CN111944838A - 革兰氏阳性菌表达系统在表达腐败梭菌毒素中的应用、腐败梭菌α毒素的制备方法和疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种革兰氏阳性菌表达系统在表达腐败梭菌毒素中的应用、腐败梭菌α毒素的制备方法和疫苗，涉及生物技术领域。采用革兰氏阳性菌表达系统表达腐败梭菌毒素实现了腐败梭菌毒素的胞外分泌表达，离心收集上清，就可以获得表达量高且纯度较好的目的蛋白，降低目的蛋白纯化和内毒素去除工艺生产成本。

Description

革兰氏阳性菌表达系统在表达腐败梭菌毒素中的应用、腐败 梭菌α毒素的制备方法和疫苗
技术领域
本发明涉及生物制品技术领域，尤其是涉及一种革兰氏阳性菌表达系统在表达腐败梭菌毒素中的应用、腐败梭菌α毒素的制备方法和疫苗。
背景技术
腐败梭菌(Clostridium septium)是一种革兰氏阳性厌氧杆菌，可引起动物和人的恶性水肿病、肌肉坏死、气性坏疽及坏死性肠炎等疾病，也是引发羊快疫的病原菌。
腐败梭菌可分泌α、β和γ等多种外毒素，其中α毒素是其主要致病性毒力因子和免疫保护性抗原。腐败梭菌α毒素是气溶素家族穿孔毒素的一种，是腐败梭菌的主要致死性毒力因子，具有溶血、致死和坏死的作用。腐败梭菌分泌的α毒素具有良好的免疫原性，由其制备的类毒素可有效抵抗腐败梭菌的感染。
目前制备腐败梭菌α毒素疫苗有两种方法。一种是传统菌苗，用腐败梭菌(C55-1株)接种到厌气肉肝汤中厌氧培养24h，提取α毒素，测定毒力后加入甲醛灭活，然后按照一定比例与氢氧化铝佐剂混合制成。传统菌苗中主要活性成分腐败梭菌(C55-1株)采用厌气肉肝汤培养，厌气肉肝汤培养基成分复杂，难于质量控制，导致批间差异大，杂蛋白多；传统菌苗的毒素采用小鼠毒力实验测定，操作复杂且定量结果并不准确；传统菌苗中腐败梭菌(C55-1株)使用甲醛灭活，但是由于腐败梭菌毒性强，因此用于灭活的甲醛用量多，灭活时间长。天然腐败梭菌的α毒素含量较低，需要浓缩10～15倍才能满足疫苗中的抗原含量要求。
另一种腐败梭菌α毒素疫苗为基因工程亚单位疫苗。已有关于腐败梭菌α毒素基因工程疫苗的报道，如一种腐败梭菌α毒素重组亚单位疫苗以及其生产方法(CN107812183A)，一种腐败梭菌α毒素基因及其生产方法(CN109395072A)。这些报道中，均采用IPTG作为诱导剂在大肠杆菌系统中表达，需要检测重组大肠杆菌的生长情况添加诱导剂；α毒素重组蛋白均在胞内表达，需要进行超声破碎及镍柱纯化等复杂的过程。虽然大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、操作简便、生产周期短、表达水平高、成本低和易于大规模培养等优点，是最常用、最经济的外源蛋白表达系统，但是其表达的外源蛋白通常在胞内以不可溶性的包涵体或胞内的可溶性蛋白表达，包涵体不具有生物活性，需进行变性、复性处理；胞内的可溶性蛋白具有生物活性，但含杂蛋白较多，需进行复杂的纯化过程们；由于大肠杆菌是阴性菌，含有大量的LPS(内毒素)，造成疫苗副反应，因此疫苗生产中需要去除内毒素，但是其内毒素的去除工艺复杂，生产成本高，目前是兽用生物制品生产中的难点。因此一种改进的腐败梭菌α毒素的制备方法是目前需要的。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供革兰氏阳性菌表达系统在表达腐败梭菌毒素中的应用，采用革兰氏阳性菌表达系统表达腐败梭菌毒素能够实现腐败梭菌毒素的分泌表达。
本发明的第二目的在于提供一种腐败梭菌α毒素的制备方法，该制备方法实现了腐败梭菌α毒素的胞外分泌表达，离心收集上清，就可以获得表达量高且纯度较好的目的蛋白，降低目的蛋白纯化和内毒素去除工艺生产成本。
本发明的第三目的在于提供上述腐败梭菌α毒素的制备方法的应用。
本发明的第四目的在于提供包含由上述腐败梭菌α毒素的制备方法制备得到的腐败梭菌α毒素的疫苗。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了革兰氏阳性菌表达系统在表达腐败梭菌毒素中的应用。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种腐败梭菌α毒素的制备方法，包括使用革兰氏阳性菌表达系统表达腐败梭菌α毒素。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了所述腐败梭菌α毒素的制备方法制备得到的腐败梭菌α毒素。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了表达编码腐败梭菌α毒素基因的宿主，所述宿主为革兰氏阳性菌。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了所述制备方法，所述腐败梭菌α毒素，或所述宿主在如下(x1)～(x3)中至少一种的应用；
(x1)制备腐败梭菌基因工程疫苗；
(x2)制备腐败梭菌抗原；
(x3)制备单克隆抗体。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种疫苗，该疫苗包括所述腐败梭菌α毒素和任意的辅料。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的革兰氏阳性菌表达系统在表达腐败梭菌毒素中的应用，采用革兰氏阳性菌表达系统表达腐败梭菌毒素能够实现腐败梭菌毒素的分泌表达。采用革兰氏阳性菌分泌表达系统，在商品化的培养基中发酵培养，能够将腐败梭菌毒素蛋白诱导分泌表达到培养基中，目的蛋白表达量和蛋白纯度高、无需要去除内毒素；同时制备方法工艺简单、成本低、过程可控。基于上述发明构思，本发明还提供了腐败梭菌α毒素的制备方法，该制备方法具有上述全部有益效果，在此不再赘述。
本发明提供的疫苗具有生产工艺简单、生产成本低、抗原纯度高和疫苗副作用小等优点，有效的避免现有传统疫苗和大肠杆菌基因工程疫苗生产工艺复杂、内毒素含量高、副反应大、抗原复杂、有效抗原含量低和生产成本较高等问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中酶切产物的电泳结果；
图2为实施例1中重组载体的目的基因PCR扩增产物；
图3为实施例2重组表皮葡萄球菌SE/PYL-ATXC86L-N296A诱导表达后上清中腐败梭菌α毒素突变体的SDS-PAGE电泳结果；
图4为实施例2重组表皮葡萄球菌SE/PYL-ATXC86L-N296A诱导表达后上清中腐败梭菌α毒素突变体的Western blot鉴定结果；
图5为腐败梭菌α毒素突变体对VERO细胞的毒力实验结果；
图6为腐败梭菌α毒素突变体疫苗抗体持续期实验结果；
图7为优化后发酵条件发酵制备得到的腐败梭菌α毒素突变体的SDS-PAGE电泳结果；
图8为PYL质粒图谱示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，本发明提供了革兰氏阳性菌表达系统在表达腐败梭菌毒素中的应用。采用革兰氏阳性菌表达系统表达腐败梭菌毒素具有如下有益效果：
(1)采用革兰氏阳性菌表达系统表达腐败梭菌毒素能够实现目的蛋白分泌表达，即将腐败梭菌毒素分泌至细胞外的培养基中，蛋白以可溶的形式分泌释放到培养基中，获得具生物活性的蛋白质，从而避免了因包涵体复性带来的困难。
(2)采用革兰氏阳性菌表达系统表达腐败梭菌毒素，制备过程中产生的杂蛋白少，目的蛋白的回收简单，配合目的蛋白的胞外分泌表达能有效提高腐败梭菌毒素的制备效率。
(3)采用革兰氏阳性菌表达系统表达腐败梭菌毒素的过程中无内毒素产生，革兰氏阳性菌也不含有其他类似脂多糖的毒性化合物，因此能够减少疫苗纯化内毒素的成本和副反应，更适合生产医学和药学上的蛋白。
(4)采用革兰氏阳性菌表达系统表达腐败梭菌毒素能够保留蛋白的天然构象。
在一些优选的实施方式中，革兰氏阳性菌表达系统包括葡萄球菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统或谷氨酸棒状杆菌表达系统。具体的应用实例包括但不限于采用葡萄球菌表达系统表达腐败梭菌α毒素；采用枯草芽孢杆菌表达系统表达腐败梭菌α毒素；采用谷氨酸棒状杆菌表达系统表达腐败梭菌α毒素。
基于上述发明构思，本发明提供了一种腐败梭菌α毒素的制备方法，该制备方法包括使用革兰氏阳性菌表达系统表达腐败梭菌α毒素，该制备方法具有上述全部有益效果，在此不再赘述。
在一些优选的实施方式中，包括将含有编码腐败梭菌α毒素的基因克隆至载体，得到重组载体；然后将重组载体转化至大肠杆菌，筛选后将重组载体阳性克隆经金黄色葡萄球菌RN4220转化，将重组载体转化进入表皮葡萄球菌中，然后经诱导表达得到腐败梭菌α毒素。其中，载体优选为pYL质粒载体，pYL质粒载体是将Xyl/tet片段、ori区域和Erm抗性基因插入pRB373质粒的多克隆位点及抗性区域中，得到的重组pYL质粒载体。
进一步优选的技术方案中，诱导表达为使用诱导剂ATC在36～38℃条件下诱导16～24h，诱导剂的终浓度为300～700ng/mL；其中，诱导剂ATC的诱导温度例如可以为但不限于为36℃、36.5℃、37℃、37.5℃或38℃，优选为37℃；诱导时间例如可以为但不限于为16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h或24h；诱导剂的终浓度例如可以为但不限于为300ng/mL、400ng/mL、500ng/mL、600ng/mL或700ng/mL，优选为500ng/mL。补料碳源优选包括葡萄糖和/或甘油，更优选包括甘油；种子液的接种量为0.1％～5％(v/v)，例如可以为但不限于为0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％。采用优化后的诱导条件发酵生产腐败梭菌α毒素蛋白含量不低于350μg/ml，蛋白纯度不低于80％，非常适合联苗或者单苗所需要的每组抗原要求。
在一些优选的实施方式中，腐败梭菌α毒素为腐败梭菌α毒素突变体。对腐败梭菌α毒素中的氨基酸残基进行突变，可以在体外细胞水平以及体内水平对腐败梭菌α毒素进行减毒，甚至突变出无毒的腐败梭菌α毒素，同时还能在动物体内呈现良好的免疫原型和免疫保护性。
在一些优选的实施方式中，腐败梭菌α毒素突变体包括将氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示的野生型腐败梭菌α毒素的第86半胱氨酸突变为亮氨酸，第296天冬酰胺突变为丙氨酸。按照该方式得到的腐败梭菌α毒素突变体与野生成熟腐败梭菌α毒素相比，100μg的重组蛋白对小鼠无毒力，减毒成功，毒素安全；同时在兔子和牛模型呈现良好的免疫原性和免疫保护性，能够应用于制备预防腐败梭菌亚单位疫苗或多价梭菌毒素亚单位疫苗。更优选地，所述腐败梭菌α毒素突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
MSKKSFAKKVICTSMIAIQCAAVVPHVQAYALTNLEEGGYANHNNASSIKIFGYEDNEDLKAKIIQDPEFIRNWANVAHSLGFGWCGGTANPNVGQGFEFKREVGAGGKVSYLLSARYNPNDPYASGYRAKDRLSMKISNVRFVIDNDSIKLGTPKVKKLAPLNSASFDLINESKTESKLSKTFNYTTSKTVSKTDNFKFGEKIGVKTSFKVGLEAIADSKVETSFEFNAEQGWSNTNSTTETKQESTTYTATVSPQTKKRLFLDVLGSQIDIPYEGKIYMEYDIELMGFLRYTGNAREDHTEDRPTVKLKFGKNGMSAEEHLKDLYSHKNINGYSEWDWKWVDEKFGYLFKNSYDALTSRKLGGIIKGSFTNINGTKIVIREGKEIPLPDKKRRGKRSVDSLDARLQNEGIRIENIETQDVPGFRLNSITYNDKKLILINNI(SEQID NO.3)。
MSKKSFAKKVICTSMIAIQCAAVVPHVQAYALTNLEEGGYANHNNASSIKIFGYEDNEDLKAKIIQDPEFIRNWANVAHSLGFGWLGGTANPNVGQGFEFKREVGAGGKVSYLLSARYNPNDPYASGYRAKDRLSMKISNVRFVIDNDSIKLGTPKVKKLAPLNSASFDLINESKTESKLSKTFNYTTSKTVSKTDNFKFGEKIGVKTSFKVGLEAIADSKVETSFEFNAEQGWSNTNSTTETKQESTTYTATVSPQTKKRLFLDVLGSQIDIPYEGKIYMEYDIELMGFLRYTGAAREDHTEDRPTVKLKFGKNGMSAEEHLKDLYSHKNINGYSEWDWKWVDEKFGYLFKNSYDALTSRKLGGIIKGSFTNINGTKIVIREGKEIPLPDKKRRGKRSVDSLDARLQNEGIRIENIETQDVPGFRLNSITYNDKKLILINNI(SEQID NO.1)。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种采用上述腐败梭菌α毒素的制备方法制备得到的腐败梭菌α毒素。采用上述制备方法制备得到的腐败梭菌α毒构象接近天然蛋白。腐败梭菌α毒素优选为腐败梭菌α毒素突变体，腐败梭菌α毒素的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
根据本发明的一个方面，本发明提供了表达编码腐败梭菌α毒素基因的宿主，宿主为革兰氏阳性菌，能够表达腐败梭菌α毒素，用于生产腐败梭菌α毒素。
在一些优选的实施方式中，宿主为表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腐败梭菌α毒素突变体的重组表皮葡萄球菌SE/PYL-ATXC86L-N296A。
根据本发明的一个方面，本发明提供了腐败梭菌α毒素的制备方法，腐败梭菌α毒素，或表达编码腐败梭菌α毒素基因的宿主在如下(x1)～(x3)中至少一种的应用；
(x1)制备腐败梭菌基因工程疫苗，将上述腐败梭菌α毒素的制备方法应用于制备基因工程疫苗，由于蛋白分泌表达且不含内毒素，因此疫苗制备效率高，成本低；将腐败梭菌α毒素或能够表达其的宿主应用于制备基因工程疫苗也具有上述有益效果。
(x2)制备腐败梭菌抗原，腐败梭菌α毒素可以直接作为腐败梭菌抗原，以进一步作为疫苗的免疫原或用于制备腐败梭菌抗体。
(x3)制备单克隆抗体，腐败梭菌α毒素可以作为免疫原免疫动物以制备腐败梭菌的单克隆抗体。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种疫苗，该疫苗包括腐败梭菌α毒素和任意的辅料。本发明提供的疫苗具有生产工艺简单、生产成本低、抗原纯度高和疫苗副作用小等优点，有效的避免现有传统疫苗和大肠杆菌基因工程疫苗生产工艺复杂、内毒素含量高、副反应大、抗原复杂、有效抗原含量低和生产成本较高等问题。本发明提供的疫苗还可以含有其他抗原，或能够提供抗原的前体物质，包括但不限于来源于腐败梭菌的其他抗原，或来源于其他致病微生物的抗原。本发明提供的疫苗还可以含有本领域可接受的任意的辅料，其中“任意的”指的是疫苗中可以含有辅料，也可以不含有，辅料的实例包括但不限于疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的一种或多种，优选含有疫苗佐剂，佐剂的实例包括但不限于氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、MF59佐剂或Montanide ISA系列佐剂；优选使用Montanide ISA系列佐剂。实验发现将ISA35A佐剂与腐败梭菌α毒素突变体配合使用，免疫动物后对实验动物的保护力较好。
疫苗中的抗原物质优选含有氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腐败梭菌α毒素突变体，以该腐败梭菌α毒素突变体作为抗原毒性低，免疫原性好。疫苗中腐败梭菌α毒素突变体的浓度优选为25～100μg/mL，例如可以为但不限于为25μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL、90μg/mL或100μg/mL，优选为50μg/mL。
优选地，所述疫苗佐剂包括氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、MF59佐剂或Montanide ISA系列佐剂；优选使用Montanide ISA系列佐剂；更优选使用ISA35A佐剂。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。
质粒载体pYL和RN4220感受态细胞由发明人实验室冻存；菌株RN4220、表皮葡萄球菌(SE)购自ATCC；E.coli DH5α感受态细胞购自宝生物工程(大连)有限公司。
高保真FastPfu DNA聚合酶和dNTPs购自全式金公司；限制性内切酶(Asc Ⅰ；PmeⅠ)、DL2000 DNA Marker、10×Loading Buffer、4×Protein SDS PAGE Loading Buffer、PCR产物回收纯化试剂盒，均购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。
Vero细胞系由发明人实验室冻存；腐败梭菌C55-1购自中国兽医药品监察所菌种保藏中心；体重15～20g的小鼠、体重1.5～2.0kg的兔均购自新疆医科大学实验动物中心。
实施例1
1.pYL表达质粒的构建：
1.1合成启动子、ori区域和Erm抗性基因：根据对表达载体的需求，人工化学合成可使用四环素进行表达调控的Xyl/tet片段、ori区域及可使用抗生素进行筛选的Erm抗性基因。
1.2PYL表达质粒的构建：将上述1.1合成的基因片段通过分子生物学的方法插入到PRB373质粒中，测序正确，获得表达质粒PYL，质粒谱图如图8所示。
2.构建腐败梭菌α毒素突变体：
对氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的野生型腐败梭菌α毒素的基因进行优化，将第86半胱氨酸(C)突变为亮氨酸(L)，第296天冬酰胺(N)突变为丙氨酸(A)，经人工合成获得基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。然后对人工合成获得基因片段进行扩增，引物如下所示：
F1：5’-AAACTATGTCAAAAAAATCTTTTGCTAA-3’(SEQ ID NO.4)；
R1：5’-TTGGCGCGCCTTATATATTATTAATTAATATCAATT-3’(SEQ ID NO.5)；
ATGTCAAAAAAATCTTTTGCTAAAAAAGTAATTTGTACATCTATGATTGCAATTCAGTGTGCGGCAGTAGTACCACATGTACAAGCTTATGCACTTACAAATCTTGAAGAGGGGGGATATGCAAATCATAATAATGCTTCTTCAATTAAAATATTTGGATATGAAGACAATGAAGATTTAAAAGCTAAAATTATTCAAGATCCAGAGTTTATAAGAAATTGGGCAAATGTAGCTCATTCATTAGGATTTGGATGGTTAGGTGGAACGGCTAATCCAAATGTTGGACAAGGTTTTGAATTTAAAAGAGAAGTTGGGGCAGGTGGAAAAGTATCTTATTTATTATCTGCTAGATACAATCCAAATGATCCTTATGCAAGTGGGTATCGTGCAAAAGATAGACTTTCTATGAAAATATCAAATGTTAGATTTGTTATTGATAATGATTCTATAAAATTAGGTACACCTAAAGTGAAAAAATTAGCACCTTTAAACTCTGCTAGTTTTGATTTAATAAATGAAAGTAAAACTGAGTCTAAATTATCAAAAACATTTAATTATACAACTTCTAAAACAGTTTCTAAAACAGATAACTTTAAATTTGGAGAAAAAATAGGAGTAAAAACATCATTTAAAGTAGGTCTTGAAGCTATAGCTGACAGTAAAGTTGAGACAAGCTTTGAATTTAATGCAGAACAAGGTTGGTCAAATACAAATAGTACTACTGAAACTAAACAAGAAAGTACTACATATACTGCAACAGTTTCTCCACAAACTAAAAAGAGATTATTCCTAGATGTGTTAGGATCACAAATTGATATTCCTTATGAAGGAAAAATATATATGGAATACGACATAGAATTAATGGGATTTTTAAGATATACAGGAAGCGCTCGTGAAGATCATACTGAAGATAGACCAACAGTTAAACTTAAATTTGGTAAAAACGGTATGAGTGCTGAGGAACATCTTAAAGATTTATATAGTCATAAGAATATTAATGGATATTCAGAATGGGATTGGAAATGGGTAGATGAGAAATTTGGTTATTTATTTAAAAATTCATACGATGCTCTTACTAGTAGAAAATTAGGAGGAATAATAAAAGGCTCATTTACTAACATTAATGGAACAAAAATAGTAATTAGAGAAGGTAAAGAAATTCCACTTCCTGATAAGAAGAGAAGAGGAAAACGTTCAGTAGATTCTTTAGATGCTAGATTACAAAATGAAGGTATTAGAATAGAAAATATTGAAACACAAGATGTTCCAGGATTTAGACTAAATAGCATAACATACAATGATAAAAAATTGATATTAATTAATAATATATAA(SEQ ID NO.2)。
PCR反应体系如下：
DNA Temple 1.0μl
F1 0.5μl
F2 0.5μl
Premix Ex Taq 12.5μl
双蒸水 10.5μl
PCR反应程序为：
Figure BDA0002662174150000111
回收扩增产物，然后与载体使用Asc Ⅰ和Pme Ⅰ PYL进行双酶切，然后将酶切产物回收，酶切结果如图1所示，图1中泳道M1和M2为DNA Marker；泳道1为质粒；泳道2为经双酶切的质粒。
将酶切后的目的片段和线性化载体连接，连接体系如下，16℃连接过夜。
DNA Ligase Buffer 1μl
目的片段 4μl
线性化载体PYL 2μl
T4 DNA连接酶 1μl
双蒸水 2μl
将连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞(购自宝生物工程(大连)有限公司)涂布于LB(300μg/ml Erm)平板，36～38℃培养16～24h后挑取单菌落提取质粒，PCR鉴定和测序鉴定，PCR结果如图2所示，图2中泳道1为目的基因PCR扩增产物；泳道2为阴性对照；泳道3为腐败梭菌α毒素；泳道M为DNA Marker；将测序正确重组质粒再转化至RN4220后，置于36～38℃恒温培养箱培养20～24小时，从平板上挑取5个菌落转接到10ml TSB液体培养基(含5μg/ml红霉素)中，置于36～38℃恒温振荡培养箱，以200r/min振荡培养16～20小时，将菌液按照核酸提取试剂盒说明书进行操作，提取RN4220中的质粒转化(电转)表皮葡萄球菌(SE)中，获得能够诱导表达腐败梭菌a毒素突变体蛋白的重组菌株SE/PYL-ATXC86L-N296A。
实施例2
腐败梭菌α毒素突变体的表达：
将实施例1制备得到的重组表皮葡萄球菌SE/PYL-ATXC86L-N296A接种于TSB液体培养基(含5μg/ml Erm)，接种比例为1％，诱导表达目的蛋白，诱导条件为：诱导剂ATC终浓度300ng/ml，诱导温度36～37℃，培养箱转速200r/min，培养时间18～24h。诱导表达培养后高速离心收集上清，然后对上清中的目的蛋白进行SDS-PAGE检测和Western Blot鉴定。SDS-PAGE检测的结果如图3所示，图3中泳道M为蛋白分子量Marker；泳道a～d依次为浓度1000μg/ml BSA、500μg/ml BSA、250μg/ml BSA和125μg/ml BSA；泳道1为上清中腐败梭菌α毒素突变体。
SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜，使用HRP标记的腐败梭菌α毒素单克隆抗体(1∶20)进行孵育，底物显色按照试剂盒说明书进行操作。目的蛋白反应原性如图4所示，图4中泳道M为蛋白分子量Marker；泳道1为诱导后培养基上清；泳道2为诱导前培养基。从图4可以看出培养基上清中目的蛋白为腐败梭菌α毒素，将制备得到的腐败梭菌α毒素突变体命名为rATX蛋白。
实施例3
rATX蛋白小鼠毒力实验，实验方法参照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)，包括如下步骤：选取18±2g小鼠，按照随机分组的方式共分为6组，每组5只小鼠。6组包括三组实验组，阴性对照组，阳性对照组和空白对照组。三组实验组分别给与1μg、10μg和100μgrATX蛋白；阴性对照给与培养基；阳性对照给与1MLD的天然腐败梭菌α毒素。给药方式为尾静脉注射，注射时样品用明胶缓冲液稀释，给药量为200μL/只，给药后观察1～3d。实验结果为：阳性对照组小鼠全部死亡，阴性对照组和实验组小鼠均存活。
实施例4
rATX蛋白Vero细胞毒力实验：
(1)细胞培养：将Vero细胞制成浓度为2×105个/ml的细胞悬液，然后铺板(96孔板)，每孔100μl细胞悬液，37℃，5％CO2过夜培养。
(2)将rATX蛋白和野生型腐败梭菌α毒素蛋白使用0.2μm的滤器过滤后稀释，进行蛋白定量。将蛋白进行2倍倍比稀释，共12个浓度，正常细胞接种空培养基，各实验组和对照组均设置三组重复，于37℃，5％CO2培养箱中培养，观察细胞生长情况，如图5所示，其中A图为rATX蛋白200μg/ml的VERO细胞毒力结果，B图为野生型腐败梭菌a毒素蛋白1μg/ml的VERO细胞毒力结果。
(3)MTS法测定细胞增殖：培养24h后弃去上清，然后每孔加入100μL培养基和20μLMTS试剂，培养1～2h后酶标仪读取A490nm下的OD值，细胞死亡率按照如下公式计算：细胞死亡率(％)＝(1-实验组A490nm/阴性对照组A490nm)100％；细胞半数病变量CT50值按照如下公式计算：CT50＝㏒-1[Xm-i(∑P-0.5)]+i/4(1-Pm-Pn)。经计算rATX蛋白处理Vero细胞后CT50为212μg/ml，野生型腐败梭菌α毒素处理Vero细胞后CT50为0.8μg/ml。
实施例5
腐败梭菌α毒素突变体rATX蛋白的免疫原性鉴定：
(1)将实施例1制备得到的重组表皮葡萄球菌SE/PYL-ATXC86L-N296A接种于TSB固体培养基(含5μg/ml Erm)，36～37℃培养16～18h；然后挑取单菌落接种于10ml TSB液体培养基(含5μg/ml Erm)，36～37℃，200r/min振荡培养12～14h；再接种于TSB液体培养基(含5μg/ml Erm)中诱导表达rATX蛋白，接种比例为1％。诱导表达的条件为：诱导剂ATC，终浓度300ng/ml；诱导温度36～37℃；培养箱转速200r/min；诱导时间16～24h。诱导表达后高速离心收集上清液，经SDS-PAGE检测采用下述方法进行rATX蛋白含量和纯度的测定。
(1.1)蛋白定量：将蛋白Marker、BSA标准品和待检测的目的蛋白SDS-PAGE电泳，电泳后考马斯亮蓝R250进行染色30分钟，脱色至条带清晰后牌照。然后利用Launch VisionWorks LS软件绘制标准曲线，当R2≥0.99时可进行蛋白定量。以标准曲线为参照，使用Launch Vision Works LS软件分析得出待检样品中的目的蛋白浓度。
(1.2)纯度测定：使用AlphaEaseFC软件中的“Aanlysis Tools”进行蛋白纯度鉴定，具体的为点击“Aanlysis Tools”按钮，再打开“1D-Muti”界面，框选待检样品所有条带，点击“AUTOGRID”按钮，得出待检样品所有条带百分比含量，记录目的蛋白百分比含量，即为rATX蛋白纯度结果。
(2)制备抗原：先试用甲醛灭活rATX蛋白样品中的残留菌体，具体的：按照0.2％的比例向样品中加入甲醛，36～37℃，100r/min处理24～48h，然后注射至2只体重18±2g的小鼠，注射量为0.4ml/L，24h后小鼠健活则甲醛处理后rATX蛋白样品可用。将处理后的rATX蛋白样品使用水包油佐剂乳化制备成疫苗，并使疫苗中的rATX蛋白样品的终浓度为100μg/ml，总共制备疫苗400ml。
(3)兔子免疫实验：实验组每只家兔(体重1.5～2.0kg)肌肉注射步骤(2)制备得到的疫苗0.25ml，共注射家兔4只。
(3.1)中和抗体实验：注射21天后采血，并分离血清，每只家兔取等量血清混合，然后取混合血清0.4ml与含12个小鼠MLD的腐败梭菌毒素0.8ml混合，然后在36～37℃的温度下作用40min。然后将上述混合物静脉注射至小鼠(15～20g)，注射量为0.3ml/只；并设置对照组，对照组注射1MLD的腐败梭菌毒素；实验组和对照组均设置两组重复，观察小鼠3日后判定结果。
(3.2)免疫攻毒实验：注射21天后向实验组家兔的耳缘静脉注射1个家1个兔MLD的(MLD)的腐败梭菌毒素，对照组选取和实验组条件相同的家兔2只也注射1个兔MLD的(MLD)的D型腐败梭菌毒素，攻毒1如后观察家兔的死亡情况。
实验结果如表1所示，可以看出各代次免疫组血清中和效价对腐败梭菌毒素的效价均达到3(0.1ml免疫动物血清中和3MLD毒素)；静脉注射1兔MLD的腐败梭菌毒素，免疫组均4/4保护，对照全部死亡。
表1.家兔血清中和效价和攻毒实验结果
分组 实验动物(只) 血清中和效价(MLD/0.1ml) 攻毒结果
免疫组 4 3 4/4存活
对照组 2 0 0/2存活
(4)牛免疫实验：实验组选用3只牛，用3～6月龄，肌肉注射步骤(2)制备得到的疫苗2ml，免疫21日后二免。
(4.1)中和抗体实验：二免14日后采血，并分离血清，每只牛取等量血清混合，然后取混合血清0.4ml与含12个小鼠MLD的腐败梭菌毒素0.8ml混合，然后在36～37℃的温度下作用40min。然后将上述混合物静脉注射至小鼠(15～20g)，注射量为0.3ml/只；并设置对照组，对照组注射1MLD的腐败梭菌毒素；实验组和对照组均设置两组重复，观察小鼠3日后判定结果。
(4.2)免疫攻毒实验：二免14日后向实验组牛静脉注射1个牛最小致死剂量(MLD)的腐败梭菌毒素；对照组选取和实验组条件相同的牛3只，注射1个牛最小致死剂量(MLD)的腐败梭菌毒素，攻毒3观察牛的死亡情况。
实验结果如表2所示，结果显示，重组蛋白200μg/头免疫组血清中和效价对腐败梭菌毒素的效价均达到3(0.1ml免疫动物血清中和3MLD毒素)。
表2.牛血清中和效价和攻毒实验结果
Figure BDA0002662174150000161
实施例6
腐败梭菌α毒素突变体亚单位疫苗免疫持续其实验：
选取4只健康易感兔子，通过肌肉注射实施例5制备得到的疫苗，注射剂量为0.25ml/只，即25μg/只。分别于首免后如下日期采血并分离血清：14、28、60、90、120、150和180日，将分离得到的血清使用抗体检测试剂盒检测。并在首免后的180日对所有实验动物攻毒，攻毒方式为每个实验组的兔子静脉注射1个兔MLD的腐败梭菌毒素，对照组选取和实验组条件相同且未使用疫苗免疫的兔子2只，直接攻毒，然后计算阻断率。阻断率按照如下公式计算：
样品阻断率＝[(阴性血清OD值－样品血清OD值)/阴性对照OD值]×100％。
阳性血清阻断率＝[(阴性血清OD值－阳性血清OD值)/阴性血清OD值]×100％。
实验成立的标准：阳性血清阻断率>30％，且阴性血清OD值－阳性血清OD值>0.7。
实验结果如图6所示，使用含有100μg/ml rATX蛋白的疫苗免疫兔子后180天后，兔子血清的阻断率至少可达到80％以上；且使用1个兔MLD的D型腐败梭菌毒素对实验动物攻毒后，实验组兔子4/4存活，对照组兔2/2死亡。上述实验结果说明腐败梭菌α毒素突变体亚单位疫苗以25μg/只的剂量免疫兔子，从抗体阻断率和免疫攻毒结果来看，免疫持续期至少保持180日以上。
实施例7
蛋白表达优化：
(1)培养基配置：
TSA固体培养基：将940ml注射用水和40g胰蛋白大豆琼脂粉(Tryptic Soy Agar，TSA)混合均匀，121℃高压蒸汽灭菌15分钟，若需制备成含有红霉素的TSA固体培养基，则当高压灭菌后培养基冷却至50℃左右时加入红霉素至培养基中的红霉素的终浓度为5μg/ml，然后倒平板备用。
TSB液体培养基：将940ml注射用水和30g胰蛋白大豆肉汤粉(Tryptic Soy Broth，TSB)混合均匀，121℃高压蒸汽灭菌15分钟，若需制备成含有红霉素的TSB液体培养基，在使用前向培养基中加入红霉素至培养基中的红霉素的终浓度为5μg/ml。
(2)菌种复苏：
制备一级生产种子：取经表面消毒的重组表皮葡萄球菌SE/PYL-ATXC86L-N296A，先加入少量TSB液体培养基，然后划线接种于TSB平板，36～38℃培养12～16h，然后挑取单菌落接种至10ml含5μg/ml红霉素TSB液体培养基，36～38℃，200r/min振荡培养16～24h后作为一级生产种子。
制备二级生产种子：将一级生产种子接种于200ml含5μg/ml红霉素TSB液体培养基中，接种比例为0.2％(V/V)，使用500ml药瓶震荡培养，培养条件为36～38℃，200r/min振荡培养8～12h。
发酵罐发酵条件优化，包括优化诱导剂浓度和诱导时间、补料碳源、种子液的接种比例。其他发酵条件参考培养瓶发酵条件：发酵罐为15L，培养基初始体积为5L，且培养基经无菌过滤；培养基中含终浓度为5μg/ml的红霉素以及0.01％的消泡剂。打开补料、补碱、补酸三路开关,通过自动添加1mol/L盐酸或30％氨水来控制pH值，使pH值维持在7；发酵温度为36～37℃，溶氧值为20％。
诱导剂浓度优化：按1％的比例接种种子液，以甘油作为补料碳源，分别以终浓度为300ng/ml、500ng/ml和700ng/ml的诱导剂ATC进行诱导表达，分别不同时间取样检测rATX蛋白的表达量。结果见表3，500ng/ml浓度诱导剂表达量高。
表3诱导剂浓度对rATX表达的影响
Figure BDA0002662174150000181
诱导时间优化：按1％的比例接种种子液，以甘油作为补料碳源，诱导剂ATC的终浓度为500ng/ml，分别不同时间取样检测rATX蛋白的表达量。结果见表4，在20-24h表达量最高。
表4不同诱导时间对rATX的影响
Figure BDA0002662174150000182
补料碳源的优化：按1％的比例接种种子液，采用葡萄糖和甘油分别作为补料碳源，诱导条件为诱导剂终浓度500ng/ml，分别不同时间取样检测rATX蛋白的表达量。其结果见下表5，添加甘油组蛋白表达量高。
表5补料碳源对rATX蛋白表达的影响
Figure BDA0002662174150000191
发酵罐中种子液接种比例的优化：发酵罐中培养基的初始体积为5L，分别按照0.2％、1％、5％的接种比例接种种子液，以甘油作为补料碳源，诱导剂ATC终浓度500ng/ml，分别不同时间取样检测rATX蛋白的表达量。1％的接种量比较适合蛋白表达。
表6种子接种量对rCPB表达的影响
Figure BDA0002662174150000192
发酵优化结果：用15L发酵罐进行了4次重组表皮葡萄球菌SE/PYL-ATXC86L-N296A的发酵表达，参数为：诱导剂ATC浓度为500ng/ml、诱导时间为24h、补料碳源为甘油、种子液的接种比例为1％。发酵结果显示蛋白含量均不低于250μg/ml，蛋白纯度不低于80％，发酵产物的SDS-PAGE的结果如图7所示，图7中泳道M为蛋白分子量Marker；泳道a为BSA(1000μg/ml)；泳道b为BSA(500μg/ml)；泳道c为BSA(250μg/ml)；泳道d为BSA(125μg/ml)；泳道1～4为采用优化参数发酵得到的目的蛋白。
实施例8
筛选佐剂：分别以氢氧化铝胶、油包水佐剂(ISA 61)、水包油包水佐剂(ISA 201)和水包油佐剂(ISA 35A)作为疫苗的佐剂，四种佐剂制备得到的疫苗中腐败梭菌a毒素突变蛋白含量均为100μg/ml。
将制被得到含有不同佐剂的四种疫苗肌肉注射给豚鼠以检测疫苗的安全性。具体的：选取8至350～450g的豚鼠，随机分成四组，每组两只，肌肉注射四种佐剂制备得到的疫苗，注射量为2ml/只。注射后观察豚鼠注射疫苗的部位是否发生坏死，以及豚鼠是否发生死亡。结果显示四组豚鼠均健活，注射部位也没有发生坏死。
疫苗效力检测：选取18只重量为1.5～2.0kg的兔子，分成五组，其中实验组四组，空白对照组一组；实验组每组4只兔子，空白对照组2只兔子。肌肉注射疫苗免疫实验组兔子，注射量为0.25ml/只。实验组免疫21天后使用腐败梭菌强毒毒素(C55-1)攻毒，攻毒实验结果如表7所示，水包油佐剂(ISA 35A)制备得到的疫苗实验组4只兔子全部存活，保护效果最好。
表7攻毒实验结果
Figure BDA0002662174150000201
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 天康生物股份有限公司
<120> 革兰氏阳性菌表达系统在表达腐败梭菌毒素中的应用、腐败梭菌α毒素的制
备方法和疫苗
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ser Lys Lys Ser Phe Ala Lys Lys Val Ile Cys Thr Ser Met Ile
1 5 10 15
Ala Ile Gln Cys Ala Ala Val Val Pro His Val Gln Ala Tyr Ala Leu
20 25 30
Thr Asn Leu Glu Glu Gly Gly Tyr Ala Asn His Asn Asn Ala Ser Ser
35 40 45
Ile Lys Ile Phe Gly Tyr Glu Asp Asn Glu Asp Leu Lys Ala Lys Ile
50 55 60
Ile Gln Asp Pro Glu Phe Ile Arg Asn Trp Ala Asn Val Ala His Ser
65 70 75 80
Leu Gly Phe Gly Trp Leu Gly Gly Thr Ala Asn Pro Asn Val Gly Gln
85 90 95
Gly Phe Glu Phe Lys Arg Glu Val Gly Ala Gly Gly Lys Val Ser Tyr
100 105 110
Leu Leu Ser Ala Arg Tyr Asn Pro Asn Asp Pro Tyr Ala Ser Gly Tyr
115 120 125
Arg Ala Lys Asp Arg Leu Ser Met Lys Ile Ser Asn Val Arg Phe Val
130 135 140
Ile Asp Asn Asp Ser Ile Lys Leu Gly Thr Pro Lys Val Lys Lys Leu
145 150 155 160
Ala Pro Leu Asn Ser Ala Ser Phe Asp Leu Ile Asn Glu Ser Lys Thr
165 170 175
Glu Ser Lys Leu Ser Lys Thr Phe Asn Tyr Thr Thr Ser Lys Thr Val
180 185 190
Ser Lys Thr Asp Asn Phe Lys Phe Gly Glu Lys Ile Gly Val Lys Thr
195 200 205
Ser Phe Lys Val Gly Leu Glu Ala Ile Ala Asp Ser Lys Val Glu Thr
210 215 220
Ser Phe Glu Phe Asn Ala Glu Gln Gly Trp Ser Asn Thr Asn Ser Thr
225 230 235 240
Thr Glu Thr Lys Gln Glu Ser Thr Thr Tyr Thr Ala Thr Val Ser Pro
245 250 255
Gln Thr Lys Lys Arg Leu Phe Leu Asp Val Leu Gly Ser Gln Ile Asp
260 265 270
Ile Pro Tyr Glu Gly Lys Ile Tyr Met Glu Tyr Asp Ile Glu Leu Met
275 280 285
Gly Phe Leu Arg Tyr Thr Gly Ala Ala Arg Glu Asp His Thr Glu Asp
290 295 300
Arg Pro Thr Val Lys Leu Lys Phe Gly Lys Asn Gly Met Ser Ala Glu
305 310 315 320
Glu His Leu Lys Asp Leu Tyr Ser His Lys Asn Ile Asn Gly Tyr Ser
325 330 335
Glu Trp Asp Trp Lys Trp Val Asp Glu Lys Phe Gly Tyr Leu Phe Lys
340 345 350
Asn Ser Tyr Asp Ala Leu Thr Ser Arg Lys Leu Gly Gly Ile Ile Lys
355 360 365
Gly Ser Phe Thr Asn Ile Asn Gly Thr Lys Ile Val Ile Arg Glu Gly
370 375 380
Lys Glu Ile Pro Leu Pro Asp Lys Lys Arg Arg Gly Lys Arg Ser Val
385 390 395 400
Asp Ser Leu Asp Ala Arg Leu Gln Asn Glu Gly Ile Arg Ile Glu Asn
405 410 415
Ile Glu Thr Gln Asp Val Pro Gly Phe Arg Leu Asn Ser Ile Thr Tyr
420 425 430
Asn Asp Lys Lys Leu Ile Leu Ile Asn Asn Ile
435 440
<210> 2
<211> 1332
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgtcaaaaa aatcttttgc taaaaaagta atttgtacat ctatgattgc aattcagtgt 60
gcggcagtag taccacatgt acaagcttat gcacttacaa atcttgaaga ggggggatat 120
gcaaatcata ataatgcttc ttcaattaaa atatttggat atgaagacaa tgaagattta 180
aaagctaaaa ttattcaaga tccagagttt ataagaaatt gggcaaatgt agctcattca 240
ttaggatttg gatggttagg tggaacggct aatccaaatg ttggacaagg ttttgaattt 300
aaaagagaag ttggggcagg tggaaaagta tcttatttat tatctgctag atacaatcca 360
aatgatcctt atgcaagtgg gtatcgtgca aaagatagac tttctatgaa aatatcaaat 420
gttagatttg ttattgataa tgattctata aaattaggta cacctaaagt gaaaaaatta 480
gcacctttaa actctgctag ttttgattta ataaatgaaa gtaaaactga gtctaaatta 540
tcaaaaacat ttaattatac aacttctaaa acagtttcta aaacagataa ctttaaattt 600
ggagaaaaaa taggagtaaa aacatcattt aaagtaggtc ttgaagctat agctgacagt 660
aaagttgaga caagctttga atttaatgca gaacaaggtt ggtcaaatac aaatagtact 720
actgaaacta aacaagaaag tactacatat actgcaacag tttctccaca aactaaaaag 780
agattattcc tagatgtgtt aggatcacaa attgatattc cttatgaagg aaaaatatat 840
atggaatacg acatagaatt aatgggattt ttaagatata caggaagcgc tcgtgaagat 900
catactgaag atagaccaac agttaaactt aaatttggta aaaacggtat gagtgctgag 960
gaacatctta aagatttata tagtcataag aatattaatg gatattcaga atgggattgg 1020
aaatgggtag atgagaaatt tggttattta tttaaaaatt catacgatgc tcttactagt 1080
agaaaattag gaggaataat aaaaggctca tttactaaca ttaatggaac aaaaatagta 1140
attagagaag gtaaagaaat tccacttcct gataagaaga gaagaggaaa acgttcagta 1200
gattctttag atgctagatt acaaaatgaa ggtattagaa tagaaaatat tgaaacacaa 1260
gatgttccag gatttagact aaatagcata acatacaatg ataaaaaatt gatattaatt 1320
aataatatat aa 1332
<210> 3
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Ser Lys Lys Ser Phe Ala Lys Lys Val Ile Cys Thr Ser Met Ile
1 5 10 15
Ala Ile Gln Cys Ala Ala Val Val Pro His Val Gln Ala Tyr Ala Leu
20 25 30
Thr Asn Leu Glu Glu Gly Gly Tyr Ala Asn His Asn Asn Ala Ser Ser
35 40 45
Ile Lys Ile Phe Gly Tyr Glu Asp Asn Glu Asp Leu Lys Ala Lys Ile
50 55 60
Ile Gln Asp Pro Glu Phe Ile Arg Asn Trp Ala Asn Val Ala His Ser
65 70 75 80
Leu Gly Phe Gly Trp Cys Gly Gly Thr Ala Asn Pro Asn Val Gly Gln
85 90 95
Gly Phe Glu Phe Lys Arg Glu Val Gly Ala Gly Gly Lys Val Ser Tyr
100 105 110
Leu Leu Ser Ala Arg Tyr Asn Pro Asn Asp Pro Tyr Ala Ser Gly Tyr
115 120 125
Arg Ala Lys Asp Arg Leu Ser Met Lys Ile Ser Asn Val Arg Phe Val
130 135 140
Ile Asp Asn Asp Ser Ile Lys Leu Gly Thr Pro Lys Val Lys Lys Leu
145 150 155 160
Ala Pro Leu Asn Ser Ala Ser Phe Asp Leu Ile Asn Glu Ser Lys Thr
165 170 175
Glu Ser Lys Leu Ser Lys Thr Phe Asn Tyr Thr Thr Ser Lys Thr Val
180 185 190
Ser Lys Thr Asp Asn Phe Lys Phe Gly Glu Lys Ile Gly Val Lys Thr
195 200 205
Ser Phe Lys Val Gly Leu Glu Ala Ile Ala Asp Ser Lys Val Glu Thr
210 215 220
Ser Phe Glu Phe Asn Ala Glu Gln Gly Trp Ser Asn Thr Asn Ser Thr
225 230 235 240
Thr Glu Thr Lys Gln Glu Ser Thr Thr Tyr Thr Ala Thr Val Ser Pro
245 250 255
Gln Thr Lys Lys Arg Leu Phe Leu Asp Val Leu Gly Ser Gln Ile Asp
260 265 270
Ile Pro Tyr Glu Gly Lys Ile Tyr Met Glu Tyr Asp Ile Glu Leu Met
275 280 285
Gly Phe Leu Arg Tyr Thr Gly Asn Ala Arg Glu Asp His Thr Glu Asp
290 295 300
Arg Pro Thr Val Lys Leu Lys Phe Gly Lys Asn Gly Met Ser Ala Glu
305 310 315 320
Glu His Leu Lys Asp Leu Tyr Ser His Lys Asn Ile Asn Gly Tyr Ser
325 330 335
Glu Trp Asp Trp Lys Trp Val Asp Glu Lys Phe Gly Tyr Leu Phe Lys
340 345 350
Asn Ser Tyr Asp Ala Leu Thr Ser Arg Lys Leu Gly Gly Ile Ile Lys
355 360 365
Gly Ser Phe Thr Asn Ile Asn Gly Thr Lys Ile Val Ile Arg Glu Gly
370 375 380
Lys Glu Ile Pro Leu Pro Asp Lys Lys Arg Arg Gly Lys Arg Ser Val
385 390 395 400
Asp Ser Leu Asp Ala Arg Leu Gln Asn Glu Gly Ile Arg Ile Glu Asn
405 410 415
Ile Glu Thr Gln Asp Val Pro Gly Phe Arg Leu Asn Ser Ile Thr Tyr
420 425 430
Asn Asp Lys Lys Leu Ile Leu Ile Asn Asn Ile
435 440
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaactatgtc aaaaaaatct tttgctaa 28
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttggcgcgcc ttatatatta ttaattaata tcaatt 36

Claims (10)

1.革兰氏阳性菌表达系统在表达腐败梭菌毒素中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阳性菌表达系统包括葡萄球菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统或谷氨酸棒状杆菌表达系统。
3.一种腐败梭菌α毒素的制备方法，其特征在于，包括使用革兰氏阳性菌表达系统表达腐败梭菌α毒素。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述革兰氏阳性菌表达系统包括葡萄球菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统或谷氨酸棒状杆菌表达系统。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，包括将含有编码腐败梭菌α毒素的基因克隆至载体，得到重组载体；然后将重组载体转化至大肠杆菌，筛选后将重组载体阳性克隆经金黄色葡萄球菌RN4220转化，将重组载体转化进入表皮葡萄球菌中，然后经诱导表达得到腐败梭菌α毒素；
优选地，所述载体包括pYL质粒载体，所述pYL质粒载体是将Xyl/tet片段、ori区域和Erm抗性基因插入pRB373质粒的多克隆位点及抗性区域中，得到的重组pYL质粒载体；
优选地，所述诱导表达为使用诱导剂ATC在36～38℃条件下诱导16～24h，所述诱导剂的终浓度为300～700ng/mL；
优选地，所述诱导表达为使用诱导剂ATC在37℃条件下诱导24h，所述诱导剂的终浓度为500ng/mL；
优选地，补料碳源包括葡萄糖和/或甘油；和/或，种子液的接种量为0.1％～5％(v/v)；
优选地，补料碳源为甘油；
优选地，种子液的接种量为1％(v/v)。
6.根据权利要求3-5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述腐败梭菌α毒素为腐败梭菌α毒素突变体；
优选地，所述腐败梭菌α毒素突变体包括将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的腐败梭菌α毒素的第86半胱氨酸突变为亮氨酸，第296天冬酰胺突变为丙氨酸；
优选地，所述腐败梭菌α毒素突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
7.权利要求3-6任一项所述的腐败梭菌α毒素的制备方法制备得到的腐败梭菌α毒素；
优选地，所述腐败梭菌α毒素为腐败梭菌α毒素突变体，所述腐败梭菌α毒素的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
8.表达编码腐败梭菌α毒素基因的宿主，所述宿主为革兰氏阳性菌；
优选地，所述宿主为表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腐败梭菌α毒素突变体的表皮葡萄球菌SE/PYL-ATXC86L-N296A。
9.权利要求3-6任一项所述的制备方法，权利要求7所述的腐败梭菌α毒素，或权利要求8所述的宿主在如下(x1)～(x3)中至少一种的应用；
(x1)制备腐败梭菌基因工程疫苗；
(x2)制备腐败梭菌抗原；
(x3)制备单克隆抗体。
10.疫苗，其特征在于，包括权利要求7所述的腐败梭菌α毒素和任意的辅料；
优选地，所述腐败梭菌α毒素为腐败梭菌α毒素突变体，所述腐败梭菌α毒素的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
优选地，所述腐败梭菌α毒素突变体的浓度为25～100μg/mL，优选为50μg/mL；
优选地，所述辅料包括疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的一种或多种；
优选地，所述疫苗佐剂包括氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、MF59佐剂或Montanide ISA系列佐剂；优选使用Montanide ISA系列佐剂；更优选使用ISA35A佐剂。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1192245A (zh) * 1995-06-07 1998-09-02 洛克菲勒大学 利用革兰氏阳性菌表达重组蛋白质
WO2007050103A2 (en) * 2004-11-29 2007-05-03 Phyllom Llc Recombinant bacteria without selection marker
CN106987548A (zh) * 2017-04-10 2017-07-28 东北农业大学 一种同时表达产气荚膜梭菌α、β2、ε、β1外毒素的重组乳酸杆菌及其构建方法和应用
CN107812183A (zh) * 2017-10-20 2018-03-20 中国兽医药品监察所 一种腐败梭菌α毒素重组亚单位疫苗及其生产方法
CN109111509A (zh) * 2018-09-19 2019-01-01 天康生物股份有限公司 腐败梭菌α毒素突变体、表达其的基因、制备方法和腐败梭菌疫苗
CN109395072A (zh) * 2018-10-30 2019-03-01 中国兽医药品监察所 一种腐败梭菌α毒素基因工程疫苗及其生产方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1192245A (zh) * 1995-06-07 1998-09-02 洛克菲勒大学 利用革兰氏阳性菌表达重组蛋白质
WO2007050103A2 (en) * 2004-11-29 2007-05-03 Phyllom Llc Recombinant bacteria without selection marker
CN106987548A (zh) * 2017-04-10 2017-07-28 东北农业大学 一种同时表达产气荚膜梭菌α、β2、ε、β1外毒素的重组乳酸杆菌及其构建方法和应用
CN107812183A (zh) * 2017-10-20 2018-03-20 中国兽医药品监察所 一种腐败梭菌α毒素重组亚单位疫苗及其生产方法
CN109111509A (zh) * 2018-09-19 2019-01-01 天康生物股份有限公司 腐败梭菌α毒素突变体、表达其的基因、制备方法和腐败梭菌疫苗
CN109395072A (zh) * 2018-10-30 2019-03-01 中国兽医药品监察所 一种腐败梭菌α毒素基因工程疫苗及其生产方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JODY A. MELTON-WITT: "Identification of functional domains of Clostridium septicum alpha toxin", 《BIOCHEMISTRY》 *
MICHAEL OTTO等: "Structure of the pheromone peptide of the Staphylococcus epidermidis agr system", 《FEBS LETTERS》 *

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