CN111787943A - 作为疫苗的来自产气荚膜梭菌的ε毒素 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检测、诊断、预防、治疗或改善有需要的人或动物受试者中的脱髓鞘病症的症状的方法和组合物，所述病症选自：肠毒血症(ET)、多发性硬化症(MS)、临床确诊MS(CDMS)、临床孤立综合征(CIS)、视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)、视神经炎(ON)、视神经脊髓炎(NMO)、脊髓炎、脊髓炎、横贯性脊髓炎(TM)、以水通道蛋白‑4(AQP‑4)的抗体增加或存在和/或星形胶质细胞损伤为特征的疾病或病症、以及急性播散性脑脊髓炎(ADEM)。所述方法包括向所述受试者施用一种包含有效量的剂的组合物，所述剂直接或间接干扰由产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)B型或D型菌株产生的ε毒素(Etx)、Etx结合受体或Etx与其结合受体的相互作用，从而抑制或阻遏Etx调节的受体信号传递活性。本发明还提供了可用作抗由产气荚膜梭菌的ε毒素导致的或与其相关的疾病的疫苗的新型多肽。

Description

作为疫苗的来自产气荚膜梭菌的ε毒素
技术领域
本发明涉及用于检测、诊断、预防、治疗或改善脱髓鞘病症的症状的方法和组合物。
背景技术
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是棒状、孢子形成、革兰氏阴性、厌氧菌，能够产生至少17种毒素，使产气荚膜梭菌成为梭菌属中致病性最强的菌种之一。根据其产生四种类型毒素(即α-毒素、β-毒素、ε-毒素和ι-毒素)的能力，产气荚膜梭菌菌株被分类为五种毒素类型(被称为类型A至E)之一(Petit et al.(1999)Trends Microbiol.vol.7，104-110)。
ε毒素(Etx)由毒素类型B和D产生。这些菌株是造成一种称为肠毒血症的严重疾病的原因，该疾病主要影响绵羊和羔羊，但也导致反刍动物种(包括山羊和小牛)的感染(Songer(1996)Clin.Microbiol.Rev.vol.9，216-234)。自然感染动物中的肠毒血症通常以绵羊的全身性病变和山羊的小肠结肠炎为特征。除了分类型的毒素之外，所述细菌还能够产生多种所谓的次要毒素，例如β1、β2、δ、θ、λ、μ、v和肠毒素(Rood(1998)Annu.Rev.Microbiol.vol.20 52，333-360)。
在绵羊和其他反刍动物中引发疾病的最重要因素是过量进食高卡路里的食物，导致肠中存在大量碳水化合物。这导致了肠道中微生物平衡的破坏，导致产气荚膜梭菌的增殖和随后的Etx的过量产生。所述毒素导致肠通透性增加，促进其进入血流并使其扩散至主要靶器官(肾脏和大脑)(McDonel(1980)Pharmacol Ther 10(3)：617-655)。在这里，由于血管通透性的增加，中毒会导致液体蓄积。在中枢神经系统中的蓄积导致神经障碍，迅速导致死亡(Finnie(2003Aust.Vet.J.vol.81，219-221)。最近，Etx被认为在人类多发性硬化症的发展中起作用(Rumah et al.(2013)PIoS One 8：e76359)。
多发性硬化症(MS)是一种大脑和脊髓中的神经细胞的绝缘层受损的脱髓鞘疾病。这种损伤破坏了部分神经系统的沟通能力，导致一系列症状，包括复视、单眼失明、肌肉无力、感觉障碍或协调障碍。这种病症在被证实为临床确诊MS(CDMS)之前，通常作为临床孤立综合征(CIS)开始一段时间。
视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)是一种罕见的神经病症，其特征在于视神经炎(ON)和横贯性脊髓炎(TM)的发作，伴有一种或多种其他诊断标准，包括在一些情况下存在特异性抗体(水通道蛋白-4(AQP-4))。
视神经炎(ON)是视神经的脱髓鞘炎症。其经常与多发性硬化症有关。自身免疫性疾病视神经脊髓炎(NMO)是由视神经(视神经炎)和脊髓(脊髓炎)的同时发炎和脱髓鞘组成的异质性病症。大约80％的被诊断为NMO的患者，水通道蛋白-4(AQP-4)抗体检测呈阳性(http://www.nmouk.nhs.uk/healthcare-professionals/aqp4-antibodies)。Zamvil等人(Neurotherapeutics(2018)15：92-101)推测肠道微生物群和可能产气荚膜梭菌本身，可能参与NMO发病机制。
横贯性脊髓炎(TM)是脊髓的一个节段两侧的炎症，并且也可导致髓磷脂损伤。
急性播散性脑脊髓炎(ADEM)的特征在于大脑和脊髓中的短暂但广泛的炎症发作，其损害髓磷脂。ADEM通常在病毒感染或细菌感染之后发生，或较少在麻疹、腮腺炎或风疹的疫苗接种之后发生。ADEM通常损伤白质，导致神经症状，例如单眼或双眼的视力丧失(由于视神经的炎症)。
Etx是被表达为具有指导原毒素(prototoxin)从细菌中输出的信号序列(McDonel(1986)in Pharmacology of bacterial toxins eds.Dorner&Drew，Pergamon Press，477-517)。在疾病的发展中，相对无活性的原毒素通过肠腔中的蛋白水解切割(通过宿主的消化蛋白酶(例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)(Bhown&Habeerb(1977)Biochem.Biophys.Res.Commun.vol.78，889-896)或通过产气荚膜梭菌λ-蛋白酶(Minami et al.(1997)Microbiol.Immun.vol.41，527-535))转化为活性毒素。Etx的蛋白水解激活也可以通过受控的蛋白水解在体外实现(Hunter et al.(1992)Infect.Immun.vol.60，102-110)。根据蛋白酶，蛋白水解切割会导致10-13个氨基末端氨基酸和22-29个羧基末端氨基酸的去除(Bhown&Habeerb(1977)；Minami et al.(1997)。当N-末端和C-末端都被切割时，发生最大化的激活(Worthington&Mulders(1977)Infect.Immun.vol.18，549-551)。
Etx的3D结构已经被确定(Cole et al.(2004)Nature 5Structural&MolecularBiology vol.11，797-798)并且揭示了一个主要由β-片层组成的分子，该分子可分为三个功能结构域。N-末端的结构域I包括提出的受体相互作用区域。中间的结构域II包括两亲性β-发夹结构，预计在膜插入中起作用。C-末端的结构域III包括C-末端肽，必须将其除去才能发生激活。
ε毒素是一种气单胞菌溶素样β-孔形成毒素(β-PFT)，其中两亲性β-发夹环插入膜中以形成β-桶状结构。Etx的整体折叠与来自革兰氏阴性嗜水气单胞菌的气单胞菌溶素(Aeromonas hydrophila)(Parler et al.(1994)Nature vol.367，292-295)、来自苏云金茅孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的伴孢晶体蛋白-2(parasporin-2(PS))(Akiba etal.(2009)J.Mol.Biol.vol.386，121-133)和来自硫黄菌(Laetiporus sulphurous)的成孔凝集素(LSL)(Mancheno et al.(2005)J.Biol.Chem.vol.280，17251-17259)的结构相似。这些毒素之间的结构相似性在其两个C-末端结构域中最为显著。其N-末端结构域显示出更大的结构变异，这可能是它们的靶细胞特异性和效力的差异的原因(Bokori-Brown et al.(2011)FEBS J.vol.278，45894601)。
在气单胞菌溶素中，两个氨基末端结构域(结构域I和结构域II)被认为在与具有重叠功能的细胞表面结合中起作用(MacKenzie et al.25(1999)J.Biol.Chem.vol，274，22604-22609)，并且提出Etx的结构域I(等同于气单胞菌溶素的结构域II)执行类似的功能(Cole et al.(2004))，但是这尚未得到证实。气单胞菌溶素的结构域II含有甘露糖6-磷酸结合环。然而，气单胞菌溶素中参与甘露糖-6-磷酸结合的结构域II的残基在Etx的结构域I中不保守，这表明这些毒素的N-末端受体结合结构域中的结构变化可能是它们的靶细胞特异性之间差异的原因。
Etx在β-PFT中是独特的，因为其效力强并具有很高的细胞特异性。由于其强效力，Etx被美国政府疾病控制与预防中心认为是国际恐怖主义的潜在生物武器(Morbidity andMortality Weekly Report(MMWR)Recommendations and Reports 2000)vol.49，1-14)。静脉内注射后Etx在小鼠中的50％致死剂量(LD50)通常为100ng/kg(Gill(1982)Microbiol.Rev.vol.46，86-94)，使Etx成为继肉毒神经毒素之后最有效力的梭菌毒素。Etx还显示出高细胞特异性。在测试的许多细胞系中，只有四个细胞系被认定对该毒素敏感。这些细胞系包括犬(MDCK(Knight et al.(1990)Biologicals vol.18，263-270))、小鼠(mpkCCDcl4(Chassin et al.(2007)Am.J.Physiol.Renal Physiol.vol.293，F927-937))和人类(G-402(Shortt et al.(2000)Hum.Exp.Toxicol.vol.19，108-116)以及ACHN(Ivieet al.(2011)PloS ONE vol.6，e17787)来源的肾细胞系。大多数关于Etx的体外研究都是使用Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞系进行的，因为该细胞系对所述毒素最敏感(Payne etal.(1994)FEMS Microbiol.Lett.vol.116，161-167)。据报道，Etx杀死50％的MDCK细胞的剂量(CT50)低至15ng/ml。
Etx与MDCK细胞的结合与稳定的高分子量复合物的形成有关(Petit et al.(1997)J.Bacteriol.vol.179，6480-6487)。中毒的细胞在细胞死亡之前经历形态变化，包括肿胀和质膜出泡(Petit et al.(1997)J.Bacteriol.vol.179，6480-6487)。快速的毒素诱导的细胞死亡和ε毒素仅对一些细胞系的特异性表明靶细胞上存在特异性受体。Etx通过与宿主细胞结合而起作用，并且有证据表明该蛋白质的七个单体组装成跨细胞膜的孔(Miyata et al.(2002)J Biol Chem.277：39463-8.)，导致不受调节的离子跨膜运动和细胞死亡。毒性似乎是在靶细胞膜中形成孔的结果(Petit et al.(2001)J.Biol.Chem.25vol.276，15736-15740)。
所述毒素的细胞表面受体的身份仍然没有完全阐明。有证据表明该毒素与MDCK.2细胞上的甲型肝炎病毒细胞受体1蛋白(HAVCR1)结合(Ivie et al.(2011)PLoS One 6：e17787)。最近，已有证据表明所述受体是髓磷脂和淋巴细胞蛋白(MAL)(Rumah et al.(2015)PLoS Pathog.11：e1004896)。通常对该毒素具有高度抗性的CHO细胞在表达MAL时变得敏感，并且据报道MAL敲除小鼠对该毒素具有高度抗性(Rumah et al.(2015))。
许多商用疫苗可用于预防肠毒血症。这些疫苗通常由用甲醛处理产气荚膜梭菌培养滤液导致Etx解毒来生产。这些疫苗除了Etx外还含有许多种蛋白质，并且这些制剂的免疫原性可能存在相当大的批次间变异。已有报道，接种疫苗后的炎症反应导致饲料消耗减少。这些不足促使进行设计改进的疫苗的工作，并且已报道了许多重组免疫原，包括由大肠杆菌产生的经甲醛处理的Etx(Lobato et al.(2010)Vaccine 28：6125-7)和毒性降低的Etx的定点突变体(遗传类毒素)(Kang et al.(2017)Human vaccines&immunotherapeutics 13：1598-608)。定点突变体克服了与疫苗生产的化学解毒方法相关的免疫原性的批次间变异的问题。然而，所述毒素的高效力可能使其难以消除毒性。所述突变体的毒性已使用MDCK细胞培养物(Ivie and McClain(2012)Biochemistry 51：7588-95；Kang et al.(2017))或在小鼠中被评估。
据报道，与野生型毒素相比，Etx的定点突变体(Y30A-Y196A)对MDCK.2细胞的细胞毒性降低了430倍以上，并且在小鼠中显示出降低的但未消除的毒性(Bokori-Brown etal.，(2014)Vaccine vol.32，2682-2687)。
仍然需要鉴定具有潜力用作针对由Etx的存在导致的或与之相关的疾病和/或由产气荚膜梭菌感染导致的疾病的疫苗的改进分子。
具体实施方式
本发明涉及用于检测、诊断、预防、治疗或改善有需要的人或动物受试者中的脱髓鞘病症的症状的方法和组合物，所述病症选自：肠毒血症(ET)、多发性硬化症(MS)、临床确诊MS(CDMS)、临床孤立综合征(CIS)、视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)、视神经炎(ON)、视神经脊髓炎(NMO)、脊髓炎、横贯性脊髓炎(TM)、以水通道蛋白-4(AQP-4)的抗体增加或存在和/或星形胶质细胞损伤为特征的疾病或病症、以及急性播散性脑脊髓炎(ADEM)。所述方法包括向所述受试者施用一种包含有效量的剂的组合物，所述剂直接或间接干扰由产气荚膜梭菌B型或D型菌株产生的ε毒素(Etx)、Etx结合受体或Etx与其结合受体的相互作用，从而抑制或阻遏Etx调节的受体信号传递活性。本发明涉及用作疫苗的新型多肽，所述疫苗对抗由产气荚膜梭菌的ε毒素导致的或与之相关的疾病，特别是在易患肠毒血症的动物中和在治疗脱髓鞘病症中。
本发明人发现患有脱髓鞘病症(例如肠毒血症(ET)、视神经脊髓炎(NMO)和横贯性脊髓炎(TM)，后两者是视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)的实例)的受试者，由产气荚膜梭菌B型或D型菌株产生的ε毒素(Etx)的存在测试为阳性和/或抗水通道蛋白-4(AQP4)的抗体的存在测试为阳性。
脱髓鞘病症的特征在于髓鞘损伤，并且包括选自以下的病症：肠毒血症(ET)、多发性硬化症(MS)、临床确诊MS(CDMS)、临床孤立综合征(CIS)、视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)、视神经炎(ON)、视神经脊髓炎(NMO)、脊髓炎、横贯性脊髓炎(TM)、以水通道蛋白-4(AQP4)的抗体增加或存在和/或星形胶质细胞损伤为特征的疾病或病症、以及急性播散性脑脊髓炎(ADEM)。
根据本发明的第一方面，提供了预防、治疗或改善有需要的人或动物受试者中的脱髓鞘病症的症状的方法，所述病症选自：肠毒血症(ET)、多发性硬化症(MS)、临床确诊MS(CDMS)、临床孤立综合征(CIS)、视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)、视神经炎(ON)、视神经脊髓炎(NMO)、脊髓炎、横贯性脊髓炎(TM)、以水通道蛋白-4(AQP-4)的抗体增加或存在和/或星形胶质细胞损伤为特征的疾病或病症、以及急性播散性脑脊髓炎(ADEM)。所述方法包括向所述受试者施用一种包含有效量的剂的组合物，所述剂直接或间接干扰由产气荚膜梭菌B型或D型菌株产生的ε毒素(Etx)、Etx结合受体或Etx与其结合受体的相互作用，从而抑制或阻遏Etx调节的受体信号传递活性。
根据本发明的第二方面，所述组合物包含直接或间接干扰由产气荚膜梭菌B型或D型菌株产生的ε毒素(ETX)、ETX-结合受体或ETX与其结合受体的相互作用，从而抑制或阻遏Etx调节的受体信号传递活性的剂，所述剂是产气荚膜梭菌ε毒素(Etx)多肽，其对表达髓磷脂和淋巴细胞(MAL)蛋白的细胞具有降低的毒性并且包含与具有序列SEQ ID NO：65的野生型Etx多肽相比经修饰的结构域III，其中所述降低的毒性是相对于SEQ ID NO：65和/或SEQID NO：14的，并且其中所述Etx多肽能够与至少一种结合SEQ ID NO：65和/或SEQ ID NO：14所表示序列的抗体相结合。
替换与结合SEQ ID NO：13和/或SEQ ID NO：14的抗体相结合的能力，或者在与结合SEQ ID NO：13和/或SEQ ID NO：14的抗体相结合的能力的基础上，所述多肽可以与至少一种结合SEQ ID NO：11(未激活的原毒素(prototoxin)形式的ε毒素)的抗体相结合。
经修饰的结构域III可以是在结构域III的聚糖(β-辛基-葡萄糖苷)结合位点中和/或在结构域III的糖结合能力中的任何修饰，和/或对结构域III的修饰，使Etx多肽与被激活时的相应野生型序列相比，与表达MAL的CHO细胞结合的能力降低。
经修饰的结构域III可以在构成结构域III的氨基酸序列(SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3)中包括一个或多个氨基酸突变：VYVGKALLTNDTQQEQKLKSQSFTCK(SEQID NO：1)，THNVPSQDILVPANTTVEVIAYLK(SEQ ID NO：2)；以及DELIVKVRNLNTNNVQEYVIPVDKKEKSNDSNIVKYRSLyIKAPGIK(SEQ ID NO：3)，所述突变是在结构域III(SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个或基本上所有氨基酸残基的替换或缺失。当在结构域III中存在多于一个突变时，所述突变可以任选地是替换和缺失的组合。
经修饰的结构域III可以包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的一个或多个以下突变：
Figure BDA0002655236720000071
(SEQ ID NO：1)，其中带下划线和粗体的V和F可以替换为任何其他氨基酸，或可以缺失。例如，V可以替换为F(V[F])和/或F可以替换为A(F[A])；
Figure BDA0002655236720000072
(SEQ ID NO：2)，其中带下划线和粗体的H、V和A可以替换为任何其他氨基酸，或可以缺失。例如，H可以替换为A(H[A])，V可以替换为A(V[A])和/或A可以替换为F(A[F])。
本发明的多肽可以包括在如下表1中所示的位置处的突变，该表给出了结构域III中合适的突变的实例(SEQ ID NO：6至SEQ ID NO：10)。SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5中所示的突变是结构域I突变。因此，本发明的Etx多肽可以包括一个或多个代表结构域III中的突变的下列序列：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；或包含在SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2中的一个或多个突变。
表1：包含在SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：10中的突变
Figure BDA0002655236720000081
Figure BDA0002655236720000091
包含在SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：10的任何一个或多个中的突变可包含在来自SEQ ID NO：13的一段至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、255、260、261、262、263个连续氨基酸中，其包括SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：10中的一个或多个。
本发明不必限于表1的特定突变，影响结构域III的糖结合能力的任何一个或者多个突变和/或使Etx多肽与表达MAL的(CHO)细胞结合的能力降低的一个或者多个突变同等地构成本发明的一部分。本领域技术人员可以使用已知的工具和常规技术(例如本文所述的那些)容易地确定合适的突变。
如下表2所示，SEQ ID NO：11是全长野生型产气荚膜梭菌ε毒素并且SEQ ID NO：12是相同的序列，但缺少前32个氨基酸。所述序列(SEQ ID NO：12)是为晶体结构所公布的序列(参见结构生物信息学联合研究所(RCSB)数据库，wwww.rcsb.org/PDB；PDB ID：1UYJ)。
SEQ ID NO：65是胰蛋白酶激活的野生型产气荚膜梭菌ε毒素，其是在胰蛋白酶切割后保留的部分，其中N-末端和C-末端被去除。当如下所述确定时，SEQ ID NO：11和SEQ IDNO：65在全局比对水平上具有79％的一致性。
SEQ ID NO：13是包含SEQ ID NO：65和在N-末端的两个另外的氨基酸残基的重组毒素。SEQ ID NO：14是等同于SEQ ID NO：13的序列，但在SEQ ID NO：13的151位具有H＞A突变(在以下实例中作为H149A突变提及，残基编号的差异解释如下)。这是激活的毒素的变体，其可以在ACGM 2级实验室中研究(Oyston et al.(1998)Microbiol.vol.144(Pt 2)，333-341)并且因此可能实际更方便确定抗体结合。包含本文所述的H149A突变将加倍确保根据本发明的多肽可在ACGM 2级使用。
表2：序列的身份信息
SEQ ID NO 序列的身份信息
11 全长野生型天然ε毒素
12 用于获得晶体结构的序列(PDB ID：1YUJ)
13 胰蛋白酶激活的重组ε毒素
14 具有H149A突变的胰蛋白酶激活的重组ε毒素
15 重组ε毒素序列
65 胰蛋白酶激活的野生型ε毒素
本文引用的表1中所提到的下列突变位置即30、196、72、92、149、166和168的指代是从SEQ ID NO：65的位置1起计数的。在SEQ ID NO：11中可以发现相同的残基位置(从残基46开始计数，即SEQ ID NO：65缺少SEQ ID NO：11的残基1-32(信号序列)和残基33-45(N-末端前肽))。在SEQ ID NO：12中可发现相同的残基位置(从残基14开始计数，即SEQ ID NO：65缺少SEQ ID NO：12的残基1-13(N-末端前肽))。在SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14中可发现相同的残基位置(从残基3开始计数，即SEQ ID NO：65缺少SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的残基1-2(合成信号序列的一部分))。在SEQ ID NO：15中可以发现相同的残基位置(从残基25开始计数，即SEQ ID NO：65缺少SEQ ID NO：15的残基1-24(合成信号序列))。本领域技术人员将能够容易地确定在任何给定的Etx多肽中的相当于位置30、196、72、92、149、166和168处的突变。
所提到的“Y30A-Y196A”和“Y43A-Y209A”双突变体在本文中可互换使用，指Etx野生型序列(由SEQ ID NO：65表示)中的相同突变位置，位置编号取决于该位置是在激活的毒素内还是在其无活性前体内。当双突变体被称为Y30A-Y196A时，位置30和196是从激活蛋白质的起始处(SEQ ID NO：65所示序列的1位)计数的，当双突变体被称为Y43A-Y209A时，等同的位置43和209是从无活性前体的起始处(即从图2所示序列的-13位开始或从SEQ ID NO：12的1位开始)计数的。V72F、F92A、H149A、V166A、A168F突变的位置如在SEQ ID NO：65中发现的。
在一项先前的研究(WO2013/144636)中，证明Y30A-Y196双突变体(位于结构域I)显著降低了毒素结合MDCK细胞并杀死MDCK细胞的能力，并且在小鼠中具有降低的毒性，表明Y30A-Y196A突变体能够构成抗肠毒血症的改进的重组疫苗的基础。
然而，先前研究使用MDCK细胞系来测量细胞毒性。令人惊奇的是，双突变体在表达MAL的CHO细胞中没有产生相同的毒性降低的结果。现在令人惊讶地发现，修饰Etx多肽的结构域III(例如通过将一个或多个突变引入结构域III)降低了在表达MAL的CHO细胞中的毒性。对结构域III的修饰可以是例如本文所述的任何修饰。
因此，如WO2013/144636中所述，对结构域III的修饰改进了已知的候选疫苗Y30A-Y196。关于Etx的大多数体外研究都是使用MDCK细胞系进行的，因为该细胞系被认为是对毒素最敏感的(Payne et al.(1994)FEMS Microbiol.Lett.vol.116，161-167)。考虑到Etx候选疫苗可能还没有在表达MAL的(CHO)细胞上进行测试，本发明提供了通过如本文所述修饰结构域III来改进现有Etx疫苗和Etx候选疫苗的机会。
根据本发明的多肽可以包含与野生型多肽SEQ ID NO：65相比经修饰的结构域III，根据本发明的多肽与包含SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的Etx多肽相比或与包含SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的Etx多肽相比显示出降低的毒性。在本文中，所述“Etx多肽”可以是在全局水平上与SEQ ID NO：65具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％序列同一性的多肽，所述多肽能够与至少一种能结合SEQ ID NO：65的抗体相结合。
SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5存在于Y30A-Y196A双突变体中，但结构域I中其他酪氨酸残基的突变也显示出能有效降低对MDCK细胞的毒性。例如，一个或者多个突变的酪氨酸残基可以是例如Y29、Y33、Y42、Y43、Y49和/或Y209中的一个或多个的突变(替换或缺失)，这里的残基编号从无活性前体的起始处(即，从图2所示序列的-13位开始或从SEQ ID NO：12的1位开始)开始计数。一个或者多个酪氨酸突变可包含在来自SEQ ID NO：65的一段至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、255、256、257、258、259或260个连续的氨基酸中。
根据本发明，还提供了一种Etx多肽，其与野生型多肽SEQ ID NO：65相比具有修饰的结构域III并且与其他Etx疫苗多肽和用作候选疫苗的多肽相比显示出降低的毒性。例如，以下出版物公开了对MCDK细胞显示出毒性降低并且可通过修饰结构域III而进一步改进的多肽：Kang J et al.(2017)Hum Vaccin Immunother 13：1598-1608描述了一种提出的在结构域1中具有突变(F199)的疫苗；Yao et al.(2016)Sci Rep.6：24162描述了结构域1中的Y196突变；Li et al.(2013)Hum Vaccin 25Immunother 9：2386-92描述了F199E和H106P突变体(F199在结构域1中，H106在结构域2中)；Oyston et al.(1998)Microbiology144：333-41描述了H106P突变体并且还提及了H149P突变体是无毒的(H106在结构域2中)；Dorca-Aré valo et al.(2014)PLoS One 9：e102417描述了V56C/F118C和H106P突变对MDCK细胞是无毒的(V56在结构域2中和F118在结构域2中)。
还令人惊奇地发现，Y30A-Y196双突变体根据MAL来源的物种而显示出不同的毒性结果。例如，与野生型Etx相比，双突变体对表达绵羊MAL的CHO细胞的毒性仅略低，但对表达人MAL的CHO细胞的毒性更高。然而，在表达犬MAL的CHO细胞中，所述突变体的毒性明显更低。这一发现表明，来自不同物种的MAL与Etx的相互作用不同，表明MDCK细胞可能不是测试Etx候选疫苗毒性的良好模型，而表达MAL的CHO细胞可能是该测试的更好模型。因此，根据本发明的另一方面，提供了表达MAL的(CHO)细胞作为模型在测试ε候选疫苗的毒性中的用途。
下面的表3显示了引入Y30A-Y196A双突变体的结构域III的突变的实例。
表3：Y30A-Y196A的进一步突变
Figure BDA0002655236720000131
Figure BDA0002655236720000141
Figure BDA0002655236720000151
因此，本文所述的新序列(表3中的SEQ ID NO：18至SEQ ID NO：50)是适合用于纳入下一代肠毒素血症或脱髓鞘疾病疫苗以及对抗患上由产气荚膜梭菌和/或Etx导致的或与之相关的疾病的疫苗中的遗传类毒素。特别地，SEQ ID NO：21是合适的。
表3中所示的突变被描述为包含在胰蛋白酶激活的重组Etx(SEQ ID NO：13或SEQID NO：65)中，但是相同的突变也可包含在全长Etx多肽(SEQ ID NO：11)中的等同位置或全长重组Etx多肽(SEQ ID NO：15)中的等同位置；或表3中所示的突变可包含在与SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：65具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列中的等同位置。
本文所述的任何突变可包含在与SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：65具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列中。
SEQ ID NO：18至SEQ ID NO：50的多肽可具有与SEQ ID NO：14或缺少前2个N-末端氨基酸残基的SEQ ID NO：14相同或相似或降低的毒性，和/或可以是无毒的。
根据本发明的多肽可以包括来自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：65中任何一个的至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310或315个连续氨基酸的序列，并且在等同于SEQ ID NO：65的位置30-196的位置处包含一个双突变，并且另外在等同于位置72、92、149、166和168的位置处包含至少一个、两个或更多个突变。突变位置的编号如本文所述。所述突变可以包括替换或缺失。
根据本发明的多肽可以包括来自表3的SEQ ID NO：18至SEQ ID NO：50中任何一个的至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、261、262或263个连续氨基酸的序列，并且包含表3中表示为相关SEQ ID NO的突变或由其组成。
使根据本发明的多肽中包含氨基酸序列SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：10之一，导致所述多肽中包含的序列，除了包含SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：10之一中作为“X”的突变的位置之外，与来自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：65中任何一个的等同(即对应)序列相同。
根据本发明的多肽可与表3中SEQ ID NO：18至SEQ ID NO：50中任何一个具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且包含针对相关SEQ ID NO指出的突变或由其组成。
毒性水平可以如本文所述在体外或体内进行测定。例如，通过使用基于细胞的检测，如基于MDCK.2细胞的LDH检测、ACHN细胞、使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如，表达绿色荧光蛋白(GFP)、人MAL(CHO-hMAL)、绵羊MAL(CHO-sMAL)、犬MAL(CHO-dMAL)等的CHO细胞)。毒性研究也可以在体内进行，例如，在小鼠或任何其他合适的动物中进行。
当施用于受试者例如人类或非人类动物(例如羔羊、绵羊、山羊、猪、牛、马或兔)时，本发明的多肽为受试者提供保护，以免患上由产气荚膜梭菌感染导致的和/或由活性ε毒素的存在导致的(或与产气荚膜梭菌或所述毒素的存在相关的)疾病(如肠毒血症)和/或出现与脱髓鞘相关的病症。这种保护可以是部分的，由此降低群体中发病个体受试者的概率，这种保护也可以是完全的，由此受试者将不会发病(即，由产气荚膜梭菌和/或Etx导致的、或与之相关的患病的概率为0％)。
本说明书通篇所用的术语″受试者″，就本发明的任何方面而言，表示任何人或动物个体，包括(但不限于)猫、犬或马、或反刍动物、牛、绵羊、山羊或猪。所述人或动物可以是表现出脱髓鞘疾病症状的人或动物，所述脱髓鞘疾病例如肠毒血症(ET)、多发性硬化症(MS)、临床确诊MS(CDMS)、临床孤立综合征(CIS)、视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)、视神经炎(ON)、视神经脊髓炎(NMO)、脊髓炎、横贯性脊髓炎(TM)、以水通道蛋白-4(AQP-4)的抗体增加或存在和/或星形胶质细胞损伤为特征的疾病或病症、以及急性播散性脑脊髓炎(ADEM)。
如下文进一步概述的，可以使用Needleman-Wunsch全局序列比对工具确定序列同一性，该工具可从美国马里兰州贝塞斯达的国家生物技术信息中心(NCBI)获得，例如通过http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，使用缺省参数设置。当将序列同一性水平与(例如)SEQ ID NO：65比较时，通常应该相对于SEQ ID NO：65的全长进行，以避免高同一性重叠的短区域，从而导致高的整体评估的同一性(即，使用全局比对方法)。例如，一个具有例如五个氨基酸的短多肽片段可能与整个SEQ ID NO：65中的五个氨基酸区域具有100％的同一性序列，但这不能提供100％的氨基酸同一性，除非该片段形成更长序列的一部分，该序列在与SEQID NO：65中的位置等同的其他位置也具有相同的氨基酸。例如，SEQ ID NO：11在全局水平上与SEQ ID NO：65为79％相同；SEQ ID NO：11的位置46-305与SEQ ID NO：65的位置1-260100％相同，SEQ ID NO：65中不存在SEQ ID NO：11的位置1-45和位置306-328。SEQ ID NO：65是等同于(或对应于)SEQ ID NO：11的位置46-305的序列，并且SEQ ID NO：11的位置46-305等同于(或对应于)SEQ ID NO：65。
因此，技术人员能够容易地通过比对序列以在尽可能多的位置处实现氨基酸相同的最大化来确定两个序列之间的等同位置，例如通过使用全局序列比对程序，如可通过http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi获得的，将在下文进一步讨论。
本发明还涵盖了包括所述多肽变体的多肽以及使用这些变体多肽的方法。本文所用的“变体”是指其氨基酸序列与其来源的基础序列不同，该序列中的一个或多个氨基酸被其他氨基酸所替换的多肽。所述变体是功能变体，因为该变体所来源的多肽的功能特征得以保持。例如，变体多肽可以具有与能够结合非变体多肽的抗体相结合的类似能力(例如，作为非限制性实例，表3中SEQ ID NO：18至SEQ ID NO：50中的任何一个)。特别地，任何氨基酸替换、添加或缺失不必改变或不必显著改变包含在变体所来源的多肽内的一个或多个表位的三级结构，以使变体多肽保留与结合SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：14的抗体相结合的能力。技术人员能够容易地确定合适的功能变体，并确定表位的三级结构及其任何改变，无需付出创造性劳动。
在一个氨基酸被一个具有大致相似性质的不同氨基酸替换的情况下，氨基酸替换可以被认为是“保守的”。非保守替换是其中将氨基酸替换为不同类型的氨基酸。
“保守替换”是指氨基酸被相同分类的另一氨基酸替换，其中所述分类定义如下：
分类 氨基酸的实例
非极性： Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp
不带电荷的极性：Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln
酸性： Asp、Glu
碱性： Lys、Arg、His。
如本领域技术人员所公知的，通过保守替换改变多肽的一级结构可能不会显著改变该多肽的活性，因为插入序列中的氨基酸侧链可能能够形成如被替换的氨基酸侧链相似的键和接触。即使当所述替换位于决定多肽构象的关键区域时也是如此。
如上所述，非保守替换是可能的，只要这些替换不破坏多肽内表位的三级结构，例如，不破坏多肽的免疫原性(例如，抗原性)。
广义地说，在不改变多肽的生物活性的情况下，较少的非保守替换是可能的。如上所述，适合地，变体可以与基础序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同。
如已经简要提及的，氨基酸序列之间的序列同一性可以通过比较序列的比对来确定。当被比较序列中的等同位置被相同氨基酸占据时，则分子在该位置是相同的。将比对评分为同一性百分比是比较序列共有的位置处的相同氨基酸的数目的函数。当比较序列时，最佳比对可能需要将空位引入一个或多个序列中，以考虑序列中可能的插入和缺失。序列比较方法可以采用空位罚分，使得对于被比较序列中相同数目的相同分子，具有尽可能少的空位的序列比对(反映两个被比较序列之间的更高相关性)获得比具有许多空位的序列比对更高的得分。最大百分比同一性的计算涉及考虑到空位罚分的最佳比对的产生。如上所述，应使用Needleman-Wunsch全局序列比对工具来确定序列同一性百分比，该工具可通过http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi公开获得，使用缺省参数设置。Needleman-Wunsch算法发表于J.Mol.Biol.(1970)vol.48：443-5 53。
本发明的另一方面提供了具有编码根据本发明第一方面的多肽的核酸序列的多核苷酸。本发明还包括编码本发明多肽的变体核酸。关于核酸序列的术语“变体”是指一个或者多个核酸相对于多核苷酸序列的任何替换、变异、修饰、缺失或一个或多个核酸向多核苷酸序列的任何添加，使提供的由多核苷酸编码的所得多肽序列表现出至少与由基本序列编码的多肽相同的性质。因此，该术语包括等位基因变体，并且还包括与本发明的多核苷酸序列基本上杂交的多核苷酸(“探针序列”)。这种杂交可以在低严格条件和高严格条件下或在低严格条件和高严格条件之间发生。一般而言，低严格条件可以定义为洗涤步骤在0.330M至0.825M NaCl缓冲液中于比探针序列的计算解链温度或实际解链温度(Tm)低40℃至48℃的温度(例如，约实验室环境温度至约55℃)进行的杂交，而高严格条件涉及在0.0165M至0.0330M NaCl缓冲液中于比探针序列的计算Tm或实际Tm低约5℃至10℃的温度(例如，约65℃)的洗涤。缓冲溶液可以是例如SSC缓冲液(0.15M NaCl和0.015M柠檬酸三钠)，低严格性洗涤在3×SSC缓冲液中进行，高严格性洗涤在0.1×SSC缓冲液中进行。核酸序列杂交中涉及的步骤已经由例如Sambroket等人所描述(2001；“Molecular Cloning：alaboratory manual”，3rd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，30NewYork)。
本发明的多肽和核酸可以使用常规合成仪合成制备。或者，其可以使用重组DNA技术产生，并可以纳入合适的表达载体中，然后用该表达载体转化合适的宿主细胞，例如原核细胞如大肠杆菌(E.coli)。培养转化的宿主细胞并从中分离多肽。
因此，本发明还提供了包含这种多核苷酸的载体。这包括含有一个或多个上述核酸分子的重组构建体。所述构建体包括本发明的核酸分子以正向或反向插入其中的载体，例如质粒载体或病毒载体。在该实施方案的优选方面，构建体还包含调控序列，包括例如与该序列可操作地连接的启动子。大量合适的载体和启动子是本领域技术人员已知的，并且是可商购的。Sambrook等人还描述了用于原核宿主和真核宿主的合适的克隆载体和表达载体。
本发明的另一方面提供了包含根据本发明的多肽、多核苷酸或载体中的任何一个的细胞。例如，合适的细胞可以是沙门氏菌(Salmonella)细胞，例如肠沙门氏菌(Salmonella enterica)细胞，在一些实施方案中来自血清型鼠伤寒沙门氏菌(Serovartyphimurium)。沙门氏菌可以是一种减毒株。可以任选地使用菌株χ8914和χ9241。例如，Kulkarni等人(2008，Vaccine vol.26，4194-4203)描述的一种合适的系统。优选地，宿主细胞不是干细胞，尤其不是人类干细胞，例如人类胚胎干细胞。
本发明的另一方面提供了亲和试剂，其能够与根据本发明第一方面的多肽之一相结合，并促进施用了该亲和试剂的个体体内的免疫应答。例如，亲和试剂可以是抗体，其可以是单克隆抗体或合成抗体、
Figure BDA0002655236720000201
分子或其他抗体模拟物、适体、蛋白质支架或主要组织相容性复合体(MHC)蛋白或其部分。亲和试剂可以是针对根据本发明第一方面的多肽产生的抗体。
本发明的另一方面提供了含有根据本发明第一方面的多肽的亚单位疫苗或结合疫苗。例如，其可以是融合蛋白的形式和/或重组病毒疫苗的形式。
本发明的另一方面提供制备疫苗的方法，包括通过相对于野生型Etx多肽SEQ IDNO：65修饰结构域III来改变Etx多肽或包含Etx多肽的疫苗或候选疫苗。另一方面提供了通过包括上述方法的方法所制备的疫苗组合物。
用于改进(通过与野生型多肽相比的对结构域III的修饰)的疫苗或候选疫苗可选自以下任何一种，与原始疫苗或候选疫苗相比其在修饰结构域III后显示出毒性降低。例如，以下出版物公开了对MCDK细胞显示出毒性降低并且可通过修饰结构域III而进一步改进的多肽：Kang J et al.(2017)Hum Vaccin Immunother 13：1598-1608描述了一种提出的在结构域1中具有突变(F199)的人类疫苗；Yao et al.(2016)Sci Rep.6：24162描述了结构域1中的Y196突变；Li et al.(2013)Hum Vaccin 25Immunother 9：2386-92描述了F199E和H106P突变体(F199在结构域1中，H106在结构域2中)；Oyston et al.(1998)Microbiology 144：333-41描述了H106P突变体并且还提及了H149P突变体是无毒的(H106在结构域2中)；Dorca-Aré valo et al.(2014)PLoS One 9：e102417描述了V56C/F118C和H106P突变对MDCK细胞是无毒的(V56在结构域2中和F118在结构域2中)。
本发明的另一个方面提供了免疫治疗组合物，其包含：根据本发明前述方面的多肽、多核苷酸、载体、亲和试剂、亚单位疫苗和/或结合疫苗，以在药学上可接受的制剂的形式。例如，所述免疫治疗组合物可以是包含根据本发明第一方面的多肽和佐剂的疫苗组合物。所述组合物还可包含适于将所述组合物施用给需要治疗或免疫接种以对抗患上由产气荚膜梭菌和/或Etx疾病导致的疾病的受试者的工具的赋形剂和/或稀释剂。选择适当的组分在本领域技术人员的常规能力范围内，无需付出创造性劳动。
例如，本发明的免疫治疗组合物可以方便地使用药学上可接受的赋形剂或稀释剂例如水性溶剂、非水性溶剂、无毒赋形剂(例如盐)、防腐剂、缓冲剂等来配制。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有机酯如油酸乙酯。水性溶剂包括水、醇/水溶液、盐溶液、肠胃外载体(如氯化钠、林格氏葡萄糖)等。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。疫苗组合物中的各种组分的pH和确切浓度根据常规技术进行调整。
任选地，免疫治疗制剂可以包含载体。常用的载体分子是牛血清白蛋白(BSA)、钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)(KLH)、卵清蛋白、小鼠血清白蛋白、兔血清白蛋白等。合成载体可以使用并且容易获得。将肽与载体蛋白偶联的方法是本领域公知的，并且包括戊二醛、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳二亚胺和双重氮联苯胺。
在某些情况下，可能还需要配制包含佐剂的免疫治疗组合物以增强免疫应答。这样的佐剂包括所有可接受的免疫刺激化合物，例如细胞因子、毒素或合成组合物。常用的佐剂包括氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙、弗氏佐剂和Quil-A皂苷。由SEPPIC Inc(New Jersey，USA)提供的作为MontanideTM佐剂的佐剂，例如MontanideTM ISA 61VG，也可以是合适的佐剂。本发明人发现，与使用氢氧化铝(alhydrogel)佐剂相比，使用MontanideTM ISA 61VG佐剂会导致诱导更好的抗体应答。除了佐剂之外，可能还需要将生物应答调节剂(BRM)与肽或变体或衍生物共同施用，以下调抑制性T细胞活性。
用于免疫治疗制剂给药的可能载体包括脂质体。脂质体是由一个或多个包围水相隔室的脂质双层组成的微观囊泡。脂质体在组成上与细胞膜相似，因此，脂质体通常可以安全地施用并且是可生物降解的。制备脂质体的技术和用脂质体对各种分子(包括肽和寡核苷酸)进行制剂(例如包封)的技术是众所周知的。
根据制备方法，脂质体可以是单层或多层的，并且可以在尺寸上变化，直径范围为0.02μm至大于10μm。脂质体也可吸附到几乎任何类型的细胞上，然后释放被包封的剂。或者，脂质体与靶细胞融合，由此将脂质体的内容物排空到靶细胞中。或者，被吸附的脂质体可以被吞噬细胞胞吞。胞吞作用之后是脂质体脂质的溶酶体内降解和被包封的剂的释放。在本文中，根据本发明的多肽可以定位在脂质体的表面上，以促进抗原呈递而不破坏脂质体或胞吞作用。然而，不管机制或递送如何，结果是相关多肽的细胞内布置。
脂质体载体可以是阴离子或阳离子的。阴离子脂质体载体包括pH敏感的脂质体，其在胞吞作用和内体酸化后破坏内体膜或与内体膜融合。阳离子脂质体优选用于介导体外哺乳动物细胞转染或核酸的一般递送，但也可用于递送其他治疗药物，例如肽。
用于本发明方法的其他合适的脂质体包括多层脂质体(MLV)、寡层脂质体(OLV)、单层脂质体(UV)、小单层脂质体(SUV)、中等尺寸的单层脂质体(MIN)、大单层脂质体(LUV)、巨型单层脂质体(GUV)、多孔脂质体(MVV)、通过逆相蒸发法制备的单层脂质体或寡层脂质体(REV)、通过逆相蒸发法制备的多层脂质体(MLV-REV)、稳定的多层脂质体(plurilamellar vesicles)(SPLV)、冻融MLV(FATMLV)、通过挤出法制备的脂质体(VET)、通过法式压力法(French press)制备的脂质体(FPV)、通过融合制备的脂质体(FUV)、脱水-再水化脂质体(DRV)和泡状脂质体(bubblesomes)(BSV)。制备这些脂质体的技术是本领域公知的。
其他形式的递送颗粒，例如微球等，也被考虑用于肽表位或多表位的递送。
或者，可以生产基于核酸的疫苗，其包含编码免疫活性肽表位或多表位并克隆到合适的载体(例如牛痘、金丝雀痘、腺病毒或其他真核病毒的载体)中的核酸，例如DNA或RNA。
或者，多肽可以通过施用已在体外处理的自体或同种异体的APC细胞或树突细胞，以细胞疫苗的形式施用，以便将肽呈递到其表面上。肠沙门氏菌或大肠杆菌菌株携带的突变可降低其毒力并允许其在不引起疾病的情况下在宿主动物中定殖，可用于递送疫苗抗原，特别是用于非人类动物施用。所用的细菌可能包括已在家畜中用作疫苗的菌株，其中减毒病变未被充分表征。此外，如WO2013/144636中所述，毒力通过有意将突变引入细菌中被合理地减弱的菌株可用于递送多肽。抗原也可以作为裸DNA疫苗递送，其中编码ε类毒素的基因被克隆到哺乳动物表达载体中并从真核启动子表达。
用作外源抗原载体的减毒沙门氏菌中研究最广泛的一类是营养缺陷型。编码5-烯醇丙酮酸-3-磷酸合酶的aroA基因的遗传定义突变体，已经在鼠伤寒沙门氏菌(S.entericavar.Typhimurium)和伤寒杆菌(S.enterica var.Typhi)中构建。这些突变体是减毒的并且在小鼠中具有免疫原性。其他营养缺陷型突变体的实例包括嘌呤生物合成途径中涉及的基因中有缺失的沙门氏菌。另一组充分研究的减毒沙门氏菌是沙门氏菌毒力调节中涉及的基因中具有确定缺失的突变体。例如，编码腺苷酸环化酶(CyA)和环磷酸腺苷受体蛋白(CRP)的基因的突变会影响所涉及基因的表达。
在一个实施方案中，免疫治疗组合物可以包含在食品(即，适于人或动物食用的食品材料)中，所述食品包括根据本发明前述方面的多肽和/或多核苷酸和/或载体和/或细胞和/或亚单位疫苗和/或疫苗组合物。在非限制性实例中，这可以是微丸、碎屑或糊状物的形式，所述微丸、碎屑或糊状物还可以包含(再次仅作为举例)谷物、草和/或蛋白质组分。该组合物也可以包含在饮用液体中和/或通过喷雾施用到动物周围的大气中，从而被动物吸入。
如果疫苗组合物是用于施用于人类受试者，其可以是适于口服施用(例如在膳食补充剂中)和/或肠胃外施用(例如通过注射、吸入或经由贴剂、洗剂或凝胶的经皮施用)的形式。以上概述的特定形式通常也可用于施用于人类受试者。
根据本发明的多肽、多核苷酸、载体、亚单位疫苗、结合疫苗、抗体、亲和试剂、疫苗组合物和/或免疫治疗组合物可用于治疗或疫苗接种受试者以对抗患上由产气荚膜梭菌和/或Etx导致的疾病的方法中，该疾病例如涉及可由产气荚膜梭菌释放的ε毒素(特别是缺乏全长原毒素的N末端和C末端的活性ε毒素)在受试者血液中的积累；和/或根据本发明的多肽、多核苷酸、载体、亚单位疫苗、结合疫苗、抗体、亲和试剂、疫苗组合物和/或免疫治疗组合物可用于治疗或疫苗接种受试者以对抗脱髓鞘相关的病症。根据本发明的多肽、多核苷酸、载体、亚单位疫苗、结合疫苗、抗体、亲和试剂、疫苗组合物和/或免疫治疗组合物可用于治疗或疫苗接种受试者以对抗患上与产气荚膜梭菌感染相关的或与Etx的存在相关的疾病或出现与脱髓鞘相关的病症的方法中。根据一个实施方案，所述疾病是肠毒血症或脱髓鞘疾病，例如多发性硬化、视神经脊髓炎(NMO)、视神经炎(ON)或脊髓炎。
本发明还提供了疫苗接种受试者以对抗患上由产气荚膜梭菌导致的和/或由ε毒素(特别是活性毒素)导致的疾病或与产气荚膜梭菌感染相关的或与Etx的存在相关的疾病、或出现与脱髓鞘相关的病症的方法，该方法包括向受试者施用根据本发明的多肽、多核苷酸、载体、亚单位疫苗、结合疫苗、亲和试剂、疫苗组合物和/或免疫治疗试剂(例如，以保护量)。受试者可以是人类或非人类动物。非人类动物可以是马或反刍动物(例如绵羊、猪或山羊)、或牛属动物(例如家养的牛)或伴侣动物(例如犬、猫或兔)。幼年动物，例如羔羊、小猪、小孩和小牛也包括在内。
“保护量”是足以在受试者中诱导免疫应答的量，从而降低或消除受试者患上由产气荚膜梭菌导致的(例如由ε毒素特别是活性毒素导致的(或与其存在相关的))疾病的概率。例如，能够与SEQ ID NO：65和/或SEQ ID NO：14结合的抗体在施用后可以是可检测的，其中这样的抗体在施用前是不可检测的，或只能在比施用后更低的浓度下才是可检测的。
本发明还提供了包含根据本发明的多肽、多核苷酸、载体、亚单位疫苗、结合疫苗、亲和试剂、疫苗组合物和/或免疫治疗试剂的试剂盒，所述试剂盒具有例如在治疗或疫苗接种受试者以对抗患上由产气荚膜梭菌和/或Etx感染导致的疾病的方法中的用途；或所述试剂盒具有在治疗或疫苗接种受试者以对抗患上与产气荚膜梭菌感染相关的疾病或与Etx的存在相关的疾病或出现与存在与脱髓鞘相关的病症的方法中的用途。该试剂盒可以包括将多肽、多核苷酸、载体、亚单位疫苗、结合疫苗、亲和试剂、疫苗组合物和/或免疫治疗试剂施用于个体的工具。例如，该试剂盒可以包括一种或多种缓冲剂或稀释剂和/或一种或多种施用装置，例如注射器或其他注射装置。试剂盒可以替换地或另外地包括说明书，该说明书使使用者能够实施治疗或疫苗接种受试者以对抗患上由产气荚膜梭菌和/或Etx导致的或与之相关的疾病和/或脱髓鞘疾病的方法，所述疾病为例如肠毒血症(ET)、多发性硬化症(MS)、临床确诊MS(CDMS)、临床孤立综合征(CIS)、视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)、视神经炎(ON)、视神经脊髓炎(NMO)、脊髓炎、横贯性脊髓炎(TM)、以水通道蛋白-4(AQP-4)的抗体增加或存在和/或星形胶质细胞损伤为特征的疾病或病症、以及急性播散性脑脊髓炎(ADEM)。
如本文所述，由产气荚膜梭菌和/或(活性)ε毒素导致的或与之相关的疾病可以是例如肠毒血症，包括疾病前症状(如全身性病变和小肠结肠炎)。其他症状可包括主要靶器官肾脏和大脑的水肿和对血管内皮细胞的损伤。肠毒血症的末期的特征在于严重神经疾病，包括角弓反张、癫痫和痛苦挣扎。该疾病可以是脱髓鞘疾病，例如多发性硬化症(MS)、临床确诊MS(CDMS)、临床孤立综合征(CIS)、视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)、视神经炎(ON)、视神经脊髓炎(NMO)、脊髓炎、横贯性脊髓炎(TM)、以水通道蛋白-4(AQP-4)的抗体增加或存在和/或星形胶质细胞损伤为特征的疾病或病症、以及急性播散性脑脊髓炎(ADEM)。
在本申请文本的说明书和权利要求中，词语“包括(comprise)”和“包含”以及该词语的变体，例如“包括(comprising)”和“包括(comprises)”，表示“包括但不限于”，并且不排除其他部分、添加剂、组分、整数或步骤。
在本申请文本的说明书和权利要求中，单数包括复数，除非上下文另有要求。特别地，在使用不定冠词的情况下，除非上下文另有要求，否则本申请文本应被理解为既考虑复数又考虑单数。
本发明的每个方面的优选特征可以如结合任何其他方面所描述的。
本发明的其他特征将从以下实施例中变得显而易见。一般而言，本发明延伸至本申请文本(包括所附权利要求和附图)中公开的任何一个新的特征或特征的任何新的组合。因此，结合本发明的特定方面、实施方案或实施例描述的特征、整数、特性、化合物或化学部分应被理解为适用于本文所述的任何其他方面、实施方案或实施例，除非与其不相容。
此外，除非另有说明，否则本文所公开的任何特征可由用于相同或相似目的的替代特征代替。
附图说明
现在将参考图1至图5仅以示例的方式描述本发明的实施方案，其中：
图1是重组ε原毒素(P-Etx)的示意图，其中N-末端PelB前导肽代替13个氨基酸的N-末端肽序列，并具有C-末端His-标签以帮助纯化(还显示了加工位点周围的氨基酸序列)；
图2显示了Etx氨基酸序列，其具有信号序列(残基1-32)、N-末端前肽(残基33-45)、C-末端前肽(残基305-328)、和突变的残基Y30A(Y43)、V72f、F92a、H129a、V166a、A168f、Y196A(Y209)的位置，在突变位置下显示原始未突变的氨基酸；
图3A显示了针对诱变鉴定的Etx结构域III中聚糖(β-辛基-葡萄糖苷)结合位点旁侧的5个残基(建议的第二受体结合位点)：V72、F92、H149、V166、A168。先前突变的残基位置(以深灰色显示并加圆圈(顶部)；Y30和Y196)和β-辛基-葡萄糖苷结合裂缝中的残基(V72、F92、H149、V166、A168；以浅灰色显示并加圆圈(底部)；
图3B显示了本研究中测试的纯化蛋白的SDS-PAGE凝胶。使用编码Y30A-Y196A变体形式的Etx的质粒，引入另外的突变V72、F92、H149、V166和A168。这些残基突变为丙氨酸(H149、F92、V166)或苯丙氨酸(A168、V72)，突变基因编码的His-标签的蛋白质在大肠杆菌中表达并纯化；
图4显示了WHO标准抗毒素(5IU/ml)或抗遗传类毒素的兔血清在竞争ELISA中取代中和单克隆抗体结合的能力。测试前，如图例所示稀释血清。所示数据是两次检测的平均值，显示有SEM棒。
图5显示了野生型蛋白和变体蛋白的解链温度(Tm)。Etx原毒素的热稳定性通过Boltzmann方法使用Protein Thermal Shift软件(Applied Biosystems)测定。结果代表三次样品的平均值和标准偏差。
图6显示了用ε毒素(野生型Etx；Y30AY196A；Y30AY196A+H149A；Y30AY196A+A168F；Y30AY196A+F92A；Y30AY196A+V166A；和四位突变(quad)：Y30AY196+A168F+H149A)处理人红细胞的结果。Y30AY196A+A168F、Y30AY196A+H149A和四位突变即使在胰蛋白酶激活时也不溶血。
项目
现在将参考以下项目描述本发明，其中：
1.一种预防或治疗有需要的人或动物受试者中的脱髓鞘病症的方法，所述病症选自：肠毒血症(ET)、多发性硬化症(MS)、临床确诊MS(CDMS)、临床孤立综合征(CIS)、视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)、视神经炎(ON)、视神经脊髓炎(NMO)、脊髓炎、脊髓炎、横贯性脊髓炎(TM)、以水通道蛋白-4(AQP-4)的抗体增加或存在和/或星形胶质细胞损伤为特征的疾病或病症、以及急性播散性脑脊髓炎(ADEM)，包括：向所述受试者施用一种包含有效量的剂的组合物，所述剂直接或间接干扰由产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)B型或D型菌株产生的ε毒素(Etx)、Etx结合受体或Etx与其结合受体的相互作用，从而抑制或阻遏Etx调节的受体信号传递活性。
2.根据项目1所述的方法，其中所述剂是Etx的抑制剂，例如抗体或其功能组分。
3.根据项目1所述的方法，其中所述剂是Etx结合受体的抑制剂或拮抗剂。
4.根据项目3所述的方法，其中所述Etx结合受体是髓磷脂和淋巴细胞蛋白(MAL)或甲型肝炎病毒细胞受体1蛋白(HAVCR1)。
5.根据项目1所述的方法，其中所述剂是抗产气荚膜梭菌B型或D型菌株或抗由其产生的ε毒素(Etx)的疫苗。
6.根据前述任一项所述的方法，其中所述剂包括ε毒素(Etx)多肽，所述ε毒素(Etx)多肽对表达髓磷脂和淋巴细胞蛋白(MAL)的细胞具有降低的毒性并且包含与野生型Etx多肽SEQ ID NO：65相比经修饰的结构域III，其中所述降低的毒性是相对于SEQ ID NO：65和/或SEQ ID NO：14的，并且其中所述Etx多肽能够与至少一种结合SEQ ID NO：65和/或SEQ ID NO：14所表示的序列的抗体相结合。
7.根据项目6所述的方法，其中所述经修饰的结构域III是在结构域III的聚糖(β-辛基-葡萄糖苷)结合位点中的修饰。
8.根据项目6或7所述的方法，其中所述经修饰的结构域III包括构成结构域III的如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中的氨基酸的一个或多个突变。
9.根据项目6至8中任一项所述的方法，其包括以下一个或多个：SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9。
10.根据项目6至9中任一项所述的方法，其包括SEQ ID NO：4和/或SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6。
11.根据项目6至10中任一项所述的方法，其包括至少以下序列：
i)SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5；
并且任选地除(i)之外，还包括
ii)SEQ ID NO：6；和
iii)以下一个或多个：SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9。
12.根据项目6至11中任一项所述的方法，其中与包括SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的Etx多肽、或包括SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的Etx多肽相比，或与已知的Etx疫苗或Etx候选疫苗相比，所述降低的毒性降低。
13.根据项目6至12中任一项所述的方法，与SEQ ID NO：18至SEQ ID NO：50中的任一项具有至少60％的序列同一性，并且包括表3中针对相关SEQ ID NO指出的一个或多个突变或由表3中针对相关SEQ ID NO指出的一个或多个突变组成。
14.一种多核苷酸，其具有编码根据前述任一项所述的多肽的核酸序列。
15.一种载体，其包含根据项目14所述的多核苷酸或根据项目1-5任一项所述的剂。
16.一种细胞，其包含根据项目1至5中任一项所述的剂、根据项目6至13中任一项所述的多肽和/或根据项目14所述的多核苷酸和/或根据项目15所述的载体。
17.一种亚单位疫苗或结合疫苗，其包含根据项目1-5中任一项所述的剂、根据项目6-13中任一项所述的多肽。
18.一种亲和试剂，其能够与根据项目1至5中任一项所述的剂、根据项目6至13中任一项所述的多肽之一相结合，并且促进施用过所述亲和试剂的个体体内的免疫应答。
19.一种制备免疫治疗组合物、任选地疫苗组合物的方法，其包括通过相对于野生型Etx多肽修饰结构域III来改变Etx多肽或包含Etx多肽的疫苗。
20.一种免疫治疗组合物或疫苗组合物，其是通过根据项目19所述的方法制备的。
21.一种免疫治疗组合物或疫苗组合物，其包含根据项目1至5中任一项所述的剂、根据项目6至13中任一项所述的多肽和/或根据项目14所述的多核苷酸和/或根据项目15所述的载体和/或根据项目16所述的细胞和/或根据项目17所述的亚单位疫苗和/或根据项目14所述的亲和试剂。
22.一种根据项目20或21所述的免疫治疗组合物，任选地疫苗组合物，其是人或动物的食品。
23.根据项目1至5中任一项所述的剂、根据项目6至13中任一项所述的多肽和/或根据项目14所述的多核苷酸和/或根据项目15所述的载体和/或根据项目16所述的细胞和/或根据项目17所述的亚单位疫苗或结合疫苗和/或根据项目18所述的亲和试剂和/或根据项目20至22中任一项所述的免疫治疗组合物或疫苗组合物，其用于治疗或免疫接种受试者以对抗患上由产气荚膜梭菌导致的或与产气荚膜梭菌相关的疾病和/或由(活性)ε毒素导致的或与(活性)ε毒素相关的疾病和/或对抗脱髓鞘疾病的方法中之用途。
24.根据项目23所述的多肽，其中所述疾病选自：肠毒血症(ET)、多发性硬化症(MS)、临床确诊MS(CDMS)、临床孤立综合征(CIS)、视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)、视神经炎(ON)、视神经脊髓炎(NMO)、脊髓炎、横贯性脊髓炎(TM)、以水通道蛋白-4(AQP-4)的抗体增加或存在和/或星形胶质细胞损伤为特征的疾病或病症、以及急性播散性脑脊髓炎(ADEM)。
25.一种治疗患有由产气荚膜梭菌的存在导致的或与产气荚膜梭菌的存在相关的疾病和/或由(活性)ε毒素的存在导致的或与(活性)ε毒素的存在相关的疾病的受试者和/或治疗受试者以对抗脱髓鞘疾病的方法，或一种免疫接种受试者以对抗患上所述疾病的方法，所述方法包括向受试者施用根据项目1至5中任一项所述的剂、根据项目6至13中任一项所述的多肽和/或根据项目14所述的多核苷酸和/或根据项目15所述的载体和/或根据项目16所述的细胞和/或根据项目17所述的亚单位疫苗和/或根据项目18所述的亲和试剂和/或根据项目20至22中任一项所述的疫苗组合物或免疫治疗组合物，其中所述脱髓鞘病症选自：肠毒血症(ET)、多发性硬化症(MS)、临床确诊MS(CDMS)、临床孤立综合征(CIS)、视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)、视神经炎(ON)、视神经脊髓炎(NMO)、脊髓炎、横贯性脊髓炎(TM)、以水通道蛋白-4(AQP-4)的抗体增加或存在和/或星形胶质细胞损伤为特征的疾病或病症、以及急性播散性脑脊髓炎(ADEM)。
26.根据项目20至22中任一项所述的剂、多肽、多核苷酸、载体、细胞、亲和试剂、疫苗组合物或免疫治疗组合物，或根据项目25所述的方法，其中所述受试者是反刍动物、马、伴侣动物或人。
27.MAL细胞作为模型在测试ε候选疫苗的毒性中的用途。
28.一种试剂盒，其包括根据项目1至5中任一项所述的剂、根据项目6至13中任一项所述的多肽和/或根据项目14所述的多核苷酸和/或根据项目15所述的载体和/或根据项目16所述的细胞和/或根据项目17所述的亚单位疫苗和/或根据项目18所述的亲和试剂和/或根据项目20至22中任一项所述的疫苗组合物或免疫治疗组合物。
29.基本上如本文所述的多肽、多核苷酸、载体、细胞、亚单位疫苗、结合疫苗、亲和试剂、疫苗组合物或免疫治疗组合物或方法。
实施例
材料和方法
化学品
所有化学品均获自Sigma Chemical Co.(St Louis，MO)，除非另有说明。
重组ε毒素野生型和突变体的表达和纯化
将编码来自产气荚膜梭菌D型菌株NCTC 8346的ε原毒素D的etxD基因克隆到表达载体pET-26b(+)(Merck，Darmstadt，Germany)中，其中N-末端PelB前导肽代替13个氨基酸的N-末端肽序列(残基KEISNTVSNEMSK)，并具有C-末端多组氨酸(6×His)标签以帮助重组原毒素的亲和纯化(Bokori-Brown et al.，(2013)Protein science：a publication ofthe Protein Society 22：650-9)。氨基酸编号对应于没有13个氨基酸的N-末端肽序列的原毒素。使用QuickChange Lightning Site-Directed突变试剂盒(AgilentTechnologies，In c.Santa Clara，US)，根据制造商的说明(氨基酸编号对应没有13个氨基酸的N-末端肽序列的原毒素)将突变H149A、A168F、F92A、V166A和V72F(β-辛基-葡萄糖苷结合位点旁侧的残基)引入先前产生的Y30A-Y196A突变体(Bokori-Brown et al.(2014)3534Vaccine 32：2682-7)中。用于定点诱变的引物如下表4所示。重组蛋白在大肠杆菌Rosetta 2(DE3)细胞(Merck，Darmstadt，Germany)中表达，并在补充50μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素的ZYM-5052自动诱导培养基(Studier FW(2005)Protein expression andpurification 41：207-34)中生长。细胞(100mL)于37℃生长3小时，并于20℃、300rpm下再培养24小时。
表4-用于定点诱变的引物
Figure BDA0002655236720000321
Figure BDA0002655236720000331
a带下划线的碱基是用于替换的密码子。所有引物序列均显示为5′至3′方向。氨基酸编号对应于没有N-末端肽序列的原毒素。
蛋白质纯化
对于纯化蛋白质，通过离心收集细胞，使用BugBusterTM蛋白质提取试剂(Merck，Darmstadt，Germany)进行酶裂解，并根据制造商的说明通过Ni-NTA色谱柱(GE HealthcareLife Sciences，Little Chalfont，UK)纯化Y30A-Y196A及其衍生物。对于缓冲液交换和进一步的样品净化，将含有原毒素的洗脱液加到PD-10脱盐柱(GE Healthcare LifeSciences，Little Chalfont，UK)上，并用10mM磷酸盐缓冲液、2.7mM氯化钾、137mM NaCl(pH7.4)洗脱。使用BCA检测(Fisher Scientific UK Ltd，Loughborough，UK)确定蛋白质浓度。
对于在小鼠、兔或绵羊中的研究，根据制造商的说明，使用包含高容量内毒素去除树脂的可商购试剂盒(PierceTM High Capacity Endotoxin Removal Spin Columns，Thermo Scientific)处理所述蛋白质以去除内毒素。使用定量显色检测(Pierce LALChromogenic Endotoxin Quantitation kit，Thermo Scientific)测量内毒素的残留水平。
胰蛋白酶激活
用来自牛胰腺的经TPCK处理的胰蛋白酶(Sigma-Aldrich Company Ltd.，Gillingham，UK)激活经纯化的重组ε原毒素及其衍生物，去除C-末端肽序列。胰蛋白酶在PBS中制备，并以1∶100(重量/重量)的比例加入重组P-Etx中，并于室温孵育1小时。将不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Fisher Scientific UK Ltd，Loughborough，UK)加入到消化物中以抑制样品中的胰蛋白酶。通过SDS-PAGE评估C-末端肽序列的去除。
SDS-PAGE分析
使用XCell SureLockTM Mini-Cell电泳仪(Invitrogen Ltd.，Paisley，UK)和NuPAGE MES SDS电泳缓冲液(Invitrogen Ltd.，Paisley，UK)在4-12％Bis-Tris NuPAGE凝胶(Invitrogen Ltd.，Paisley，UK)上通过SDS-PAGE分析蛋白质纯度。在加样前，所有样品在NuPAGE LDS样品缓冲液(Invitrogen Ltd.，Paisley，UK)中于70℃加热10分钟。凝胶通常在200V运行45分钟。电泳分离后，蛋白质通过用SimplyBlue染色(Invitrogen Ltd.，Paisley，UK)显示。使用完美蛋白质分子量标准(Merck，Darmstadt，Germany)作为标记。
热稳定性检测
通过将经纯化的蛋白质(0.25mg/mL)与240×SYPRO橙蛋白质凝胶染色剂(Sigma-Aldrich Company Ltd.，UK)混合来评估热稳定性。使用StepOnePlus定量PCR仪(AppliedBiosystems，US)从25℃至99℃以1％热梯度监测荧光。使用Protein Thermal Shift软件(Applied Biosystems)分析获得的荧光数据，以使用Boltzmann方法计算解链温度(Tm)。所有测量均进行三次。
细胞培养
MDCK.2细胞(ATCC-LGC Standards，Teddington，UK)和ACHN细胞(ECACC，Salisbury，UK)在补充了10％特级胎牛血清(PAA，Pasching，Austria)的Eagle′s MinimumEssential Medium(EMEM；ATCC-LGC Standards，Teddington，UK)中于37℃在95％空气/5％CO2的潮湿环境中常规培养。每2天至3天更换培养基。细胞通过在胰蛋白酶/EDTA中孵育而常规分离，并适当地分开(通常以1∶6稀释)。
表达绿色荧光蛋白(GFP)-标签的人MAL(CHO-hMAL)、绵羊MAL(CHO-sMAL)或犬MAL(CHO-dMAL)的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或CHO细胞在补充了10％胎牛血清的Dulbecco′sModified Eagle′s Medium/Ham′sF12(DMEM/F12)培养基(Life Technologies)中于37℃在95％空气/5％CO2的潮湿环境中常规培养。每2天至3天更换培养基。细胞通过在胰蛋白酶/EDTA中孵育而常规分离，并适当地分开(通常以1∶6稀释)。
细胞毒性分析
胰蛋白酶激活的毒素对MDCK.2细胞的细胞毒性是通过使用CytoTox96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega UK，Southampton，UK)，根据制造商的方案测量从裂解细胞的胞质溶胶释放到细胞培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)的量来测定的。简言之，在PBS中制备每种激活毒素的两倍稀释系列(范围为10μM至0.15nM)，并加入接种于96孔板的细胞中(3×104细胞/孔)。于37℃孵育3小时后，从细胞单层收取细胞培养基(50μL)，转移到新鲜的96孔酶标板中，并向每个孔中加入50μL重建的底物混合物。将所述板避光于室温孵育30分钟。使用680型酶标仪(Bio-Rad)在490nm处读取吸光度。通过减去从未处理的细胞的培养基中获得的吸光度值，将每个样品的吸光度值归一化。通过非线性回归分析(GraphPad)确定杀死50％细胞单层所需的毒素剂量(CT50)。所有实验进行三次，每次具有三次技术重复。
兔的免疫接种
多组(每组三只)新西兰白兔分别用100μg Y30A-Y196A、Y30A-Y196A-A168F或Y30A-Y196A-H149A-A168F(Cambridge Research Biochemicals)进行皮下免疫。将弗氏完全佐剂用于初始免疫接种，并将弗氏不完全佐剂用于以14天为间隔的4次后续免疫接种。在第3次加强免疫后7天(第49天)和第4次加强免疫后7天(第63天)收集血液。
WHO国际标准产气荚膜梭菌ε马抗毒素血清(CPEPAT)从国家生物制品检定所(NIBSC，South Mimms，UK)获得。
使用Y30AY196A+A168F类毒素免疫接种绵羊
饲养羔羊而不免疫接种对抗产气荚膜梭菌ε毒素的疫苗，并每隔一段时间使用蛋白质印迹法测试抗ε毒素抗体的存在。12个月后，5只羔羊的一组没有接受任何处理，6只羔羊的一组接受200μg含MontanideTM ISA 61VG(Seppic，Paris，France)佐剂的Y30AY196A+A168F类毒素(1∶1)，以及5只羔羊的一组接受200μg含氢氧化铝(alhydrogel；Sigma-Aldrich，Poole UK；0.25％重量/体积最终浓度)佐剂的Y30AY196A+A168F类毒素。发明人还用200μg的Y30AY196A+A168F类毒素与MontanideTM ISA 61VG佐剂(1∶1)的混合物免疫接种了4只羔羊的一组，该组具有显著水平的预先存在的与ε毒素的反应性。所有含佐剂的混合物以6×0.5ml剂量皮下给予。三周后，给予羔羊第二剂含佐剂的蛋白。在研究开始时和第3周、第7周和第12周采集血样。羔羊的免疫接种通过Orygen Antibodies Ltd，Penicuik，Scotland进行。
用于测量中和抗体的竞争ELISA检测
根据制造商的说明，使用Monoscreen ELISA试剂盒(BioX Diagnostics，BIO K222/2)进行竞争ELISA以测量中和抗体。在450nm处读取吸光度，并使用下式计算抑制：
抑制样品％＝[(OD450nm阴性血清-OD样品)/OD450nm阴性血清]×100
抑制阳性％＝[(OD450nm阴性血清-OD阳性血清)/OD450nm阴性血清]×100
只有当OD阴性-OD阳性大于0.7并且阳性对照的抑制大于30％时，该试验才有效。
对细胞培养物毒性的中和
将表达人MAL的CHO细胞以每孔3×104细胞接种于96孔板中，并静置过夜。将纯兔血清和20IU/ml标准ε抗毒素(国家生物制品检定所)在DPBS中以系列倍数稀释液稀释，并与等体积的胰蛋白酶激活的野生型ε毒素(5×CT50)于室温孵育1小时。CHO hMAL细胞用无血清DMEM/F12洗涤两次，然后加入毒素：抗体/标准抗毒素混合物，连同仅有DPBS和仅有毒素的对照(5×CT50)。在37℃潮湿环境中孵育3小时后，用100μl新鲜无血清DMEM/F12和10μl WST-1细胞增殖试剂(Abcam)替换培养基。在37℃潮湿环境中孵育1小时后读取420nm处的吸光度。
在小鼠中的毒性
将多组(每组六只)雌性BALB/c小鼠通过腹膜内(i.p.)或皮下(s.c.)途径用100μl体积的未激活的或胰蛋白酶激活的蛋白质挑战。实验在i.p.挑战后24小时或s.c.挑战后7天后终止。所述研究在现场动物伦理委员会的批准下进行。根据预定的评分矩阵，每隔一段时间评估动物的神经症状、外观变化或行为变化。综合得分为5或更高的动物被剔除。
结果
β-辛基-葡萄糖苷结合位点旁侧残基的诱变
在以前的研究中，本发明人鉴定了Etx结构域III中的聚糖(β-辛基-葡萄糖苷)结合位点，并提出该位点可能是第二个受体结合位点(Bokori-Brown(2013))。在本研究中，该位点旁侧的5个残基针对诱变被鉴定(V72、F92、H149、V166、A168；图3a)，以评估它们在毒性中的作用。使用编码Etx的Y30A-Y196A变体形式的质粒，在V72、F92、H149、V166和A168引入另外的突变。这些残基突变为丙氨酸(H149、F92、V166)或苯丙氨酸(A168、V72)，突变基因编码的His-标签的蛋白质在大肠杆菌中表达并被纯化。还表达和纯化了Etx的Y30A-Y196A变体形式和除Y30A-Y196A外还含有H149A和A168A的突变体。通过两种方式验证了蛋白质的真实性。首先，对编码突变基因的基因进行测序以验证预期突变的存在。其次，通过质谱法分析纯化的蛋白质以证实实验测定的质量与蛋白质的预期分子质量相匹配。对于在小鼠、兔或绵羊中的研究，蛋白质的内毒素水平对于小鼠和兔低于1内毒素单位(EU)/ml，并且对于绵羊低于40内毒素单位(EU)/ml。
蛋白质的热稳定性
使用热稳定性检测评估野生型ε毒素、Y30A-Y196A变体蛋白和Y30A-Y196A的4个突变体的结构稳定性。这表明Y30A-Y196A的解链温度(Tm，以℃计)低于野生型毒素的解链温度。但是，在Y30A-Y196A变体蛋白中引入另外的突变(V72、F92、H149、V166和A168)仅导致蛋白热稳定性的微小变化(图5)，这表明这些替换不会破坏蛋白的三级结构的稳定。Y30A-Y196A-H149A-A168F具有最低解链温度，表明这是所测试的突变体中最不稳定的。
变体蛋白在细胞培养物中的毒性
测试胰蛋白酶激活的纯化Etx蛋白对MDCK.2细胞、CHO细胞和表达hMAL、sMAL或dMAL的CHO细胞的毒性(表5)。如前面所发现的，Y30AY196A突变导致对MDCK细胞的毒性降低超过400倍。但是，与野生型毒素相比，该突变体显示出对表达hMAL的CHO细胞的毒性增加了57倍，对表达sMAL的CHO细胞的毒性降低了12倍，对表达dMAL的CHO细胞的毒性降低了180倍。将H149A、A168F、F92A或V72F突变另外引入β-辛基-葡萄糖苷结合位点降低了对表达hMAL的CHO细胞的毒性。
Figure BDA0002655236720000391
变体蛋白在小鼠中的毒性
对在CHO-hMAL细胞培养物中具有降低毒性的变体蛋白(Y30A-Y196A-H149A、Y30A-Y196A-A168F和Y30A-Y196A-H149A-A168F)测试了在小鼠中的毒性(表5)。当通过i.p.途径给予时，胰蛋白酶激活的Y30A-Y196A-H149A的MLD剂量为2μg至20μg，而胰蛋白酶激活的Y30A-Y196A-A168F或Y30A-Y196A-H149A-A168F的MLD剂量高于测试的最高剂量(20μg)。选择Y30A-Y196A-A168F蛋白，在胰蛋白酶激活之前或之后，通过s.c.途径做进一步的毒性测试。胰蛋白酶激活的蛋白质的MLD剂量为20μg至200μg，而未激活的蛋白质在测试的剂量下是无毒的。
对变体蛋白的抗体应答
用与弗氏不完全佐剂一起给予的Y30A-Y196A、Y30A-Y196A-A168F或Y30A-Y196A-H149A-A168F遗传类毒素免疫接种多组(每组3只)兔。这项工作由Cambridge ResearchBiochemicals(Cleveland，UK)进行。在第四次免疫剂后一周，测试血清中能够取代抗ε毒素的中和单克隆抗体的抗体，这表明血清中存在中和抗体。为了比较，发明人纳入了WHO国际标准ε毒素抗毒素，稀释至5IU/ml。结果表明，当用竞争ELISA测试时所有兔都产生了与野生型ε毒素反应的抗体。来自每个免疫组中的各只兔的血清中的滴度大致相似，因此发明人合并血清用于随后的测试。
发明人发现未稀释的血清或在PBS中稀释10倍的血清在取代中和抗体的能力上彼此相似，并且与国际标准ε毒素抗毒素相似。当稀释100倍时，抗Y30A-Y196A、Y30A-Y196A-A168F和Y30A-Y196A-H149A-A168F的血清在取代中和抗体方面比国际标准ε毒素抗毒素更有效(图4)。
羔羊的免疫接种
发明人用与MontanideTM ISA 61VG或氢氧化铝佐剂一起给予的2剂的Y30A-Y196A-A168F原毒素免疫了多组(每组5只或6只)羔羊(表6)。另一组羔羊在研究开始时具有预先存在的抗ε毒素抗体(用蛋白质印迹法检测)，这些羔羊用2剂的Y30A-Y196A-A168F蛋白质和MontanideTM ISA 61VG佐剂免疫接种。使用两种不同的检测，测试来自这些动物的血清和来自未被免疫接种的羔羊的对照血清中能够中和ε毒素的抗体的存在。首先，发明人使用竞争ELISA来测量羊血清取代中和单克隆抗体的能力。发明人还测试了该血清中和ε毒素对CHO-hMAL细胞的毒性的能力。在这两种检测中，发明人都纳入了含有已知浓度的中和抗体的标准血清的稀释液，以国际单位(IU/ml)表示。
发明人使用任一检测都没有在对照羔羊中检测到抗体。使用竞争ELISA，发明人在用类毒素和氢氧化铝佐剂免疫接种的组中检测到低水平的抗体，但使用CHO-hMAL检测，发明人无法检测到任何中和抗体。相反，使用MontanideTM ISA 61VG佐剂中的类毒素免疫接种的羔羊在两种检测中都产生高水平的中和抗体，在CHO-hMAL检测中超过64IU/ml，在竞争ELISA检测中为200IU/ml(表6)。相对于使用MontanideTM ISA 61VG佐剂中的类毒素免疫接种的没有预先存在的抗ε毒素抗体的羔羊，使用MontanideTM ISA 61VG佐剂中的类毒素免疫接种、但有预先存在的抗ε毒素抗体的羔羊在免疫后产生的中和抗体水平较低。
表6.用Y30A-Y196A-A168F免疫接种的羔羊中的中和抗体
Figure BDA0002655236720000411
hMAL＝人MAL
sMAL＝绵羊MAL
讨论
在先前研究中，本发明人研究了在推定的受体结合结构域(结构域1)中具有突变的Etx的定点突变体的潜力，并展示了Y30A和Y196A突变的组合显著降低了毒素结合MDCK细胞并杀死MDCK细胞的能力。本发明人之前还展示了Y30A-Y196A在小鼠中具有降低的毒性，表明Y30A-Y196A突变体能够形成抗肠毒血症的改进重组疫苗的基础。在体外中和检测中，抗Y30A-Y196A的多克隆抗体提供了抗野生型毒素的保护。
然而，先前的研究使用MDCK细胞系来测量细胞毒性，并且随后显示表达MAL的CHO细胞对毒素也是高度敏感的。MAL是该毒素的受体的可能性通过发现MAL敲除小鼠变得对Etx作用有抗性而得到支持。在形成本申请的基础的本研究中，发现与野生型Etx相比，Y30A-Y196A突变体对表达绵羊MAL的CHO细胞的毒性仅略低，而对表达人MAL的CHO细胞的毒性更高。然而，在表达犬MAL的CHO细胞中，突变体的毒性显著降低。该发现表明，来自不同物种的MAL与Etx的相互作用不同，表明在未来的研究中MDCK细胞以及表达MAL的CHO细胞都应该并行使用。
发明人引入了另外的突变以降低Y30A-Y196A对表达MAL的CHO细胞的毒性。将该突变引入结构域3中涉及糖结合的区域。这些突变体中许多在CHO-hMAL细胞培养物中以及对MDCK细胞和在小鼠中显示出降低的毒性。该数据证实了该区域在毒性中的作用。发明人能够生产出所有这些蛋白，并且基于热稳定性测量该蛋白似乎没有显示出稳定性的重大变化，表明该蛋白的构象与野生型ε毒素的构象大致相似。Y30AY196A+A168F突变体被选择用于在绵羊中进行测试，因为其在兔中诱导了强抗体应答。
含有氢氧化铝或皂苷作为佐剂的家畜疫苗通常诱导短期的抗体应答(Khorasaniet al.，(2016)Iranian journal of veterinary research 17：8-12)。这需要每隔一段时间的加强免疫，有时间隔短至4个月。MontanideTM ISA 61VG是一种用于家畜的新的即用的基于矿物油的佐剂，提供了在动物中诱导高水平的和长期的应答的潜力(Khorasani etal.，(2016))。与使用氢氧化铝佐剂相比，使用MontanideTM ISA 61VG佐剂导致诱导了更好的抗体应答，该发现与之前使用口蹄疫疫苗的发现(Khorasani et al.，(2016))相似。先前的报告也显示在诱导抗体应答方面，ISA 61VG优于ISA 201VG(油包水)佐剂或MontanideTMGel 01(水性聚合物)佐剂(Petermann et al.，(2017)Exp Appl Acarol.72：303-315)。在羔羊中使用含MontanideTM ISA 61VG佐剂的蛋白后未见局部副作用的证据，尽管其他人报告了使用该佐剂的局部副作用的证据(Petermann et al.，(2017)Exp Appl Acarol.72：303-315)。在欧洲，对于ε类毒素疫苗的许可，要求符合欧洲药典(Ph.Eur.)关于兽用产气荚膜梭菌疫苗的专论(0363)。所产生的类毒素显示出低于要求的残余毒性，并且发明人使用MontanideTM ISA 61VG佐剂达到的中和抗体的水平是阈值要求(5IU/ml)的至少10倍。
具有预先存在的抗ε毒素抗体的羔羊对疫苗接种的应答不太好，这一发现与在其他物种中的研究一致。例如，抗体会抑制对多种疫苗的应答(Voysey et al.，)2017)JAMApaediatrics 171：637-46；Edwards et al.，(2015)Vaccine 33：6469-72；Idoko et al.，(2014)Vaccine 32：4220-7；Zarnitsyna et al.，(2016)PLoS Pathog.12：e1005692)。这些预先存在的抗体可能会导致抗原的清除或限制B细胞激活的抗原-抗体复合物的形成或通过物理掩蔽来自B细胞的表位(Zarnitsyna et al.，(2016))。
本发明设计的疫苗将用于易感由产气荚膜梭菌ε毒素导致的肠毒血症的家畜。该疫苗相比于现有疫苗有许多优点，因为它在使用前不需要解毒。抗原的纯度和佐剂(如MontanideTM ISA 61VG)的使用应促进长期的免疫性，减少或消除对加强免疫接种的需要。此外，其可以作为诱导针对家畜的其它疾病的保护性抗体的多糖的蛋白载体(Petermannet al.，(2017)Exp Appl Acarol.72：303-315.；Voysey et al.，(2017)；Edwards et al.，(2015)Idoko et al.，(2014)；Zarnitsyna et al.，(2016)；35Byrd et al.，(1992)Veterinary immunology and immunopathology 34：307-24)。糖缀合物将促进对多糖部分的T细胞应答(Avci et al.，(2011)Nature medicine 17：1602-9)，增加抗体应答的强度和对多糖的记忆应答的诱导(Avci(2013)Current Topics in Medicinal Chemistry 13：2535-40)；Pace(2013)Expert opinion on biological therapy 13：11-33)。此外，多糖与ε毒素载体的连接将允许该疫苗用于幼年动物(PACE(2013))。Y30AY196A+A168F蛋白可以与多糖化学偶联，或者其可以被进一步修饰以作为利用细菌中天然存在的糖基化体系产生的重组糖缀合物的受体(Valguarnera et al.，(2016)J Mol Biol.428：3206-20；Cuccui etal.，(2015)The Journal of pharmacy and 10 pharmacology 67：338-50)。
最后，Y30AY196A+A168F蛋白将来可以开发用作人用疫苗。产气荚膜梭菌ε毒素被认为是潜在的生物威胁剂(Greenfield et al.，(2002)Am J Med Sci.323：326-40；Bergeret al.，(2016)Disaster and military medicine 2：7)，并且对处于危险中的个体进行疫苗接种将保护他们免于疾病。此外，最近ε毒素被认为在多发性硬化症的发展中起作用(Rumah et al.，(2013)PLoS One 8：e76359；Rumah et al.，(2015)PLoS Pathog.11：e1004896；Linden et al.，(2015)mBio.6)。如果建立了这种联系，那么预防该毒素的疫苗接种可能是潜在的预防或治疗选择。
保护性抗体应答的寿命
饲养羔羊而不免疫接种对抗产气荚膜梭菌ε毒素的疫苗，12个月后，5只羔羊的一组接受200μg含MontanideTM ISA 61VG(Seppic，Paris，France)佐剂的Y30AY196A+A168F类毒素(1∶1)，以6×0.5ml剂量皮下给予。三周后，给予羔羊第二剂含佐剂的蛋白。在研究开始时和免疫接种后长达12个月的间隔中采集血样。根据制造商的说明，使用MonoscreenELISA试剂盒(BioX Diagnostics，BIO K 222/2)进行竞争ELISA以测量中和抗体。发明人纳入了含有已知浓度的中和抗体的标准化血清稀释液，以国际单位(IU/ml)表示，以使其能够计算以IU/l表示的中和抗体的抗体水平。结果如下表7所示。
表7.用含MontanideTM ISA 61VG佐剂的Y30AY196A+A168F免疫接种后第0周和第3周的血清中的中和抗体
Figure BDA0002655236720000441
Figure BDA0002655236720000451
在施用本发明的类毒素和Montanide ISA 61VG佐剂的绵羊中发现的中和抗体滴度远超过报告的绵羊中的最低保护滴度(0.1IU/ml至0.3IU/ml(de la Rosa et al.1997(JAnim Sci 75(9)：2328-2334)；Uzal and Kelly 1998(Veterinary Record 142(26)：722-725)；或山羊中的最低保护滴度(1IU/ml(Uzal，Bodero et al.1998(Vet Rec 143(17)：472-474)，Uzal and Kelly 1998(Veterinary Record 142(26)：722-725))，并且在免疫接种后一年依然高于这一阈值。此外，中和抗体的水平在一剂本发明的疫苗(即在第3周)后超过了保护滴度，表明可实现用于家畜的单剂疫苗。
NMO、ON和TM患者样本测试
下表8显示了取自患有NMO的受试者的样品的蛋白质印迹数据，几乎所有受试者最初都出现了ON和/或TM。与对照组(其中2/25(8％)为阳性)相比，30个样本中的15个(50％)对Etx显示出非常强阳性(3)、强阳性(2)、阳性(8)或弱阳性(2)的反应性。
AQP-4抗体测试为阳性的所有受试者和15名受试者中Etx测试为阳性的11名受试者最初显示出横贯性脊髓炎(TM)和/或视神经炎(ON)的特征，TM和ON为视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)的实例。
表8：蛋白质印迹数据
Figure BDA0002655236720000452
Figure BDA0002655236720000461
粗斜体表示的对照：性别和年龄匹配+/-2岁
用ε毒素处理人红细胞(RBC)
测试人红细胞暴露于野生型Etx、Y30AY196A、Y30AY196A+H149A、Y30AY196A+A168F、Y30AY196A+F92A、Y30AY196A+V166A、和四位突变Y30AY196+A168F+H149A时的溶血。对10μM的原毒素和10μM和1μM的胰蛋白酶激活的毒素与3.3％的RBC进行测试。每种毒素在每种剂量做三次测试。结果相对于1％Tx100对照(导致100％溶血)来表示；阴性对照＝PBS。结果如图6所示，并说明了即使在胰蛋白酶激活时，Y30AY196A+H149A、Y30AY196A+A168F和Y30AY196+A168F+H149A也不溶血。
序列(突变位置以粗体显示)
SEQ ID NO：1
Figure BDA0002655236720000481
SEQ ID NO：2
Figure BDA0002655236720000482
SEQ ID NO：3
Figure BDA0002655236720000483
SEQ ID NO：4 Y30A突变
Figure BDA0002655236720000484
SEQ ID NO：5 Y196A突变
Figure BDA0002655236720000485
SEQ ID NO：6 H149A突变
Figure BDA0002655236720000486
SEQ ID NO：7 V72F突变
Figure BDA0002655236720000487
SEQ ID NO：8 F92A突变
Figure BDA0002655236720000488
SEQ ID NO：9 V166A突变
Figure BDA0002655236720000489
SEQ ID NO：10 A168F突变
Figure BDA00026552367200004810
SEQ ID NO：11全长野生型天然ε毒素
Figure BDA00026552367200004811
用于获得晶体结构的SEQ ID NO：12序列(PDB ID：1YUJ)
Figure BDA00026552367200004812
Figure BDA0002655236720000491
SEQ ID NO：13胰蛋白酶激活的野生型重组ε毒素
Figure BDA0002655236720000492
SEQ ID NO：14胰蛋白酶激活的具有H149A突变的重组ε毒素
Figure BDA0002655236720000493
SEQ ID NO：15全长重组ε毒素
Figure BDA0002655236720000494
SEQ ID NO：16胰蛋白酶激活的重组ε毒素(Y30A+Y196A)
Figure BDA0002655236720000495
SEQ ID NO：17胰蛋白酶激活的重组ε毒素(Y30A+Y196A+H149A)
Figure BDA0002655236720000501
SEQ ID NO：18胰蛋白酶激活的重组ε毒素(Y30A+Y196A+V72F)
Figure BDA0002655236720000502
SEQ ID NO：19胰蛋白酶激活的重组ε毒素(Y30A+Y196A+F92A)
Figure BDA0002655236720000503
SEQ ID NO：20胰蛋白酶激活的重组ε毒素(Y30A+Y196A+V166A)
Figure BDA0002655236720000504
SEQ ID NO：21胰蛋白酶激活的重组ε毒素
(Y30A+Y196A+A168F)
Figure BDA0002655236720000505
SEQ ID NO：22胰蛋白酶激活的重组ε毒素
(Y30A+Y196A+H149A+V72F)
Figure BDA0002655236720000511
SEQ ID NO：23胰蛋白酶激活的重组ε毒素
(Y30A+Y196A+H149A+F92A)
Figure BDA0002655236720000512
SEQ ID NO：24胰蛋白酶激活的重组ε毒素
(Y30A+Y196A+H149A+V166A)
Figure BDA0002655236720000513
SEQ ID NO：25胰蛋白酶激活的重组ε毒素
(Y30A+Y196A+H149A+A168F)
Figure BDA0002655236720000514
SEQ ID NO：26胰蛋白酶激活的重组ε毒素
(Y30A+Y196A+V72F+F92A)
Figure BDA0002655236720000515
SEQ ID NO：27胰蛋白酶激活的重组ε毒素
(Y30A+Y196A+V72F+V166A)
Figure BDA0002655236720000521
SEQ ID NO：28胰蛋白酶激活的重组ε毒素
(Y30A+Y196A+V72F+A168F)
Figure BDA0002655236720000522
SEQ ID NO：29胰蛋白酶激活的重组ε毒素
(Y30A+Y196A+F92A+V166A)
Figure BDA0002655236720000523
SEQ ID NO：30胰蛋白酶激活的重组ε毒素
(Y30A+Y196A+F92A+A168F)
Figure BDA0002655236720000524
SEQ ID NO：31胰蛋白酶激活的重组ε毒素
(Y30A+Y196A+V166A+A168F)
Figure BDA0002655236720000525
SEQ ID NO：32胰蛋白酶激活的重组ε毒素
(Y30A+Y196A+H149A+V72F+F92A)
Figure BDA0002655236720000531
SEQ ID NO：33胰蛋白酶激活的重组ε毒素
(Y30A+Y196A+H149A+V72F+V166A)
Figure BDA0002655236720000532
SEQ ID NO：34胰蛋白酶激活的重组ε毒素
(Y30A+Y196A+H149A+V72F+A168F)
Figure BDA0002655236720000533
SEQ ID NO：35胰蛋白酶激活的重组ε毒素
(Y30A+Y196A+H149A+F92A+V166A)
Figure BDA0002655236720000534
SEQ ID NO：36胰蛋白酶激活的重组ε毒素
(Y30A+Y196A+H149A+F92A+A168F)
Figure BDA0002655236720000535
SEQ ID NO：37胰蛋白酶激活的重组ε毒素
(Y30A+Y196A+H149A+V166A+A168F)
Figure BDA0002655236720000541
SEQ ID NO：38胰蛋白酶激活的重组ε毒素
(Y30A+Y196A+V72F+F92A+V166A)
Figure BDA0002655236720000542
SEQ ID NO：39胰蛋白酶激活的重组ε毒素
(Y30A+Y196A+V72F+F92A+A168F)
Figure BDA0002655236720000543
SEQ ID NO：40胰蛋白酶激活的重组ε毒素
(Y30A+Y196A+V72F+V166A+A168F)
Figure BDA0002655236720000544
SEQ ID NO：41胰蛋白酶激活的重组ε毒素
(Y30A+Y196A+F92A+V166A+A168F)
Figure BDA0002655236720000545
SEQ ID NO：42胰蛋白酶激活的重组ε毒素
(Y30A+Y196A+H149A+V72F+F92A+V166A)
Figure BDA0002655236720000551
SEQ ID NO：43胰蛋白酶激活的重组ε毒素
(Y30A+Y196A+H149A+V72F+F92A+A168F)
Figure BDA0002655236720000552
SEQ ID NO：44胰蛋白酶激活的重组ε毒素
(Y30A+Y196A+V72F+F92A+V166A+A168F)
Figure BDA0002655236720000553
SEQ ID NO：45胰蛋白酶激活的重组ε毒素
(Y30A+Y196A+H149A+V72F+F92A+V166A+A168F)
Figure BDA0002655236720000554
SEQ ID NO：46胰蛋白酶激活的重组ε毒素(V72F)
Figure BDA0002655236720000555
SEQ ID NO：47胰蛋白酶激活的重组ε毒素(F92A)
Figure BDA0002655236720000561
SEQ ID NO：48胰蛋白酶激活的重组ε毒素(H149A)
Figure BDA0002655236720000562
SEQ ID NO：49胰蛋白酶激活的重组ε毒素(V166A)
Figure BDA0002655236720000563
SEQ ID NO：50胰蛋白酶激活的重组ε毒素(A168F)
Figure BDA0002655236720000564
SEQ ID NO：51 Y43A正向
Figure BDA0002655236720000565
SEQ ID NO：52 Y43A反向
Figure BDA0002655236720000566
SEQ ID NO：53 Y209A正向
Figure BDA0002655236720000571
SEQ ID NO：54 Y209A反向
Figure BDA0002655236720000572
SEQ ID NO：55 H149A正向
Figure BDA0002655236720000573
SEQ ID NO：56 H149A反向
Figure BDA0002655236720000574
SEQ ID NO：57 V72F正向
Figure BDA0002655236720000575
SEQ ID NO：58 V72F反向
Figure BDA0002655236720000576
SEQ ID NO：59 F92A正向
Figure BDA0002655236720000577
SEQ ID NO：60 F92A反向
Figure BDA0002655236720000578
SEQ ID NO：61 V166A正向
Figure BDA0002655236720000579
SEQ ID NO：62 V166A反向
Figure BDA00026552367200005710
SEQ ID NO：63 A168F正向
Figure BDA00026552367200005711
SEQ ID NO：64 A168F反向
Figure BDA00026552367200005712
SEQ ID NO：65(图2未突变序列的残基1-260；胰蛋白酶激活多肽)
Figure BDA00026552367200005713
Figure BDA0002655236720000581
SEQ ID NO：66(图2信号序列残基1-32)
Figure BDA0002655236720000582
SEQ ID NO：67(图2N-末端前肽残基33-45)
to 45)
Figure BDA0002655236720000583
SEQ ID NO：68(图2C-末端前肽残基305-328)
305 to 328)
Figure BDA0002655236720000584
序列表
<110> 一康合资有限公司
<120> 作为疫苗的来自产气荚膜梭菌的ε毒素
<130> P3260PC00
<150> GB1803401.7
<151> 2018-03-02
<150> GB1900361.5
<151> 2019-01-10
<160> 68
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 蛋白质片段
<400> 1
Val Tyr Val Gly Lys Ala Leu Leu Thr Asn Asp Thr Gln Gln Glu Gln
1 5 10 15
Lys Leu Lys Ser Gln Ser Phe Thr Cys Lys
20 25
<210> 2
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 蛋白质片段
<400> 2
Thr His Asn Val Pro Ser Gln Asp Ile Leu Val Pro Ala Asn Thr Thr
1 5 10 15
Val Glu Val Ile Ala Tyr Leu Lys
20
<210> 3
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 蛋白质片段
<400> 3
Asp Glu Leu Ile Val Lys Val Arg Asn Leu Asn Thr Asn Asn Val Gln
1 5 10 15
Glu Tyr Val Ile Pro Val Asp Lys Lys Glu Lys Ser Asn Asp Ser Asn
20 25 30
Ile Val Lys Tyr Arg Ser Leu Tyr Ile Lys Ala Pro Gly Ile Lys
35 40 45
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 蛋白质片段突变体
<220>
<221> Xaa
<222> (6)..(6)
<223> 除Tyr以外的任何氨基酸，或是缺失
<400> 4
Arg Met Glu Lys Tyr Xaa Pro Asn Ala Met
1 5 10
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 蛋白质片段 突变体
<220>
<221> Xaa
<222> (6)..(6)
<223> 除Tyr以外的任何氨基酸，或是缺失
<400> 5
Gly Glu Ile Pro Ser Xaa Leu Ala Phe Pro
1 5 10
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 蛋白质片段 突变体
<220>
<221> Xaa
<222> (6)..(6)
<223> 除His以外的任何氨基酸，或是缺失
<400> 6
Ser Lys Glu Ile Thr Xaa Asn Val Pro Ser
1 5 10
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 蛋白质片段 突变体
<220>
<221> Xaa
<222> (6)..(6)
<223> 除Val以外的任何氨基酸，或是缺失
<400> 7
Leu Glu Asp Val Tyr Xaa Gly Lys Ala Leu
1 5 10
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 蛋白质片段 突变体
<220>
<221> Xaa
<222> (6)..(6)
<223> 除Phe以外的任何氨基酸，或是缺失
<400> 8
Leu Lys Ser Gln Ser Xaa Thr Cys Lys Asn
1 5 10
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 蛋白质片段 突变体
<220>
<221> Xaa
<222> (6)..(6)
<223> 除Val以外的任何氨基酸，或是缺失
<400> 9
Asn Thr Thr Val Glu Xaa Ile Ala Tyr Leu
1 5 10
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 蛋白质片段 突变体
<220>
<221> Xaa
<222> (6)..(6)
<223> 除Ala以外的任何氨基酸，或是缺失
<400> 10
Thr Val Glu Val Ile Xaa Tyr Leu Lys Lys
1 5 10
<210> 11
<211> 328
<212> PRT
<213> 产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）
<400> 11
Met Lys Lys Asn Leu Val Lys Ser Leu Ala Ile Ala Ser Ala Val Ile
1 5 10 15
Ser Ile Tyr Ser Ile Val Asn Ile Val Ser Pro Thr Asn Val Ile Ala
20 25 30
Lys Glu Ile Ser Asn Thr Val Ser Asn Glu Met Ser Lys Lys Ala Ser
35 40 45
Tyr Asp Asn Val Asp Thr Leu Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asn Thr Lys
50 55 60
Tyr Asn Tyr Leu Lys Arg Met Glu Lys Tyr Tyr Pro Asn Ala Met Ala
65 70 75 80
Tyr Phe Asp Lys Val Thr Ile Asn Pro Gln Gly Asn Asp Phe Tyr Ile
85 90 95
Asn Asn Pro Lys Val Glu Leu Asp Gly Glu Pro Ser Met Asn Tyr Leu
100 105 110
Glu Asp Val Tyr Val Gly Lys Ala Leu Leu Thr Asn Asp Thr Gln Gln
115 120 125
Glu Gln Lys Leu Lys Ser Gln Ser Phe Thr Cys Lys Asn Thr Asp Thr
130 135 140
Val Thr Ala Thr Thr Thr His Thr Val Gly Thr Ser Ile Gln Ala Thr
145 150 155 160
Ala Lys Phe Thr Val Pro Phe Asn Glu Thr Gly Val Ser Leu Thr Thr
165 170 175
Ser Tyr Ser Phe Ala Asn Thr Asn Thr Asn Thr Asn Ser Lys Glu Ile
180 185 190
Thr His Asn Val Pro Ser Gln Asp Ile Leu Val Pro Ala Asn Thr Thr
195 200 205
Val Glu Val Ile Ala Tyr Leu Lys Lys Val Asn Val Lys Gly Asn Val
210 215 220
Lys Leu Val Gly Gln Val Ser Gly Ser Glu Trp Gly Glu Ile Pro Ser
225 230 235 240
Tyr Leu Ala Phe Pro Arg Asp Gly Tyr Lys Phe Ser Leu Ser Asp Thr
245 250 255
Val Asn Lys Ser Asp Leu Asn Glu Asp Gly Thr Ile Asn Ile Asn Gly
260 265 270
Lys Gly Asn Tyr Ser Ala Val Met Gly Asp Glu Leu Ile Val Lys Val
275 280 285
Arg Asn Leu Asn Thr Asn Asn Val Gln Glu Tyr Val Ile Pro Val Asp
290 295 300
Lys Lys Glu Lys Ser Asn Asp Ser Asn Ile Val Lys Tyr Arg Ser Leu
305 310 315 320
Ser Ile Lys Ala Pro Gly Ile Lys
325
<210> 12
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 用于晶体结构分析的构建体
<400> 12
Lys Glu Ile Ser Asn Thr Val Ser Asn Glu Met Ser Lys Lys Ala Ser
1 5 10 15
Tyr Asp Asn Val Asp Thr Leu Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asn Thr Lys
20 25 30
Tyr Asn Tyr Leu Lys Arg Met Glu Lys Tyr Tyr Pro Asn Ala Met Ala
35 40 45
Tyr Phe Asp Lys Val Thr Ile Asn Pro Gln Gly Asn Asp Phe Tyr Ile
50 55 60
Asn Asn Pro Lys Val Glu Leu Asp Gly Glu Pro Ser Met Asn Tyr Leu
65 70 75 80
Glu Asp Val Tyr Val Gly Lys Ala Leu Leu Thr Asn Asp Thr Gln Gln
85 90 95
Glu Gln Lys Leu Lys Ser Gln Ser Phe Thr Cys Lys Asn Thr Asp Thr
100 105 110
Val Thr Ala Thr Thr Thr His Thr Val Gly Thr Ser Ile Gln Ala Thr
115 120 125
Ala Lys Phe Thr Val Pro Phe Asn Glu Thr Gly Val Ser Leu Thr Thr
130 135 140
Ser Tyr Ser Phe Ala Asn Thr Asn Thr Asn Thr Asn Ser Lys Glu Ile
145 150 155 160
Thr His Asn Val Pro Ser Gln Asp Ile Leu Val Pro Ala Asn Thr Thr
165 170 175
Val Glu Val Ile Ala Tyr Leu Lys Lys Val Asn Val Lys Gly Asn Val
180 185 190
Lys Leu Val Gly Gln Val Ser Gly Ser Glu Trp Gly Glu Ile Pro Ser
195 200 205
Tyr Leu Ala Phe Pro Arg Asp Gly Tyr Lys Phe Ser Leu Ser Asp Thr
210 215 220
Val Asn Lys Ser Asp Leu Asn Glu Asp Gly Thr Ile Asn Ile Asn Gly
225 230 235 240
Lys Gly Asn Tyr Ser Ala Val Met Gly Asp Glu Leu Ile Val Lys Val
245 250 255
Arg Asn Leu Asn Thr Asn Asn Val Gln Glu Tyr Val Ile Pro Val Asp
260 265 270
Lys Lys Glu Lys Ser Asn Asp Ser Asn Ile Val Lys Tyr Arg Ser Leu
275 280 285
Ser Ile Lys Ala Pro Gly Ile Lys
290 295
<210> 13
<211> 263
<212> PRT
<213> 产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）
<400> 13
Met Gly Lys Ala Ser Tyr Asp Asn Val Asp Thr Leu Ile Glu Lys Gly
1 5 10 15
Arg Tyr Asn Thr Lys Tyr Asn Tyr Leu Lys Arg Met Glu Lys Tyr Tyr
20 25 30
Pro Asn Ala Met Ala Tyr Phe Asp Lys Val Thr Ile Asn Pro Gln Gly
35 40 45
Asn Asp Phe Tyr Ile Asn Asn Pro Lys Val Glu Leu Asp Gly Glu Pro
50 55 60
Ser Met Asn Tyr Leu Glu Asp Val Tyr Val Gly Lys Ala Leu Leu Thr
65 70 75 80
Asn Asp Thr Gln Gln Glu Gln Lys Leu Lys Ser Gln Ser Phe Thr Cys
85 90 95
Lys Asn Thr Asp Thr Val Thr Ala Thr Thr Thr His Thr Val Gly Thr
100 105 110
Ser Ile Gln Ala Thr Ala Lys Phe Thr Val Pro Phe Asn Glu Thr Gly
115 120 125
Val Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Ser Phe Ala Asn Thr Asn Thr Asn Thr
130 135 140
Asn Ser Lys Glu Ile Thr His Asn Val Pro Ser Gln Asp Ile Leu Val
145 150 155 160
Pro Ala Asn Thr Thr Val Glu Val Ile Ala Tyr Leu Lys Lys Val Asn
165 170 175
Val Lys Gly Asn Val Lys Leu Val Gly Gln Val Ser Gly Ser Glu Trp
180 185 190
Gly Glu Ile Pro Ser Tyr Leu Ala Phe Pro Arg Asp Gly Tyr Lys Phe
195 200 205
Ser Leu Ser Asp Thr Val Asn Lys Ser Asp Leu Asn Glu Asp Gly Thr
210 215 220
Ile Asn Ile Asn Gly Lys Gly Asn Tyr Ser Ala Val Met Gly Asp Glu
225 230 235 240
Leu Ile Val Lys Val Arg Asn Leu Asn Thr Asn Asn Val Gln Glu Tyr
245 250 255
Val Ile Pro Val Asp Lys Lys
260
<210> 14
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 突变多肽
<400> 14
Met Gly Lys Ala Ser Tyr Asp Asn Val Asp Thr Leu Ile Glu Lys Gly
1 5 10 15
Arg Tyr Asn Thr Lys Tyr Asn Tyr Leu Lys Arg Met Glu Lys Tyr Tyr
20 25 30
Pro Asn Ala Met Ala Tyr Phe Asp Lys Val Thr Ile Asn Pro Gln Gly
35 40 45
Asn Asp Phe Tyr Ile Asn Asn Pro Lys Val Glu Leu Asp Gly Glu Pro
50 55 60
Ser Met Asn Tyr Leu Glu Asp Val Tyr Val Gly Lys Ala Leu Leu Thr
65 70 75 80
Asn Asp Thr Gln Gln Glu Gln Lys Leu Lys Ser Gln Ser Phe Thr Cys
85 90 95
Lys Asn Thr Asp Thr Val Thr Ala Thr Thr Thr His Thr Val Gly Thr
100 105 110
Ser Ile Gln Ala Thr Ala Lys Phe Thr Val Pro Phe Asn Glu Thr Gly
115 120 125
Val Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Ser Phe Ala Asn Thr Asn Thr Asn Thr
130 135 140
Asn Ser Lys Glu Ile Thr Ala Asn Val Pro Ser Gln Asp Ile Leu Val
145 150 155 160
Pro Ala Asn Thr Thr Val Glu Val Ile Ala Tyr Leu Lys Lys Val Asn
165 170 175
Val Lys Gly Asn Val Lys Leu Val Gly Gln Val Ser Gly Ser Glu Trp
180 185 190
Gly Glu Ile Pro Ser Tyr Leu Ala Phe Pro Arg Asp Gly Tyr Lys Phe
195 200 205
Ser Leu Ser Asp Thr Val Asn Lys Ser Asp Leu Asn Glu Asp Gly Thr
210 215 220
Ile Asn Ile Asn Gly Lys Gly Asn Tyr Ser Ala Val Met Gly Asp Glu
225 230 235 240
Leu Ile Val Lys Val Arg Asn Leu Asn Thr Asn Asn Val Gln Glu Tyr
245 250 255
Val Ile Pro Val Asp Lys Lys
260
<210> 15
<211> 315
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 重组多肽
<400> 15
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Gly Lys Ala Ser Tyr Asp Asn Val Asp
20 25 30
Thr Leu Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asn Thr Lys Tyr Asn Tyr Leu Lys
35 40 45
Arg Met Glu Lys Tyr Tyr Pro Asn Ala Met Ala Tyr Phe Asp Lys Val
50 55 60
Thr Ile Asn Pro Gln Gly Asn Asp Phe Tyr Ile Asn Asn Pro Lys Val
65 70 75 80
Glu Leu Asp Gly Glu Pro Ser Met Asn Tyr Leu Glu Asp Val Tyr Val
85 90 95
Gly Lys Ala Leu Leu Thr Asn Asp Thr Gln Gln Glu Gln Lys Leu Lys
100 105 110
Ser Gln Ser Phe Thr Cys Lys Asn Thr Asp Thr Val Thr Ala Thr Thr
115 120 125
Thr His Thr Val Gly Thr Ser Ile Gln Ala Thr Ala Lys Phe Thr Val
130 135 140
Pro Phe Asn Glu Thr Gly Val Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Ser Phe Ala
145 150 155 160
Asn Thr Asn Thr Asn Thr Asn Ser Lys Glu Ile Thr His Asn Val Pro
165 170 175
Ser Gln Asp Ile Leu Val Pro Ala Asn Thr Thr Val Glu Val Ile Ala
180 185 190
Tyr Leu Lys Lys Val Asn Val Lys Gly Asn Val Lys Leu Val Gly Gln
195 200 205
Val Ser Gly Ser Glu Trp Gly Glu Ile Pro Ser Tyr Leu Ala Phe Pro
210 215 220
Arg Asp Gly Tyr Lys Phe Ser Leu Ser Asp Thr Val Asn Lys Ser Asp
225 230 235 240
Leu Asn Glu Asp Gly Thr Ile Asn Ile Asn Gly Lys Gly Asn Tyr Ser
245 250 255
Ala Val Met Gly Asp Glu Leu Ile Val Lys Val Arg Asn Leu Asn Thr
260 265 270
Asn Asn Val Gln Glu Tyr Val Ile Pro Val Asp Lys Lys Glu Lys Ser
275 280 285
Asn Asp Ser Asn Ile Val Lys Tyr Arg Ser Leu Tyr Ile Lys Ala Pro
290 295 300
Gly Ile Lys Leu Glu His His His His His His
305 310 315
<210> 16
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 突变体多肽
<400> 16
Met Gly Lys Ala Ser Tyr Asp Asn Val Asp Thr Leu Ile Glu Lys Gly
1 5 10 15
Arg Tyr Asn Thr Lys Tyr Asn Tyr Leu Lys Arg Met Glu Lys Tyr Ala
20 25 30
Pro Asn Ala Met Ala Tyr Phe Asp Lys Val Thr Ile Asn Pro Gln Gly
35 40 45
Asn Asp Phe Tyr Ile Asn Asn Pro Lys Val Glu Leu Asp Gly Glu Pro
50 55 60
Ser Met Asn Tyr Leu Glu Asp Val Tyr Val Gly Lys Ala Leu Leu Thr
65 70 75 80
Asn Asp Thr Gln Gln Glu Gln Lys Leu Lys Ser Gln Ser Phe Thr Cys
85 90 95
Lys Asn Thr Asp Thr Val Thr Ala Thr Thr Thr His Thr Val Gly Thr
100 105 110
Ser Ile Gln Ala Thr Ala Lys Phe Thr Val Pro Phe Asn Glu Thr Gly
115 120 125
Val Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Ser Phe Ala Asn Thr Asn Thr Asn Thr
130 135 140
Asn Ser Lys Glu Ile Thr His Asn Val Pro Ser Gln Asp Ile Leu Val
145 150 155 160
Pro Ala Asn Thr Thr Val Glu Val Ile Ala Tyr Leu Lys Lys Val Asn
165 170 175
Val Lys Gly Asn Val Lys Leu Val Gly Gln Val Ser Gly Ser Glu Trp
180 185 190
Gly Glu Ile Pro Ser Ala Leu Ala Phe Pro Arg Asp Gly Tyr Lys Phe
195 200 205
Ser Leu Ser Asp Thr Val Asn Lys Ser Asp Leu Asn Glu Asp Gly Thr
210 215 220
Ile Asn Ile Asn Gly Lys Gly Asn Tyr Ser Ala Val Met Gly Asp Glu
225 230 235 240
Leu Ile Val Lys Val Arg Asn Leu Asn Thr Asn Asn Val Gln Glu Tyr
245 250 255
Val Ile Pro Val Asp Lys Lys
260
<210> 17
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 突变体多肽
<400> 17
Met Gly Lys Ala Ser Tyr Asp Asn Val Asp Thr Leu Ile Glu Lys Gly
1 5 10 15
Arg Tyr Asn Thr Lys Tyr Asn Tyr Leu Lys Arg Met Glu Lys Tyr Ala
20 25 30
Pro Asn Ala Met Ala Tyr Phe Asp Lys Val Thr Ile Asn Pro Gln Gly
35 40 45
Asn Asp Phe Tyr Ile Asn Asn Pro Lys Val Glu Leu Asp Gly Glu Pro
50 55 60
Ser Met Asn Tyr Leu Glu Asp Val Tyr Val Gly Lys Ala Leu Leu Thr
65 70 75 80
Asn Asp Thr Gln Gln Glu Gln Lys Leu Lys Ser Gln Ser Phe Thr Cys
85 90 95
Lys Asn Thr Asp Thr Val Thr Ala Thr Thr Thr His Thr Val Gly Thr
100 105 110
Ser Ile Gln Ala Thr Ala Lys Phe Thr Val Pro Phe Asn Glu Thr Gly
115 120 125
Val Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Ser Phe Ala Asn Thr Asn Thr Asn Thr
130 135 140
Asn Ser Lys Glu Ile Thr Ala Asn Val Pro Ser Gln Asp Ile Leu Val
145 150 155 160
Pro Ala Asn Thr Thr Val Glu Val Ile Ala Tyr Leu Lys Lys Val Asn
165 170 175
Val Lys Gly Asn Val Lys Leu Val Gly Gln Val Ser Gly Ser Glu Trp
180 185 190
Gly Glu Ile Pro Ser Ala Leu Ala Phe Pro Arg Asp Gly Tyr Lys Phe
195 200 205
Ser Leu Ser Asp Thr Val Asn Lys Ser Asp Leu Asn Glu Asp Gly Thr
210 215 220
Ile Asn Ile Asn Gly Lys Gly Asn Tyr Ser Ala Val Met Gly Asp Glu
225 230 235 240
Leu Ile Val Lys Val Arg Asn Leu Asn Thr Asn Asn Val Gln Glu Tyr
245 250 255
Val Ile Pro Val Asp Lys Lys
260
<210> 18
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 突变体多肽
<400> 18
Met Gly Lys Ala Ser Tyr Asp Asn Val Asp Thr Leu Ile Glu Lys Gly
1 5 10 15
Arg Tyr Asn Thr Lys Tyr Asn Tyr Leu Lys Arg Met Glu Lys Tyr Ala
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Leu Ile Val Lys Val Arg Asn Leu Asn Thr Asn Asn Val Gln Glu Tyr
245 250 255
Val Ile Pro Val Asp Lys Lys
260
<210> 19
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 突变体多肽
<400> 19
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1 5 10 15
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260
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<211> 263
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<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 突变体多肽
<400> 20
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<210> 21
<211> 263
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<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 突变体多肽
<400> 21
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<210> 22
<211> 263
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<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 突变体多肽
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<210> 23
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<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 突变体多肽
<400> 23
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<210> 24
<211> 263
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<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 突变体多肽
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<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 突变体多肽
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<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 突变体多肽
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260
<210> 27
<211> 263
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<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 突变体多肽
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260
<210> 28
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 突变体多肽
<400> 28
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<210> 29
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 突变体多肽
<400> 29
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<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 突变体多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 突变体多肽
<400> 31
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Val Ile Pro Val Asp Lys Lys
260
<210> 32
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<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 突变体多肽
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<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 突变体多肽
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<223> 突变体多肽
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<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 突变体多肽
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<220>
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<213> 人工序列（artificial sequence）
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<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 突变体多肽
<400> 39
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<220>
<223> 突变体多肽
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<220>
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<400> 43
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<220>
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<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 突变体多肽
<400> 45
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Asn Ser Lys Glu Ile Thr Ala Asn Val Pro Ser Gln Asp Ile Leu Val
145 150 155 160
Pro Ala Asn Thr Thr Val Glu Ala Ile Phe Tyr Leu Lys Lys Val Asn
165 170 175
Val Lys Gly Asn Val Lys Leu Val Gly Gln Val Ser Gly Ser Glu Trp
180 185 190
Gly Glu Ile Pro Ser Ala Leu Ala Phe Pro Arg Asp Gly Tyr Lys Phe
195 200 205
Ser Leu Ser Asp Thr Val Asn Lys Ser Asp Leu Asn Glu Asp Gly Thr
210 215 220
Ile Asn Ile Asn Gly Lys Gly Asn Tyr Ser Ala Val Met Gly Asp Glu
225 230 235 240
Leu Ile Val Lys Val Arg Asn Leu Asn Thr Asn Asn Val Gln Glu Tyr
245 250 255
Val Ile Pro Val Asp Lys Lys
260
<210> 46
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 突变体多肽
<400> 46
Met Gly Lys Ala Ser Tyr Asp Asn Val Asp Thr Leu Ile Glu Lys Gly
1 5 10 15
Arg Tyr Asn Thr Lys Tyr Asn Tyr Leu Lys Arg Met Glu Lys Tyr Tyr
20 25 30
Pro Asn Ala Met Ala Tyr Phe Asp Lys Val Thr Ile Asn Pro Gln Gly
35 40 45
Asn Asp Phe Tyr Ile Asn Asn Pro Lys Val Glu Leu Asp Gly Glu Pro
50 55 60
Ser Met Asn Tyr Leu Glu Asp Val Tyr Phe Gly Lys Ala Leu Leu Thr
65 70 75 80
Asn Asp Thr Gln Gln Glu Gln Lys Leu Lys Ser Gln Ser Phe Thr Cys
85 90 95
Lys Asn Thr Asp Thr Val Thr Ala Thr Thr Thr His Thr Val Gly Thr
100 105 110
Ser Ile Gln Ala Thr Ala Lys Phe Thr Val Pro Phe Asn Glu Thr Gly
115 120 125
Val Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Ser Phe Ala Asn Thr Asn Thr Asn Thr
130 135 140
Asn Ser Lys Glu Ile Thr His Asn Val Pro Ser Gln Asp Ile Leu Val
145 150 155 160
Pro Ala Asn Thr Thr Val Glu Val Ile Ala Tyr Leu Lys Lys Val Asn
165 170 175
Val Lys Gly Asn Val Lys Leu Val Gly Gln Val Ser Gly Ser Glu Trp
180 185 190
Gly Glu Ile Pro Ser Tyr Leu Ala Phe Pro Arg Asp Gly Tyr Lys Phe
195 200 205
Ser Leu Ser Asp Thr Val Asn Lys Ser Asp Leu Asn Glu Asp Gly Thr
210 215 220
Ile Asn Ile Asn Gly Lys Gly Asn Tyr Ser Ala Val Met Gly Asp Glu
225 230 235 240
Leu Ile Val Lys Val Arg Asn Leu Asn Thr Asn Asn Val Gln Glu Tyr
245 250 255
Val Ile Pro Val Asp Lys Lys
260
<210> 47
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 突变体多肽
<400> 47
Met Gly Lys Ala Ser Tyr Asp Asn Val Asp Thr Leu Ile Glu Lys Gly
1 5 10 15
Arg Tyr Asn Thr Lys Tyr Asn Tyr Leu Lys Arg Met Glu Lys Tyr Tyr
20 25 30
Pro Asn Ala Met Ala Tyr Phe Asp Lys Val Thr Ile Asn Pro Gln Gly
35 40 45
Asn Asp Phe Tyr Ile Asn Asn Pro Lys Val Glu Leu Asp Gly Glu Pro
50 55 60
Ser Met Asn Tyr Leu Glu Asp Val Tyr Val Gly Lys Ala Leu Leu Thr
65 70 75 80
Asn Asp Thr Gln Gln Glu Gln Lys Leu Lys Ser Gln Ser Ala Thr Cys
85 90 95
Lys Asn Thr Asp Thr Val Thr Ala Thr Thr Thr His Thr Val Gly Thr
100 105 110
Ser Ile Gln Ala Thr Ala Lys Phe Thr Val Pro Phe Asn Glu Thr Gly
115 120 125
Val Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Ser Phe Ala Asn Thr Asn Thr Asn Thr
130 135 140
Asn Ser Lys Glu Ile Thr His Asn Val Pro Ser Gln Asp Ile Leu Val
145 150 155 160
Pro Ala Asn Thr Thr Val Glu Val Ile Ala Tyr Leu Lys Lys Val Asn
165 170 175
Val Lys Gly Asn Val Lys Leu Val Gly Gln Val Ser Gly Ser Glu Trp
180 185 190
Gly Glu Ile Pro Ser Tyr Leu Ala Phe Pro Arg Asp Gly Tyr Lys Phe
195 200 205
Ser Leu Ser Asp Thr Val Asn Lys Ser Asp Leu Asn Glu Asp Gly Thr
210 215 220
Ile Asn Ile Asn Gly Lys Gly Asn Tyr Ser Ala Val Met Gly Asp Glu
225 230 235 240
Leu Ile Val Lys Val Arg Asn Leu Asn Thr Asn Asn Val Gln Glu Tyr
245 250 255
Val Ile Pro Val Asp Lys Lys
260
<210> 48
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 突变体多肽
<400> 48
Met Gly Lys Ala Ser Tyr Asp Asn Val Asp Thr Leu Ile Glu Lys Gly
1 5 10 15
Arg Tyr Asn Thr Lys Tyr Asn Tyr Leu Lys Arg Met Glu Lys Tyr Tyr
20 25 30
Pro Asn Ala Met Ala Tyr Phe Asp Lys Val Thr Ile Asn Pro Gln Gly
35 40 45
Asn Asp Phe Tyr Ile Asn Asn Pro Lys Val Glu Leu Asp Gly Glu Pro
50 55 60
Ser Met Asn Tyr Leu Glu Asp Val Tyr Val Gly Lys Ala Leu Leu Thr
65 70 75 80
Asn Asp Thr Gln Gln Glu Gln Lys Leu Lys Ser Gln Ser Phe Thr Cys
85 90 95
Lys Asn Thr Asp Thr Val Thr Ala Thr Thr Thr His Thr Val Gly Thr
100 105 110
Ser Ile Gln Ala Thr Ala Lys Phe Thr Val Pro Phe Asn Glu Thr Gly
115 120 125
Val Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Ser Phe Ala Asn Thr Asn Thr Asn Thr
130 135 140
Asn Ser Lys Glu Ile Thr Ala Asn Val Pro Ser Gln Asp Ile Leu Val
145 150 155 160
Pro Ala Asn Thr Thr Val Glu Val Ile Ala Tyr Leu Lys Lys Val Asn
165 170 175
Val Lys Gly Asn Val Lys Leu Val Gly Gln Val Ser Gly Ser Glu Trp
180 185 190
Gly Glu Ile Pro Ser Tyr Leu Ala Phe Pro Arg Asp Gly Tyr Lys Phe
195 200 205
Ser Leu Ser Asp Thr Val Asn Lys Ser Asp Leu Asn Glu Asp Gly Thr
210 215 220
Ile Asn Ile Asn Gly Lys Gly Asn Tyr Ser Ala Val Met Gly Asp Glu
225 230 235 240
Leu Ile Val Lys Val Arg Asn Leu Asn Thr Asn Asn Val Gln Glu Tyr
245 250 255
Val Ile Pro Val Asp Lys Lys
260
<210> 49
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 突变体多肽
<400> 49
Met Gly Lys Ala Ser Tyr Asp Asn Val Asp Thr Leu Ile Glu Lys Gly
1 5 10 15
Arg Tyr Asn Thr Lys Tyr Asn Tyr Leu Lys Arg Met Glu Lys Tyr Tyr
20 25 30
Pro Asn Ala Met Ala Tyr Phe Asp Lys Val Thr Ile Asn Pro Gln Gly
35 40 45
Asn Asp Phe Tyr Ile Asn Asn Pro Lys Val Glu Leu Asp Gly Glu Pro
50 55 60
Ser Met Asn Tyr Leu Glu Asp Val Tyr Val Gly Lys Ala Leu Leu Thr
65 70 75 80
Asn Asp Thr Gln Gln Glu Gln Lys Leu Lys Ser Gln Ser Phe Thr Cys
85 90 95
Lys Asn Thr Asp Thr Val Thr Ala Thr Thr Thr His Thr Val Gly Thr
100 105 110
Ser Ile Gln Ala Thr Ala Lys Phe Thr Val Pro Phe Asn Glu Thr Gly
115 120 125
Val Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Ser Phe Ala Asn Thr Asn Thr Asn Thr
130 135 140
Asn Ser Lys Glu Ile Thr His Asn Val Pro Ser Gln Asp Ile Leu Val
145 150 155 160
Pro Ala Asn Thr Thr Val Glu Ala Ile Ala Tyr Leu Lys Lys Val Asn
165 170 175
Val Lys Gly Asn Val Lys Leu Val Gly Gln Val Ser Gly Ser Glu Trp
180 185 190
Gly Glu Ile Pro Ser Tyr Leu Ala Phe Pro Arg Asp Gly Tyr Lys Phe
195 200 205
Ser Leu Ser Asp Thr Val Asn Lys Ser Asp Leu Asn Glu Asp Gly Thr
210 215 220
Ile Asn Ile Asn Gly Lys Gly Asn Tyr Ser Ala Val Met Gly Asp Glu
225 230 235 240
Leu Ile Val Lys Val Arg Asn Leu Asn Thr Asn Asn Val Gln Glu Tyr
245 250 255
Val Ile Pro Val Asp Lys Lys
260
<210> 50
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 突变体多肽
<400> 50
Met Gly Lys Ala Ser Tyr Asp Asn Val Asp Thr Leu Ile Glu Lys Gly
1 5 10 15
Arg Tyr Asn Thr Lys Tyr Asn Tyr Leu Lys Arg Met Glu Lys Tyr Tyr
20 25 30
Pro Asn Ala Met Ala Tyr Phe Asp Lys Val Thr Ile Asn Pro Gln Gly
35 40 45
Asn Asp Phe Tyr Ile Asn Asn Pro Lys Val Glu Leu Asp Gly Glu Pro
50 55 60
Ser Met Asn Tyr Leu Glu Asp Val Tyr Val Gly Lys Ala Leu Leu Thr
65 70 75 80
Asn Asp Thr Gln Gln Glu Gln Lys Leu Lys Ser Gln Ser Phe Thr Cys
85 90 95
Lys Asn Thr Asp Thr Val Thr Ala Thr Thr Thr His Thr Val Gly Thr
100 105 110
Ser Ile Gln Ala Thr Ala Lys Phe Thr Val Pro Phe Asn Glu Thr Gly
115 120 125
Val Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Ser Phe Ala Asn Thr Asn Thr Asn Thr
130 135 140
Asn Ser Lys Glu Ile Thr His Asn Val Pro Ser Gln Asp Ile Leu Val
145 150 155 160
Pro Ala Asn Thr Thr Val Glu Val Ile Phe Tyr Leu Lys Lys Val Asn
165 170 175
Val Lys Gly Asn Val Lys Leu Val Gly Gln Val Ser Gly Ser Glu Trp
180 185 190
Gly Glu Ile Pro Ser Tyr Leu Ala Phe Pro Arg Asp Gly Tyr Lys Phe
195 200 205
Ser Leu Ser Asp Thr Val Asn Lys Ser Asp Leu Asn Glu Asp Gly Thr
210 215 220
Ile Asn Ile Asn Gly Lys Gly Asn Tyr Ser Ala Val Met Gly Asp Glu
225 230 235 240
Leu Ile Val Lys Val Arg Asn Leu Asn Thr Asn Asn Val Gln Glu Tyr
245 250 255
Val Ile Pro Val Asp Lys Lys
260
<210> 51
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 引物序列
<400> 51
gaaaggaaga tataatacaa aatataatta cttaaagaga atggaaaaat atgcgcctaa 60
tgctatggca tattttgata agg 83
<210> 52
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 引物序列
<400> 52
ccttatcaaa atatgccata gcattaggcg catatttttc cattctcttt aagtaattat 60
attttgtatt atatcttcct ttc 83
<210> 53
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 引物序列
<400> 53
gtgaatgggg agagatacct agtgcgttag cttttcctag ggatggtta 49
<210> 54
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 引物序列
<400> 54
taaccatccc taggaaaagc taacgcacta ggtatctctc cccattcac 49
<210> 55
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 引物序列
<400> 55
caaatacaaa tacaaatact aattcaaaag aaattactgc taatgtccct tcacaagata 60
tacta 65
<210> 56
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 引物序列
<400> 56
tagtatatct tgtgaaggga cattagcagt aatttctttt gaattagtat ttgtatttgt 60
atttg 65
<210> 57
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 引物序列
<400> 57
agaaccatca atgaattatc ttgaagatgt ttattttgga aaagctctct taac 54
<210> 58
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 引物序列
<400> 58
gttaagagag cttttccaaa ataaacatct tcaagataat tcattgatgg ttct 54
<210> 59
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 引物序列
<400> 59
tcttaactaa tgatactcaa caagaacaaa aattaaaatc acaatcagcg acttgtaaaa 60
atactgatac agtaac 76
<210> 60
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 引物序列
<400> 60
gttactgtat cagtattttt acaagtcgct gattgtgatt ttaatttttg ttcttgttga 60
gtatcattag ttaaga 76
<210> 61
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 引物序列
<400> 61
atactagtac cagctaatac tactgtagaa gcgatagcat atttaaaaaa agttaatgtt 60
aaag 64
<210> 62
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 引物序列
<400> 62
ctttaacatt aacttttttt aaatatgcta tcgcttctac agtagtatta gctggtacta 60
gtat 64
<210> 63
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 引物序列
<400> 63
gatatactag taccagctaa tactactgta gaagtaatat tttatttaaa aaaagttaat 60
gttaaaggaa atgtaaagtt ag 82
<210> 64
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 引物序列
<400> 64
ctaactttac atttccttta acattaactt tttttaaata aaatattact tctacagtag 60
tattagctgg tactagtata tc 82
<210> 65
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 蛋白质片段
<400> 65
Lys Ala Ser Tyr Asp Asn Val Asp Thr Leu Ile Glu Lys Gly Arg Tyr
1 5 10 15
Asn Thr Lys Tyr Asn Tyr Leu Lys Arg Met Glu Lys Tyr Tyr Pro Asn
20 25 30
Ala Met Ala Tyr Phe Asp Lys Val Thr Ile Asn Pro Gln Gly Asn Asp
35 40 45
Phe Tyr Ile Asn Asn Pro Lys Val Glu Leu Asp Gly Glu Pro Ser Met
50 55 60
Asn Tyr Leu Glu Asp Val Tyr Val Gly Lys Ala Leu Leu Thr Asn Asp
65 70 75 80
Thr Gln Gln Glu Gln Lys Leu Lys Ser Gln Ser Phe Thr Cys Lys Asn
85 90 95
Thr Asp Thr Val Thr Ala Thr Thr Thr His Thr Val Gly Thr Ser Ile
100 105 110
Gln Ala Thr Ala Lys Phe Thr Val Pro Phe Asn Glu Thr Gly Val Ser
115 120 125
Leu Thr Thr Ser Tyr Ser Phe Ala Asn Thr Asn Thr Asn Thr Asn Ser
130 135 140
Lys Glu Ile Thr His Asn Val Pro Ser Gln Asp Ile Leu Val Pro Ala
145 150 155 160
Asn Thr Thr Val Glu Val Ile Ala Tyr Leu Lys Lys Val Asn Val Lys
165 170 175
Gly Asn Val Lys Leu Val Gly Gln Val Ser Gly Ser Glu Trp Gly Glu
180 185 190
Ile Pro Ser Tyr Leu Ala Phe Pro Arg Asp Gly Tyr Lys Phe Ser Leu
195 200 205
Ser Asp Thr Val Asn Lys Ser Asp Leu Asn Glu Asp Gly Thr Ile Asn
210 215 220
Ile Asn Gly Lys Gly Asn Tyr Ser Ala Val Met Gly Asp Glu Leu Ile
225 230 235 240
Val Lys Val Arg Asn Leu Asn Thr Asn Asn Val Gln Glu Tyr Val Ile
245 250 255
Pro Val Asp Lys
260
<210> 66
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 蛋白质片段
<400> 66
Met Lys Lys Asn Leu Val Lys Ser Leu Ala Ile Ala Ser Ala Val Ile
1 5 10 15
Ser Ile Tyr Ser Ile Val Asn Ile Val Ser Pro Thr Asn Val Ile Ala
20 25 30
<210> 67
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 蛋白质片段
<400> 67
Lys Glu Ile Ser Asn Thr Val Ser Asn Glu Met Ser Lys
1 5 10
<210> 68
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 蛋白质片段
<400> 68
Lys Glu Lys Ser Asn Asp Ser Asn Ile Val Lys Tyr Arg Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Ile Lys Ala Pro Gly Ile Lys
20

Claims (29)

1.一种预防或治疗有需要的人或动物受试者中的脱髓鞘病症的方法，所述病症选自：肠毒血症(ET)、多发性硬化症(MS)、临床确诊MS(CDMS)、临床孤立综合征(CIS)、视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)、视神经炎(ON)、视神经脊髓炎(NMO)、脊髓炎、脊髓炎、横贯性脊髓炎(TM)、以水通道蛋白-4(AQP-4)的抗体增加或存在和/或星形胶质细胞损伤为特征的疾病或病症、以及急性播散性脑脊髓炎(ADEM)，包括：向所述受试者施用一种包含有效量的剂的组合物，所述剂直接或间接干扰由产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)B型或D型菌株产生的ε毒素(Etx)、Etx结合受体或Etx与其结合受体的相互作用，从而抑制或阻遏Etx调节的受体信号传递活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述剂是Etx的抑制剂，例如抗体或其功能组分。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述剂是Etx结合受体的抑制剂或拮抗剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述Etx结合受体是髓磷脂和淋巴细胞蛋白(MAL)或甲型肝炎病毒细胞受体1蛋白(HAVCR1)。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述剂是抗产气荚膜梭菌B型或D型菌株的疫苗或抗由产气荚膜梭菌B型或D型菌株产生的ε毒素(Etx)的疫苗。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述剂包括ε毒素(Etx)多肽，所述ε毒素(Etx)多肽对表达髓磷脂和淋巴细胞(MAL)蛋白的细胞具有降低的毒性并且包含与野生型Etx多肽SEQ ID NO：65相比经修饰的结构域III，其中所述降低的毒性是相对于SEQ IDNO：65和/或SEQ ID NO：14的，并且其中所述Etx多肽能够与至少一种结合SEQ ID NO：65和/或SEQ ID NO：14所表示的序列的抗体相结合。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述经修饰的结构域III是在结构域III的聚糖(β-辛基-葡萄糖苷)结合位点中的修饰。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述经修饰的结构域III包括构成结构域III的如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中的氨基酸的一个或多个突变。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，包括以下一个或多个：SEQ ID NO：10、SEQID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的方法，包括SEQ ID NO：4和/或SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6。
11.根据权利要求6至10中任一项所述的方法，包括至少以下序列：
a.SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5；
并且任选地除(i)之外
b.SEQ ID NO：6；和
c.以下一个或多个：SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9。
12.根据权利要求6至11中任一项所述的方法，其中与包括SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的Etx多肽，或包括SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的Etx多肽相比，或与已知的Etx疫苗或Etx候选疫苗相比，所述降低的毒性降低。
13.根据权利要求6至12中任一项所述的方法，与SEQ ID NO：18至SEQ ID NO：50中的任一个具有至少60％的序列同一性，并且包括表3中针对相关SEQ ID NO指出的一个或多个突变或由表3中针对相关SEQ ID NO指出的一个或多个突变组成。
14.一种多核苷酸，其具有编码根据前述权利要求任一项所述的剂或多肽的核酸序列。
15.一种载体，其包含根据权利要求14的多核苷酸。
16.一种细胞，其包含根据权利要求1至5中任一项所述的剂、根据权利要求6至13中任一项所述的多肽和/或根据权利要求14所述的多核苷酸和/或根据权利要求15所述的载体。
17.一种亚单位疫苗或结合疫苗，其包含根据权利要求1-5中任一项所述的剂、根据权利要求6-13中任一项所述的多肽。
18.一种亲和试剂，其能够与根据权利要求1至5中任一项所述的剂、根据权利要求6至13中任一项所述的多肽之一相结合，并且促进施用过所述亲和试剂的个体体内的免疫应答。
19.一种制备免疫治疗组合物、任选地疫苗组合物的方法，其包括通过相对于野生型Etx多肽修饰结构域III来改变Etx多肽或包含Etx多肽的疫苗。
20.一种免疫治疗组合物或疫苗组合物，其是通过根据权利要求19所述的方法制备的。
21.一种免疫治疗组合物或疫苗组合物，其包含根据权利要求1至5中任一项所述的剂、根据权利要求6至13中任一项所述的多肽和/或根据权利要求14所述的多核苷酸和/或根据权利要求15所述的载体和/或根据权利要求16所述的细胞和/或根据权利要求17所述的亚单位疫苗和/或根据权利要求14所述的亲和试剂。
22.一种根据权利要求20或21所述的免疫治疗组合物，任选地疫苗组合物，其是人或动物的食品。
23.根据权利要求6至13中任一项所述的多肽和/或根据权利要求14所述的多核苷酸和/或根据权利要求15所述的载体和/或根据权利要求16所述的细胞和/或根据权利要求17所述的亚单位疫苗或结合疫苗和/或根据权利要求18所述的亲和试剂和/或根据权利要求20至22中任一项所述的免疫治疗组合物或疫苗组合物、或根据权利要求1至5中任一项所述的剂，其在治疗或免疫接种受试者以对抗患上由产气荚膜梭菌导致的或与产气荚膜梭菌相关的疾病和/或由(活性)ε毒素导致的或与(活性)ε毒素相关的疾病和/或对抗脱髓鞘疾病的方法中的用途。
24.根据权利要求23所述的多肽，其中所述疾病选自：肠毒血症(ET)、多发性硬化症(MS)、临床确诊MS(CDMS)、临床孤立综合征(CIS)、视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)、视神经炎(ON)、视神经脊髓炎(NMO)、脊髓炎、脊髓炎、横贯性脊髓炎(TM)、以水通道蛋白-4(AQP-4)的抗体增加或存在和/或星形胶质细胞损伤为特征的疾病或病症、以及急性播散性脑脊髓炎(ADEM)。
25.一种治疗患有由产气荚膜梭菌的存在导致的或与产气荚膜梭菌的存在相关的疾病和/或由(活性)ε毒素的存在导致的或与(活性)ε毒素的存在相关的疾病的受试者和/或治疗受试者以对抗脱髓鞘疾病的方法，或一种免疫接种受试者以对抗患上所述疾病的方法，所述方法包括向受试者施用根据权利要求1至5中任一项所述的剂、根据权利要求6至13中任一项所述的多肽和/或根据权利要求14所述的多核苷酸和/或根据权利要求15所述的载体和/或根据权利要求16所述的细胞和/或根据权利要求17所述的亚单位疫苗和/或根据权利要求18所述的亲和试剂和/或根据权利要求20至22中任一项所述的疫苗组合物或免疫治疗组合物，其中所述脱髓鞘病症选自：肠毒血症(ET)、多发性硬化症(MS)、临床确诊MS(CDMS)、临床孤立综合征(CIS)、视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)、视神经炎(ON)、视神经脊髓炎(NMO)、脊髓炎、横贯性脊髓炎(TM)、以水通道蛋白-4(AQP-4)的抗体增加或存在和/或星形胶质细胞损伤为特征的疾病或病症、以及急性播散性脑脊髓炎(ADEM)。
26.根据权利要求20至22中任一项所述的多肽、多核苷酸、载体、细胞、亲和试剂、疫苗组合物或免疫治疗组合物，或根据权利要求25所述的方法，其中所述受试者是反刍动物、马、伴侣动物或人。
27.MAL细胞作为模型在测试ε候选疫苗的毒性中的用途。
28.一种试剂盒，其包括根据权利要求1至5中任一项所述的剂、根据权利要求6至13中任一项所述的多肽和/或根据权利要求14所述的多核苷酸和/或根据权利要求15所述的载体和/或根据权利要求16所述的细胞和/或根据权利要求17所述的亚单位疫苗和/或根据权利要求18所述的亲和试剂和/或根据权利要求20至22中任一项所述的疫苗组合物或免疫治疗组合物。
29.基本上如本文所述的多肽、多核苷酸、载体、细胞、亚单位疫苗、结合疫苗、亲和试剂、疫苗组合物或免疫治疗组合物或方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114432297A (zh) * 2022-02-07 2022-05-06 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 Zaragozic acid A在产气荚膜梭菌Epsilon毒素中毒救治中的应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111961121B (zh) * 2020-09-02 2022-05-31 天康制药(苏州)有限公司 产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白及其制备方法、应用和疫苗
CN117417847B (zh) * 2023-08-22 2024-03-15 大理大学 一种大理梭菌及其在制备抗氧化功能性物质中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101845082A (zh) * 2010-05-07 2010-09-29 吉林大学 一种猪血凝性脑脊髓炎病毒结合蛋白及制备方法和用途
US20150064207A1 (en) * 2012-03-29 2015-03-05 University Of Exeter Epsilon toxin epitopes from clostridium perfringens with reduced toxicity
CN104560780A (zh) * 2014-11-28 2015-04-29 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 产气荚膜梭菌ε毒素减毒突变体及其应用
CN105050621A (zh) * 2013-02-14 2015-11-11 康奈尔大学 防止和治疗多发性硬化症的方法
CN106987548A (zh) * 2017-04-10 2017-07-28 东北农业大学 一种同时表达产气荚膜梭菌α、β2、ε、β1外毒素的重组乳酸杆菌及其构建方法和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012004645A1 (en) * 2010-07-05 2012-01-12 National Institute Of Immunology A RECOMBINANT VACCINE AGAINST CLOSTRIDIUM PERFRINGENS INFECTION AND EPSILON (ε) TOXIN INTOXICATION

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101845082A (zh) * 2010-05-07 2010-09-29 吉林大学 一种猪血凝性脑脊髓炎病毒结合蛋白及制备方法和用途
US20150064207A1 (en) * 2012-03-29 2015-03-05 University Of Exeter Epsilon toxin epitopes from clostridium perfringens with reduced toxicity
CN105050621A (zh) * 2013-02-14 2015-11-11 康奈尔大学 防止和治疗多发性硬化症的方法
CN104560780A (zh) * 2014-11-28 2015-04-29 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 产气荚膜梭菌ε毒素减毒突变体及其应用
CN106987548A (zh) * 2017-04-10 2017-07-28 东北农业大学 一种同时表达产气荚膜梭菌α、β2、ε、β1外毒素的重组乳酸杆菌及其构建方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MONIKA ET AL: "Clostridium perfringensepsilon toxin mutant Y30A-Y196A as a recombinant vaccine candidate against enterotoxemia", VACCIN, vol. 32, no. 23, pages 2682 - 2687, XP028644956, DOI: 10.1016/j.vaccine.2014.03.079 *
许崇利: "IPTG诱导剂对C型产气荚膜梭菌β_2毒素基因表达的影响", 湖北农业科学, vol. 55, no. 03, pages 749 - 752 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114432297A (zh) * 2022-02-07 2022-05-06 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 Zaragozic acid A在产气荚膜梭菌Epsilon毒素中毒救治中的应用
CN114432297B (zh) * 2022-02-07 2022-10-11 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 Zaragozic acid A在产气荚膜梭菌Epsilon毒素中毒救治中的应用

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