CN106987548A - 一种同时表达产气荚膜梭菌α、β2、ε、β1外毒素的重组乳酸杆菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时表达产气荚膜梭菌α、β2、ε、β1外毒素的重组乳酸杆菌及其构建方法和应用。本发明以从基因水平去毒性化改造的产气荚膜梭菌α、β1、β2和ε外毒素为免疫原，改造后的外毒素完全失去致病性，但仍保留其免疫原性，同时以乳酸杆菌作为传递与表达免疫抗原的安全级活菌载体，构建得到了一株能够同时表达产气荚膜梭菌α、β2、ε、β1外毒素的重组乳酸杆菌，并且创制了能够有效预防5个血清型产气荚膜梭菌感染的基因工程乳酸杆菌多价亚单位类毒素口服免疫制剂。本发明的提出为预防产气荚膜梭菌感染提供了有效的技术手段。

Description

一种同时表达产气荚膜梭菌α、β2、ε、β1外毒素的重组乳酸杆 菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种通过基因工程手段获得的重组乳酸菌，特别涉及一种同时表达产气荚膜梭菌α、β2、ε、β1外毒素的重组乳酸杆菌，还涉及该菌株的构建及其在制备产气荚膜梭菌疫苗中的用途。本发明属于兽用药物技术领域。

背景技术

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是典型的肠道致病细菌，主要引起牛、羊等动物坏死性肠炎、肠毒血症以及创伤性气性坏疽等疾病，是危害牛、羊养殖业发展的主要细菌性传染病之一。产气荚膜梭菌致病因子是其分泌的各种外毒素，其中α、β(β1、β2)、ε和ι是最主要的外毒素，根据产外毒素种类的不同，将产气荚膜梭菌分为A、B、C、D和E共5个血清型。A型产气荚膜梭菌，主要分泌α外毒素，可引起牛、羊等动物的气性坏疽和肌肉坏死；B型产气荚膜梭菌分泌α、β1和ε外毒素，主要引起羔羊痢疾及家畜创伤性坏疽；C型产气荚膜梭菌主要分泌α和β2外毒素，可引起牛、羊等动物坏死性肠炎和肠毒血症；D型产气荚膜梭菌主要分泌α和ε外毒素，对绵羊和山羊具有致死作用；E型产气荚膜梭菌主要分泌α和ι外毒素，可引起犊牛和羔羊的肠毒血症。

目前，已研制出了产气荚膜梭菌单价苗和多联灭活疫苗，用于预防产气荚膜梭菌病，如山东绿都生物科技有限公司和齐鲁动物保健品有限公司研制的兔产气荚膜梭菌(A型)灭活疫苗以及哈药集团生物疫苗有限公司研制的兔病毒性出血病-多杀性巴氏杆菌病-产气荚膜梭菌病(A型)三联灭活疫苗等。但现有的产气荚膜梭菌单价苗和多联灭活疫苗不能有效预防全部血清型，同时产气荚膜梭菌灭活疫苗生产过程中，外毒素的产生量对培养时间、温度、接种量以及培养基质量有着较高的要求，而且传统灭活疫苗还存在安全性不高(外毒素脱毒不完全)、免疫效果差、脱毒成本高等不足。此外，以注射途径为主的产气荚膜梭菌灭活疫苗，不能阻断产气荚膜梭菌经动物肠道感染的途径。

外毒素是产气荚膜梭菌的主要致病因子，利用外毒素制备的类毒素疫苗诱导动物机体产生的免疫应答不仅能够有效地抑制致病菌的感染，而且能够中和致病菌产生的外毒素。基于产气荚膜梭菌经肠道黏膜感染而致病的特点，集多种毒素研制多价亚单位口服疫苗，是科学防治产气荚膜梭菌病的理想途径。乳酸菌是一类益生菌，具有固有免疫佐剂效应、黏膜粘附特性、动物肠道良好的定殖能力以及增强机体非特异性免疫等生物学特性，益生性良好，在传递疫苗抗原有效诱导机体免疫应答，特别是生物安全方面，具有显著的优势，顺应了当前养殖业注重绿色、安全和环保的发展理念，是其他类疫苗载体系统所不及的。李晓静等构建了表达A型产气荚膜梭菌α毒素的重组干酪乳杆菌，口服免疫小鼠产生了一定的保护效果。但是，仅针对A型产气荚膜梭菌α毒素构建的基因工程乳酸菌对其它血清型的产气荚膜梭菌难以提供有效保护。

因此，根据产气荚膜梭菌经动物肠道致病的特点，集多种毒素从黏膜免疫角度设计疫苗以预防不同血清型产气荚膜梭菌的感染，对产气荚膜梭菌病的防控具有重要意义。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种能够预防不同血清型产气荚膜梭菌感染的口服疫苗制剂及其构建方法和应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明以从基因水平去毒性化改造的产气荚膜梭菌α、β1、β2、ε外毒素为免疫原，利用益生菌乳酸杆菌为疫苗抗原传递载体，构建得到了能够同时表达产气荚膜梭菌α、β1、β2、ε外毒素的重组乳酸杆菌，通过口服由该重组乳酸杆菌制备得到的预防产气荚膜梭菌病的基因工程乳酸杆菌多价类毒素亚单位疫苗，能够达到一次免疫预防5种血清型产气荚膜梭菌感染的目的。

具体的，本发明的一种同时表达产气荚膜梭菌α、β2、ε、β1外毒素的重组乳酸杆菌，以去毒性化的产气荚膜梭菌α、β2、ε、β1外毒素为免疫原，以乳酸杆菌作为传递与表达免疫原的活菌载体，其中，去毒性化改造后的产气荚膜梭菌α、β1、β2和ε外毒素的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-4所示。

其中，优选的，所述的乳酸杆菌分离于反刍动物的肠道。在本发明的一个具体实施例中，所述的乳酸杆菌为一株分离于反刍动物的肠道植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，当然，其他分离于反刍动物肠道的乳酸杆菌也适用于本发明。

进一步的，本发明还提出了一种构建所述的重组乳酸杆菌的方法，包括以下步骤：

(1)分别通过合成或PCR扩增的方法得到编码去毒性化的产气荚膜梭菌α、β2、ε、β1外毒素的基因序列；

(2)将步骤(1)得到的产气荚膜梭菌α、β2、ε、β1外毒素的编码基因依次克隆入乳酸杆菌表达质粒中，彼此之间通过柔性link序列连接，得到含有α-link-β2-link-ε-link-β1序列的重组质粒；

(3)制备乳酸杆菌感受态细胞，经电转化技术将步骤(2)构建的重组质粒转入乳酸杆菌感受态细胞，筛选重组乳酸杆菌转化子，得到同时表达产气荚膜梭菌α、β2、ε、β1外毒素的重组乳酸杆菌。

在本发明所述的方法中，优选的，步骤(1)中所述的编码去毒性化的产气荚膜梭菌α、β2、ε、β1外毒素的基因序列分别如SEQ ID NO.5-8所示。

在本发明所述的方法中，优选的，步骤(2)中所述的乳酸菌表达质粒为pPG612.1。

在本发明所述的方法中，优选的，步骤(2)中所述的柔性link序列如SEQ ID NO.9所示。

在本发明所述的方法中，优选的，步骤(3)中所述的乳酸杆菌感受态细胞为分离于反刍动物肠道的乳酸杆菌的感受态细胞。

更进一步的，本发明还提出了所述的同时表达产气荚膜梭菌α、β2、ε、β1外毒素的重组乳酸杆菌在制备防治产气荚膜梭菌病药物中的用途，优选在制备防治牛、羊产气荚膜梭菌病药物中的用途。

其中，优选的，所述的药物为产气荚膜梭菌基因工程乳酸杆菌多价类毒素亚单位疫苗。

其中，优选的，所述的产气荚膜梭菌病包括由产气荚膜梭菌A型、B型、C型、D型和E型共5个血清型所导致的产气荚膜梭菌病。

相较于现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明从基因水平去毒性化改造产气荚膜梭菌α、β1、β2和ε外毒素，使其完全失去致病性，同时保留其免疫原性，利用一株分离于反刍动物肠道中的植物乳酸杆菌作为传递与表达免疫抗原的安全级活菌载体，构建得到了一株能够同时表达产气荚膜梭菌α、β2、ε、β1外毒素的重组乳酸杆菌，并且创制了能够有效预防5个血清型产气荚膜梭菌感染的基因工程乳酸杆菌多价亚单位类毒素口服免疫制剂，为预防产气荚膜梭菌感染提供了有效的技术手段。

附图说明

图1为重组质粒pPG612.1-α-β2-ε-β1的鉴定结果；

M：DNA marker；1：BamH I酶切结果；2：Xho I酶切结果；3：PCR鉴定结果；

图2为重组类毒素的鉴定结果；

A)：SDS-PAGE鉴定结果：M：蛋白质分子量标准；1：经诱导的重组乳酸杆菌；2-3：未经诱导的重组乳酸杆菌；

B)：Western blot鉴定结果：1：未经诱导的重组乳酸杆菌；2：经诱导的重组乳酸杆菌；

图3为免疫鼠粪便中抗重组类毒素sIgA水平检测结果；

图4为免疫小鼠泪液中sIgA抗体水平检测结果；

图5为免疫小鼠阴道黏液中sIgA抗体水平检测结果；

图6为免疫鼠血清中抗重组类毒素特异性IgG抗体水平检测结果。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1同时表达产气荚膜梭菌α、β2、ε、β1外毒素的重组乳酸杆菌的构建

1.产气荚膜梭菌外毒素的去毒性改造

通过产气荚膜梭菌外毒素α、β1、β2和ε的生物信息分析，确定了决定每种外毒素毒性的关键基因位点，利用PCR方法进行去毒性化改造，使其成为类毒素。具体为：将编码α毒素基因的第202-204位残基突变为GGC；将编码β毒素(β1、β2)基因的第699-702位残基突变为GGA；将编码ε毒素基因的第316-318残基突变为CCA，编码去毒性化的产气荚膜梭菌外毒素α、β2、ε、β1基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5-8所示，其所编码得到的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-4所示。然后，将每种类毒素编码基因的PCR产物依次克隆入pMD19-T载体，α基因用BamH I和Kpn I酶切位点、β2基因用Kpn I和Sal I酶切位点、ε基因用Sal I和Xba I酶切位点、β1基因用Xba I和Xho I酶切位点，彼此之间用柔性link(SEQ ID NO.9所示)连接，构建得到含有α-link-β2-link-ε-link-β1序列的重组质粒，命名为pMD19-α-β2-ε-β1。

2.表达产气荚膜梭菌α、β1、β2、ε四联外毒素重组乳酸杆菌的构建

利用限制性核酸内切酶BamH I和Xho I分别对质粒pMD19-α-β2-ε-β1和乳酸菌表达质粒pPG612.1双酶切处理，经DNA胶回收试剂盒纯化目的基因片段。将回收纯化的α-β2-ε-β1基因片段与表达载体pPG612.1目的片段连接，构建重组表达质粒pPG612.1-α-β2-ε-β1，重组质粒的酶切鉴定结果见图1，经测序，该重组质粒核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

制备植物乳杆菌感受态细胞(该植物乳杆菌分离于反刍动物的肠道，由本实验室保存)，经电转化技术将构建的重组质粒pPG612.1-α-β2-ε-β1转入植物乳杆菌感受态细胞，在含有氯霉素抗性的选择培养基平板中筛选重组乳酸杆菌转化子，阳性重组乳酸杆菌命名为pPG612.1-α-β2-ε-β1/LP。

3.重组类毒素的表达与鉴定

以1％木糖为诱导剂，诱导重组乳酸杆菌pPG612.1-α-β2-ε-β1/LP表达重组类毒素α-β2-ε-β1，经SDS-PAGE检测，结果显示，重组类毒素获得表达，大小与理论值相符(见图2A：泳道1)。诱导表达产物经Western blot鉴定，结果显示，经重组乳酸杆菌pPG612.1-α-β2-ε-β1/LP表达的重组类毒素可被抗重组类毒素抗血清识别(见图2B：泳道2)。

实施例2重组乳酸杆菌免疫原性检测

本发明以BALB/c小鼠为动物模型系统性评价了实施例1得到的重组乳酸杆菌的免疫原性。免疫程序为：经口服灌胃途径接种重组乳酸杆菌pPG612-α-β2-ε-β1/LP，每只BALB/c小鼠每次接种菌量2×10⁸CFU/mL，每2周免疫1次，共免疫3次。同时，以口服接种非重组乳酸杆菌(LP)、PBS作为对照。采用ELISA方法检测实验鼠粪便、阴道粘液和泪液中sIgA抗体水平以及血清中IgG抗体水平。

此外，对经免动物进行了攻毒保护性试验：于第3次免疫后15天进行攻毒(纯化的产气荚膜梭菌外毒素)试验，每只小鼠经腹腔注射2倍最小致死剂量的产气荚膜梭菌外毒素，以评价重组乳酸杆菌的免疫保护效力。具体结果如下：

1、免疫鼠粪便中特异性sIgA抗体检测

结果见图3所示：口服免疫重组乳酸杆菌pPG612-α-β2-ε-β1/LP组小鼠粪便中检测出了高水平的抗重组类毒素sIgA抗体，而对照组(非重组乳酸杆菌组、PBS组)小鼠粪便中免疫前后sIgA抗体水平无差异。

2、免疫鼠泪液及阴道黏液中特异性sIgA抗体检测

不同时间分别采集免疫鼠眼冲洗液和外生殖道冲洗液样品，经ELISA方法检测样本中抗重组类毒素sIgA抗体水平，结果显示，在口服免疫重组乳酸杆菌pPG612-α-β2-ε-β1/LP组小鼠泪液(图4)中和阴道黏液(图5)中均检测出了较高水平的sIgA抗体水平，而对照组(非重组乳酸杆菌组、PBS组)小鼠泪液和阴道黏液中sIgA抗体水平免疫前后差异不显著。

3、免疫鼠血清中特异性IgG抗体检测

结果见图6所示：口服免疫重组乳酸杆菌pPG612-α-β2-ε-β1/LP组小鼠血清中检测出了高水平的抗重组类毒素特异性IgG抗体，而对照组(非重组乳酸杆菌组、PBS组)小鼠血清中抗重组类毒素特异性IgG抗体水平免疫前后无差异。

4、保护性评价

结果显示，口服免疫重组乳酸杆菌pPG612-α-β2-ε-β1/LP组小鼠能够完全抵抗2倍最小致死剂量的产气荚膜梭菌α、β1、β2和ε外毒素攻击，对照组小鼠攻毒素后24h内全部死亡，实验结果表明，口服免疫重组乳酸杆菌pPG612-α-β2-ε-β1/LP能够产生有效保护力(表1)。

表1攻毒素保护结果(存活数/试验数)

综上，本发明在产气荚膜梭菌α、β1、β2和ε外毒素去毒性化改造的基础上，成功构建了表达重组类毒素的基因工程乳酸菌pPG612-α-β2-ε-β1/LP。经口服途径免疫实验动物，既能有效诱导局部黏膜免疫应答，又可刺激机体产生系统的体液免疫应答，显示了良好的免疫保护作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种同时表达产气荚膜梭菌α、β2、ε、β1外毒素的重组乳酸杆菌及其构建方法和应用

<130> KLPI170194

<160> 10

<170> PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 398

<212> PRT

<213> Clostridium perfringens

<400> 1

1 MET Glu Arg Lys Ile Cys Lys Ala Leu Ile Cys Ala Ala Leu Arg

16 Thr Ser Leu Trp Ala Gly Ala Ser Thr Lys Val Tyr Ala Trp Asp

31 Gly Lys Ile Asp Gly Thr Gly Thr His Ala MET Ile Val Thr Gln

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181 Thr Phe Ala Glu Glu Arg Lys Glu Gln Tyr Lys Ile Asn Thr Ala

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211 Lys Asp Phe Asn Ala Trp Ser Lys Glu Tyr Ala Arg Gly Phe Ala

226 Lys Thr Gly Lys Ser Ile Tyr Tyr Ser His Ala Ser MET Ser His

241 Ser Trp Asp Asp Trp Asp Tyr Ala Ala Lys Val Thr Leu Ala Asn

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<210> 2

<211> 265

<212> PRT

<213> Clostridium perfringens

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<210> 3

<211> 328

<212> PRT

<213> Clostridium perfringens

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ctcttaacta atgatactca acaagaacaa aaattaaaat cacaatcatt cacttgtaaa 420

aatactgata cagtaactgc aactactact catactgtgg gaacttcgat acaagcaact 480

gctaagttta ctgttccttt taatgaaaca ggagtatcat taactactag ttatagtttt 540

gcaaatacaa atacaaatac taattcaaaa gaaattactc ataatgtccc ttcacaagat 600

atactagtac cagctaatac tactgtagaa gtaatagcat atttaaaaaa agttaatgtt 660

aaaggaaatg taaagttagt aggacaagta agtggaagtg aatggggaga gatacctagt 720

tatttagctt ttcctaggga tggttataaa tttagtttat cagatacagt aaataagagt 780

gatttaaatg aagatggtac tattaatatt aatggaaaag gaaattatag tgcagttatg 840

ggagatgagt taatagttaa ggttagaaat ttaaatacaa ataatgtaca agaatatgta 900

atacctgtag ataaaaaaga aaaaagtaat gattcaaata tagtaaaata taggagtctt 960

tctattaagg caccaggaat aaaataa 987

<210> 8

<211> 1011

<212> DNA

<213> Clostridium perfringens

<400> 8

atgaagaaaa aatttatttc attagttata gttagttcac ttttaaacgg atgcctatta 60

tcaccaactt tagtgtatgc aaatgatata ggtaaaacta ctactataac tagaaataag 120

acatcagatg gctatactat aattacacaa aatgataaac agataatatc atatcaatct 180

gttgactctt caagtaaaaa tgaagatggt tttactgcat ctatagatgc tagatttatc 240

gatgataaat attcatctga aatgacaact ttaataaact taactggatt tatgtcttca 300

aaaaaagaag atgttataaa aaaatacaat ttgcatgatg ttactaattc tactgcaatt 360

aattttccgg ttagatactc gatttctatt ttaaatgaaa gtattaatga aaatgtaaaa 420

atagttgata gtattcctaa aaatacaatt tctcaaaaaa ctgtatccaa tacaatggga 480

tacaaaatag gaggttcaat tgaaatagaa gaaaataaac ctaaagcttc aattgaaagc 540

gaatatgctg aatcatctac aatagaatat gtccaacctg atttttctac tatacagaca 600

gatcattcaa cctctaaagc ttcatgggat acaaaattta cagaaactac tcgtggtaat 660

tataatttaa aatcaaacaa ccctgtatat ggaaatgagg agtttatgta cggaagatat 720

actaatgttc ctgcaactga aaatataatt ccagattatc aaatgtcaaa attaataaca 780

ggtggtttaa accctaatat gtctgtagtt ctaactgctc ctaatggtac tgaagaatct 840

ataataaaag ttaaaatgga gcgtgaaaga aactgttatt atcttaattg gaatggtgct 900

aactgggtag gacaagtcta ttccaggcta gcttttgata ccccaaatgt agatagtcat 960

atatttacat tcaaaataaa ttggcttact cacaaagtaa cagctattta g 1011

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggtccaggtc catatgtg 18

<210> 10

<211> 7402

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctagaaagcg tttacaaaaa taagccaatg cgctgtaatc ttacttgtag gttggttgcc 60

gaaacaaact aaaaaggggg cagtaaaaag tgaaaaaaaa gaaaagtttc tggcttgttt 120

cttttttagt tatagtagct agtgttttct ttatatcttt tggatttagc aatcattcta 180

aacaagttgc tcaagcggct agtgatacga catcaactga tcactcaagc aatgatacag 240

ctgattctgt tagcgacggt gttattttgc atgcggatct agcggccgcg gatccatgga 300

aagaaagatt tgtaaggcgc ttatttgtgc tgcgctacga actagcctat gggctggggc 360

atcaactaaa gtctacgctt gggatggaaa aattgatgga acaggaactc atgctatgat 420

tgtaactcaa ggggtttcaa tcttagaaaa tgatctgtct aaaaatgaac cagaaagtgt 480

aagaaaaaac ttagagggct taaaagagaa catgcatgag cttcaattag gttctactta 540

tccagattat gataagaacg cctatgatct atatcaagat catttctggg atcctgatac 600

agataataat ttctcaaagg ataatagttg gtatttagct tattctatac ctgacacagg 660

ggaatcacaa ataagaaaat tttcagcatt agctagatat gaatggcaaa gaggaaacta 720

taaacaagct acattctatc ttggagaggc tatgcactat tttggagata tagatactcc 780

atatcatcct gctaatgtta ctgccgttga tagcgcagga catgttaagt ttgagacttt 840

tgcagaggaa agaaaagaac agtataaaat aaacacagca ggttgcaaaa ctaatgagga 900

tttttatgct gatatcttaa aaaacaaaga ttttaatgca tggtcaaaag aatatgcaag 960

aggttttgct aaaacaggaa aatcaatata ctatagtcat gctagcatga gtcatagttg 1020

ggatgattgg gattatgcag caaaggtaac tttagctaac tctcaaaaag gaacagcagg 1080

atatatttat agattcttac acgatgtatc agagggtaat gatccatcag ttggaaagaa 1140

tgtaaaagaa ctagtagctt acatatcaac tagtggtgag aaagatgctg gaacagatga 1200

ctacatgtat tttggaatca aaacaaagga tggaaaaact caagaatggg aaatggacaa 1260

cccaggaaat gattttatga ctggaagtaa agacacttat actttcaaat taaaagatga 1320

aaatctaaaa attgatgata tacaaaatat gtggattaga aaaagaaaat atacagcatt 1380

cccagatgct tataagccag aaaacataaa gataatagca aatggaaaag ttgtagtgga 1440

caaagatata aatgagtgga tttcaggaaa ttcaacttat aatataaaag gtaccggtcc 1500

aggtccatat gtgatgaaaa aattaatagt aaaaagtaca atgatgcttt tattttcttg 1560

cttattatgt ttaggaatac agttacctaa tacagttaaa gcaaatgaag tgaataaata 1620

ccaatctgta atggtacagt atttagaagc ttttaaaaat tatgatattg atacgatagt 1680

agatatttct aaagatagta gagctgttac taaagaagaa tataaaaaca tgttaatgga 1740

atttaaatat gatcctaacc aaaaacttaa atcatatgaa ataacaagtt caagaaaaat 1800

tgataatagt gaaatttttt ctgtgaaaac agagttttta aatggtgcta tatataatat 1860

ggaatttaca gtatcatata ttgataataa gttaatggta agtgatatga atagaatagc 1920

aataataaat gaaggtaaac gtattcctac accaagtttc agaactcaag tttgtacatg 1980

ggatgatgaa ttaagtcaat atattggaga cgctgttagt tttacacgtt ctagtaaatt 2040

tcaatatagc tctaatacta ttacattaaa ctttagacaa tatgcaactt ctggatcaag 2100

atcattaaag gtaaaataca gtgtagtaga ccattggatt tggggggatg acattagagc 2160

ttctcaatgg gtatatggtg aaaatccgga ttatgctaga cagataaaat tggatctagg 2220

ttcaggagaa actttccaaa attatagaat taaagtagaa aattatactc cagcatcaat 2280

tagagtattt ggtgaaggtt attgttatgt cgacggtcca ggtccatatg tgatgaaaaa 2340

aaatcttgta aaaagtttag caatcgcatc agcggtgata tccatctatt caatagttaa 2400

tattgtttcg ccaactaatg taatagctaa ggaaatatct aatacagtat ctaatgaaat 2460

gtccaaaaaa gcttcttatg ataatgtaga tacattaatt gagaaaggaa gatataatac 2520

aaaatataat tacttaaaga gaatggaaaa atattatcct aatgctatgg catattttga 2580

taaggttact ataaatccac aaggaaatga tttttatatt aataatccta aagttgaatt 2640

agatggacca ccatcaatga attatcttga agatgtttat gttggaaaag ctctcttaac 2700

taatgatact caacaagaac aaaaattaaa atcacaatca ttcacttgta aaaatactga 2760

tacagtaact gcaactacta ctcatactgt gggaacttcg atacaagcaa ctgctaagtt 2820

tactgttcct tttaatgaaa caggagtatc attaactact agttatagtt ttgcaaatac 2880

aaatacaaat actaattcaa aagaaattac tcataatgtc ccttcacaag atatactagt 2940

accagctaat actactgtag aagtaatagc atatttaaaa aaagttaatg ttaaaggaaa 3000

tgtaaagtta gtaggacaag taagtggaag tgaatgggga gagataccta gttatttagc 3060

ttttcctagg gatggttata aatttagttt atcagataca gtaaataaga gtgatttaaa 3120

tgaagatggt actattaata ttaatggaaa aggaaattat agtgcagtta tgggagatga 3180

gttaatagtt aaggttagaa atttaaatac aaataatgta caagaatatg taatacctgt 3240

agataaaaaa gaaaaaagta atgattcaaa tatagtaaaa tataggagtc tttctattaa 3300

ggcaccagga ataaaatcta gaggtccagg tccatatgtg atgaagaaaa aatttatttc 3360

attagttata gttagttcac ttttaaacgg atgcctatta tcaccaactt tagtgtatgc 3420

aaatgatata ggtaaaacta ctactataac tagaaataag acatcagatg gctatactat 3480

aattacacaa aatgataaac agataatatc atatcaatct gttgactctt caagtaaaaa 3540

tgaagatggt tttactgcat ctatagatgc tagatttatc gatgataaat attcatctga 3600

aatgacaact ttaataaact taactggatt tatgtcttca aaaaaagaag atgttataaa 3660

aaaatacaat ttgcatgatg ttactaattc tactgcaatt aattttccgg ttagatactc 3720

gatttctatt ttaaatgaaa gtattaatga aaatgtaaaa atagttgata gtattcctaa 3780

aaatacaatt tctcaaaaaa ctgtatccaa tacaatggga tacaaaatag gaggttcaat 3840

tgaaatagaa gaaaataaac ctaaagcttc aattgaaagc gaatatgctg aatcatctac 3900

aatagaatat gtccaacctg atttttctac tatacagaca gatcattcaa cctctaaagc 3960

ttcatgggat acaaaattta cagaaactac tcgtggtaat tataatttaa aatcaaacaa 4020

ccctgtatat ggaaatgagg agtttatgta cggaagatat actaatgttc ctgcaactga 4080

aaatataatt ccagattatc aaatgtcaaa attaataaca ggtggtttaa accctaatat 4140

gtctgtagtt ctaactgctc ctaatggtac tgaagaatct ataataaaag ttaaaatgga 4200

gcgtgaaaga aactgttatt atcttaattg gaatggtgct aactgggtag gacaagtcta 4260

ttccaggcta gcttttgata ccccaaatgt agatagtcat atatttacat tcaaaataaa 4320

ttggcttact cacaaagtaa cagctattta gctcgagtaa tgataaggtc acccctagag 4380

tcaactaaaa gccactactg taatagttaa aattgtttaa aagaggaaat cagtttgtta 4440

tcagttgatt tcctctttta tgtatcactg ttttcagagt aagttccaat ggctggcatt 4500

gctgttaata tgacactaga tgatataagt tatcatgtta agctcgatgg taagttgggt 4560

ttaattgata gaaaacataa tagttatgag atgcttgaaa tacctactaa aaatacattt 4620

ttaccaaatt ttatatgatc aagctcggcc gagctgtatt ctatagtgtc acctaaatcg 4680

tatgtgtatg atacataagg ttatgtatta attgtagccg cgttctaacg acaatatgta 4740

caagcctaat tgtgtagcat ctggcttact gaagcagacc ctatcatctc tctcgtaaac 4800

tgccgtcaga gtcggtttgg ttggacgaac cttctgagtt tctggtaacg ccgttccgca 4860

ccccggaaat ggtcagcgaa ccaatcagca gggtcatcgc tagagagcta gcaagcttgt 4920

cgagtgcata ttttcggcaa tcttctcaat gagatgctct tcagcatgtt caatgatgtc 4980

gattttttat taaaacgtct caaaatcgtt tctgagacgt tttagcgttt atttcgttta 5040

gttatcggca taatcgttaa aacaggcgtt atcgtagcgt aaaagccctt gagcgtagcg 5100

tgctttgcag cgaagatgtt gtctgttaga ttatgaaagc cgatgactga atgaaataat 5160

aagcgcagcg tccttctatt tcggttggag gaggctcaag ggagtttgag ggaatgaaat 5220

tccctcatgg gtttgatttt aaaaattgct tgcaattttg ccgagcggta gcgctggaaa 5280

atttttgaaa aaaatttgga atttggaaaa aaatgggggg aaaggaagcg aattttgctt 5340

ccgtactacg accccccatt aagtgccgag tgccaatttt tgtgccaaaa acgctctatc 5400

ccaactggct caagggtttg aggggttttt caatcgccaa cgaatcgcca acgttttcgc 5460

caacgttttt tataaatcta tatttaagta gctttattgt tgtttttatg attacaaagt 5520

gatacactaa ttttataaaa ttatttgatt ggagtttttt aaatggtgat ttcagaatcg 5580

aaaaaaagag ttatgatttc tctgacaaaa gagcaagata aaaaattaac agatatggcg 5640

aaacaaaaag gtttttcaaa atctgcggtt gcggcgttag ctatagaaga atatgcaaga 5700

aaggaatcag aacaaaaaaa ataagcgaaa gctcgcgttt ttagaaggat acgagttttc 5760

gctacttgtt tttgataagg taatatatca tggctattaa aaatactaaa gctagaaatt 5820

ttggattttt attatatcct gactcaattc ctaatgattg gaaagaaaaa ttagagagtt 5880

tgggcgtatc tatggctgtc agtcctttac acgatatgga cgaaaaaaaa gataaagata 5940

catggaatag tagtgatgtt atacgaaatg gaaagcacta taaaaaacca cactatcacg 6000

ttatatatat tgcacgaaat cctgtaacaa tagaaagcgt taggaacaag attaagcgaa 6060

aattggggaa tagttcagtt gctcatgttg agatacttga ttatatcaaa ggttcatatg 6120

aatatttgac tcatgaatca aaggacgcta ttgctaagaa taaacatata tacgacaaaa 6180

aagatatttt gaacattaat gattttgata ttgaccgcta tataacactt gatgaaagcc 6240

aaaaaagaga attgaagaat ttacttttag atatagtgga tgactataat ttggtaaata 6300

caaaagattt aatggctttt attcgcctta ggggagcgga gtttggaatt ttaaatacga 6360

atgatgtaaa agatattgtt tcaacaaact ctagcgcctt tagattatgg tttgagggca 6420

attatcagtg tggatataga gcaagttatg caaaggttct tgatgctgaa acgggggaaa 6480

taaaatgaca aacaaagaaa aagagttatt tgctgaaaat gaggaattaa aaaaagaaat 6540

taaggactta aaagagcgta ttgaaagata cagagaaatg gaagttgaat taagtacaac 6600

aatagattta ttgagaggag gcatatcaaa tgaactttaa taaaattgat ttagacaatt 6660

ggaagagaaa agagatattt aatcattatt tgaaccaaca aacgactttt agtataacca 6720

cagaaattga tattagtgtt ttataccgaa acataaaaca agaaggatat aaattttacc 6780

ctgcatttat tttcttagtg acaagggtga taaactcaaa tacagctttt agaacttgtt 6840

acaatagcga cggagagtta ggttattggg ataagttaga gccactttat acaatttttg 6900

atggtgtatc taaaacattc tctggtattt ggactcctgt aaagaatgac ttcaaagagt 6960

tttatgattt atacctttct gatgtagaga aatataatgg ttcggggaaa ttgtttccca 7020

aaacacctat acctgaaaat gctttttctc tttctattat tccatggact tcatttactg 7080

ggtttaactt aaatatcaat aataatagta attaccttct acccattatt acagcaggaa 7140

aattcattaa taaaggtaat tcaatatatt taccgctatc tttacaggta catcattctg 7200

tttgtgatgg ttatcatgca ggattgttta tgaactctat tcaggaattg tcagataggc 7260

ctaatgactg gcttttataa tatgagataa tgccgactgt actttttaca gtcggttttc 7320

taatgtcact aacctgcccc gttagttgaa gaaggttttt atattacagc tccaagatct 7380

ccgcttcttt tatttttttg tt 7402

Claims (10)

1.一种同时表达产气荚膜梭菌α、β2、ε、β1外毒素的重组乳酸杆菌，其特征在于所述的重组乳酸杆菌以去毒性化的产气荚膜梭菌α、β2、ε、β1外毒素为免疫原，以乳酸杆菌作为传递与表达免疫原的活菌载体，其中，去毒性化改造后的产气荚膜梭菌α、β1、β2和ε外毒素的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-4所示。

2.如权利要求1所述的同时表达产气荚膜梭菌α、β2、ε、β1外毒素的重组乳酸杆菌，其特征在于所述的乳酸杆菌分离于反刍动物的肠道。

3.一种构建权利要求1所述的重组乳酸杆菌的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)分别通过合成或PCR扩增的方法得到编码去毒性化的产气荚膜梭菌α、β2、ε、β1外毒素的基因序列；

(2)将步骤(1)得到的产气荚膜梭菌α、β2、ε、β1外毒素的编码基因依次克隆入乳酸杆菌表达质粒中，彼此之间通过柔性link序列连接，得到含有α-link-β2-link-ε-link-β1序列的重组质粒；

(3)制备乳酸杆菌感受态细胞，经电转化技术将步骤(2)构建的重组质粒转入乳酸杆菌感受态细胞，筛选重组乳酸杆菌转化子，得到同时表达产气荚膜梭菌α、β2、ε、β1外毒素的重组乳酸杆菌。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述的编码去毒性化的产气荚膜梭菌α、β2、ε、β1外毒素的基因序列分别如SEQ ID NO.5-8所示。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述的乳酸杆菌表达质粒为pPG612.1。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述的柔性link序列如SEQ IDNO.9所示。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述的乳酸杆菌感受态细胞为分离于反刍动物肠道的乳酸杆菌的感受态细胞。

8.权利要求1或2所述的同时表达产气荚膜梭菌α、β2、ε、β1外毒素的重组乳酸杆菌在制备防治产气荚膜梭菌病药物中的用途，优选在制备防治牛、羊产气荚膜梭菌病药物中的用途。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于所述的药物为产气荚膜梭菌基因工程乳酸杆菌多价类毒素亚单位疫苗。

10.如权利要求8所述的用途，其特征在于所述的产气荚膜梭菌病包括由产气荚膜梭菌A型、B型、C型、D型和E型共5个血清型所导致的产气荚膜梭菌病。