JP7161493B2 - Crm197の高レベル製造のための改良法 - Google Patents
Crm197の高レベル製造のための改良法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7161493B2 JP7161493B2 JP2019557469A JP2019557469A JP7161493B2 JP 7161493 B2 JP7161493 B2 JP 7161493B2 JP 2019557469 A JP2019557469 A JP 2019557469A JP 2019557469 A JP2019557469 A JP 2019557469A JP 7161493 B2 JP7161493 B2 JP 7161493B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- crm
- medium
- acid
- amino acids
- strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 79
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 48
- 108010071134 CRM197 (non-toxic variant of diphtheria toxin) Proteins 0.000 title description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 71
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 56
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 56
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 56
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 49
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 49
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 35
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 29
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 29
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 27
- 241000186227 Corynebacterium diphtheriae Species 0.000 claims description 26
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims description 22
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 21
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 230000004907 flux Effects 0.000 claims description 20
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 20
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 18
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 18
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 claims description 18
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- WLJVNTCWHIRURA-UHFFFAOYSA-N pimelic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCC(O)=O WLJVNTCWHIRURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 claims description 18
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 17
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 16
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 15
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 13
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 13
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 12
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 12
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 12
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 12
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 12
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 claims description 11
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 11
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 11
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 11
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 11
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 11
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 11
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 11
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 11
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 11
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 10
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 10
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 10
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 10
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 10
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 10
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 claims description 10
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 claims description 10
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 claims description 10
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 9
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 9
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 9
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 9
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 9
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 9
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 claims description 9
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 claims description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 claims description 8
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 8
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims description 8
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 8
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 8
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 8
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 claims description 7
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 claims description 7
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 claims description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 6
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 6
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 6
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 5
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 claims description 5
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 5
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 claims description 4
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 4
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 claims description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 4
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 claims description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 claims description 4
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 4
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 claims description 4
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 claims description 4
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 claims description 4
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 claims description 4
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 claims description 4
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 claims description 4
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 claims description 3
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 claims description 3
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 claims description 3
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 3
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 claims description 3
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 claims description 2
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 101150044687 crm gene Proteins 0.000 description 98
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 14
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 11
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 9
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 9
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 8
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 8
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 7
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 7
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 7
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 7
- JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.[Cu+2].[O-]S([O-])(=O)=O JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 3
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 3
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 3
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 3
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N hydron Chemical compound [H+] GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 102000009062 ADP Ribose Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108010049290 ADP Ribose Transferases Proteins 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241000702141 Corynephage beta Species 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124950 Prevnar 13 Drugs 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 229940045808 haemophilus influenzae type b Drugs 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003312 immunocapture Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 235000021048 nutrient requirements Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/05—Actinobacteria, e.g. Actinomyces, Streptomyces, Nocardia, Bifidobacterium, Gardnerella, Corynebacterium; Propionibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Manufacture Of Electron Tubes, Discharge Lamp Vessels, Lead-In Wires, And The Like (AREA)
- Forging (AREA)
Description
本発明のさらに他の目的は、コスト効果が高くかつ結合型ワクチン作製のために使用できる高レベルのCRM197製造のための改良法を提供することである。
サプリメントとして本発明に用いられる種々の栄養素には、ニコチン酸、チアミン、パントテン酸、ビオチン、リボフラビン、葉酸から選択されるビタミン;ピメリン酸;ホスフェート、窒素源および微量金属などが含まれ、各ビタミンは約0.05から20mg/lまでの範囲の量で用いられる。
本発明は、CRM197遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌株を用いてCRM197を高収量で製造するための改良法を提供し、その方法は代謝フラックスモデルに基づいて発酵培地に栄養素を補充することを含む。
このモデルは、主要変数としてのプロセス中の水素イオン蓄積、それに続いて溶存酸素、酸素からCO2への変換、ならびにプロセス中に放出される熱のオンラインデータ解釈に基づいて作成された。たとえば、このモデルは炭素源制限条件について作動する。炭素源を周期的に変動させ、その応答をプロセス中で評価する。その応答に基いて、水素イオン発生に対する補正行動をとった。次いで、定常的なpHおよび溶存酸素(dissolved oxygen)(DO)および熱伝達速度(たとえば、pH7.4;残留DO>2~20;熱伝達速度((Heat transfer rate)HTR)を得るために供給を最適化した。
本発明は、炭素源としてのマルトースの使用および脱鉄工程を伴なわない。
i)CRM197遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌株を、動物由来成分を含まない、基礎培地、ならびにアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、およびそれの塩類から選択される10種類より多いアミノ酸を含む発酵培地中で培養し、そして
ii)代謝フラックスモデルに基づいて培地にグルコースおよび栄養素を補充する
ことを含む。
本発明により製造したCRM197を、免疫捕獲酵素結合イムノソルベントアッセイ(Immuno-Capture Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay)(IC-ELISA)で定量した。
ジフテリア菌C7(β-197) ATCC 53821にはCRM197をコードする遺伝子が単一コピーとして存在し、鉄調節された条件下で変異CRM197タンパク質が培地中へ分泌される。2コピーのコリネファージ-ベータ(corynephage-beta)を有するジフテリア菌C7株(ATCC 39255)においては、CRM197の収量は3倍増加する。これは、遺伝子コピー数が生産性増大と関連することを示唆する。ジフテリア菌からのCRM197産生を商業価値のあるものにするためには、発現レベルを増大させることが望まれる。より多数のコピーを細菌ゲノムに組み込むことは技術的に難しい。多コピーのファージ組込み体は遺伝学的に不安定であり、CRM遺伝子の追加コピーを喪失する。本発明者らは、CRM197の天然調節エレメントと共に抗生物質選択マーカーを有するプラスミド上において、送達されるCRM197の遺伝子コピー数を増加させることにより、CRM197発現レベルを改善することを試みた。それに応じて、本発明者らはCRM197遺伝子のコピー数が増加したジフテリア菌株を開発し、その株の安定性を評価した。その改変株は、非改変ジフテリア菌株と比較して、より高いレベルのCRM197を発現した。
態様1
CRM 197 遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)株を用いてCRM 197 を高収量で製造するための改良法であって、10種類より多いアミノ酸を含み、動物由来成分を含まない発酵培地中で、その株を増殖させることを含む方法。
態様2
培地に栄養素を補充することを含む、態様1に記載の方法。
態様3
栄養素の補充が代謝フラックスモデルに基づく、態様2に記載の方法。
態様4
アミノ酸が、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、およびそれの塩類から選択される、態様1に記載の方法。
態様5
各アミノ酸を約0.05~2g/lの量で使用する、態様4に記載の方法。
態様6
発酵培地がフェニルアラニン、アルギニンおよび他のアミノ酸の組合わせを含有し、その際、フェニルアラニンおよびアルギニンの量が約1g/L未満である、態様1に記載の方法。
態様7
栄養素が、ビタミン、たとえばニコチン酸、チアミン、パントテン酸、ビオチン、リボフラビン、葉酸;ピメリン酸;ホスフェート、窒素源および微量金属から選択される、態様2に記載の方法。
態様8
発酵培地が脱鉄されておらず、動物由来成分を全く含まない、前記態様のいずれかに記載の方法。
態様9
発酵培地組成物が、酵母エキス、ベジタブルペプトン、リン酸二水素カリウム(KH 2 PO 4 )、トリプトファン、グルコース、YC微量塩類溶液を含む基礎発酵培地を含む、前記態様のいずれかに記載の方法。
態様10
発酵プロセス全体を通して培地にグルコースを補充することを含む、前記態様のいずれかに記載の方法。
態様11
CRM 197 を製造するための改良法であって、
i)CRM 197 遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)株を、動物由来成分を含まない、基礎培地、ならびにアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、およびそれの塩類から選択される10種類より多いアミノ酸を含む発酵培地中で培養し、そして
ii)代謝フラックスモデルに基づいて培地にグルコースおよび栄養素を補充する
ことを含む方法。
態様12
CRM 197 を製造するための改良法であって、CRM 197 遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)株を、動物由来成分を含まない、10種類より多いアミノ酸を含む発酵培地中で培養し、そして代謝フラックスモデルに基づいて培地に栄養素を補充し、その際、各アミノ酸を約0.05~2g/lの量で使用することを含む方法。
態様13
発酵を30~40℃の温度、および7.0~8.0、好ましくは7.4~7.6の範囲のpHで実施する、前記態様のいずれかに記載の方法。
態様14
得られるCRM 197 の収量が150mg/L、200mg/L、300mg/L、500mg/L、1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L、3.5g/L、4g/l、4.5g/L、5g/Lより多い、前記態様のいずれかに記載の方法。
態様15
チフス菌(Salmonella typhi)、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)に由来する多糖を前記態様のいずれかの記載の方法により製造されたCRM 197 と結合させることを含む、結合型ワクチンを製造するための方法。
以下に示す例を参照して本発明をより具体的に説明する。ただし、当業者に自明のとおり、本発明が例によって決して限定されず、本明細書に記載するパラメーター内でのその変動を含むことを理解すべきである。
CRM197のエピソームコピーによるCRM197発現の改良:
ジフテリア菌C7(β197)において安定複製できるベクターを作製した。ジフテリア菌C7からの天然プラスミドの単離を、T.C Currier et al., Anal Biochem. 1976; 76(2): 431441に記載される大型プラスミド単離プロトコルを用いて実施した。天然プラスミドDNAの調製法を用いて、1.87Kbの複製起点(oriR)を増幅した。同時に、pUC4-KIXX鋳型DNAを用いて1.033KbのkanR配列を増幅させ、平滑末端をoriRにライゲートさせてpBE30を作製した。さらに、pToxプロモーター領域(Boyd et al., 1988)、cruおよび推定ターミネーター配列を含む2.13KbのCRM197遺伝子配列をジフテリア菌C7(β197)ゲノムDNAから増幅させ、pBE30中に設計したユニークSpeI制限部位内へクローニングした。このアンプリコンにおけるGAG変異を、対立遺伝子特異的PCRアッセイ(Pushnova et al., Analytical Biochemistry. 1998; 260: 24 to 29)およびDNAシーケンシングによって立証した。こうして得られたプラスミドをpBE33と表記した(図1)。
動物由来成分を含まない基礎培地上での工学操作ジフテリア菌C7Ep株を用いるCRM197の産生
ジフテリア菌C7Ep株をこのプロセスに用いた。接種用調製物を得るために振とうフラスコ内で2工程培養を行なった。振とうフラスコ培養のための培地は、酵母エキス(Yeast Extract)(YE)10g/L、ベジタブルペプトン(Veg. Peptone)15g/L、KH2PO4 4.3g/L、トリプトファン50mg/L、グルコース4.0g/L、ニコチン酸0.8mg/L、ピメリン酸0.08mg/L、CuSO4・5H2O 25mg/L、ZnSO4・5H2O 12.5mg/L、MnCl2・4H2O 6.25mg/L、シスチン0.5g/L、カナマイシン25mg/L、グルコース4.0g/Lを含む。
動物由来成分を含まない基礎培地上での代謝フラックスバランスモデルに従った工学操作ジフテリア菌C7Ep株を用いるCRM197の製造
ジフテリア菌C7Ep株をこのプロセスに用いた。接種用調製物を得るために振とうフラスコ内での2工程培養を行なった。振とうフラスコ培養のための培地は、YE 10g/L、ベジタブルペプトン15g/L、KH2PO4 4.3g/L、トリプトファン50mg/L、グルコース4.0g/L、ニコチン酸0.8mg/L、ピメリン酸0.08mg/L、CuSO4・5H2O 25mg/L、ZnSO4・5H2O 12.5mg/L、MnCl2・4H2O 6.25mg/L、シスチン0.5g/L、カナマイシン25mg/L、グルコース4.0g/Lを含む。
本発明に従ったCRM197の製造
接種用調製物を得るために3工程培養を行なった。最初の2工程を振とうフラスコ内で行なった。振とうフラスコ培養のための培地は、YE 10g/L、ベジタブルペプトン15g/L、KH2PO4 4.3g/L、トリプトファン50mg/L、グルコース 4.0g/L、YC微量塩類溶液 2ml/L、シスチンサプリメント1ml/L、カナマイシン25mg/L、グルコース4.0g/Lを含む。
天然ジフテリア菌C7および工学操作ジフテリア菌C7Ep株を用いるCRM197収量の比較
アニマルフリー基礎培地、プレモデルプロセス改良、ならびに本発明による培地およびプロセスを用い、天然C7ジフテリア菌および工学操作ジフテリア菌株を用いて発酵を実施した。
Claims (14)
- CRM197遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)株を用いてCRM197を高収量で製造するための改良法であって、チロシンおよびアスパラギン以外の10種類より多いアミノ酸を含み、動物由来成分並びにチロシンおよびアスパラギンを含まない、脱鉄されていない発酵培地中で、その株を増殖させる、ここで炭素源としてマルトースは使用しない、ことを含む方法。
- 培地に栄養素を補充することを含む、請求項1に記載の方法。
- 栄養素の補充が代謝フラックスモデルに基づく、請求項2に記載の方法。
- アミノ酸が、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、およびそれの塩類から選択される、請求項1に記載の方法。
- 各アミノ酸を0.05~2g/lの量で使用する、請求項4に記載の方法。
- 発酵培地がフェニルアラニン、アルギニンおよび他のアミノ酸の組合わせを含有し、その際、フェニルアラニンおよびアルギニンの量が1g/L未満である、請求項1に記載の方法。
- 栄養素が、ビタミン、たとえばニコチン酸、チアミン、パントテン酸、ビオチン、リボフラビン、葉酸、ピメリン酸、ホスフェート、窒素源および微量金属から選択される、請求項2に記載の方法。
- 発酵培地組成物が、酵母エキス、ベジタブルペプトン、リン酸二水素カリウム(KH2PO4)、トリプトファン、グルコース、YC微量塩類溶液を含む基礎発酵培地を含む、請求項1から7のいずれか1項に記載の方法。
- 発酵プロセス全体を通して培地にグルコースを補充することを含む、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。
- CRM197を製造するための改良法であって、
i)CRM197遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)株を、動物由来成分並びにチロシンおよびアスパラギンを含まず、基礎培地、ならびにアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、およびそれの塩類から選択される10種類より多いアミノ酸を含む、脱鉄されていない発酵培地中で培養し、そして
ii)代謝フラックスモデルに基づいて培地にグルコースおよび栄養素を補充する、ここで炭素源としてマルトースは使用しない、
ことを含む方法。 - CRM197を製造するための改良法であって、CRM197遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)株を、動物由来成分並びにチロシンおよびアスパラギンを含まず、チロシンおよびアスパラギン以外の10種類より多いアミノ酸を含む、脱鉄されていない発酵培地中で培養し、そして代謝フラックスモデルに基づいて培地に栄養素を補充し、その際、各アミノ酸を0.05~2g/lの量で使用する、ここで炭素源としてマルトースは使用しない、ことを含む方法。
- 発酵を30~40℃の温度、および7.0~8.0の範囲のpHで実施する、請求項1から11のいずれか1項に記載の方法。
- 150mg/Lから500mg/LのCRM197を産生する、請求項1から12のいずれか1項に記載の方法。
- チフス菌(Salmonella typhi)、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)に由来する多糖を請求項1から13のいずれか1項の記載の方法により製造されたCRM197と結合させることを含む、結合型ワクチンを製造するための方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IN201741014335 | 2017-04-22 | ||
IN201741014335 | 2017-04-22 | ||
PCT/IN2018/050235 WO2018193475A2 (en) | 2017-04-22 | 2018-04-19 | An improved method for high level production of crm |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020517274A JP2020517274A (ja) | 2020-06-18 |
JP7161493B2 true JP7161493B2 (ja) | 2022-10-26 |
Family
ID=63678648
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019557469A Active JP7161493B2 (ja) | 2017-04-22 | 2018-04-19 | Crm197の高レベル製造のための改良法 |
Country Status (30)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11098089B2 (ja) |
EP (1) | EP3612553B1 (ja) |
JP (1) | JP7161493B2 (ja) |
KR (1) | KR102637436B1 (ja) |
CN (1) | CN110741013B (ja) |
AU (1) | AU2018255959B2 (ja) |
BR (1) | BR112019022093A2 (ja) |
CA (1) | CA3060723A1 (ja) |
CL (1) | CL2019003003A1 (ja) |
CO (1) | CO2019011643A2 (ja) |
CU (1) | CU24668B1 (ja) |
DK (1) | DK3612553T3 (ja) |
EA (1) | EA201992527A1 (ja) |
ES (1) | ES2926535T3 (ja) |
HR (1) | HRP20221060T1 (ja) |
HU (1) | HUE059629T2 (ja) |
IL (1) | IL270075B2 (ja) |
LT (1) | LT3612553T (ja) |
MX (1) | MX2019012563A (ja) |
MY (1) | MY194242A (ja) |
PH (1) | PH12019550214A1 (ja) |
PL (1) | PL3612553T3 (ja) |
PT (1) | PT3612553T (ja) |
RS (1) | RS63551B1 (ja) |
SA (1) | SA519410306B1 (ja) |
SG (1) | SG11201909765XA (ja) |
SI (1) | SI3612553T1 (ja) |
UA (1) | UA127497C2 (ja) |
WO (1) | WO2018193475A2 (ja) |
ZA (1) | ZA201906270B (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20210062669A (ko) | 2018-09-23 | 2021-05-31 | 바이오로지칼 이 리미티드 | 스트렙토코쿠스 뉴모니아에의 정제된 협막 다당류 |
CN113755380A (zh) * | 2021-09-23 | 2021-12-07 | 艾美卫信生物药业(浙江)有限公司 | 一种发酵生产白喉毒素crm197蛋白的菌种培养基、配制方法以及菌种复苏培养方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007513613A (ja) | 2003-12-12 | 2007-05-31 | サノフィ パストゥール リミテッド | ジフテリア毒素の産生 |
JP2008533980A (ja) | 2005-03-23 | 2008-08-28 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | ジフテリア毒素生産のための発酵方法 |
JP2014500269A (ja) | 2011-11-11 | 2014-01-09 | ノバルティス アーゲー | ヒトワクチンとしての使用に適するジフテリアトキソイドの生成のための動物由来成分を含まない発酵培地 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2231770T3 (es) * | 1993-03-05 | 2005-05-16 | Wyeth Holdings Corporation | Nuevos plasmidos para la produccion de proteina crm y toxina difterica. |
PT1849860E (pt) | 1997-05-28 | 2011-02-23 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Processo de preparação de um factor imunogénico de corynebacterium diphtheriae utilizando um meio de cultura com extracto de levedura como fonte de aminoácidos e sem complexos proteicos de origem animal |
US20040087020A1 (en) * | 1997-05-28 | 2004-05-06 | Chiron S.P.A. | Culture medium with yeast or soy bean extract as amino acid source and no protein complexes of animal origin |
GB9904582D0 (en) | 1999-02-26 | 1999-04-21 | Nycomed Imaging As | Process |
AU2010201410B2 (en) * | 2010-03-30 | 2015-04-30 | Pelican Technology Holdings, Inc. | High level expression of recombinant CRM197 |
FR2992656B1 (fr) * | 2012-07-02 | 2016-10-07 | Sanofi Pasteur | Procede de production d'antigenes haemophilus influenzae type b |
ITMI20130142A1 (it) * | 2013-01-31 | 2014-08-01 | Biosynth Srl | Vaccini glicoconiugati comprendenti unita' di base di un costrutto molecolare esprimente epitopi multipli incorporati |
JP6473460B2 (ja) * | 2014-03-03 | 2019-02-20 | スカラブ ゲノミクス, エルエルシー | 大腸菌における組換えcrm197の産生強化 |
-
2018
- 2018-04-19 US US16/606,958 patent/US11098089B2/en active Active
- 2018-04-19 SG SG11201909765X patent/SG11201909765XA/en unknown
- 2018-04-19 BR BR112019022093A patent/BR112019022093A2/pt unknown
- 2018-04-19 KR KR1020197033074A patent/KR102637436B1/ko active IP Right Grant
- 2018-04-19 ES ES18773868T patent/ES2926535T3/es active Active
- 2018-04-19 CU CU2019000083A patent/CU24668B1/es unknown
- 2018-04-19 LT LTEPPCT/IN2018/050235T patent/LT3612553T/lt unknown
- 2018-04-19 HU HUE18773868A patent/HUE059629T2/hu unknown
- 2018-04-19 HR HRP20221060TT patent/HRP20221060T1/hr unknown
- 2018-04-19 RS RS20220813A patent/RS63551B1/sr unknown
- 2018-04-19 EP EP18773868.7A patent/EP3612553B1/en active Active
- 2018-04-19 MX MX2019012563A patent/MX2019012563A/es unknown
- 2018-04-19 WO PCT/IN2018/050235 patent/WO2018193475A2/en active Application Filing
- 2018-04-19 DK DK18773868.7T patent/DK3612553T3/da active
- 2018-04-19 AU AU2018255959A patent/AU2018255959B2/en active Active
- 2018-04-19 JP JP2019557469A patent/JP7161493B2/ja active Active
- 2018-04-19 PT PT187738687T patent/PT3612553T/pt unknown
- 2018-04-19 IL IL270075A patent/IL270075B2/en unknown
- 2018-04-19 EA EA201992527A patent/EA201992527A1/ru unknown
- 2018-04-19 CN CN201880026461.2A patent/CN110741013B/zh active Active
- 2018-04-19 CA CA3060723A patent/CA3060723A1/en active Pending
- 2018-04-19 UA UAA201911302A patent/UA127497C2/uk unknown
- 2018-04-19 MY MYPI2019006169A patent/MY194242A/en unknown
- 2018-04-19 PL PL18773868.7T patent/PL3612553T3/pl unknown
- 2018-04-19 SI SI201830744T patent/SI3612553T1/sl unknown
-
2019
- 2019-09-23 ZA ZA2019/06270A patent/ZA201906270B/en unknown
- 2019-10-16 PH PH12019550214A patent/PH12019550214A1/en unknown
- 2019-10-16 SA SA519410306A patent/SA519410306B1/ar unknown
- 2019-10-21 CO CONC2019/0011643A patent/CO2019011643A2/es unknown
- 2019-10-21 CL CL2019003003A patent/CL2019003003A1/es unknown
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007513613A (ja) | 2003-12-12 | 2007-05-31 | サノフィ パストゥール リミテッド | ジフテリア毒素の産生 |
JP2008533980A (ja) | 2005-03-23 | 2008-08-28 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | ジフテリア毒素生産のための発酵方法 |
JP2014500269A (ja) | 2011-11-11 | 2014-01-09 | ノバルティス アーゲー | ヒトワクチンとしての使用に適するジフテリアトキソイドの生成のための動物由来成分を含まない発酵培地 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
P.P. Nagarkar, et al.,The amino acid requirements of Corynebacterium diphtheriae PW 8 substrain CN 2000.,Journal of Applied Microbiology,2002年,Vol.92,p.215-220 |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6961819B2 (ja) | L−リジンを生産する組換え菌、その構築方法およびl−リジンの生産方法 | |
JP5980580B2 (ja) | アスパラギン酸由来アミノ酸および化学物質の改善された生産のための改変グリオキシル酸シャント | |
JP7125477B2 (ja) | グリシン生産能が増加された微生物及びこれを用いた発酵組成物の生産方法 | |
JP2021500914A5 (ja) | ||
CN107034250A (zh) | 谷氨酸类l‑氨基酸的制造方法 | |
JP5897197B2 (ja) | 有用物質の製造法 | |
CN108467848A (zh) | 可利用木糖的棒状杆菌微生物和利用其产生l-赖氨酸的方法 | |
TWI785327B (zh) | 製造l-胺基酸的微生物及使用該微生物製造l-胺基酸的方法 | |
JP7161493B2 (ja) | Crm197の高レベル製造のための改良法 | |
JP2019115341A (ja) | L−リジンを生産するコリネバクテリウム属微生物、及びそれを利用したl−リジンの生産方法 | |
CN105980544B (zh) | 生产l-氨基酸的微生物及使用所述微生物生产l-氨基酸的方法 | |
Masilamani et al. | Method for high level production of CRM 197 | |
EA045614B1 (ru) | Улучшенный способ крупномасштабного производства crm197 | |
OA20586A (en) | An improved method for high level production of CRM | |
CN115044490B (zh) | L-赖氨酸生产能力得到提高的谷氨酸棒状杆菌突变株及利用其的l-赖氨酸的生产方法 | |
CN116286759A (zh) | 氨基酸产量相关蛋白cynT及其生物材料和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200318 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210308 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20211110 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20211124 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220224 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220603 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220823 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20221011 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20221014 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7161493 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |