CN117417847B - 一种大理梭菌及其在制备抗氧化功能性物质中的应用 - Google Patents

一种大理梭菌及其在制备抗氧化功能性物质中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大理梭菌及其在制备抗氧化功能性物质中的应用，属于微生物技术领域，所述大理梭菌(Clostridium dalinum)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.27789，保藏日期为2023年07月03日。基于本发明提供的一种大理梭菌(Clostridium dalinum)对开发功能保健制品、丰富发酵产品种类、建立乳酸菌菌种资源库具有重要的现实意义，同时也给抗人体氧化应激带来新的思路。

Description

一种大理梭菌及其在制备抗氧化功能性物质中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种大理梭菌及其在制备抗氧化功能性物质中的应用。
背景技术
人体细胞内会持续发生一系列的氧化还原反应，氧化应激是指人体氧化系统和抗氧化系统平衡失调，这一系列反应将产生自由基等有害物质，会损伤细胞的膜、蛋白质和核酸等生物分子，进而引起组织或细胞的功能紊乱和损伤。其特征主要是由三种产生氧自由基的方式，导致机体氧化应激态：一是线粒体进行代谢过程时电子泄露进而导致机体产生氧自由基，二是内质网代谢过程中的Fe2+离子的催化反应产生氧自由基，三是吞噬细胞吞噬病原微生物时呼吸爆发产生氧自由基。因此氧化应激是一个从外界到机体细胞，再从细胞到机体整体的系统性过程，而由氧化应激严重导致的氧化炎症会损伤和杀死细胞，这样的过程导致机体得病率上升，严重危害人类健康。近几年研究表明，氧化应激与氧化炎症是导致心脑血管疾病、肿瘤、慢性呼吸系统、神经系统疾病以及糖尿病等慢性疾病发生的最主要原因之一，因此通过对氧化应激防治有望成为预防与治疗这类慢性疾病的方法之一。
目前，对氧化应激的防治使用最多的方法便是摄入具有抗氧化效果的制剂，临床上常用的抗氧化剂有维生素C(Vit C,VC)、维生素E(Vit E,VE)等，VC与VE均有天然与人工合成产品，人工合成VC是抗氧化效果最好的制剂，但在长期的临床使用中发现，VC在治理氧化应激疾病时需要持续、大剂量摄入，此举可能引起血栓、结石、草酸盐肾病等，而长期大量使用VE可能引起癌症或肿瘤，甚至增加全因死亡率及出血性卒中的风险，因此在临床使用中，它们的抗氧化功能受限。由此可知，开发新的适合人体环境的天然抗氧化剂迫在眉睫。
大部分乳酸菌被认为是非致病性的、安全的微生物，其参与众多体内的代谢活动，具有重要的益生特性，如:缓解乳糖不耐症、降低胆固醇、改善免疫功能、抗氧化以及抑制某些病原体的粘附。能量摄入过剩会导致机体氧化应激，破坏肠道屏障改变肠道通透性，使得肠道细胞等受到氧化损伤，进而导致肠道损伤，甚至功能失调等。研究发现乳酸菌具有良好的抗氧化活性，能够修复各种因素对肠道造成的氧化应激损伤，提高宿主肠道的屏障功能。由于大众期望以更安全、更高效的角度减轻肠道损伤，乳酸菌作为食品安全级别的益生菌，其抗氧化的特性越来越受到关注。若在机体处于氧化应激状态时，服用含有抗氧化乳酸菌的食品，可对机体肠道进行较好的修复、保护作用；或作为膳食补充摄入体内，在肠道细胞受到氧化因子等攻击时抢先清除，可以抑制能量摄入过剩对机体的氧化损伤。因此，以乳酸菌作为抗氧化主力，制备具有抗氧化功能的发酵食品具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新的含有抗氧化功能的大理梭菌及其在益生制品中的应用。
本发明采用以下技术方案来实现：
本发明提供一种大理梭菌(Clostridium dalinum)，所述大理梭菌(Clostridiumdalinum)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.27789，保藏日期为2023年07月03日。
该大理梭菌(Clostridium dalinum)为革兰氏阳性菌，卵状，不能运动，在MRS肉汤琼脂培养基上单菌落为小型圆形，乳黄色，表面光滑，菌落中央突起；16s基因序列为SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列。
本发明提供一种上述大理梭菌在制备用于抗人体氧化应激的功能物质中的应用，所述功能物质包括但不限于食品、药品、保健品、动物饲料。
本发明提供一种用于抗氧化的酸乳，该酸乳中含有上述大理梭菌菌株或其菌液。
本发明自云南省大理白族自治州大理市大理镇苍山国家级自然保护区的自然土壤样本中分离得到的凝乳效果、抗氧化效果俱佳的梭菌新种，命名为大理梭菌。当菌液浓度OD值为0.60±0.02、接菌量为1％(v/v)时，在42℃培养4h即可凝乳。体外抗氧化应激方面，大理梭菌对50mg/L的DPPH自由基的体外清除率为85.67％(等体积作用)；ABTS自由基体外清除率为72.85％(等体积作用)；FRAP还原能力为2.73。这些结果表明，大理梭菌有着优良的体外生化抗氧化效果。因此，大理梭菌可用于制备具备抗氧化效果的功能性食品与发酵品。
本发明考察了大理梭菌发酵酸乳的体外生化抗氧化能力，以及对Caco-2细胞的抗氧化应激和抗氧化炎症能力的影响：(1)体外生化抗氧化表现方面：大理梭菌发酵的酸乳对50mg/L的DPPH的体外清除率为108.93％；ABTS体外清除率为94.64％；FRAP还原能力为3.67。(2)对Caco-2细胞抗氧化应激和抗氧化炎症能力影响的表现方面：①空白组的ROS含量为：
2.428±0.008IU/mL，病理组(t-BHP)为3.176±0.012IU/mL，VC组(1mg/mL)为：2.501±0.012IU/mL，原料组(1mg/mL)为：3.134±0.021IU/mL，大理梭菌发酵的酸乳(1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL)的含量分别为：2.579±0.015、2.510±0.022、2.433±0.084IU/mL；②空白组的8-OHdG含量为：1.507±0.006ng/L，病理组(t-BHP)为：2.090±0.009ng/L，VC组(1mg/mL)为：1.564±0.009ng/L，原料组(1mg/mL)为：2.037±0.029ng/L，大理梭菌发酵的酸乳(1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL)的含量分别为：1.756±0.022、1.621±0.019、1.510±0.066ng/L；③空白组的TNF-α含量为：120.200±3.795pg/L，病理组(t-BHP)为206.4±10.040pg/L，VC组(1mg/mL)为：142.300±5.920pg/L，原料组(1mg/mL)为：203.700±1.690pg/L，大理梭菌发酵的酸乳(1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL)的含量分别为：168.200±6.679、140.600±3.711、120.000±2.666pg/L；④空白组的IL-1β含量为：30.960±2.559pg/L，病理组(t-BHP)为64.560±1.663pg/L，VC组(1mg/mL)为：37.860±1.773pg/L，原料组(1mg/mL)为：63.190±0.649pg/L，大理梭菌发酵的酸乳(1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL)的含量分别为：45.760±4.300、38.860±3.541、30.530±4.140pg/L。这些结果表明，大理梭菌发酵的酸乳具有优良的体外生化抗氧化能力，可以显著提高Caco-2细胞的抗氧化应激和抗氧化炎症能力，可以与VC媲美；与原料组相比具有显著差异，说明是大理梭菌发酵酸乳中的抗氧化应激和抗氧化炎症能力主要来源是大理梭菌。
本发明还考察了大理梭菌发酵酸乳对秀丽隐杆线虫的抗氧化应激和抗氧化炎症能力的影响。对秀丽隐杆线虫细胞抗氧化应激和抗氧化炎症能力影响的表现方面：①空白组的ROS含量为：2.256±0.018IU/mL，病理组(t-BHP)为2.511±0.032IU/mL，VC组(1mg/mL)为：2.261±0.058IU/mL，原料组(1mg/mL)为：2.510±0.001IU/mL，大理梭菌发酵的酸乳(1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL)的含量分别为：2.388±0.024、2.322±0.014、2.220±0.033IU/mL；②空白组的8-OHdG含量为：1.370±0.015ng/L，病理组(t-BHP)为1.572±0.025ng/L，VC组(1mg/mL)为：1.374±0.046ng/L，原料组(1mg/mL)为：1.571±0.007ng/L，大理梭菌发酵的酸乳(1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL)的含量分别为：1.488±0.001、1.422±0.011、1.340±0.027ng/L；③空白组的TNF-α含量为：164.400±17.050pg/L，病理组(t-BHP)为245.800±30.930pg/L，VC组(1mg/mL)为：175.500±2.818pg/L，原料组(1mg/mL)为：239.700±4.083pg/L，大理梭菌发酵的酸乳(1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL)的含量分别为：194.600±3.582、175.100±3.125、168.400±5.627pg/L；④空白组的IL-1β含量为：28.400±5.789pg/L，病理组(t-BHP)为63.970±5.003pg/L，VC组(1mg/mL)为：35.350±2.509pg/L，原料组(1mg/mL)为：63.920±0.207pg/L，大理梭菌发酵的酸乳(1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL)的含量分别为：42.360±3.120、35.050±1.471、28.750±2.409pg/L。这些结果表明，大理梭菌发酵的酸乳具有优良的体外生化抗氧化能力，可以显著提高秀丽隐杆线虫细胞的抗氧化应激和抗氧化炎症能力，可以与VC媲美；与原料组相比具有显著差异，说明是大理梭菌发酵酸乳中的抗氧化应激和抗氧化炎症能力主要来源是大理梭菌。因此，此酸乳可作为具备抗氧化应激和抗氧化炎症的功能性发酵食品。
本发明的有益效果在于：本发明利用滇西北优质自然生物资源，从云南大理筛选出一株抗氧化效果好，凝乳状态极佳的乳酸菌菌株新种—大理梭菌，对开发功能食品、丰富发酵产品种类、建立乳酸菌菌种资源库具有重要的现实意义，同时也给抗氧化治疗带来了新的突破口。
附图说明
图1为所分离的大理梭菌在MRS培养基上的菌落形态及革兰氏染色结果。
图2为大理梭菌属系统发育树。
图3为大理梭菌对DPPH(A)、ABTS(B)的体外清除能力和FRAP(C)的体外还原能力。
图4为大理梭菌发酵的酸乳对DPPH(A)、ABTS(B)的体外清除能力和FRAP(C)的体外还原能力。
图5为大理梭菌发酵的酸乳对Caco-2细胞的抗氧化应激和抗氧化炎症能力的影响，测定的氧化应激指标：8-OHdG(A)、ROS(B)；氧化炎症指标：TNF-α(C)、IL-1β(D)。
图6为大理梭菌发酵的酸乳对秀丽隐杆线虫的抗氧化应激和抗氧化炎症能力的影响，测定的氧化应激指标：8-OHdG(A)、ROS(B)；氧化炎症指标：TNF-α(C)、IL-1β(D)。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明:
1、材料
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
大理梭菌(Clostridium dalinum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.27789，保藏日期为2023年07月03日。
2、抗氧化乳酸菌的筛选及其抗氧化性能研究
2.1乳酸菌的分离、纯化及鉴定
采集自大理苍山的土壤样本。
取土壤样本10g，加入225ml无菌生理盐水，120rpm震荡15min，静置5min后，吸取上清液200μL涂布于MRS(CaCO3)培养基平板中，37℃培养，挑取有透明圈生成的菌落，划线于MRS培养基平板中进行纯化，挑取划线出的菌落进行革兰氏染色，鉴定菌株是否成功纯化。纯化后的菌株按照“GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验”进行鉴定。其菌株菌落形态及革兰氏染色结果如图1所示。
2.2乳酸菌菌株分子生物学鉴定
采用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒(Rapid Bacterial Genomic DNA IsolationKit，上海生工生物股份有限公司)提取菌株的DNA。所得DNA送至上海生工生物股份有限公司进行DNA测序，采用16s RNA扩增，正向引物选择27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)，反向引物选择1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。
扩增产物测序后，通过NCBI数据库BLAST功能在线比对，利用MEGA7.0软件构建系统发育树。扩增产物序列如SEQ ID No.1所示。系统发育树显示该菌株与梭菌属相似度最高(图2)，因此将其归入梭菌属，命名为大理梭菌(Clostridium dalinum)。
2.3乳酸菌DPPH体外清除能力初筛
(1)将乳酸菌接至装有4mLMRS液体培养基的5mLEP管中，加入MRS液体培养基4mL；将EP管放到摇床中，25℃180rpm的震荡培养3天；
(2)3天后，将MRS液体培养基混匀后分离至1mL的EP管中，8000rpm/min离心20min；后将样品放置25℃，99％power的超声仪中超声60min；
(3)用移液枪吸取700μL样品上清液至1.5mL离心管中，然后再往其中加入等量的75mg/L的DPPH溶液混匀。
(4)同时做一管仅装有4mLMRS液体培养基的离心管，与上述操作同时进行；用移液枪吸取700μLMRS液体培养基，加入等量75mg/L的DPPH溶液混匀做对照。
(5)实验管与对照管放置37℃的恒温水浴锅种水浴30min后，取出对比实验管与对照管颜色差别，若实验管与对照管的颜色相比较越浅，则说明该菌株有抗氧化活性越强。结果发现，共有66株乳酸菌具有抗氧化活性。
2.4乳酸菌凝乳实验
选择2.3中有明显颜色变化的菌液，分别吸取100μL菌液，加入至装有10mL纯牛乳的试管中，置于42℃环境下，每1h观察牛奶凝结情况。结果发现，大理梭菌可在此条件下，于4h内凝乳。
2.5体外抗氧化能力测定
2.5.1菌液样品准备
将菌株接入MRS液体培养基中，37℃120rpm震荡培养24h，取出，将菌液倒入无菌的50mL离心管内，8000rpm离心10min，弃上清。加入无菌PBS洗涤，8000rpm离心10min，弃上清，重复洗涤3次。加入适当体积的PBS，调整菌液OD值为0.60±0.02，用作抗氧化活性测定用待测菌液及发酵酸乳制备用菌种。
2.5.2乳酸菌发酵酸乳制作
按照《微生物通用实验教程》略作改动，取纯牛乳1000mL，加入7％(w/v)白砂糖，接入1％体积2.5.1中的乳酸菌菌种，置于42℃环境下，发酵培养4h，后放入4℃冰箱48h，得到发酵酸乳。
2.5.3乳酸菌发酵酸乳样品准备
取2.5.2中后熟好的酸乳30mL于50mL离心管内，4℃下8000rpm离心10min，取上清作为乳清样品待测。
2.5.4细胞实验样品准备
(1)取2.5.2中后熟好的酸乳，经冷冻干燥后，使用DMEM培养基溶解，配制成1mg/mL、5mg/mL和10mg/mL的样液，过0.22μm的微孔滤膜后作为实验组备用。
(2)取含糖量为7％，经巴氏灭菌的纯牛乳，经冷冻干燥后，使用DMEM培养基溶解，配制成1mg/mL的样液，过0.22μm的微孔滤膜后作为原料组备用。
(3)使用DMEM培养基配制1mg/mL的VC溶液，0.22μm的微孔滤膜后作为VC对照组备用。
2.5.5DPPH清除能力测定
各2mL菌液和2mL乳清样品，分别与50mg/LDPPH工作液等体积混匀，37℃水浴避光反应30min，于517nm处测定吸光值。同时，再取2mL菌液和2mL乳清样品，分别与等体积的无水乙醇混合作为对照管，取2mL无水乙醇与等体积的DPPH工作液混合作为空白管。按照上述样品方法测定其DPPH自由基清除能力。实验重复测定6次。
DPPH自由基清除率计算：
DPPH自由基清除率＝{1-[(A1-A2)/A0]}×100％
式中：A1为样品管的吸光值；A2为对照管的吸光值；A0为空白管的吸光值。
2.5.6ABTS清除能力测定
各2mL菌液和2mL乳清样品，分别与ABTS工作液等体积混合，避光反应6min在734nm处测定吸光值。同时，再取2mL菌液和2mL乳清样品，分别与等体积的无水乙醇混合作为对照管，取2mL无水乙醇与等体积ABTS工作液混合作为空白管。按照上述样品方法测定其ABTS清除能力。实验重复测定6次。
式中：A1为样品管的吸光值；A2为对照管的吸光值；A0为空白管的吸光值。
ABTS清除率计算：
ABTS清除率＝{1-[(A1-A2)/A0]}×100％
式中：A1为样品管的吸光值；A2为对照管的吸光值；A0为空白管的吸光值。
2.5.7FRAP还原能力测定
实验组：分别加入100uL菌液和100uL乳清样品后，再各加入2.4mL的FRAP工作液，摇匀，37℃反应10min；
对照组：分别加入100uL菌液和100uL乳清样品后，再各加入2.4ml的无菌水，摇匀，37℃反应10min；
空白：根据标准曲线进行计算得到空白组；
标准曲线的绘制：以0.1-1.6mmol/L的FeSO4的标准液代替样品绘制标准曲线；
使用酶标仪在593nm处进行测定吸光值，每组6个平行。
图3为大理梭菌对50mg/L的DPPH(A)、ABTS(B)的体外清除能力和FRAP(C)的体外还原能力，经综合比较，大理梭菌凝乳效果最好。抗氧化表现方面，大理梭菌对DPPH自由基的体外清除率为85.67％；ABTS自由基的体外清除率为72.85％；FRAP还原能力为2.73。这些结果表明，大理梭菌有着优良的抗氧化效果。
图4为大理梭菌发酵的酸乳对DPPH(A)、ABTS(B)的体外清除能力和FRAP(C)的体外还原能力测试。结果为：以大理梭菌发酵所得酸乳对DPPH自由基的体外清除率为108.93％；ABTS自由基的体外清除率为94.64％；FRAP还原能力为3.67。这些结果表明，利用大理梭菌发酵制备的发酵酸乳具有优质的抗氧化效果。
2.5.8Caco-2细胞抗氧化能力测定
将Caco-2细胞浓度调整至5×105cell/mL，6孔板每孔接种2.0mL细胞悬液，放入培养箱中进行培养，每12h更换一次培养液。2d后，弃置细胞培养基，每孔加入1mLPBS进行清洗，重复2次。然后，用不同浓度(0.0mg/mL、1.0mg/mL、5.0mg/mL和10mg/mL)的酸乳样品、1mg/mL的原料组样品和1mg/mL的VitC对Caco-2细胞进行预保护12h，每组均设有6个实验孔。弃置保护液，每孔加入1mLPBS进行清洗，重复2次，用2mL含2mmoLt-BHP的DMEM培养基处理细胞，5h后，取300μL孔内溶液，置于1.5mL离心管中作为样品待测，密封并在-20℃下保存。使用试剂盒法在450nm处测定细胞氧化应激指标：ROS和8-OHdG(编号：No.202204和编号：02/2022，中国上海酶联生物技术有限公司)。使用试剂盒法在450nm处测定细胞的氧化炎症指标：TNF-α和IL-1β(编号：No.2391811208和编号：No.1141816208，武汉Boster生物工程有限公司)，按照试剂盒的使用说明操作测定。
测试结果如图5所示，①空白组的ROS含量为：2.428±0.008IU/mL，病理组(t-BHP)为3.176±0.012IU/mL，VC组(1mg/mL)为：2.501±0.012IU/mL，原料组(1mg/mL)为：3.134±0.021IU/mL，大理梭菌发酵的酸乳(1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL)的含量分别为：2.579±0.015、2.510±0.022、2.433±0.084IU/mL；②空白组的8-OHdG含量为：1.507±0.006ng/L，病理组(t-BHP)为：2.090±0.009ng/L，VC组(1mg/mL)为：1.564±0.009ng/L，原料组(1mg/mL)为：2.037±0.029ng/L，大理梭菌发酵的酸乳(1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL)的含量分别为：1.756±0.022、1.621±0.019、1.510±0.066ng/L；③空白组的TNF-α含量为：120.200±3.795pg/L，病理组(t-BHP)为206.4±10.040pg/L，VC组(1mg/mL)为：142.300±5.920pg/L，原料组(1mg/mL)为：203.700±1.690pg/L，大理梭菌发酵的酸乳(1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL)的含量分别为：168.200±6.679、140.600±3.711、120.000±2.666pg/L；④空白组的IL-1β含量为：30.960±2.559pg/L，病理组(t-BHP)为64.560±1.663pg/L，VC组(1mg/mL)为：37.860±1.773pg/L，原料组(1mg/mL)为：63.190±0.649pg/L，大理梭菌发酵的酸乳(1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL)的含量分别为：45.760±4.300、38.860±3.541、30.530±4.140pg/L。与对照组(CK)和病理组(t-BHP)相比，大理梭菌所制备的酸乳可以提高Caco-2细胞的抗氧化应激和抗氧化炎症的能力；与原料组(Milk)相比，发酵后的酸乳具有显著的抗氧化应激和抗氧化炎症效果，说明是大理梭菌的作用使纯牛乳具有了抗氧化应激和抗氧化炎症活性；与VC组相比，酸乳的抗氧化应激和抗氧化炎症能力可与VC媲美。说明大理梭菌发酵的酸乳可以作为一种特别优质的抗氧化剂。
2.6体内抗氧化能力测定
2.6.1线虫准备
选择N2野生型秀丽隐杆线虫，使用OP50尿嘧啶缺陷型大肠杆菌作为线虫的食物，线虫生长培养基(NGM)作为线虫的正常培养条件。除非特别说明，否则线虫均以20℃，涂布了OP50菌液的NGM培养基(OP50-NGM)作为培养条件。
2.6.2线虫同期化
用M9缓冲液冲洗处于产卵高峰期的线虫，1000r/min离心1min，弃上清，反复洗涤至上清液澄清，收集沉淀并加入1mL线虫裂解液，于漩涡混匀器剧烈震荡5min，6000r/min离心1min，弃上清液。用M9缓冲液反复冲洗沉淀5～6次至无次氯酸气味，弃上清液，收集底部虫卵备用。
2.6.3样液制备
(1)取2.7中后熟好的酸乳，经冷冻干燥后，使用M9缓冲液溶解，配制成2mg/mL、10mg/mL和20mg/mL的样液，过0.22μm的微孔滤膜后备用；
(2)取含糖量为7％，经巴氏灭菌的纯牛乳，经冷冻干燥后，使用M9缓冲液溶解，配制成2mg/mL的样液，过0.22μm的微孔滤膜后备用；
(3)使用M9缓冲液配制2mg/mL的VC溶液过，0.22μm的微孔滤膜后备用。
将上述制备好的溶液与1mg/mL的OP50菌液等比混匀，最终配置成1、5、10mg/mL的酸乳样液、1mg/mL的原料组样液和1mg/mL的VC样液。
2.6.4样品板的制备
取2.6.3中制备好的样液200μL涂布于90mm平板中，37℃放置4h作为样品板备用，每个样品设置6个平行。
取2.6.2中同期化后的虫卵，均匀加入上述样品板中，20℃恒温培养至L4期，获得同期化线虫。
2.6.5同期化线虫悬液制备
(1)用3ml灭菌后的M9缓冲液洗涤2.6.4中制备好的平板，将线虫洗脱至1.5ml的EP管内；
(2)1000r/min离心4min以沉淀线虫；
(3)弃上清，重复洗涤直至上清透明为止；
(4)加入M9缓冲液至1.5ml刻度线；
(5)将所有线虫混匀，使用线虫计数板对线虫悬液进行计数，调整悬液浓度至100μL含有100条线虫。
2.6.6秀丽隐杆线虫抗氧化能力测试
(1)吸取200μL的2.6.5制备好的线虫悬液，加入至6孔板内，补800μLM9缓冲液至1mL，向每个孔中加入1mL浓度为10mmol/L的t-BHP溶液，空白组加入1mL的M9缓冲液；
(2)20℃放置3h进行干扰；
(3)干扰结束后，将线虫吸至1.5ml的EP管内，每管1ml(共2管)，12000r/min，离心4min；
(4)弃上清900μL，将同一孔的样品合并成一管，体积为200μL；
(5)12000r/min，离心4min，弃上清100μL；
(6)每管加入0.10g石英砂，研磨5min，用100μLM9缓冲液清洗研磨棒(总体积为200μL)；
(7)研磨后的样品于-20℃下冷冻2.5h，取出28℃环境下融化0.5h。反复冻融3次；冻融结束后，再次研磨5min；
(8)12000r/min，离心4min以沉淀固体杂质；
(9)取上清300μL分别分装至新1.5ml EP管内(按照试剂盒要求样品体积)，-20℃保存，作为样品待测。
使用试剂盒法在450nm处测定细胞氧化应激指标：ROS和8-OHdG(编号：No.202204和编号：02/2022，中国上海酶联生物技术有限公司)。在450nm处测定细胞的氧化炎症指标：TNF-α和IL-1β(编号：No.2391811208和编号：No.1141816208，武汉Boster生物工程有限公司)，按照试剂盒的使用说明操作测定。
测试结果如图6所示，①空白组的ROS含量为：2.256±0.018IU/mL，病理组(t-BHP)为2.511±0.032IU/mL，VC组(1mg/mL)为：2.261±0.058IU/mL，原料组(1mg/mL)为：2.510±0.001IU/mL，大理梭菌发酵的酸乳(1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL)的含量分别为：2.388±0.024、2.322±0.014、2.220±0.033IU/mL；②空白组的8-OHdG含量为：1.370±0.015ng/L，病理组(t-BHP)为1.572±0.025ng/L，VC组(1mg/mL)为：1.374±0.046ng/L，原料组(1mg/mL)为：1.571±0.007ng/L，大理梭菌发酵的酸乳(1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL)的含量分别为：1.488±0.001、1.422±0.011、1.340±0.027ng/L；③空白组的TNF-α含量为：164.400±17.050pg/L，病理组(t-BHP)为245.800±30.930pg/L，VC组(1mg/mL)为：175.500±2.818pg/L，原料组(1mg/mL)为：239.700±4.083pg/L，大理梭菌发酵的酸乳(1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL)的含量分别为：194.600±3.582、175.100±3.125、168.400±5.627pg/L；④空白组的IL-1β含量为：28.400±5.789pg/L，病理组(t-BHP)为63.970±5.003pg/L，VC组(1mg/mL)为：35.350±2.509pg/L，原料组(1mg/mL)为：63.920±0.207pg/L，大理梭菌发酵的酸乳(1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL)的含量分别为：42.360±3.120、35.050±1.471、28.750±2.409pg/L。与对照组(CK)和病理组(t-BHP)相比，大理梭菌所制备的酸乳可以提高秀丽隐杆线虫的抗氧化应激和抗氧化炎症的能力；与原料组(Milk)相比，发酵后的酸乳具有显著的抗氧化应激和抗氧化炎症效果，说明是大理梭菌的作用使纯牛乳具有了抗氧化应激和抗氧化炎症活性；与VC组相比，酸乳的抗氧化应激和抗氧化炎症能力可与VC媲美。说明大理梭菌发酵的酸乳是一种特别优质的抗氧化剂。因此，此酸乳可作为具备抗氧化效果的功能性发酵食品、保健品、药品等，甚至可以应用于家禽家畜的饲料中。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (4)

1.一种大理梭菌（Clostridium dalinum），其特征在于，所述大理梭菌（Clostridium dalinum）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.27789，保藏日期为2023年07月03日。
2.一种如权利要求1所述的大理梭菌在制备抗氧化应激类功能物质中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述功能物质为食品、药品、保健品或动物饲料。
4.一种用于抗氧化的酸乳，其特征在于，该酸乳中含有如权利要求1所述的大理梭菌菌株或其菌液。
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