JP2007513613A - ジフテリア毒素の産生 - Google Patents
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Abstract
Description
非毒性でしばしばCRMs(cross-reacting materials)と称されるジフテリア毒素の類似物(analogs)が報告されている(例えば非特許文献7を参照)。それらの例示として、CEM-197、CEM-9、CRM-45、CRM-102、CRM-103およびCRM-107が挙げられる。
アミノ酸培地の調製において、そのアプローチは、Toxiprotone-D含有培地およびNZ-アミン動物性成分含有培地の両方において各アミノ酸のより高い濃度(mM)を選択して、ジフテリアの増殖および毒素産生を支持することができる培地を作成することである。
NZアミン含有培地を用いた発酵
第1の前培養において、凍結乾燥した種を、凍結乾燥種からレフラースラント(Loefflers slant)に増殖させ、その際36±2℃で22±2時間培養物を増殖させた。第2の前培養では、22±2時間のインキュベーションの後、スラントからの細胞を100mLのNZ培地を含む第1フラスコに移し、36±2℃にて22時間180rpmでインキュベートした。フラスコは、1mLの1:10希釈リン酸溶液(32%(w/v))および0.5mLの1:2希釈塩化カルシウム溶液(53%(w/v))も含んでいた。第3の前培養では100mLの第1振とうフラスコ(shake flask)から、約5mLの第1培養物を採取し、250mLのNZアミン培地に播種し、36±2℃にて22時間180rpmでインキュベートした。その培養は、2.5mLの1:10希釈リン酸溶液(32%(w/v))および1.25mLの1:2希釈塩化カルシウム溶液(53%(w/v))も含んでいた。発酵において、第3の前培養物15mLを用いて、発酵槽中の15LのNZアミン培地に播種した。その培養は、100.7mLの0.32%(w/v)リン酸溶液および125mLの1:2希釈塩化カルシウム溶液(53%(w/v))、および23.44mLの硫酸第1鉄七水和物溶液(0.1%(w/v))も含んでいた。発酵は、1つのラッシュトン型タービン羽根を有するBraun発酵槽中、600rpmの攪拌を用い、ヘッドスペースを通した1.57vvmの通気で、36±2℃の調節温度下において実施した。25時間の発酵後、攪拌を800rpmまで上昇させ、発酵槽を0.4barまで加圧した。さらに16時間発酵を継続した。
第1の前培養において、凍結乾燥した種を、凍結乾燥種から5%ヒツジ血液寒天プレートを用いてbactoトリプトース寒天に増殖させ、その際36±2℃で22±2時間培養物を増殖させた。第2の前培養では、血液寒天培地からの細胞を90mLの培地を含む第1フラスコに移し、室温で48時間静止させ、その後36±2℃にて24時間180rpmでインキュベートした。90mLの第1振とうフラスコから、約1.6mLの第1培養物を採取し、800mLの培地に播種し、36±2℃にて22時間180rpmでインキュベートした。次に、その800mLの培養物を用いて、発酵槽中の10Lの培地に播種した。発酵は、2つのラッシュトン型タービン羽根、1つの噴霧器および4つのバッフルを有するNew Brunswick Scientific発酵槽中で実施した。培養物を、36±2℃で0.2vvmの通気を行い220rpmで攪拌した。8時間前から32時間の発酵が完了するまでの間、pHを7.5から7.6の間に調節した。生じたLf/mLは80-90Kf/mLであった。
第1の前培養
湿式凍結(wet frozen)した種(グリセロール保存)をCDM+5g/L YE寒天培地で増殖させ、36℃で24時間インキュベートした。
プレートでの培養物を、5mLのCDM+3g/L YE培地中に再懸濁させ、その2.5mLを用いて90mLのCDM+3g/LYE培地の入った第1フラスコに播種した。そのフラスコを36℃で24時間、200rpmの一定の振とう下でインキュベートした。第1フラスコは、0.9mLの1:10希釈リン酸溶液(32%(w/v))および0.45mLの1:2希釈塩化カルシウム溶液(53%(w/v))も含んでいた。
第3の前培養物の約800mLを用いて、発酵槽中の10LのCDM+3g/L YE培地に播種した。100mLの1:10希釈リン酸溶液(32%(w/v))および50mLの1:2希釈塩化カルシウム溶液(53%(w/v))および3.4mLの硫酸第1鉄七水和物溶液(0.1%(w/v))を発酵物に添加した。発酵は、New Brunswick ScientificまたはBraun発酵槽中、36℃の調節温度下で実施した。プロセスパラメーター:250rpmでの攪拌;0.45vvmでの通気。pHは、5Nの水酸化ナトリウムおよび2.5Mのリン酸を用いて、pHを6.5から7.6の間に調節した。
発酵処理の間のアミノ酸消費の経時的試験は、重要なアミノ酸が最初の12-18時間の増殖で使い尽くされ、毒素が産生されるその後の発酵段階では利用できないことを示した。増殖を支持し、さらには毒素合成のための前駆体として培地中のアミノ酸を用いるため、培地に窒素を補足なければならない。酵母抽出物および硫酸アンモニウムを下記のようにCDMに添加した:
ジフテリア菌の増殖およびジフテリア毒素の産生に用いた様々な培地を以下に示す:
a)CDM+5g/Lの酵母抽出物
b)CDM+5g/Lの硫酸アンモニウム;および
c)その培地中のアミノ酸の濃度の半分を含有する修飾CDM+5g/Lの酵母抽出物および5g/Lの硫酸アンモニウム。
コンピューター統計解析(「FusionPro」)を用いて、培地組成を最適化した。その解析において、様々な濃度の3つの成分(酵母抽出物、アミノ酸混合物および鉄)を統計解析における入力として用いた。一部実施計画(fractional factorial design)を選択した(下記の表11を参照):
10リットルの発酵培養物を4℃、12,500xgで20分間遠心分離し、上清を回収した。次に、上清を0.22μm膜フィルターで濾過して、残留細菌を除去した。4℃で絶え間なく攪拌しながら、濾過した上清に硫酸アンモニウム27%(w/v)を添加し、その後4℃、12,500gで20分間遠心分離した。次の処理のために上清を回収した。この上清に、絶え間なく攪拌しながら硫酸アンモニウム13%(w/v)を添加した。混合物をさらに4℃で一晩攪拌し、その後4℃、125,00gで20分間遠心分離した。得られたペレットを約1000mLの0.9%(w/v)生理食塩水中に溶解した。
動物性成分含有培地および動物性成分不含培地を用いて産生されたジフテリア毒素およびトキソイドを、SDS-PAGE、ウェスタンブロット、CDスペクトルの特定、N-末端シークエンシングにおいて分析した。結果は、動物性成分含有培地および動物性成分不含培地を用いて得られた毒素およびトキソイドが、実質的に区別できないことを示唆する。
ジフテリア毒素およびトキソイドの相対分子量(Mr)を特定し;毒素およびトキソイドの純度を評価し;さらにタンパク質バンドの分散パターンを評価するため、SDS-PAGEを実施した。還元条件下において12.5%ポリアクリルアミドゲル上でSDS-PAGEによりタンパク質を分析した。クーマシーブルーでゲルを染色し、続いてデンシトメトリーで分析した。
図3を参照して、ジフテリア毒素特異的抗体を用いたウェスタンブロット分析を示す。試料をSDS−PAGEで分離し、PVDF膜に転写し、さらにDT-特異的抗体を用いてブロットした。レーンは:1.相対分子量マーカー(kDa)、250、150、100、75、50、37、25、15、10 kDa(BioRad 分子量マーカー);2.ジフテリア毒素 CO3105;3.ジフテリア毒素 Diph-20L-40F(動物性成分含有培地);4.ジフテリア毒素 Diph-20L-48F(CDM+酵母抽出物含有培地);5.ジフテリア毒素 Diph-20L-50F(CDM+酵母抽出物含有培地);6.ジフテリア毒素 Diph-20L-55F(CDM+酵母抽出物含有培地);7.ジフテリアトキソイド CO3152;8.ジフテリアトキソイド Diph-20L-40F(動物性成分含有培地);9.ジフテリアトキソイド Diph-20L-48F(CDM+酵母抽出物含有培地);10.ジフテリアトキソイド Diph-20L-50F(CDM+酵母抽出物含有培地)。
N-末端配列分析を用いて、N-末端に変化をもたらす任意のタンパク質修飾をモニターした。タンパク質を12.5% SDS-PAGEゲルで分離し、PVDFのような固体支持体に転写した。逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)により同定する前に、エドマン分解法によりN-末端アミノ酸を遊離および誘導体化した。ジフテリア毒素およびトキソイドの対照ならびに「動物性成分不含毒素/トキソイド」の製造のための予測N-末端配列が観察された。
参照タンパク質を用いてジフテリア毒素の等電点を評価した。図3を参照して、等電点電気泳動ゲルを示す。レーンは:1.IEF標準−pI=7.80、7.50、7.10、7.00、6.50、6.00、5.10、4.65;2.ジフテリア毒素 CO3105(動物性成分含有培地);3.ジフテリア毒素 Diph-20L-11(NZアミン含有培地);4.ジフテリア毒素 Diph-20L-31(CDM+酵母抽出物含有培地);5.ジフテリア毒素 Diph-20L-31(CDM+酵母抽出物含有培地);6.ジフテリアトキソイド CO3152(動物性成分含有培地);7.ジフテリアトキソイド Diph-20L-11(CDM+酵母抽出物含有培地);8.ジフテリアトキソイド Diph-20L-31(CDM+酵母抽出物含有培地);9.ジフテリアトキソイド Diph-20L-33(CDM+酵母抽出物含有培地)。
円偏光二色性(CD)分析を用いて、様々なロットの配座または二次構造における不一致を特定した。試料の円偏光のための吸光スペクトルをソフトウェアプログラムによって分析して、α−へリックス、β−シート、リバースターンおよびランダムコイル構造の相対割合(%)の組成をもたらす。Jasco CD分光偏光計を用いてジフテリア毒素およびトキソイドを22℃で分析した。
Claims (40)
- 動物由来産物を実質的に含まず、かつ下記の成分を含むことを特徴とするジフテリア毒素またはその類似物を産生するためにジフテリア菌株を培養するための培地:
a.水;
b;炭化水素源および窒素源;
c;それぞれがジフテリア毒素またはその類似物の産生レベルを制限しない初期濃度の複数の遊離アミノ酸。 - 全ての天然アミノ酸を含むことを特徴とする請求項1記載の培地。
- 前記炭水化物源がマルトースを含むことを特徴とする請求項1記載の培地。
- グルコースを実質的に含まないことを特徴とする請求項1記載の培地。
- 前記窒素源が酵母抽出物を含むことを特徴とする請求項1記載の培地。
- 動物由来産物を欠いていることを特徴とする請求項1から5いずれか1項記載の培地。
- ジフテリア菌用の培地であって:
炭水化物源および窒素源、ならびにそれぞれがジフテリア菌によるジフテリア毒素またはその類似物の産生レベルを高めるのに十分な量の少なくとも4つのアミノ酸を含む添加物を含み、動物由来産物を実質的に含まないことを特徴とする培地。 - 全ての天然アミノ酸を含むことを特徴とする請求項7記載の培地。
- 前記炭水化物源がマルトースを含むことを特徴とする請求項7記載の培地。
- 前記窒素源が酵母抽出物であうことを特徴とする請求項7記載の培地。
- アミノ酸濃度が、培地1リットル当たり約0.5gから約1gであることを特徴とする請求項7から9いずれか1項記載の培地
- 動物由来産物を欠いていることを特徴とする請求項7から11いずれか1項記載の培地。
- ジフテリア毒素の産生をもたらす条件下で、動物由来産物を実質的に含まずかつ下記成分を含む培地中においてジフテリア菌株を培養する工程を含むことを特徴とするジフテリア毒素またはその類似物を産生する方法:
a.水;
b;炭化水素源および窒素源;
c;それぞれがジフテリア毒素またはその類似物の産生レベルを制限しない初期濃度の複数の遊離アミノ酸。 - 前記培地が全ての天然アミノ酸を含むことを特徴とする請求項13記載の方法。
- 前記炭水化物源がマルトースを含むことを特徴とする請求項13記載の方法。
- 前記培地がグルコースを実質的に含まないことを特徴とする請求項13記載の方法。
- 前記窒素源が酵母抽出物を含むことを特徴とする請求項13記載の方法。
- ジフテリア菌株を静止期まで増殖させることを特徴とする請求項13記載の方法。
- 少なくとも100Lf/mLのジフテリア毒素またはその類似物の産生が得られることを特徴とする請求項13記載の方法。
- ジフテリア毒素またはその類似物を回収して、回収ジフテリア毒素またはその類似物を提供する工程をさらに含むことを特徴とする請求項13記載の方法。
- 回収ジフテリア毒素またはその類似物を精製して、精製ジフテリア毒素またはその類似物を提供する工程をさらに含むことを特徴とする請求項20記載の方法。
- 回収したまたは精製したジフテリア毒素またはその類似物を無毒化して、ジフテリアトキソイドまたはその類似物を提供する工程をさらに含むことを特徴とする請求項20または21記載の方法。
- ジフテリア菌の感染により生じる疾患に対して宿主を免疫するためのワクチンとして前記ジフテリア毒素またはその類似物を製剤化する工程をさらに含むことを特徴とする請求項22記載の方法。
- 前記培地が、動物由来産物を欠いていることを特徴とする請求項13から23いずれか1項記載の方法。
- 請求項23記載の方法により調製したワクチンを宿主に投与する工程を含むことを特徴とする、ジフテリア菌の感染により生じる疾患に対して宿主を免疫する方法。
- ジフテリア菌の感染により生じる疾患に対して宿主を免疫するための請求項23記載の方法により調製したワクチンの使用。
- ジフテリア菌の感染により生じる疾患に対して宿主を免疫するための医薬の調製における請求項22記載の方法により得たジフテリア毒素またはその類似物の使用。
- ジフテリア菌株と、動物由来産物を実質的に含まずかつ下記の成分を含むジフテリア毒素またはその類似物を産生するための培地とを含む組成物:
a.水;
b;炭化水素源および窒素源;
c;それぞれがジフテリア毒素またはその類似物の産生レベルを制限しない初期濃度の複数の遊離アミノ酸。 - 前記培地が全ての天然アミノ酸を含むことを特徴とする請求項28記載の組成物。
- 前記炭水化物源がマルトースを含むことを特徴とする請求項28記載の組成物。
- 前記培地がグルコースを実質的に含まないことを特徴とする請求項28記載の組成物。
- 前記窒素源が酵母抽出物を含むことを特徴とする請求項28記載の組成物。
- 動物由来産物を欠いていることを特徴とする請求項28から32いずれか1項記載の組成物。
- ジフテリア毒素またはその類似物を産生する方法であって、動物由来産物を実質的に含まない培地中でジフテリア菌の培養物を増殖させ、さらに前記培養物に少なくとも1つの選択アミノ酸を提供して該選択アミノ酸が毒素産生を制限するのを防ぐ工程を含むことを特徴とする方法。
- 前記培地が酵母抽出物を更に含むことを特徴とする請求項34記載の方法
- 前記酵母抽出物が、約3g/Lの濃度で存在することを特徴とする請求項35記載の方法。
- ジフテリア毒素またはその類似物の産生をもたらすためにアミノ酸含有培地においてジフテリア菌を培養し、その培養の間に少なくとも1つの選択アミノ酸が使い尽くされてジフテリア毒素またはその類似物の産生レベルを制限する培養方法において、前記培養の間に追加量の前記少なくとも1つの選択アミノ酸の外因性の添加を含み、該少なくとも1つの選択アミノ酸がジフテリア毒素またはその類似物の産生レベルを制限しないことを特徴とする方法。
- 前記少なくとも1つの選択アミノ酸が、Glu、Asn、Ser、His、Gly、Thr、Met、Trpおよびイソロイシンより成る群から選択されることを特徴とする請求項37記載の方法。
- 前記培地が酵母抽出物をさらに含むことを特徴とする請求項37記載の方法
- 前記酵母抽出物が、約3g/Lの濃度で存在することを特徴とする請求項39記載の方法。
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