CN107058175A - 唾液链球菌及在制备去除口臭药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种口腔益生菌菌株，所述菌株的保藏号为CGMCC NO.12899，保藏日期为2016年8月23日，保藏分类命名为唾液链球菌(Streptococcus Salivarius)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。所述菌株能够明显抑制口臭标准菌株具核梭菌的挥发性硫化物的产生。本发明还公开了上述菌株在制备去除口臭药物中的应用，在去除口臭，构建有益的口腔微生态环境效的微生态制剂制备上具有广泛的应用前景和价值。

Description

唾液链球菌及在制备去除口臭药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种益生菌及其应用，属于微生物领域。

背景技术

口臭是指呼吸时出现臭味的一种症状，是一种常见疾病，中国人的患病率在22％到50％以上不等。口臭患者不敢与他人近距离交往，从而产生自卑心理，影响正常的人际、情感交流，令人十分苦恼。口臭主要由口腔内细菌，尤其是由聚集在舌后1/3的革兰阴性厌氧菌发酵产生的挥发性硫化物(Volatile Sulphur Compound，VSC)所引起。研究表明，VSC主要由牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、中间普雷沃菌和具核梭杆菌等细菌产生。Kazor等运用PCR对健康者和口臭者口腔内细菌进行分析，发现口臭患者中具核梭杆菌(Fusobacterium periodonticum)等检出率较健康者高，说明这些细菌普遍存在于口臭患者口中；而唾液链球菌(Streptococcus salivarius，S.salivarius)、粘滑罗氏菌(Rothiamucilaginosa)和一种优杆菌在健康者口腔中检出率高，而在口臭者中检出率明显低于健康者。此结果提示，口臭与口腔菌群生态失调有关，产臭菌在口腔中过度增殖，影响了口腔正常菌群如唾液链球菌的生长。

已知口臭治疗最基本的原理是减少产臭菌数量，降低VSC的浓度。目前治疗方法主要有两种：1)机械方法，包括清洁舌体、牙周洁治、清洁牙间隙及必要的刷牙和漱口等；2)生物化学方法，主要是指使用各种抗菌剂来抑制产臭菌的增殖，包括使用氯己定、金属离子和西吡氯铵等。这些方法能短期改善口臭，但长期疗效欠佳。而且使用生物化学方法因含有抗菌剂，长期使用还会导致口腔菌群失调。口臭治疗后，各种细菌重新在口腔内定植、生长、增殖，一旦产臭菌重新增殖为口腔中优势菌群，口臭即可复发，故有效地恢复口腔内菌群正常的生态平衡是治疗口臭的关键。很多学者报道了口臭及VSCs水平可以通过刷牙、刷舌苔等治疗而降低，但是这些方法持续时间短暂，停止使用后口臭会反弹。使用含有抗菌成分的漱口水在一段时间内可有效降低口臭程度，但长期使用会产生耐药性及口腔内菌群失调，并且停药后口腔内的产臭菌将会重新聚集产生口臭。因此，近年来很多学者开始探索更有效地预防及治疗口臭的方法，其中采用益生菌进行口臭的治疗已逐渐成为研究的热点。

1907年，乌克兰生物学家、诺贝尔奖获得者Elie Metchnikoff首次提出益生菌的概念。WHO对益生菌的定义是以适当剂量服用时，对宿主(人或动物)健康有益的活体微生物制剂。益生菌包括双歧杆菌族、乳酸杆菌族和链球菌族等。2001年，Henker等人首次报道了应用大肠杆菌(E.Coli，Nissle 1917)成功治疗口臭的病例，此外食窦魏斯氏菌(WeissellaCibaria)，体外实验发现能有效地抑制具核梭杆菌的增值和抑制VSCs产量，并且对于牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体、洛氏普雷沃菌也有部分的抑制作用。唾液链球菌(Streptococcus salivarius，S.salivarius)是在健康人群舌背细菌中数量最多的细菌，也是最早定植于口腔黏膜表面的细菌，S.salivarius K12是唾液链球菌的一个亚种，是Tagg等从健康儿童口腔中分离提取到的。近年国外将这种细菌作为益生菌直接用于口腔治疗链球菌性咽峡炎及口臭，取得了较满意疗效。研究人员提出S.salivarius K12可以作为口臭治疗中一种有效的辅助治疗手段，但是，需要长期阶段性地摄入含有S.salivariusK12的制剂才能起到抑制口腔产臭菌的作用。此外，唾液乳酸杆菌(LactobacillusSalivarius，L.Salivarius)属是目前最为广泛使用的益生菌发酵菌种，有研究指出，口服含有L.Salivarius WB21益生菌的制剂，可以明显改善吸烟者的牙周健康状况，同时减少牙周病患者口腔内龈上菌斑中的牙周致病菌，如牙龈卟啉单胞菌，中间普氏菌等，对于牙周健康有一定的益处，其抑菌作用与L.Salivarius产生过氧化氢、乳酸等细菌素抑制致病菌之间相互作用有关。Meurman提出乳杆菌还能刺激免疫细胞分泌炎症和抗炎细胞因子，调节粘膜免疫，来抑制口臭。

对益生菌的应用开拓了口腔医学的一个新领域，但是益生菌在口腔疾病干预中的作用研究刚开始，我们需要更了解口腔细菌微生物的种类和分布特征。

发明内容

基于上述目的，本发明首先提供了一种口腔益生菌菌株，所述菌株的保藏号为CGMCC NO.12899，保藏日期为2016年8月23日，保藏分类命名为唾液链球菌(StreptococcusSalivarius)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。

其次，本发明还提供了一种唾液链球菌(Streptococcus Salivarius)，所述菌株的16S rRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。

再次，本发明提供了上述的菌株在制备去除口臭药物中的应用。

又次，本发明提供了上述的菌株在制备食品和/或保健品中的应用。

最后，本发明提供了一种含有上述菌株的组合物。

在一个优选的技术方案中，所述组合物被制备为漱口液制剂雾化剂、胶囊或者含片。

本发明通过选取250例无口臭的儿童，从唾液取样，进行菌群的分离和鉴定以及分子遗传学分析。找出无口臭的儿童的优势菌群，分离国人口内能抑制口臭的天然存在的益生菌，体外验证其对口臭菌具有显著的抑制作用，能够弥补现有技术在口臭治疗上的不足，从而更好地解决口臭患者的需求。这为将来研发针对我国口臭患者的有效微生态制剂，去除口臭，构建有益的口腔微生态环境，具有广泛的应用前景和价值。

附图说明

图1.优势菌的16s rDNA的PCR产物电泳图谱；

图2.具核梭菌和优势唾液链球菌的共聚作用观察图；

图3.优势唾液链球菌抑制硫化氢产生的结果观察图；

图4.具核梭菌单独培养液硫化氢和甲硫醇HPLC检测图；

图5.优势唾液链球菌和具核梭菌共聚后硫化氢和甲硫醇HPLC检测图

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1菌株的筛选

实施目标：通过从250例无口臭儿童的唾液中分离口腔优势菌群，进行分解含硫化合物的检测，寻找可抑制口臭的天然细菌。

实施方案：

(1)采样：4-7岁，无口臭，无口腔疾病的正常儿童250例，无家族遗传疾病，无全身系统疾病，无长期服药史。在唾液采集前，均向学校及家长讲明实验目的及过程，并获得同意。儿童在早餐后2h内不能进食、喝饮料。用15ml无菌样品收集管，在不外界刺激唾液分泌的情况下，自然留取唾液约2ml，每个样品分三管，分别用于PCR鉴定，细菌培养及保存。

(2)分离培养：将所有样品进行分离培养，用PBS对样品稀释，均匀的涂布于脑心浸液BHI培养皿，置于37℃，5％CO₂培养箱进行培养。

(3)基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)鉴定：

样品处理方法：将基质溶于含有0.1％(V/V)甲酸和0.01mol L18-crown-6的1∶1∶1水、甲醇、乙腈溶液(基质溶剂)中，革兰氏阳性菌用CMBT基质，革兰氏阴性菌用CHCA基质。将基质溶液于混匀器上震荡混匀获得基质的饱和溶液。标准肽与CHCA饱和溶液等比例混合获得标准肽溶液。挑取细菌菌苔涂布于96孔样品板上，每一种细菌涂12孔，占样品板的一行。自然晾干1h后，用基质溶液覆盖菌苔，用标准肽溶液覆盖校准孔，每孔1μl。晾干5min后进样。

(4)16s RNA鉴定

1)DNA提取

采用QIAamp DNA mini kit提取细菌DNA，步骤严格按照说明书操作。

2)PCR扩增

扩增反应体系：扩增体积(50μL)：Premix EX TaqTM25μL，模板DNA 10μL，引物各1μL，ddH20 13μL。扩增条件：94℃10min；(94℃30s，58℃30s，72℃1.5min)×30循环；72℃10min；4℃保存。

引物序列：

D88:GAGAGTTTGATYMTGGCTCAG

E94:GAAGGAGGTGWTCCARCCGCA；

3)纯化PCR产物

取5μL PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳(120V，30min)，凝胶成像仪判定结果。取40μL PCR产物用QIAquick PCR purification kit纯化PCR产物。

4)测序及其结果分析

测序采用ABI 3730DNA测序仪，测序试剂为Bigdye terminator V3.1(上海生物工程技术服务有限公司完成测序)。采用DNASTARLasergeneV7.1进行序列拼接，将低质量测序序列切除，然后将拼接好的序列直接在NCBI的BLAST进行序列比对分析，核苷酸序列大于99％的相似度，被视为特异的细菌种类。

(5)具核梭菌培养

采用国际上通用的产生硫化氢复合物的口臭标准菌株F.nucleatum，购自美国菌种保藏中心(ATCC)，菌号ATCC 10953。具核梭菌采用BHI脑心浸液(Difco enriched withyeast extract 0.5％,haemin 5mg/mL,menadione 1mg/mL)，在厌氧培养箱(85％N2,10％H2,5％CO₂)，37℃培养。

(6)细菌共聚(Co-aggregation)实验

将分离到的优势菌与口臭标准菌株(F.nucleatum)培养，厌氧环境，37℃，24-72h，BHI培养基。采用Hardly的定量分光光度法，通过MalvernZetasizer Nano-ZS(Malvern,Worcestershire,UK)在液相表面检测布朗运动的细菌颗粒大小，检测细菌散射光，来检测共聚细菌直径大小。

具体流程如下：4000×g，15m离心细菌，收集共作用后的细胞，重悬于共作用的缓冲液(0.001M tris(hydroxymethyl)aminomethane调pH8.0，CaCl₂ 1×10^–4M，MgCl₂ 1×10^{– 4}M，NaN₃ 0.02％，和NaCl 0.15M，pH 6-7)，细菌浓度为109cells/mL，并与等量的具核梭菌混合，轻轻吹打10s，并在37℃，110×g孵育30分钟。之后，将反应物静置3分钟，采用分光光度计spectrophotometer(U2000,Hitachi,Nissei,Japan)检测，波长660nm。

(7)硫化铁沉淀法检测共培养物中，是否有硫化物气体产生

在上述步骤(6)细菌共聚实验后，弃掉共聚缓冲液，每管中加入2ml硫化铁检测缓冲液(成分：BHI培养基，0.1％半胱氨酸，0.2％硫酸亚铁，0.1M吗啉乙磺酸(2-morpholinoethanesulphonic acid))，将反应混合物转入5ml无菌密闭的硅胶盖的试管中，37℃，培养24h后，观察试管内颜色变化。

(8)气相色谱仪法检测硫化物的浓度

在5ml无菌试管中，将分离到的优势菌与口臭标准菌株(F.nucleatum)共培养，72h后，检测培养液上方的气体中硫化物的浓度。

1×10^-6(v/v)硫化物标准样品气，购自Praxair公司(USA)。试验过程中所使用的低浓度硫化物样品，均由在线稀释系统配制所得。

气相色谱仪(Agilent 7890A-5979C,Santa,Clara,USA)，色谱条件进样口：硫惰性化处理分流/不分流进样口(Sulfinert@)进样模式：不分流，静态进样与动态进样样品环体积：1mL炉温：30℃(1.5rain)，15℃/min，200℃(3min)色谱柱：HP-1，60mx0.53mm×5um。

(9)筛选出具有分解硫化氢能力的优势菌，进行全基因组测序

经过上述实验，得到一株分解硫化氢能力最强的唾液链球菌。对该菌株进行核酸提取和纯化，使用Wizaid全基因组DNA纯化试剂盒(Promega)，按照操作说明进行。

I细菌基因组DNA纯化

1)将1ml过夜菌培养物用加样枪小心加入1.5ml离心管中。

2)选择13,000～16,000×g离心2分钟，移弃上清，收集纯菌。

3)吸取50mM EDTA溶液480μl于离心管中，重悬菌液。

4)往重悬的菌液中加入200μl裂解酶溶液(浓度20mg/ml)，并小心地轻轻反复吸放混匀。此步骤能有效地削弱诺卡菌细胞壁，并达到细菌裂解的目的。

5)于37℃恒温水浴箱中孵育2小时。后13,000～16,000×g离心2分钟，吸弃上清。

6)小心吸取600μl核裂解液于离心管，缓缓吹打直至细胞重悬。

7)于80℃恒温水浴箱中孵育10分钟裂解细胞，自然冷却至室温。注：此步骤为最关键的一步，孵育过程中观察菌液裂解情况，酌情振荡混匀。

8)向细菌裂解混合物中加入3μlRNA酶溶液，轻轻颠倒离心管2～5次以混匀。

9)于37℃恒温水浴箱中孵育30～40分钟，自然冷却到室温。

10)加入蛋白沉淀液200μl于离心管中，使用涡旋振荡器剧烈振荡20秒钟，使溶液与细胞裂解物充分混匀。

11)将离心管置于冰上5分钟。

12)13,000～16,000×g离心3分钟。

13)小心吸取含DNA的上清于洁净的已装有600μl室温异丙醇的1.5ml离心管中。为避免DNA被蛋白污染，不要吸取得过于彻底，应保留少许上清。

14)缓缓颠倒离心管，混匀溶液，至白色线状物形成小块状沉淀，该沉淀为DNA沉淀。

15)13,000～16,000×g离心2分钟，若沉淀较少可适当延长离心时间。

16)将上清弃去，倒置离心管于一干净的吸水纸上。接着往离心管中加入室温70％乙醇600μl，轻柔地将颠倒离心管数次，以清洗DNA沉淀。

17)13,000～16,000×g离心2分钟，小心吸走乙醇溶液(若沉淀较少可延长离心时间)。

18)将离心管倒置于洁净的吸水纸上，自然干燥15分钟左右。

19)向离心管中加入100μl DNA水合溶液，在65℃水浴锅中孵育1小时以溶解DNA沉淀，期间可轻弹管壁混匀溶液。在4℃冰箱孵育过夜。

II DNA溶液检测

1)利用美国ND1000型紫外分光光度计，检测提取的DNA溶液进行浓度及纯度，分别测定在230nm，260nm，280nm处的紫外光吸收值。软件自动计算DNA溶液浓度，根据260/280和260/230的值评价DNA 样本的纯度。

2)取5μlDNA溶液和1μl Loading Buffer混匀，于150V的电压条件下在1％琼脂糖凝胶电泳30min，在读胶仪中观察条带位置。验证所提取基因组DNA的完整性。

优势唾液链球菌的技术效果：

(1)样品中细菌的分离，找出优势的唾液链球菌

经过MALDI-TOF MS鉴定，发现健康儿童唾液样品中的主要细菌有三种，包含：唾液链球菌(24.5％)，粘液罗氏菌(15.5％)和韦荣氏菌(11.0％)。此外，浅黄奈瑟菌和深黄奈瑟菌的比例均在10％以下。因此，可知，唾液链球菌在口腔健康儿童中是优势菌。

此外，通过16s rDNA测序法，提取优势菌的核酸，进行PCR扩增，测序，结果在Genebank中比对，结果显示16s rDNA的序列与唾液链球菌的吻合度达99％。进一步证实了口腔健康儿童的优势菌为唾液链球菌(图1)。图1中，M：2000bk的DNA marker；泳道1-6为优势菌的16srDNA扩增产物；泳道7为阴性对照。

(2)优势菌唾液链球菌和具核梭菌的共聚作用，及优势唾液链球菌分解硫化氢的能力检测。

I.共聚作用

在细菌共聚作用缓冲液的作用下，加入具核梭菌和优势唾液链球菌的试管出现了絮状沉淀，表示具核梭菌和优势唾液链球菌发生了相互作用。而单独的具核梭菌加入共聚作用缓冲液，没有出现絮状沉淀(图2)。图2中，A为具核梭菌和优势唾液链球菌，发生了共聚现象；B为具核梭菌，没有出现共聚。

II.硫化亚铁沉淀检测

通过与产生硫化氢的国际标准菌株具核梭菌相互作用，加入硫化亚铁沉淀检测试剂，反应24-72h，可以观察到只有具核梭菌的试管液体呈黑色的，表示有黑色硫化亚铁产生，即试管中的具核梭菌产生了硫化氢。而同时加入具核梭菌和优势唾液链球菌的试管中培养液颜色没有变为黑色，即试管中没有明显硫化氢，此外，空白对照的BHI细菌培养基的颜色正常。结果提示，单独的具核梭菌产生了硫化氢，而加入了优势的唾液链球菌和具核梭菌共同聚合作用后，没有产生明显的硫化氢(图3)。图3中，1只有具核梭菌的培养液，培养液呈现了黑色；2、3、4具核梭菌和优势唾液链球菌的共聚合作用后，培养液没有呈现黑色；5单独的细菌培养液BHI，培养液没有呈现黑色。

III具核梭菌和优势唾液链球菌培养液上方气体中硫化氢浓度检测

采用气相色谱法，将具核梭菌和优势唾液链球菌共同培养后的上方气体进行硫化氢和甲硫醇的含硫气体浓度检测。结果显示，单独的具核梭菌培养液上方气体有较高浓度的硫化氢和甲硫醇(图4)，而具核梭菌和优势唾液链球菌的共同培养物上方气体中，硫化氢和甲硫醇的含量明显降低(图5)。这些结果提示，优势的唾液链球菌具有分解具核梭菌产生的硫化氢和甲硫醇的能力。

(3)优势唾液链球菌的命名、保藏和全基因组测序

将得到的分解硫化氢和甲硫醇能力最强的唾液链球菌株，命名为ICDC1，并进行保藏，所述菌株的保藏号为CGMCC NO.12899，保藏日期为2016年8月23日，保藏分类命名为唾液链球菌(Streptococcus Salivarius)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：1001019。将该菌的全基因组DNA提取，并送北京诺禾致源科技股份有限公司测序，采用三代测序PacBioRISII平台技术。其16S rRNA的序列如SEQ ID NO：1所示

实施例2.菌株防治口臭的使用和效果

优势唾液链球菌对口臭标准菌株产生挥发性硫化物的分解能力检测：

通过对具核梭菌和优势唾液链球菌共同培养液上方气体中硫化氢和甲硫醇浓度的检测。采用气相色谱法，将具核梭菌和优势唾液链球菌共同培养后的上方气体进行硫化氢和甲硫醇的含硫气体浓度检测。结果显示，单独的具核梭菌培养液上方气体有较高浓度的硫化氢和甲硫醇(图4)，而具核梭菌和优势唾液链球菌的共同培养物上方气体中，硫化氢的浓度降低了64.6％，甲硫醇的浓度降低了71.9％％(图5)。

表1为具体检测数值

表1.含硫气体浓度的HPLC检测

这些结果提示，优势的唾液链球菌具有明显的分解具核梭菌产生的硫化氢和甲硫醇的能力。

实施例3优势唾液链球菌的菌粉及含菌粉制剂的制备

将优势唾液链球菌接种于脑心浸液BHI的液体培养基，置于37℃，5％CO₂培养箱进行培养12小时，收集细菌，离心、洗涤。采用10％的脱脂乳，1.5％的谷氨酸钠，3％的甘油配置成为冻干剂，将优势唾液链球菌进行真空冻干成为菌粉保存。

可以按照本领域的常规操作规程将优势唾液链球菌的菌粉配置成漱口液、雾化剂、胶囊或者含片等，这些制剂的配方中可以包括作为有效成分的菌粉、添加剂和用于此制剂形式的适宜的载体。例如在配制漱口液时，可以添加需要的木糖醇、甘油、香味剂、缓冲液、表面活性剂、着色剂等。制剂技术不是本发明的重点，可使用本领域常规技术，只要能保证优势唾液链球菌在制剂释放后具有分解具核梭菌产生的硫化氢和甲硫醇的能力即可。

序 列 表

<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120> 唾液链球菌CGMCC NO.12899及在制备去除口臭药物中的应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 923

<212> DNA

<213> Streptococcus salivarius

<400> 1

ttaggcggtg gctcaaaggt tacctcaccg acttcgggtg ttacaaactc tcgtggtgtg 60

acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg gcgtgctgat ccgcgattac 120

tagcgattcc gacttcatgt aggcgagttg cagcctacaa tccgaactga gattggcttt 180

aagagattag cttgccgtca ccgactcgca actcgttgta ccaaccattg tagcacgtgt 240

gtagcccagg tcataagggg catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttat 300

taccggcagt ctcgctagag tgcccaactg aatgatggca actaacaata ggggttgcgc 360

tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccacct 420

gtcaccgatg taccgaagta actttctatc tctagaaata gcatcgggat gtcaagacct 480

ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc 540

cgtcaattcc tttgagtttc aaccttgcgg tcgtactccc caggcggagt gcttaatgcg 600

ttagctgcgg cactgaatcc cggaaaggat ccaacaccta gcactcatcg tttacggcgt 660

ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct ccccacgctt tcgagcctca gcgtcagtta 720

cagaccagag agccgctttc gccaccggtg ttcctccata tatctacgca tttcaccgct 780

acacatggaa ttccactctc cccttctgca ctcaagtttg acagtttcca aagcgaacta 840

tggttgagcc acagccttta acttcagact tatcaaaccg cctgcgctcg ctttacgccc 900

aataaatccg gacaacgctc ggg 923

Claims (6)

1.一种口腔益生菌菌株，所述菌株的保藏号为CGMCC NO.12899，保藏日期为2016年8月23日，保藏分类命名为唾液链球菌，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.一种唾液链球菌，其特征在于，所述菌株的16S rRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求1或2所述的菌株在制备去除口臭药物中的应用。

4.根据权利要求1或2所述的菌株在制备食品和/或保健品中的应用。

5.一种含有权利要求1或2所述的菌株的组合物。

6.根据权利要求5所述的组合物，所述组合物被制备为漱口液制剂、雾化剂、胶囊或者含片。