定进展。因为噬菌体的高度专一性，大多数只能感染一种宿主菌，而实际养殖 环境中弧菌种类多种多样，目前高专一性的噬菌体无法养殖环境多样性和复杂性 的需求，文献中也未见有高效裂解多种致病弧菌噬菌体的报道。
发明内容
本发明提供了一种可以高效裂解多种弧菌的噬菌体PC-Liy1，及其在水产养 殖环境中抑制弧菌的应用。
本发明采用的技术方案如下：本发明提供了一种具有高效跨种裂解能力的弧 菌噬菌体PC-Liy1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保 藏编号为CGMCC No.23369，保藏时间为2021年12月13日。
进一步的，所述弧菌噬菌体PC-Liy1在2216E平板上形态为圆形透亮直径约 1～2mm的噬菌斑。透射电镜显示弧菌噬菌体PC-Liy1头部呈长二十面体，头部 长度为100～110nm，宽度为75～85nm，尾部长度为95～100nm，在2216E平板上 形态为圆形透亮直径为1～2mm的噬菌斑，可观察到收缩性尾鞘，尾部末端可见 尾丝，属于肌尾噬菌体科(Myoviridae)。
所述弧菌噬菌体PC-Liy1的潜伏期约为30min，裂解期在30～100min，裂解 量为70PFU/CFU。
进一步的，所述弧菌噬菌体耐受45～70℃温度。
进一步的，所述弧菌噬菌体适宜生存的pH值为4～10。
进一步的，所述弧菌噬菌体对氯仿不敏感。
进一步的，所述弧菌噬菌体能够裂解多种致病性弧菌。
进一步的，所述弧菌噬菌体PC1-Liy1为线性双链DNA，基因组大小为 246,348bp，GC％含量为42.6％。
本发明提供了一种弧菌噬菌体PC-Liy1在制备抑制生物抗菌剂中的用途。
进一步的，所述的生物抗菌剂可以同时抑制多种致病性弧菌。
进一步的，所述的致病性弧菌为霍乱弧菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、拟态 弧菌、新喀里多尼亚弧菌、希瓦氏弧菌。
进一步的，所述的弧菌噬菌体对酵母菌、芽孢菌、乳杆菌及肠杆菌都不敏感。
本发明提供了一种生物抗菌剂的制备方法，其特征在于，所述的弧菌噬菌体 PC-Liy1生产生物抗菌剂的步骤如下：
1)将宿主菌溶藻弧菌VA5接种到种子培养基中，然后将溶藻弧菌VA5与 所述弧菌噬菌体PC-Liy1混合接种到种子培养基中，37℃摇床振荡培养，制备宿 主菌溶藻弧菌VA5和所述弧菌噬菌体PC-Liy1的种子液；
2)在发酵罐中加入所述弧菌噬菌体PC-Liy1的发酵培养基并灭菌，将接种 宿主菌接种弧菌噬菌体PC-Liy1，进行发酵得到发酵混合液；
3)将所述的发酵混合液经离心膜过滤去除宿主菌VA5，得到弧菌噬菌体 PC-Liy1液体制剂。
进一步的，所述步骤(2)中温度设定为35～40℃，通气条件下发酵时间为 10～12h。
进一步的，所述制备方法步骤(2)中噬菌体的感染复数为0.1，搅拌桨转速 为40～80r/min，所述弧菌噬菌体PC-Liy1的最佳感染复数为0.1，搅拌桨转速为 40～80r/min。
进一步的，所述制备方法中的发酵培养基为每升海水中含5.0～10.0g蛋白胨 和1.0～4.0g酵母浸粉。
本发明提供了一种噬菌体PC-Liy1及其生物抑菌剂能够有效控制水体、养殖 环境、其他环境的弧菌的用途。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
1)本发明分离得到一株新的弧菌噬菌体PC-Liy1，该噬菌体可以高效裂解致病 性弧菌，且具有高效的跨种裂解能力，除可以裂解实验室分离到的3株霍乱弧菌 外还可以裂解溶藻弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌，对部分希瓦氏弧菌和新喀里多 尼亚弧菌也有裂解能力。对溶藻弧菌和副溶血弧菌的裂解率分别为82％和71％， 而对大肠杆菌、酵母菌、乳杆菌及芽孢杆菌不敏感。
2)该噬菌体可耐受45-70℃，pH值在4～10范围内可以保持109PFU/mL的高裂 解活性。
3)该噬菌体是天然的生物净化因子分离于自然环境中，在对虾水产养殖过程可以有效控制弧菌生长，可应用于水产养殖弧菌病害的防控。将噬菌体制成生物抗 菌剂后，泼洒在水产养殖虾池中，可以在至少24h内稳定控制弧菌增长。
附图说明
图1为弧菌噬菌体PC-Liy1在2216E琼脂平板上的噬菌斑形态。
图2为弧菌噬菌体PC-Liy1在透射电镜下的形态。
图3为弧菌噬菌体PC-Liy1在不同温度处理30min和60min的效价变化。
图4为弧菌噬菌体PC-Liy1在不同pH下的效价变化。
图5为弧菌噬菌体PC-Liy1的一步生长曲线。
图6为弧菌噬菌体PC-Liy1对水产养殖虾池中弧菌抑制效果，每毫升水体中 含有的弧菌量计，即CFU/mL。其中a：日照虾池，b:海阳虾池。
具体实施方式
以下通过附图和具体实施例对本发明做进一步解释和说明。
以下实施例中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；使用的原料和 试剂等，如无特殊说明均为市售产品。
实施例1：弧菌噬菌体PC-Liy1的分离纯化
样品采集自广西省南宁市各水产农贸市场海鲜水样。
取100mL水样，加入100mL的2×LB液体培养基和1.5mL对数生长期的 霍乱弧菌VC1(本课题组保藏)，37℃摇床180r/min培养12h，以富集噬菌体。 富集液经过10000r/min、15min离心除菌，取上清液过0.22μm无菌滤膜。然后 用PBS缓冲液梯度稀释与霍乱弧菌VC1混合制备双层琼脂板。放于37℃培养箱 培养6h观察有无噬菌斑。挑取单个噬菌斑进行多次双层平板法对噬菌体进行分 离纯化。直至噬菌体在平板上形成形态、大小一样的噬菌斑，如图1所示。
采用磷钨酸负染色法对噬菌体进行染色。取20μL噬菌体悬液(效价109 PFU/mL)滴于复膜铜网上，吸附10min后取出铜网，空气中自然干燥2～3min； 然后用2％的磷钨酸溶液进行染色，2min后吸干水分，空气中干燥5min，用透 射电镜观察噬菌体的微观形态。如图2所示，噬菌体PC-Liy1头部呈长二十面体， 头部长度约为110nm，宽度约为80nm，尾部长度约为100nm。在头部与尾连接 处还有一个颈圈结构，可观察到收缩性尾鞘，尾部末端可见尾丝，属于肌尾噬菌 体科(Myoviridae)。
实施例2：弧菌噬菌体PC-Liy1的全基因组特征
提取弧菌噬菌体PC1-Liy1的DNA，以此为模板，对噬菌体全基因组进行测 序，弧菌噬菌体PC1-Liy1为线性双链DNA，基因组大小为246,348bp，GC％含 量为42.6％。经全基因组和蛋白质组学分析，该序列无毒力因子和抗生素耐药性 基因。通过NCBI BLASTn进行基因组相似性比对结果如表1所示。该噬菌体与 广谱噬菌体KVP40相似度最大为98％，覆盖率为97％。
表1弧菌噬菌体PC1-Liy1基因组同源性比对
| 菌株类型 | 覆盖率 | 相似度 | 序列号 |
| 光谱噬菌体KVP40 | 97％ | 98％ | AY283928 |
| 弧菌噬菌体V09 | 96％ | 98％ | MT135026 |
| 弧菌噬菌体V07 | 96％ | 98％ | MT135025 |
| 弧菌噬菌体VH1_2019 | 95％ | 98％ | MN794232 |
将该弧菌噬菌体PC-Liy1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；肌尾噬菌体PC- Liy1的保藏编号为CGMCC No.23369，保藏时间为2021年 12月13日。
实施例3：弧菌噬菌体PC-Liy1的生物特性实验
(1)宿主范围检测
采用点滴法测定噬菌体对弧菌、酵母菌、芽孢菌、乳杆菌、肠杆菌的裂解性。 将培养至对数生长期的待测菌制成双层平板，将5μL噬菌体液(109PFU/mL)滴 于凝固的双层平板表面，于37℃培养箱中培养8h，观察是否有噬菌斑产生。
通过点滴法测定噬菌体对从山东青岛、山东日照、山东烟台、广西南宁、江 苏南通、江苏如东、浙江宁波等地的病虾样和水样分离到的弧菌及实验室保存的 大肠杆菌及各种革兰氏阳性菌的裂解性。
噬菌体PC-Liy1宿主范围结果如表2-表4所示，除可以裂解分离到的3株霍 乱弧菌外还可以裂解溶藻弧菌、副溶血弧菌和5株拟态弧菌中，对部分希瓦氏弧 菌和新喀里多尼亚弧菌也有裂解能力。对溶藻弧菌和副溶血弧菌的裂解率分别达 到82％和71％，表明该噬菌体具有高效的跨种裂解能力。而对大肠杆菌、酵母 菌、乳杆菌及芽孢杆菌不敏感。
表2.弧菌噬菌体PC-Liy1对副溶血性弧菌的裂解谱
注：+++，透亮的噬菌斑；++，噬菌斑轻微模糊；+，模糊的噬菌斑；–，无噬菌斑
表3.弧菌噬菌体PC-Liy1对溶藻弧菌的裂解谱
注：+++，透亮的噬菌斑；++，噬菌斑轻微模糊；+，模糊的噬菌斑；–，无噬菌斑
表4.弧菌噬菌体PC-Liy1对其他菌的裂解谱
注：+++，透亮的噬菌斑；++，噬菌斑轻微模糊；+，模糊的噬菌斑；–，无噬菌斑
(2)温度稳定性实验
取7.6×109PFU/mL噬菌体500μL，分别于45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃水浴30min和60min。冷却至室温后采用双层平板法测定噬菌体效价，做三 组平行实验。
结果如图3所示，该噬菌体在45℃～55℃处理60min，效价在109PFU/mL， 与未处理前相比没有明显降低。在60℃时，噬菌体效价开始降低，温度达到65℃ 及以上噬菌体效价降低到106PFU/mL，当70℃处理30min时噬菌体效价为 104PFU/mL，60min时噬菌体完全失活。总体分析，噬菌体PC-Liy1的热稳定性 良好，能够耐受45～70℃，55℃以下不丧失其活性。
(3)pH稳定性实验
分别取100μL噬菌体液与0.9mL pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、 9.0、10.0、11.0、12.0的2216E液体培养基(HCl、NaOH调节pH)混合，室温 测定3h、24h、48h时的噬菌体效价。结果如图4所示，该噬菌体在pH为4～10 的条件下，保持较高效价，其裂解活性稳定且良好，在pH值大于10或小于4 时，效价下降明显。
(4)感染复数实验
感染时噬菌体与指示菌细胞的数量比值称为感染复数(multiplicity ofinfection，MOI)，即每个细胞感染噬菌体的数目。将3×1010PFU/mL噬菌体液 梯度稀释，与100μL菌活为3×108CFU/mL的对数期宿主菌溶藻弧菌VA5按 MOI为0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10比例混合，加入5mL的液体培养基中， 37℃摇床180r/min培养至菌液澄清且可见细菌碎片。取出后分别测定各管中噬 菌体效价，效价最高所对应的MOI即为最适感染复数。将MOI为0.0001、0.001、 0.01、0.1、1、10的噬菌体与宿主菌培养至菌液澄清可见细菌碎片后测定噬菌体 效价，结果如表1所示。当MOI＝1时，噬菌体效价最高达6×1010PFU/mL，因此，弧菌噬菌体PC-Liy1的最适感染复数为1(如表5所示)。
表5.弧菌噬菌体PC-Liy1感染复数结果
(5)氯仿敏感性实验
取200μL CHCl3与4mL效价为7.6×109PFU/mL的噬菌体增殖液混合，在37℃ 摇床中180r/min培养30min。10000r/min离心5min，取上清液100μL，10倍梯 度稀释，采用双层平板法测效价。将不加氯仿处理的设为对照组。检验噬菌体对 氯仿是否敏感。噬菌体经氯仿处理30min后与对照组相比，效价由7.6×109 PFU/mL降到3.5×109PFU/mL，效价仍保持在同一数量级，该噬菌体对氯仿不敏 感，该噬菌体外壳中无脂类物质。
实施例3：弧菌噬菌体PC-Liy1的生长特性实验
取1mL对数期宿主菌VA5(108CFU/mL)与109PFU/mL的噬菌体液按最适 感染复数(MOI＝1)混合，37℃培养箱中孵育20min，使噬菌体吸附细菌。10000 r/min离心3min，弃上清液，沉淀用2216E液体培养基洗涤2次除去游离噬菌体。 用1mL培养基重悬，然后加入至50mL培养基中，37℃摇床180r/min振荡培养。 每隔10min取样一次，连续取样至180min，测定噬菌体效价并绘制一步生长曲 线，以取样时间为横坐标，以噬菌体效价的对数为纵坐标。
计算裂解量，裂解量＝裂解末期噬菌体效价/感染初期宿主菌浓度。
如图5所示，在0～30min噬菌体效价没有明显变化处于潜伏期，在30～ 100min，噬菌体效价急剧增加，这段时间为噬菌体的爆发期，爆发时间持续70min， 之后曲线趋于平稳，进入平稳期。根据裂解量公式计算得出裂解量为70PFU/CFU。
实施例4：弧菌噬菌体PC-Liy1生物抗菌剂的液体深层发酵
将宿主菌溶藻弧菌VA5按2％接种到种子培养基中，然后将溶藻弧菌VA5 与所述弧菌噬菌体PC-Liy1混合接种到另一种子培养基中，37℃摇床180r/min 振荡培养4h，制备宿主菌VA5和弧菌噬菌体PC-Liy1的种子液；
在200L发酵罐中加入60L所述弧菌噬菌体PC-Liy1的发酵培养基并灭菌 40min，按1％接种量接种宿主菌VA5，然后接种弧菌噬菌体PC-Liy1(感染复数 为0.1)，发酵温度设定为35～40℃，搅拌桨转速为40r/min～80r/min，进行发酵 10h～12h得到发酵混合液；
将所述的发酵混合液经离心膜过滤去除宿主菌VA5，得到弧菌噬菌体 PC-Liy1液体制剂。
双层平板法测得噬菌体效价为2.0×109PFU/mL～2.5×109PFU/mL。
实施例5：弧菌噬菌体PC-Liy1对水产养殖虾池弧菌的抑制作用
在50立方米的农场经营的虾池中检测该噬菌体对弧菌的抑制作用。实验前 48h，从相同深度的每个虾池中取10mL水，测定虾池水的弧菌浓度，每隔24h 测一次，以确定各虾池弧菌含量。然后将500mL效价为109PFU/mL的该噬菌体 分散在1号虾池中，将养殖户经常使用的抑菌物质(碘伏、碘酊消毒剂)加入2 号虾池中。同时，3号虾池为阴性对照组，无任何抗菌物质加入。加入噬菌体和 消毒剂后，在不同时间间隔测定各虾池水样的弧菌数。为得到准确的结果，分别 在日照和海阳两地进行此试验。
结果如图6.a，观察了处理后0～24h各组虾池水中的弧菌数量变化情况。泼 洒12h后，噬菌体处理组虾池水的总弧菌数下降到初始值的85.7％，24h后，噬 菌体处理组的弧菌数量减少到8.5×102CFU/mL，降为初始值的60.7％。而碘伏 消毒剂组虾池水的弧菌浓度从初始的1.8×103CFU/mL持续缓慢增加到2.6× 103CFU/mL，较初始值增加了44.5％。阴性对照组虾池水的弧菌浓度从初始的2.4 ×103CFU/mL增加到1.5×104CFU/mL。图6.b，为海阳养殖场的试验结果。在0～ 56h噬菌体组虾池水的弧菌浓度始终维持在1×103CFU/mL水平，弧菌数量未上 升。碘酊消毒剂处理组的弧菌浓度在0～8h从最初的1.5×103CFU/mL降为5.2×102CFU/mL，但8h后弧菌急剧增加，到56h弧菌浓度达到2.6×103CFU/mL， 较初始值增加了73％。阴性对照组弧菌数持续增加。
上述结果表明，弧菌噬菌体PC-Liy1对虾池水中弧菌的控制效果显著。该噬 菌体能稳定控制弧菌生长至少24h。与碘伏和碘酊消毒剂单独应用相比，该噬菌 体的实际控弧菌应用更有效。
Claims (13)
1.一种具有高效跨种裂解能力的弧菌噬菌体PC-Liy1，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23369，保藏时间为2021年12月13日。
2.根据权利要求1所述的弧菌噬菌体PC-Liy1，其特征在于，所述噬菌体头部呈长二十面体，头部长度为100~110nm，宽度为75~85nm，尾部长度为95~100nm，在2216E固体培养基上形态为圆形透亮直径为1~2mm的噬菌斑。
3.根据权利要求1所述的弧菌噬菌体PC-Liy1，其特征在于，所述弧菌噬菌体耐受45~70℃，适宜生存的pH值为4~10，对氯仿不敏感。
4.根据权利要求1所述的弧菌噬菌体PC-Liy1，其特征在于，所述弧菌噬菌体能够裂解多种致病性弧菌。
5.根据权利要求1所述的弧菌噬菌体PC-Liy1，其特征在于，所述弧菌噬菌体PC1-Liy1为线性双链DNA，基因组大小为246,348bp。
6.权利要求1所述的弧菌噬菌体PC-Liy1在制备生物抗菌剂中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的生物抗菌剂可以同时抑制多种致病性弧菌。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的致病性弧菌为霍乱弧菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、拟态弧菌、新喀里多尼亚弧菌、希瓦氏弧菌。
9.一种弧菌噬菌体PC-Liy1制备生物抗菌剂的方法，其特征在于，所述的弧菌噬菌体PC-Liy1制备生物抗菌剂的步骤如下：
（1）将宿主菌溶藻弧菌VA5接种到种子培养基中，然后将溶藻弧菌VA5与所述弧菌噬菌体PC-Liy1混合接种到种子培养基中，37℃摇床振荡培养，制备宿主菌溶藻弧菌VA5和所述弧菌噬菌体PC-Liy1的种子液；
（2）在发酵罐中加入所述弧菌噬菌体PC-Liy1的发酵培养基并灭菌，将接种宿主菌接种弧菌噬菌体PC-Liy1，进行发酵得到发酵混合液；
（3）将所述的发酵混合液经离心膜过滤去除宿主菌VA5，得到弧菌噬菌体PC-Liy1液体制剂。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中温度设定为35~40℃，通气条件下发酵时间为10~12h。
11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中弧菌噬菌体PC-Liy1的感染复数为0.1，搅拌桨转速为40~80r/min。
12.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中发酵培养基为每升海水中含5.0~10.0g蛋白胨和1.0~4.0g酵母浸粉。
13.权利要求1所示的噬菌体PC-Liy1或权利要求6所述的生物抗菌剂在控制水体、养殖环境、其他环境的弧菌的用途。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210099365.9A CN114561363A (zh) | 2022-01-27 | 2022-01-27 | 一种具有跨种裂解能力的弧菌噬菌体PC-Liy1、制备方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210099365.9A CN114561363A (zh) | 2022-01-27 | 2022-01-27 | 一种具有跨种裂解能力的弧菌噬菌体PC-Liy1、制备方法及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114561363A true CN114561363A (zh) | 2022-05-31 |
Family
ID=81714553
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210099365.9A Pending CN114561363A (zh) | 2022-01-27 | 2022-01-27 | 一种具有跨种裂解能力的弧菌噬菌体PC-Liy1、制备方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114561363A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114774371A (zh) * | 2022-06-21 | 2022-07-22 | 中国海洋大学 | 一种弧菌噬菌体及其应用 |
| CN115197919A (zh) * | 2022-07-26 | 2022-10-18 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 弧菌噬菌体组合物及其制备方法和应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110129280A (zh) * | 2019-05-14 | 2019-08-16 | 菲吉乐科(南京)生物科技有限公司 | 宽裂解谱溶藻弧菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用 |
| CN112029733A (zh) * | 2020-09-24 | 2020-12-04 | 瑞科盟(青岛)生物工程有限公司 | 一株高裂解性溶藻弧菌噬菌体rdp-vp-19001及其应用 |
| CN113201505A (zh) * | 2021-04-02 | 2021-08-03 | 青岛诺安百特生物技术有限公司 | 一株具备跨种裂解能力的溶藻弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用 |
-
2022
- 2022-01-27 CN CN202210099365.9A patent/CN114561363A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110129280A (zh) * | 2019-05-14 | 2019-08-16 | 菲吉乐科(南京)生物科技有限公司 | 宽裂解谱溶藻弧菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用 |
| CN112029733A (zh) * | 2020-09-24 | 2020-12-04 | 瑞科盟(青岛)生物工程有限公司 | 一株高裂解性溶藻弧菌噬菌体rdp-vp-19001及其应用 |
| CN113201505A (zh) * | 2021-04-02 | 2021-08-03 | 青岛诺安百特生物技术有限公司 | 一株具备跨种裂解能力的溶藻弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114774371A (zh) * | 2022-06-21 | 2022-07-22 | 中国海洋大学 | 一种弧菌噬菌体及其应用 |
| CN114774371B (zh) * | 2022-06-21 | 2022-09-13 | 中国海洋大学 | 一种弧菌噬菌体及其应用 |
| CN115197919A (zh) * | 2022-07-26 | 2022-10-18 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 弧菌噬菌体组合物及其制备方法和应用 |
| CN115197919B (zh) * | 2022-07-26 | 2024-05-17 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 弧菌噬菌体组合物及其制备方法和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109825479B (zh) | 一种宽谱沙门氏菌噬菌体lpstll及应用 | |
| CN113583972B (zh) | 一株可降低抗生素耐药性的大肠杆菌噬菌体及其应用 | |
| CN112195158B (zh) | 一株裂解性副溶血性弧菌噬菌体rdp-vp-19003及其应用 | |
| CN114561363A (zh) | 一种具有跨种裂解能力的弧菌噬菌体PC-Liy1、制备方法及应用 | |
| CN112280749B (zh) | 大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_swi3及其应用 | |
| CN113430173B (zh) | 一株宽裂解谱、耐高温沙门氏菌噬菌体及其应用 | |
| CN113583971B (zh) | 一株可同时裂解大肠杆菌的沙门氏菌噬菌体及其应用 | |
| CN114717199B (zh) | 一株不具转导耐药基因能力的沙门菌噬菌体ckt1及其应用 | |
| CN111269865A (zh) | 一种侧孢短芽孢杆菌菌株s62-9及其用途 | |
| CN113583966B (zh) | 一株烈性沙门氏菌噬菌体及其应用 | |
| Collin et al. | The origin of Vibrio cholerae influences uptake and persistence in the blue mussel Mytilus edulis | |
| CN104774781A (zh) | 一株枯草芽孢杆菌dcu及其用途 | |
| CN114437964B (zh) | 一株贝莱斯株芽孢杆菌及其应用 | |
| CN112522214B (zh) | 一株高裂解性铜绿假单胞菌噬菌体rdp-pa-20001及其应用 | |
| CN103992990A (zh) | 一种嗜环弧菌噬菌体及其在海参疾病预防中的应用 | |
| CN114231499A (zh) | 噬菌体及其应用 | |
| CN112553171B (zh) | 一种弧菌噬菌体制剂及其应用 | |
| CN117683697B (zh) | 一株贝莱斯芽孢杆菌y01及其在抑菌和提高动物生长性能中的应用 | |
| CN113789305B (zh) | 裂解性大肠杆菌噬菌体制剂及其制备和应用 | |
| CN115197919B (zh) | 弧菌噬菌体组合物及其制备方法和应用 | |
| CN117737002A (zh) | 一株高裂解率可跨种裂解的宽谱噬菌体及其用途 | |
| CN115927205A (zh) | 一株跨种属裂解型肺炎克雷伯菌噬菌体及其用途 | |
| CN117603918A (zh) | 一株大肠埃希氏菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用 | |
| CN115948347A (zh) | 一种维氏气单胞菌噬菌体及其应用 | |
| CN117778333A (zh) | 一种创伤弧菌噬菌体13vv501a、微生态制剂及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |