JP7161493B2

JP7161493B2 - Ｃｒｍ１９７の高レベル製造のための改良法

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Publication number: JP7161493B2
Application number: JP2019557469A
Authority: JP
Inventors: マシラマニ，バラムラリ; スリラマン，ラジャン; ディークシト，マンダル・シリシュ; チャッカ，デビプラサンナ; スレッディ，サティアム・ナイドゥ; ベンカトマトゥール，ラメシュ; デーブマンテナ，ナレンダー; ダトラ，マヒマ
Original assignee: バイオロジカルイーリミテッド
Priority date: 2017-04-22
Filing date: 2018-04-19
Publication date: 2022-10-26
Anticipated expiration: 2038-04-19
Also published as: ES2926535T3; CU20190083A7; UA127497C2; PT3612553T; IL270075A; PL3612553T3; IL270075B2; SA519410306B1; DK3612553T3; SI3612553T1; CU24668B1; EP3612553B1; AU2018255959A1; EA201992527A1; IL270075B1; US11098089B2; KR20200010218A; HRP20221060T1; WO2018193475A2; JP2020517274A

Description

本発明は、ＣＲＭ_１９７遺伝子のコピー数が増加したジフテリア菌(Corynebacterium diphtheria)株を用いて高収量でＣＲＭ_１９７を製造するための改良法に関する。

ＣＲＭ_１９７は、遺伝学的に無毒化した形態のジフテリアトキシンである。位置５２においてグリシンをグルタミン酸に置き換える単一変異は、天然トキシンのＡＤＰ－リボシルトランスフェラーゼ活性を喪失させる。ＣＲＭ_１９７の毒性欠如についての構造原理が解明され、結合型ワクチンのためのキャリアタンパク質として広く用いられている。ＣＲＭ_１９７は、ジフテリアトキシンと同様に２つのサブユニット（ジスルフィド橋により連結したもの）からなる５３５アミノ酸の一本鎖ポリペプチド（５８．４ＫＤ）である。

ＣＲＭ_１９７は、多数の承認済み結合型ワクチン、たとえば商品名Ｈｉｂｔｉｔｅｒ（商標）で市販されているインフルエンザ菌(Haemophilus influenza)ｂ型コンジュゲート、商品名ＰＲＥＶＮＡＲ１３（登録商標）で市販されている１３価肺炎球菌多糖コンジュゲートなどにおいて、キャリアタンパク質として用いられている。

Ruth M. Drew et al., Bacteriol. 1951 Nov; 62(5):549-59には、高力価ジフテリアトキシンの製造に適した化学的特定培地が開示され、パーク・ウイリアムズ(Park-Williams)ｎｏ．８のジフテリア菌トロント株のアミノ酸要求が概説されている。その培地は、動物由来成分、すなわちカゼイン水解物の有効な代替となるアミノ酸を含有する。それらのアミノ酸には、グルタミン酸、シスチン、プロリン、トリプトファン、ロイシン、バリン、メチオニン、およびグリシンが含まれる。

Rappuoli et al; Applied and Environmental Microbiology 1983 Vol. 46(3):560-564には、ノンタンデムダブル溶原菌(lysogen)は安定であり、モノ溶原菌より最大３倍高い高収量のＣＲＭ_１９７を産生できることが開示されている。

R Fass. et al., Applied Microbiology and Biotechnology; April 1995, Volume 43(1): 83-88には、２つのジフテリア菌株：Ｃ７（β）（ｔｏｘ－２０１，ｔｏｘ－９）およびＣ７（β）（ｔｏｘ－１０７）から変異ジフテリアトキシンを製造するための高密度増殖法が開示されている。その方法は迅速かつ高密度の細菌増殖をもたらす改変した脱鉄されていない(non-deferrated)増殖培地の使用を伴ない、それはグルコースおよび鉄の同時枯渇を伴なう場合にはトキシン産生を増強した。６００ｎｍで７０の吸光度を与える細胞密度（乾燥重量１５～２０ｇ／Ｌ）にまで細菌が増殖できるように、酸素富化空気が供給された。培地上清における最大トキシン濃度は１５０ｍｇ／ｌであった。

Parag P. Nagarkar et al., Journal of Applied Microbiology 2002, 92, 215-220には、ジフテリア菌の増殖中におけるアミノ酸利用パターンが開示され、試験した９種類中４種類のアミノ酸、すなわちシスチン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびメチオニンのみがジフテリア菌の増殖およびにトキシン産生に必須であることが示された。

European Patent No. 1 849 860 B1には、病原菌の培養のための培地成分として動物起源ではないタンパク性材料、たとえばダイズ、綿実、バレイショなどに由来するタンパク質の使用が開示されている。

US Patent No. 6,962,803 B2には、ジフテリアトキシンを産生できる微生物株を発酵させることによるジフテリアトキシンの精製方法が開示され、その方法は増殖培地にグルコースを添加することを含み、それによればグルコースの添加はジフテリアトキシン産生を支持するのに有効な微生物増殖を維持する。それはさらに、増殖のためには炭素源のほかに他の最少栄養素要求があり、それには微量金属、ホスフェート、窒素源、一般にカザミノ酸および酵母エキスが含まれることが開示されている。

US Patent Application Publication No. 2011/0097359 A1には、ジフテリア菌の株を培養して、あるレベルのジフテリアトキシンまたはそのアナログを産生させるための培地が開示され、その培地は動物由来の産物を実質的に含まず、水；炭水化物源；窒素源；および初期濃度の多数の遊離アミノ酸を含み、遊離アミノ酸それぞれの初期濃度はジフテリアトキシンまたはそのアナログの産生レベルを制限するものではない。さらに、炭水化物源はグルコースを含まないことが開示されている。

WO 2006/100108 A1には、ジフテリア菌の株を発酵槽内の培地中で、均一培養を維持するのに十分な撹拌および培養物内のｐＯ_２が大部分の発酵工程について４％未満に低下するように制限された通気の条件下において増殖させる工程を含む発酵プロセスが開示されている。さらに、酸または塩基の添加を必要としない程度の通気により発酵槽内のｐＨを７．０～７．８に保持することが開示されている。

ＣＲＭ_１９７プロセスはプロセス構成要素およびプロセスパラメーターのわずかな変化に対して一般的に感受性である。ジフテリア菌からのＣＲＭ_１９７製造は広く行なわれているにもかかわらず、商業化の成功は限られている。前記参考文献に開示されている方法には、工学操作ジフテリア菌株を用いて＞１５０ｍｇ／ｌのような高収量でＣＲＭ_１９７を製造するものはない。本発明の発明者らは、工学操作ジフテリア菌株を用いて高収量でＣＲＭ_１９７を製造するための代謝フラックスモデル(metabolic flux model)を開発した。

European Patent No. 1 849 860 B1 US Patent No. 6,962,803 B2 US Patent Application Publication No. 2011/0097359 A1 WO 2006/100108 A1

Ruth M. Drew et al., Bacteriol. 1951 Nov; 62(5):549-59 Rappuoli et al; Applied and Environmental Microbiology 1983 Vol. 46(3):560-564 R Fass. et al., Applied Microbiology and Biotechnology; April 1995, Volume 43(1): 83-88 Parag P. Nagarkar et al., Journal of Applied Microbiology 2002, 92, 215-220

本発明の主な目的は、ＣＲＭ_１９７の高レベル製造のための改良法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、コスト効果が高くかつ結合型ワクチン作製のために使用できる高レベルのＣＲＭ_１９７製造のための改良法を提供することである。

本発明は、ＣＲＭ_１９７遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌株を用いてＣＲＭ_１９７を高収量で製造するための改良法を提供し、その方法は１種類以上のアミノ酸を含み、動物由来成分を含まない発酵培地中で、その株を増殖させることを含む。

本発明は、ＣＲＭ_１９７を製造するための改良法を提供し、その方法はＣＲＭ_１９７遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌株を、動物由来成分を含まない、１０種類より多いアミノ酸を含む発酵培地中で培養し、その培地に栄養素を補充することを含む。

本発明はまた、ＣＲＭ_１９７を製造するための改良法を提供し、その方法はＣＲＭ_１９７遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌株を、動物由来成分を含まない、１０種類より多いアミノ酸を含む発酵培地中で培養し、代謝フラックスモデルに基づいてその培地に栄養素を補充することを含む。

図１－ｐＢＥ３３と表記するプラスミドの構築。図２－代謝フラックスバランスモデルのフローチャート。

本発明は、ＣＲＭ_１９７遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌株を用いてＣＲＭ_１９７を高収量で製造するための改良法を提供し、その方法は１０種類より多いアミノ酸を含み、動物由来成分を含まない発酵培地中で、その株を増殖させることを含む。

本発明の工学操作ジフテリア菌株（Ｃ７Ｅｐ）は、宿主ＣＲＭ_１９７遺伝子のものと同じメカニズムにより調節されるエピソーム配置された多重コピーのＣＲＭ_１９７遺伝子をもち、その株の遺伝子バックグラウンドが単一の溶原菌(lysogen)であるジフテリア菌を表わす。

本発明に用いるアミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、およびそれの塩類から選択され、各アミノ酸は約０．０５～２ｇ／ｌの量で用いられる。

ＣＲＭ_１９７の製造についてのアミノ酸、ビタミンおよびプロセス条件の影響は研究されている。あるアミノ酸は細菌の増殖に対して負の影響を示すことが見出されている。しかし、１０種類より多いアミノ酸を最適濃度で用いるとＣＲＭ_１９７の産生が増加することを見出した。アミノ酸の濃度はプラケット・バーマン(Plackett Burman)実験計画を用いて最適化される。

プラケット・バーマン計画は、多数の独立変数（因子）に対するある測定量の依存性を調べ、それによって限られた数の実験を用いてこれらの依存性の推定値の分散を最小限に抑えるための実験計画である。その結果は、アスパラギン酸、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリンなどのアミノ酸および３５～３６℃の温度はＣＲＭ_１９７合成に対して正の影響をもち、アラニン、イソロイシン、バリンなどのアミノ酸および３５～３６℃の温度はＣＲＭ_１９７合成において負の影響をもつことを示した。高レベルのＣＲＭ_１９７産生を達成するために異なる濃度で数レベルの実験計画を実施した。チロシンおよびアスパラギンの使用はＣＲＭ_１９７の全収量を低下させ、よってこれらのアミノ酸は本発明の一部ではない。

本発明の好ましい態様において、発酵培地はフェニルアラニン、アルギニン、および１種類以上の他のアミノ酸を含有し、その際、フェニルアラニンおよびアルギニンの使用量は約１ｇ／Ｌ未満である。

本発明のより好ましい態様において、発酵培地はフェニルアラニン、アルギニン、および１種類以上の他のアミノ酸を含有し、その際、フェニルアラニンの量は約０．２５～０．７５ｇ／ｌであり、アルギニンの量は約０．１～０．５ｇ／ｌである。

本発明は、ＣＲＭ_１９７遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌株を用いてＣＲＭ_１９７を製造するための改良法を提供し、その方法は１０種類より多いアミノ酸を含む発酵培地中でその株を増殖させ、培地に約０．０５～２０ｍｇ／ｌの範囲のビタミンを補充することを含み、その培地は動物由来成分を含まない。

本発明の他の態様において、アミノ酸、ビタミン、微量元素などが培養中に栄養素として発酵培地に添加される。
サプリメントとして本発明に用いられる種々の栄養素には、ニコチン酸、チアミン、パントテン酸、ビオチン、リボフラビン、葉酸から選択されるビタミン；ピメリン酸；ホスフェート、窒素源および微量金属などが含まれ、各ビタミンは約０．０５から２０ｍｇ／ｌまでの範囲の量で用いられる。

本発明に用いられる発酵培地は脱鉄されておらず(non-defferated)、動物由来成分を全く含まない。さらに、培地は伝統的な肉ベースのＬｏｅｆｆｌｅｒ培地およびカザミノ酸ベースの脱鉄された低鉄ＹＣ培地も含まない。本発明の発酵培地の成分には、酵母エキス、ベジタブルペプトン(Veg. Peptone)、リン酸二水素カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４）、トリプトファン、グルコース、ＹＣ微量塩類溶液(YC Trace salt solution)が含まれる。

本発明の他の態様において、ＣＲＭ_１９７遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌株の培養のための培地組成物は、酵母エキス、ベジタブルペプトン、リン酸二水素カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４）、トリプトファン、グルコース、ＹＣ微量塩類溶液；１種類以上のアミノ酸、ビタミン、微量元素などを含む基礎発酵培地を含む。

適切な微量金属には、カリウム、マグネシウム、カルシウム、クロリド、コリン、銅、マンガン、スルフェート、亜鉛などが含まれる。
本発明は、ＣＲＭ_１９７遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌株を用いてＣＲＭ_１９７を高収量で製造するための改良法を提供し、その方法は代謝フラックスモデルに基づいて発酵培地に栄養素を補充することを含む。

代謝フラックスモデルは、熱伝達、質量伝達、酸素伝達速度(Oxygen transfer rate)（ＯＴＲ）、酸素取込み速度(Oxygen uptake rate)（ＯＵＲ）およびイオン伝達動態の完全ネットワークを表わし、その際、ＯＴＲは純酸素中での撹拌、背圧およびポンプによって維持される。このモデルを図２に示す。

代謝フラックスモデルの開発
このモデルは、主要変数としてのプロセス中の水素イオン蓄積、それに続いて溶存酸素、酸素からＣＯ_２への変換、ならびにプロセス中に放出される熱のオンラインデータ解釈に基づいて作成された。たとえば、このモデルは炭素源制限条件について作動する。炭素源を周期的に変動させ、その応答をプロセス中で評価する。その応答に基いて、水素イオン発生に対する補正行動をとった。次いで、定常的なｐＨおよび溶存酸素(dissolved oxygen)（ＤＯ）および熱伝達速度（たとえば、ｐＨ７．４；残留ＤＯ＞２～２０；熱伝達速度((Heat transfer rate)ＨＴＲ）を得るために供給を最適化した。

本発明のある態様において、本方法は発酵プロセス全体を通して培地にグルコースを補充することを含む。
本発明は、炭素源としてのマルトースの使用および脱鉄工程を伴なわない。

本発明により製造されたＣＲＭ_１９７は、結合型ワクチン、たとえば肺炎球菌コンジュゲート、腸チフスコンジュゲート、Ｈｉｂコンジュゲートなどの製造のために使用できる。

さらに他の態様において、本発明はＣＲＭ_１９７を製造するための改良法を提供し、その方法は、ＣＲＭ_１９７遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌株を、動物由来成分を含まない、１０種類より多いアミノ酸を含む発酵培地中で培養し、代謝フラックスモデルに基づいて培地に栄養素を補充することを含み、その際、アミノ酸はアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、およびそれの塩類から選択される。

さらに他の態様において、本発明はＣＲＭ_１９７を製造するための改良法を提供し、その方法は、ＣＲＭ_１９７遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌株を、動物由来成分を含まない、１０種類より多いアミノ酸を含む発酵培地中で培養することを含み、その際、各アミノ酸は約０．０５～２ｇ／ｌの量で用いられる。

さらに他の態様において、本発明はＣＲＭ_１９７を製造するための改良法を提供し、その方法は、ＣＲＭ_１９７遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌株を、動物由来成分を含まない、１０種類より多いアミノ酸を含む発酵培地中で培養し、代謝フラックスモデルに基づいて培地に栄養素を補充することを含み、その際、各アミノ酸は約０．０５～２ｇ／ｌの量で用いられる。

さらに他の態様において、本発明はＣＲＭ_１９７を製造するための改良法を提供し、その方法は、ＣＲＭ_１９７遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌株を、動物由来成分を含まない、基礎培地、１０種類より多いアミノ酸を含む発酵培地中で培養し、代謝フラックスモデルに基づいて培地に栄養素を補充することを含み、その際、各アミノ酸は約０．０５～２ｇ／ｌの量で用いられる。

さらに他の態様において、本発明はＣＲＭ_１９７を製造するための改良法を提供し、その方法は、ＣＲＭ_１９７遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌株を、動物由来成分を含まない、１０種類より多いアミノ酸を含む発酵培地中で培養し、代謝フラックスモデルに基づいて培地に栄養素を補充することを含み、その際、アミノ酸はアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、およびそれの塩類から選択され、各アミノ酸は約０．０５～２ｇ／ｌの量で用いられる。

さらに他の態様において、本発明はＣＲＭ_１９７を製造するための改良法を提供し、その方法は、ＣＲＭ_１９７遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌株を、動物由来成分を含まない、１０種類より多いアミノ酸を含む発酵培地中で培養することを含み、その際、アミノ酸はアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、およびそれの塩類から選択され、各アミノ酸は約０．０５～２ｇ／ｌの量で用いられる。

好ましい態様において、本発明は、ＣＲＭ_１９７を製造するための改良法を提供し、その方法は、
ｉ）ＣＲＭ_１９７遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌株を、動物由来成分を含まない、基礎培地、ならびにアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、およびそれの塩類から選択される１０種類より多いアミノ酸を含む発酵培地中で培養し、そして
ｉｉ）代謝フラックスモデルに基づいて培地にグルコースおよび栄養素を補充する
ことを含む。

さらに他の態様において、発酵プロセス中温度を３０から４０℃の範囲に維持し、２０％オルトリン酸、１２．５％水酸化アンモニウムを用いてｐＨを７．０～８．０、好ましくは７．４～７．６に維持する。発酵プロセスは１５～２４時間、好ましくは１６～２０時間の期間、実施される。

ある態様において、本発明はチロシンおよびアスパラギンを含まない発酵組成物および発酵方法を提供する。ある態様において、本発明の方法はカザミノ酸ベースの脱鉄された低鉄ＹＣ培地、炭素源としてのマルトースおよび脱鉄工程を含まない。

本発明はＣＲＭ_１９７を製造するための改良法を提供し、その方法は、ＣＲＭ_１９７遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌株を、動物由来成分を含まない、約１ｇ／Ｌ未満の量のフェニルアラニン、アルギニン、および１種類以上の他のアミノ酸の組合わせを含む発酵培地中で培養することを含む。

ある態様において、本発明はＣＲＭ_１９７を製造するための改良法を提供し、その方法は、ＣＲＭ_１９７遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌株を、動物由来成分を含まない、１０種類より多いアミノ酸を含む発酵培地中で培養し、代謝フラックスモデルに基づいて培地に栄養素を補充することを含み、その際、得られるＣＲＭ_１９７の収量は１５０ｍｇ／Ｌより多い。

ある態様において、本発明は、チフス菌(Salmonella typhi)、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、髄膜炎菌(meningococcus)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)に由来する多糖を本発明により製造したＣＲＭ_１９７と結合させることを含む、結合型ワクチン(conjugate vaccine)の作製を可能にする。

本発明は、ＣＲＭ_１９７遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌株を用いてＣＲＭ_１９７を高収量で製造するための改良法を提供し、その方法は、動物由来成分を含まない、１０種類より多いアミノ酸を含む発酵培地中で、その株を培養し、代謝フラックスモデルに基づいて培地に栄養素を補充することを含む。

ある態様において、本発明はたとえば１５０ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／ｌ、４．５ｇ／Ｌ、および５ｇ／Ｌの収量でＣＲＭ_１９７を製造するための改良法を提供する。

ある態様において、本発明はｐＢＥ３３プラスミドをエレクトロポレーションにより伝達した工学操作ジフテリア菌株Ｃ７（β１９７）を提供する。
本発明により製造したＣＲＭ_１９７を、免疫捕獲酵素結合イムノソルベントアッセイ(Immuno-Capture Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay)（ＩＣ－ＥＬＩＳＡ）で定量した。

発現ベクタープラスミド上における、増加したコピー数のＣＲＭ_１９７遺伝子を有する工学操作ジフテリア菌株の開発
ジフテリア菌Ｃ７（β－１９７）ＡＴＣＣ５３８２１にはＣＲＭ_１９７をコードする遺伝子が単一コピーとして存在し、鉄調節された条件下で変異ＣＲＭ_１９７タンパク質が培地中へ分泌される。２コピーのコリネファージ－ベータ(corynephage-beta)を有するジフテリア菌Ｃ７株（ＡＴＣＣ３９２５５）においては、ＣＲＭ_１９７の収量は３倍増加する。これは、遺伝子コピー数が生産性増大と関連することを示唆する。ジフテリア菌からのＣＲＭ_１９７産生を商業価値のあるものにするためには、発現レベルを増大させることが望まれる。より多数のコピーを細菌ゲノムに組み込むことは技術的に難しい。多コピーのファージ組込み体は遺伝学的に不安定であり、ＣＲＭ遺伝子の追加コピーを喪失する。本発明者らは、ＣＲＭ_１９７の天然調節エレメントと共に抗生物質選択マーカーを有するプラスミド上において、送達されるＣＲＭ_１９７の遺伝子コピー数を増加させることにより、ＣＲＭ_１９７発現レベルを改善することを試みた。それに応じて、本発明者らはＣＲＭ_１９７遺伝子のコピー数が増加したジフテリア菌株を開発し、その株の安定性を評価した。その改変株は、非改変ジフテリア菌株と比較して、より高いレベルのＣＲＭ_１９７を発現した。

本発明の態様には、下記も含まれる。
態様１
ＣＲＭ _１９７遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)株を用いてＣＲＭ _１９７を高収量で製造するための改良法であって、１０種類より多いアミノ酸を含み、動物由来成分を含まない発酵培地中で、その株を増殖させることを含む方法。
態様２
培地に栄養素を補充することを含む、態様１に記載の方法。
態様３
栄養素の補充が代謝フラックスモデルに基づく、態様２に記載の方法。
態様４
アミノ酸が、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、およびそれの塩類から選択される、態様１に記載の方法。
態様５
各アミノ酸を約０．０５～２ｇ／ｌの量で使用する、態様４に記載の方法。
態様６
発酵培地がフェニルアラニン、アルギニンおよび他のアミノ酸の組合わせを含有し、その際、フェニルアラニンおよびアルギニンの量が約１ｇ／Ｌ未満である、態様１に記載の方法。
態様７
栄養素が、ビタミン、たとえばニコチン酸、チアミン、パントテン酸、ビオチン、リボフラビン、葉酸；ピメリン酸；ホスフェート、窒素源および微量金属から選択される、態様２に記載の方法。
態様８
発酵培地が脱鉄されておらず、動物由来成分を全く含まない、前記態様のいずれかに記載の方法。
態様９
発酵培地組成物が、酵母エキス、ベジタブルペプトン、リン酸二水素カリウム（ＫＨ _２ＰＯ _４）、トリプトファン、グルコース、ＹＣ微量塩類溶液を含む基礎発酵培地を含む、前記態様のいずれかに記載の方法。
態様１０
発酵プロセス全体を通して培地にグルコースを補充することを含む、前記態様のいずれかに記載の方法。
態様１１
ＣＲＭ _１９７を製造するための改良法であって、
ｉ）ＣＲＭ _１９７遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)株を、動物由来成分を含まない、基礎培地、ならびにアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、およびそれの塩類から選択される１０種類より多いアミノ酸を含む発酵培地中で培養し、そして
ｉｉ）代謝フラックスモデルに基づいて培地にグルコースおよび栄養素を補充する
ことを含む方法。
態様１２
ＣＲＭ _１９７を製造するための改良法であって、ＣＲＭ _１９７遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)株を、動物由来成分を含まない、１０種類より多いアミノ酸を含む発酵培地中で培養し、そして代謝フラックスモデルに基づいて培地に栄養素を補充し、その際、各アミノ酸を約０．０５～２ｇ／ｌの量で使用することを含む方法。
態様１３
発酵を３０～４０℃の温度、および７．０～８．０、好ましくは７．４～７．６の範囲のｐＨで実施する、前記態様のいずれかに記載の方法。
態様１４
得られるＣＲＭ _１９７の収量が１５０ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌより多い、前記態様のいずれかに記載の方法。
態様１５
チフス菌(Salmonella typhi)、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)に由来する多糖を前記態様のいずれかの記載の方法により製造されたＣＲＭ _１９７と結合させることを含む、結合型ワクチンを製造するための方法。
以下に示す例を参照して本発明をより具体的に説明する。ただし、当業者に自明のとおり、本発明が例によって決して限定されず、本明細書に記載するパラメーター内でのその変動を含むことを理解すべきである。

実施例１
ＣＲＭ_１９７のエピソームコピーによるＣＲＭ_１９７発現の改良：
ジフテリア菌Ｃ７（β１９７）において安定複製できるベクターを作製した。ジフテリア菌Ｃ７からの天然プラスミドの単離を、T.C Currier et al., Anal Biochem. 1976; 76(2): 431441に記載される大型プラスミド単離プロトコルを用いて実施した。天然プラスミドＤＮＡの調製法を用いて、１．８７Ｋｂの複製起点（ｏｒｉＲ）を増幅した。同時に、ｐＵＣ４－ＫＩＸＸ鋳型ＤＮＡを用いて１．０３３ＫｂのｋａｎＲ配列を増幅させ、平滑末端をｏｒｉＲにライゲートさせてｐＢＥ３０を作製した。さらに、ｐＴｏｘプロモーター領域(Boyd et al., 1988)、ｃｒｕおよび推定ターミネーター配列を含む２．１３ＫｂのＣＲＭ_１９７遺伝子配列をジフテリア菌Ｃ７（β１９７）ゲノムＤＮＡから増幅させ、ｐＢＥ３０中に設計したユニークＳｐｅＩ制限部位内へクローニングした。このアンプリコンにおけるＧＡＧ変異を、対立遺伝子特異的ＰＣＲアッセイ(Pushnova et al., Analytical Biochemistry. 1998; 260: 24 to 29)およびＤＮＡシーケンシングによって立証した。こうして得られたプラスミドをｐＢＥ３３と表記した（図１）。

ｐＢＥ３３プラスミドを、ジフテリア菌Ｃ７（β１９７）に最適化した方法に従ってエレクトロポレーションにより伝達した。形質転換したジフテリア菌Ｃ７（β１９７）（ｐＢＥ３３）コロニーを、特異的コロニーＰＣＲ、ならびにプラスミドの単離および制限消化によって確認した。コロニーにおけるＣＲＭ_１９７発現をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット法により分析した。培地中のＣＲＭ_１９７をＥＬＩＳＡおよびＨＰＬＣによって定量し、培地ｌリットル当たりの発現ＣＲＭ_１９７の濃度として提示した。

実施例２
動物由来成分を含まない基礎培地上での工学操作ジフテリア菌Ｃ７Ｅｐ株を用いるＣＲＭ_１９７の産生
ジフテリア菌Ｃ７Ｅｐ株をこのプロセスに用いた。接種用調製物を得るために振とうフラスコ内で２工程培養を行なった。振とうフラスコ培養のための培地は、酵母エキス(Yeast Extract)（ＹＥ）１０ｇ／Ｌ、ベジタブルペプトン(Veg. Peptone)１５ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４４．３ｇ／Ｌ、トリプトファン５０ｍｇ／Ｌ、グルコース４．０ｇ／Ｌ、ニコチン酸０．８ｍｇ／Ｌ、ピメリン酸０．０８ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ２５ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ１２．５ｍｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ６．２５ｍｇ／Ｌ、シスチン０．５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌ、グルコース４．０ｇ／Ｌを含む。

２０Ｌの発酵槽培地に５％の接種物を添加してプロセスを開始した。発酵槽培養のための培地は、ＹＥ１５ｇ／Ｌ、ベジタブルペプトン３０ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４４．３ｇ／Ｌ、トリプトファン５０ｍｇ／Ｌ、ニコチン酸０．８ｍｇ／Ｌ、ピメリン酸０．０８ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ２５ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ１２．５ｍｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ６．２５ｍｇ／Ｌ、シスチン０．５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌ、グルコース４．０ｇ／Ｌを含む。

バッチ全体において培養物を３００ＲＰＭで撹拌した。温度を３５℃に維持し、２０％オルトリン酸および５ＮＮａＯＨを用いてｐＨを７．４に維持した。１．０ｖｖｍの空気を用いて培養物に通気した。培養物に酸素を富化して溶存酸素（ＤＯ）レベルを２０％に維持した。最初の数時間の後、Ｏ_２富化の限界に達した時点でＤＯレベルは２０％未満に低下し続ける。残りのバッチについてのＤＯレベルはゼロに近いままであり、終了時間へ向かって上昇する。ブロス中の残存グルコースが０．５ｇ／Ｌ未満になった時点で、４０％グルコースを２ｇ／Ｌ／時で供給した。１４時間の培養後に細胞密度が約９０単位のＯＤ６００ｎｍに達した時点でバッチを収穫した。３０％オーガニック消泡剤により反応器内の泡を抑制した。ＣＲＭ_１９７産生は６０～６５ｍｇ／Ｌ（発酵ブロス）の力価に達した。

工学操作していないジフテリア菌Ｃ７ＣＲＭ_１９７株を用いて同様な条件下で行なった発酵は、工学操作した株より少ない約３５～４０ｍｇ／ＬのＣＲＭ_１９７を産生した。これは、ＣＲＭ_１９７の産生を増大させる追加遺伝子コピーの影響を示す。

実施例３：
動物由来成分を含まない基礎培地上での代謝フラックスバランスモデルに従った工学操作ジフテリア菌Ｃ７Ｅｐ株を用いるＣＲＭ_１９７の製造
ジフテリア菌Ｃ７Ｅｐ株をこのプロセスに用いた。接種用調製物を得るために振とうフラスコ内での２工程培養を行なった。振とうフラスコ培養のための培地は、ＹＥ１０ｇ／Ｌ、ベジタブルペプトン１５ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４４．３ｇ／Ｌ、トリプトファン５０ｍｇ／Ｌ、グルコース４．０ｇ／Ｌ、ニコチン酸０．８ｍｇ／Ｌ、ピメリン酸０．０８ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ２５ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ１２．５ｍｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ６．２５ｍｇ／Ｌ、シスチン０．５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌ、グルコース４．０ｇ／Ｌを含む。

バッチ全体において培養物を３００ＲＰＭで撹拌した。温度を３５℃に維持し、２０％オルトリン酸および１２．５％水酸化アンモニウムを用いてｐＨを７．４に維持した。１．０ｖｖｍの空気を用いて培養物に通気した。培養物に酸素を富化してＤＯレベルを２０％に維持した。指定した時点で代謝転化速度に従ったモデルを導入し、このモデルはｐＨ、ＣＯ_２、発熱に関する変化に対応した、残存ＤＯのオンラインパラメーターからの入力を受ける。対数期には、Ｏ_２富化限界に達したにもかかわらずＤＯレベルは２０％未満に低下し続ける。残りのバッチについてのＤＯレベルはゼロに近いままであり、終了時間へ向かって上昇する。ブロス中の残存グルコースが０．５ｇ／Ｌ未満に低下した時点で、代謝フラックスモデルの正当性を示すために４０％グルコースを供給した。１４時間の培養後に細胞密度が約９０単位のＯＤ６００ｎｍに達した時点でバッチを収穫した。３０％オーガニック消泡剤により反応器内の泡を抑制した。ＣＲＭ_１９７産生は１５０ｍｇ／Ｌ（発酵ブロス）の力価に達した。

実施例４：
本発明に従ったＣＲＭ_１９７の製造
接種用調製物を得るために３工程培養を行なった。最初の２工程を振とうフラスコ内で行なった。振とうフラスコ培養のための培地は、ＹＥ１０ｇ／Ｌ、ベジタブルペプトン１５ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４４．３ｇ／Ｌ、トリプトファン５０ｍｇ／Ｌ、グルコース４．０ｇ／Ｌ、ＹＣ微量塩類溶液２ｍｌ／Ｌ、シスチンサプリメント１ｍｌ／Ｌ、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌ、グルコース４．０ｇ／Ｌを含む。

播種発酵槽のための基礎培地組成は、ＹＥ１５ｇ／Ｌ、ベジタブルペプトン３０ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４４．３ｇ／Ｌ、トリプトファン５０ｍｇ／Ｌ、ニコチン酸０．８ｍｇ／Ｌ、ピメリン酸０．０８ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ２５ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ１２．５ｍｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ６．２５ｍｇ／Ｌ、シスチン０．５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌ、グルコース４．０ｇ／Ｌであった。

以下に、発酵槽培地組成（表Ｉ）およびプラケット・バーマン計画に従って設計された成分を示す。

前記成分を基礎培地（ＹＥ１５ｇ／Ｌ、ベジタブルペプトン３０ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４４．３ｇ／Ｌ、トリプトファン５０ｍｇ／Ｌ、ニコチン酸０．８ｍｇ／Ｌ、ピメリン酸０．０８ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ２５ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ１２．５ｍｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ６．２５ｍｇ／Ｌ、シスチン０．５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌ、グルコース４．０ｇ／Ｌ．）と共に含む２０Ｌの発酵槽に、播種発酵槽からの接種物５％を添加してプロセスを開始した。温度を３５℃に維持し、２０％オルトリン酸および１２．５％水酸化アンモニウムを用いてｐＨを７．４～７．６に維持し、代謝フラックスに基づくモデル（図２）によりグルコース供給およびＯＴＲを調節した。１．０ｖｖｍの空気を用いて培養物に通気した。培養物に酸素を富化してＤＯレベルを２０％に維持した。対数期には、Ｏ_２富化限界に達したにもかかわらずＤＯレベルは２０％未満に低下し続ける。残りのバッチについてのＤＯレベルはゼロに近いままであり、終了時間へ向かって上昇する。ブロス中の残存グルコースが０．５ｇ／Ｌ未満に低下した時点で、４０％グルコース溶液を４．５ｇ／Ｌ／時で供給した。間欠的にビタミンおよび微量元素を下記のレベルで補充した；ニコチン酸６．４２５ｍｇ／Ｌ、ピメリン酸０．４６５ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ２５ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ１２．５ｍｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ６．２５ｍｇ／Ｌ、チアミン０．０８ｍｇ／Ｌ、パントテン酸０．２５ｍｇ／Ｌ、ビオチン０．００６ｍｇ／Ｌ、リボフラビン０．３ｍｇ／Ｌ、葉酸０．０６ｍｇ／Ｌ。１８時間の培養後に細胞密度が約１３２単位のＯＤ６００ｎｍに達した時点でバッチを収穫した。３０％オーガニック消泡剤により反応器内の泡を抑制した。ＣＲＭ_１９７産生は４５０～５００ｍｇ／Ｌ（発酵ブロス）の力価に達した。

実施例５
天然ジフテリア菌Ｃ７および工学操作ジフテリア菌Ｃ７Ｅｐ株を用いるＣＲＭ_１９７収量の比較
アニマルフリー基礎培地、プレモデルプロセス改良、ならびに本発明による培地およびプロセスを用い、天然Ｃ７ジフテリア菌および工学操作ジフテリア菌株を用いて発酵を実施した。

単一溶原性ジフテリア菌株Ｃ７、およびエピソーム配置した追加のＣＲＭ_１９７遺伝子コピーをもつ工学操作株（Ｃ７Ｅｐ）をプロセス最適化に用いた。動物成分を含む一般的な脱鉄されていないＹＣ培地において、Ｃ７は２２～２５ｍｇ／ＬのＣＲＭ_１９７を産生し、それに対しＣ７Ｅｐは４０～４５ｍｇ／Ｌを産生した。動物成分をベジタブルペプトンで置き換えることにより培地を改変すると、Ｃ７株は４０～４５ｍｇ／ＬのＣＲＭ_１９７を産生し、Ｃ７Ｅｐは６５ｍｇ／ＬのＣＲＭ_１９７を産生した。パラメーターを変更することによりプロセス条件を改変すると、Ｃ７Ｅｐは１２０～１５０ｍｇ／ＬのＣＲＭ_１９７を産生した。基本プロセスからの入力を用いてモデルを開発した。この最適化した方法の最終結果は、Ｃ７から１２０ｍｇ／ｌのＣＲＭ_１９７、Ｃ７Ｅｐから＞５００ｍｇ／ＬのＣＲＭ_１９７となった。これらの収量を下記に示す表ＩＩにおいて比較する。

Claims

ＣＲＭ_１９７遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)株を用いてＣＲＭ_１９７を高収量で製造するための改良法であって、チロシンおよびアスパラギン以外の１０種類より多いアミノ酸を含み、動物由来成分並びにチロシンおよびアスパラギンを含まない、脱鉄されていない発酵培地中で、その株を増殖させる、ここで炭素源としてマルトースは使用しない、ことを含む方法。
培地に栄養素を補充することを含む、請求項１に記載の方法。
栄養素の補充が代謝フラックスモデルに基づく、請求項２に記載の方法。
アミノ酸が、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、およびそれの塩類から選択される、請求項１に記載の方法。
各アミノ酸を０．０５～２ｇ／ｌの量で使用する、請求項４に記載の方法。
発酵培地がフェニルアラニン、アルギニンおよび他のアミノ酸の組合わせを含有し、その際、フェニルアラニンおよびアルギニンの量が１ｇ／Ｌ未満である、請求項１に記載の方法。
栄養素が、ビタミン、たとえばニコチン酸、チアミン、パントテン酸、ビオチン、リボフラビン、葉酸、ピメリン酸、ホスフェート、窒素源および微量金属から選択される、請求項２に記載の方法。
発酵培地組成物が、酵母エキス、ベジタブルペプトン、リン酸二水素カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４）、トリプトファン、グルコース、ＹＣ微量塩類溶液を含む基礎発酵培地を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
発酵プロセス全体を通して培地にグルコースを補充することを含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
ＣＲＭ_１９７を製造するための改良法であって、
ｉ）ＣＲＭ_１９７遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)株を、動物由来成分並びにチロシンおよびアスパラギンを含まず、基礎培地、ならびにアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、およびそれの塩類から選択される１０種類より多いアミノ酸を含む、脱鉄されていない発酵培地中で培養し、そして
ｉｉ）代謝フラックスモデルに基づいて培地にグルコースおよび栄養素を補充する、ここで炭素源としてマルトースは使用しない、
ことを含む方法。
ＣＲＭ_１９７を製造するための改良法であって、ＣＲＭ_１９７遺伝子のコピー数が増加した工学操作ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)株を、動物由来成分並びにチロシンおよびアスパラギンを含まず、チロシンおよびアスパラギン以外の１０種類より多いアミノ酸を含む、脱鉄されていない発酵培地中で培養し、そして代謝フラックスモデルに基づいて培地に栄養素を補充し、その際、各アミノ酸を０．０５～２ｇ／ｌの量で使用する、ここで炭素源としてマルトースは使用しない、ことを含む方法。
発酵を３０～４０℃の温度、および７．０～８．０の範囲のｐＨで実施する、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
１５０ｍｇ／Ｌから５００ｍｇ／ＬのＣＲＭ_１９７を産生する、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
チフス菌(Salmonella typhi)、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)に由来する多糖を請求項１から１３のいずれか１項の記載の方法により製造されたＣＲＭ_１９７と結合させることを含む、結合型ワクチンを製造するための方法。