BR112019022093A2 - método aprimorado para a produção em alto nível de crm - Google Patents

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Masilamani Balamurali
Chakka Deviprasanna
Datla Mahima
Shirish Dixit Mandar
Dev Mantena Narender
Sriraman Rajan
Venkat Matur Ramesh
Naidu Sureddi Satyam
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Biological E Ltd
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Abstract

a presente invenção refere-se a um método aprimorado para a produção de crm197 com alto rendimento usando a cepa manipulada de corynebacterium diphtheriae com aumento do número de cópias do gene crm197, em que o método compreende cultivar a cepa em um meio isento de componentes de origem animal com um ou mais aminoácidos.

Description

“MÉTODO APRIMORADO PARA A PRODUÇÃO EM ALTO NÍVEL DE
CRM197”
CAMPO DA TÉCNICA [001 ]A presente invenção refere-se a um método aprimorado para a produção de CRM197 com alto rendimento usando a cepa de Corynebacterium diphtheriae manipulada tendo um número de cópias aumentado do gene CRM197.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [002]CRMi97 é uma forma geneticamente desintoxicada de toxina da difteria. Uma única mutação na posição 52, substituindo ácido glutâmico por glicina, causa a perda da atividade da ADP-ribosiltransferase da toxina nativa. A base estrutural de CRM197 para a falta de toxicidade foi elucidada e é amplamente utilizada como uma proteína carreadora para vacinas conjugadas. CRM197, como a toxina da difteria, é uma cadeia polipeptídica única de 535 aminoácidos (58,4 KD) que consiste de duas subunidades (ligadas por pontes dissulfeto).
[003]CRMi97 é usado como uma proteína carreadora em várias vacinas conjugadas aprovadas, tal como 0 conjugado Haemophilus influenza tipo b comercializado sob 0 nome comercial Hibtiter TM, conjugado pneumocócico polissacarídeo 13-valente comercializado sob 0 nome comercial PREVNAR 13® e similares.
[004]Ruth M. Drewe outros, Bacteriol. 1951 Nov; 62 (5): 549-59; descreveram um meio quimicamente definido adequado para a produção de toxina da difteria de alta titulação e resumiram as exigências de aminoácidos de Corynebacterium diphtheriae, cepa Toronto de Park-Williams no. 8. O meio contém aminoácidos que substituem efetivamente 0 componente derivado de animal, isto é, hidrolisado de caseína. Os aminoácidos incluem ácido glutâmico, cistina, prolina, triptofano, leucina, valina, metionina e glicina.
[005]Rappuoli e outros; Applied and Environmental Microbiology 1983, vol. 46
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2/19 (3): 560 a 564 descreveram que os duplos lisógenos não tandem eram estáveis e capazes de fornecer altos rendimentos de CRM197, até três vezes mais altos do que os monolisógenos.
[006]R Fass. e outros, Applied Microbology and Biotechnology; Abril de 1995, Volume 43 (1): 83 a 88; descreveram uma abordagem de crescimento de alta densidade para produzir toxina da difteria mutada a partir de duas cepas de Corynebacterium diphtheriae: C7 (β) (tox-201, tox-9) e C7 (β) (tox-107). O procedimento envolve 0 uso de um meio de crescimento modificado, sem ferro, que forneceu um crescimento rápido e de alta densidade das bactérias e que, quando associado à depleção simultânea de glicose e ferro, aumentou a produção de toxinas. O ar enriquecido com oxigênio foi fornecido para permitir que as bactérias crescessem até uma densidade celular, fornecendo uma absorbância de 70 a 600 nm (15 a 20 g / L em peso seco). A concentração máxima de toxina no sobrenadante em cultura foi de 150 mg / L.
[007]Parag P. Nagarkar e outros, Journal of Applied Microbiology 2002, 92, 215 a 220; descreveram 0 padrão de utilização de aminoácidos durante 0 crescimento de Corynebacterium diphtheriae e mostraram que apenas quatro dos nove aminoácidos testados, ou seja, cistina, histidina, aspartato e metionina, foram críticos para 0 crescimento e a produção de toxinas por Corynebacterium diphtheriae.
[008]A Patente Européia No. 1 849 860 B 1 descreveu 0 uso de material proteico de origem não animal, tal como proteínas de grãos de soja, sementes de algodão, batatas, etc., como um meio constituinte para 0 cultivo de bactérias patogênicas.
[009]A Patente US No. 6.962.803 B2 descreveu um método de purificação da toxina da difteria por meio da fermentação de uma cepa de micro-organismos capaz de produzir a toxina da difteria, 0 dito método compreendendo adicionar glicose a uma cultura em crescimento, onde a adição de glicose mantém 0 crescimento de micro
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3/19 organismos eficaz para suportar a produção de toxina da difteria. Descreveu ainda que, além de uma fonte de carbono, existem outros requisitos nutricionais mínimos para o crescimento, que incluem metais traço, fosfato, uma fonte de nitrogênio, geralmente casaminoácidos e extrato de levedura.
[010]A Publicação do Pedido de Patente US No. 2011/0097359 A1 descreveu um meio para cultura de uma cepa de Corynebacterium diphtheriae e para produzir um nível de toxina da difteria ou um análogo da mesma, em que o meio é substancialmente isento de produtos derivados de animais e compreende: água; uma fonte de carboidratos; uma fonte de nitrogênio; e um número de aminoácidos isentos em uma concentração inicial em que a concentração inicial de cada aminoácido isento não é limitante para o nível de produção da toxina da difteria ou seu análogo. Além disso, descreve que a fonte de carboidratos é isenta de glicose.
[011]O documento WO 2006/100108 A1 descreveu um processo de fermentação compreendendo uma etapa de crescimento de uma cepa de Corynebacterium diphtheriae em um meio dentro do fermentador sob condições de agitação suficientes para manter uma cultura homogênea e aeração limitada, de modo que pO2 dentro da cultura caia para menos de 4 % para a maior parte da etapa de fermentação. Também é descrito que o pH dentro do fermentador é mantido entre 7,0 e 7,8 pelo grau de aeração sem a necessidade de adição de ácido ou base.
[012]O processo de CRM197 geralmente é sensível a pequenas alterações nos componentes do processo, bem como nos parâmetros do processo. A produção de CRM197 de Corynebacterium diptheria é exercida em todo 0 mundo, embora com sucesso limitado para a realização comercial. Nenhuma das referências acima descreveu 0 método de produção de CRM197 com altos rendimentos, como > 150 mg / L, usando a cepa de Corynebacterium diphtheriae manipulada. Os inventores da presente invenção desenvolveram um modelo de fluxo metabólico para a produção de CRM197 de alto rendimento usando a cepa manipulada de Corynebacterium
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4/19 diphtheriae.
OBJETIVO DA INVENÇÃO [013]O principal objetivo da presente invenção é fornecer um processo aprimorado para a produção em alto nível de CRM197.
[014]Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer um processo aprimorado para a produção em alto nível de CRM197, que seja rentável e possa ser usado para a fabricação de vacinas conjugadas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [015]A presente invenção fornece um método aprimorado para a produção de CRM197 com alto rendimento usando a cepa manipulada de Corynebacterium diphtheriae com aumento do número de cópias do gene CRM197, em que 0 método compreende cultivar a cepa em um meio de fermentação que compreende um ou mais aminoácidos e é isento de componentes de origem animal.
[016]A presente invenção fornece um método aprimorado para a produção de CRM197, método que compreende cultivar a cepa manipulada de Corynebacterium diphtheriae com aumento do número de cópias do gene CRM197 em um meio de fermentação isento de componentes de origem animal e compreende mais de 10 aminoácidos e suplementar 0 meio com nutrientes.
[017]A presente invenção também fornece um método aprimorado para a produção de CRM197, método que compreende cultivar a cepa manipulada de Corynebacterium diphtheriae com aumento do número de cópias do gene CRM197 em um meio de fermentação isento de componentes de origem animal e compreende mais de 10 aminoácidos e suplementar 0 meio com nutrientes baseados no modelo de fluxo metabólico.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [018]A Figura 1 apresenta a construção de um plasmídeo designado como pBE33
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5/19 [019]A Figura 2 apresenta um fluxograma do modelo de equilíbrio de fluxo metabólico.
DESCRIÇÃO DETALHADA [020]A presente invenção fornece um método aprimorado para a produção de CRM197 com alto rendimento usando a cepa manipulada de Corynebacterium diphtheriae com aumento do número de cópias do gene CRM197, em que 0 método compreende cultivar a cepa em um meio de fermentação que compreende mais de 10 aminoácidos e está isento de componentes de origem animal.
[021 ]A cepa manipulada de Corynebacterium diphtheriae e (C7Ep) da presente invenção refere-se a Corynebacterium diphtheriae que tem múltiplas cópias epissomicamente localizadas do gene CRM197 reguladas pelo mesmo mecanismo que 0 gene CRM197 hospedeiro e 0 antecedente genético da dita cepa é um único lisógeno.
[022]Os aminoácidos utilizados na presente invenção são selecionados a partir de alanina, arginina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenil alanina, prolina, serina, treonina, triptofano, valina e seus sais e cada aminoácido é utilizado em uma quantidade de cerca de 0,05 a 2 g / L.
[023]O efeito de aminoácidos, vitaminas e as condições de processo para a produção de CRM197 foram estudados. Verificou-se que certos aminoácidos mostraram efeito negativo no crescimento de bactérias. No entanto, verificou-se que a produção de CRM197 é aumentada se mais de 10 aminoácidos forem usados em uma concentração ótima. A concentração de aminoácidos é otimizada usando 0 modelo de experimento de Plackett Burman.
[024]Os modelos de Plackett Burman são modelos experimentais para investigar a dependência de alguma quantidade medida em um número de variáveis (fatores) independentes, de maneira a minimizar a variação das estimativas dessas dependências usando um número limitado de experimentos. O resultado mostrou que
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6/19 aminoácidos tal como ácido aspártico, glutamina, glicina, isoleucina, leucina, valina e a uma temperatura de 35Q C a 36Q C têm impacto positivo na síntese de CRM197 e aminoácidos tal como alanina, isoleucina, valina e a uma temperatura de 35Q C a 36Q C têm efeito negativo na síntese de CRM197. Vários níveis de modelo de experimentos foram realizados em diferentes concentrações para alcançar a produção em alto nível de CRM197. O uso de tirosina e asparagina resultou em diminuição no rendimento total de CRM197 e, portanto, esses aminoácidos não fazem parte da invenção.
[025]Em uma modalidade preferencial da presente invenção, 0 meio de fermentação contém a combinação de Fenil alanina, Arginina e um ou mais outros aminoácidos em que a quantidade de Fenil alanina e Arginina utilizada é menor do que cerca de 1 g / L.
[026]Em uma modalidade mais preferencial da presente invenção, 0 meio de fermentação compreende a combinação de Fenil alanina, Arginina e um ou mais outros aminoácidos em que a quantidade de Fenil alanina é de cerca de 0,25 a 0,75 g / L e a de Arginina é de cerca de 0,1 a 0,5 g / L.
[027]A presente invenção fornece um método aprimorado para a produção de CRM197 usando a cepa manipulada de Corynebacterium diphtheriae com aumento do número de cópias do gene CRM197, em que 0 método compreende cultivar a cepa em um meio de fermentação que compreende mais de 10 aminoácidos, suplementando 0 meio com vitaminas na faixa de cerca de 0,05 a 20 mg por litro, em que 0 meio está isento de componentes de origem animal.
[028]Em outra modalidade da presente invenção, aminoácidos, vitaminas, elementos traço e similares são adicionados como nutrientes ao meio de fermentação durante 0 cultivo.
[029]Vários nutrientes utilizados na presente invenção como suplementos incluem vitaminas selecionadas a partir de ácido nicotínico, tiamina, ácido pantotênico, biotina, riboflavina, ácido fólico; ácido pimélico; fosfato, uma fonte de nitrogênio e
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7/19 metais traço e similares, e cada vitamina é usada em uma quantidade na faixa de cerca de 0,05 a 20 mg por litro.
[030]0 meio de fermentação utilizado na presente invenção é um produto sem ferro e completamente isento de componentes de origem animal. Além disso, o meio também é desprovido do meio tradicional Loeffler à base de carne e do meio YC com baixo teor de ferro à base de casaminoácido. Os componentes do meio de fermentação da presente invenção compreendem extrato de levedura, peptona vegetal, di-hidrogênio fosfato de potássio (KH2PO4), triptofano, glicose, solução de sal traço YC.
[031 ]Em outra modalidade da presente invenção, a composição do meio para 0 cultivo da cepa manipulada de Corynebacterium diphtheriae com aumento do número de cópias do gene CRM197 compreende meios de fermentação de base que compreendem extrato de levedura, peptona vegetal, di-hidrogênio fosfato de potássio (KH2PO4), triptofano, glicose, solução de sal traço YC; um ou mais aminoácidos, vitaminas, elementos traço e similares.
[032]Os metais traço adequados incluem potássio, magnésio, cálcio, cloreto, colina, cobre, manganês, sulfato, zinco e similares.
[033]A presente invenção fornece um método aprimorado para a produção de CRM197 usando a cepa manipulada de Corynebacterium diphtheriae com aumento do número de cópias do gene CRM197, em que 0 método compreende suplementar 0 meio de fermentação com nutrientes baseados no modelo de fluxo metabólico.
[034]O modelo de fluxo metabólico refere-se à rede completa de cinética de transferência de calor, transferência de massa, taxa de transferência de oxigênio (OTR), taxa de captação de oxigênio (OUR) e transferência de íons, em que a OTR está sendo mantida por meio de agitação, contrapressão e bomba em oxigênio puro. Este modelo é representado na Figura 2.
[035]Desenvolvimento de Modelo de Fluxo Metabólico.
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8/19 [036]Este modelo é criado com base na interpretação de dados em linha direta dos acúmulos de íons hidrogênio no processo como uma variável primária que é seguida pelo oxigênio dissolvido, conversão de oxigênio em CO2 juntamente com 0 calor liberado no processo. Por exemplo, 0 modelo trabalha nas condições de limitação da fonte de carbono. A fonte de carbono é pulsada e a resposta é avaliada no processo. A ação corretiva foi tomada na geração de íons hidrogênio com base na resposta. Em seguida, a alimentação foi otimizada para obter um pH constante e oxigênio dissolvido (DO) e taxa de transferência de calor (por exemplo, pH de 7,4; DO residual de > 2 a 20; taxa de transferência de calor HTR).
[037]Em uma modalidade da presente invenção, 0 método compreende suplementar 0 meio com glicose durante todo 0 processo de fermentação.
[038]A presente invenção não envolve 0 uso de maltose como uma fonte de carbono e a etapa sem ferro.
[039]O CRM197 produzido de acordo com a presente invenção pode ser utilizado para a fabricação de vacinas conjugadas, tal como conjugado pneumocócico, conjugado tifoide, conjugado Hib e similares.
[040]Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece um método aprimorado para a produção de CRM197, método que compreende cultivar a cepa manipulada de Corynebacterium diphtheria com aumento do número de cópias do gene CRM197 em um meio de fermentação isento de componentes de origem animal e compreende mais de 10 aminoácidos e suplementar 0 meio com nutrientes com base no modelo de fluxo metabólico, em que os aminoácidos são selecionados a partir de alanina, arginina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenil alanina, prolina, serina, treonina, triptofano, valina e sais dos mesmos.
[041 ]Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece um método aprimorado para a produção de CRM197, método que compreende cultivar a cepa de
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Corynebacterium diphtheria manipulada com aumento do número de cópias do gene CRM197 em um meio de fermentação isento de componentes de origem animal e compreende mais de 10 aminoácidos, em que cada aminoácido é usado em uma quantidade de cerca de 0,05 a 2 g / L.
[042]Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece um método aprimorado para a produção de CRM197, método que compreende cultivar a cepa manipulada de Corynebacterium diphtheria com aumento do número de cópias do gene CRM197 em um meio de fermentação isento de componentes de origem animal e compreende mais de 10 aminoácidos e suplementar 0 meio com nutrientes com base no modelo de fluxo metabólico, em que cada aminoácido é usado em uma quantidade de cerca de 0,05 a 2 g / L.
[043]Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece um método aprimorado para a produção de CRM197, método que compreende cultivar a cepa manipulada de Corynebacterium diphtheriae com aumento do número de cópias do gene CRM197 em um meio de fermentação isento de componentes de origem animal e compreende meios de base com mais de 10 aminoácidos e suplementar 0 meio com nutrientes com base no modelo de fluxo metabólico, em que cada aminoácido é usado em uma quantidade de cerca de 0,05 a 2 g / L.
[044]Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece um método aprimorado para a produção de CRM197, método que compreende cultivar a cepa manipulada de Corynebacterium diphtheria com aumento do número de cópias do gene CRM197 em um meio de fermentação isento de componentes de origem animal e compreende mais de 10 aminoácidos e suplementar 0 meio com nutrientes com base no modelo de fluxo metabólico, em que os aminoácidos são selecionados a partir de alanina, arginina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenil alanina, prolina, serina, treonina, triptofano, valina e sais dos mesmos, em que cada aminoácido é usado em uma
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10/19 quantidade de cerca de 0,05 a 2 g / L.
[045]Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece um método aprimorado para a produção de CRM197, método que compreende cultivar a cepa manipulada de Corynebacterium diphtheria com aumento do número de cópias do gene CRM197 em um meio de fermentação isento de componentes de origem animal e compreende mais de 10 aminoácidos, em que os aminoácidos são selecionados a partir de alanina, arginina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenil alanina, prolina, serina, treonina, triptofano, valina e sais dos mesmos em que cada aminoácido é usado em uma quantidade de cerca de 0,05 a 2 g / L.
[046]Em uma modalidade preferencial, a presente invenção fornece um método aprimorado para a produção de CRM197, método que compreende:
i) cultivar a cepa manipulada de Corynebacterium diphtheriae com aumento do número de cópias do gene CRM197 em um meio de fermentação isento de componentes de origem animal e compreende meios de base e mais de 10 aminoácidos selecionados a partir de alanina, arginina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenil alanina, prolina, serina, treonina, triptofano, valina e sais dos mesmos, e ii) suplementar 0 meio com glicose e nutrientes com base no modelo de fluxo metabólico.
[047]Em ainda outra modalidade, durante 0 processo de fermentação, a temperatura é mantida na faixa de 30Q C a 40Q C e 0 pH é mantido em 7,0 a 8,0, preferencialmente 7,4 a 7,6 usando ácido ortofosfórico a 20%, hidróxido de amônio a 12,5%. O processo de fermentação é realizado por um período de 15 a 24 horas, preferencialmente 16 a 20 horas.
[048]Em uma modalidade, a presente invenção fornece composição e processo de fermentação que é desprovido de tirosina e asparagina. Em uma
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11/19 modalidade, o processo da presente invenção é desprovido de meios YC com baixo teor de ferro à base de casaminoácido, maltose como uma fonte de carbono e etapa sem ferro.
[049]A presente invenção fornece um método aprimorado para a produção de CRM197, método que compreende cultivar a cepa manipulada de Corynebacterium diphtheriae com aumento do número de cópias do gene CRM197 em um meio de fermentação isento de componentes de origem animal e contém a combinação de fenil alanina e arginina em uma quantidade de cerca de menos de 1 g / L e um ou mais outros aminoácidos.
[050]Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método aprimorado para a produção de CRM197, método que compreende cultivar a cepa manipulada de Corynebacterium diphtheriae com aumento do número de cópias do gene CRM197 em um meio de fermentação isento de componentes de origem animal e compreende mais de 10 aminoácidos e suplementar 0 meio com nutrientes com base no modelo de fluxo metabólico, em que 0 rendimento de CRM197 obtido é superior a 150 mg / L.
[051 ]Em uma modalidade, a presente invenção permite fabricar uma vacina conjugada que compreende conjugar polissacarídeos a partir de Salmonella typhi, Streptococcus pneumoniae, meningococo, Haemophilus influenzae com CRM197 preparado de acordo com a presente invenção.
[052]A presente invenção fornece um método aprimorado para a produção de CRM197 com alto rendimento usando a cepa manipulada de Corynebacterium diphtheriae com aumento do número de cópias do gene CRM197, em que 0 método compreende cultivar a cepa em meios isento de componentes de origem animal compreendendo mais de 10 aminoácidos e suplementar 0 meio com nutrientes com base no modelo de fluxo metabólico.
[053]Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método
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12/19 aprimorado para a produção de CRM197 com rendimentos tais como 150 mg / L, 200 mg / L, 300 mg / L, 500 mg / L, 1 g / L, 1,5 g / L, 2 g / L, 2,5 g / L, 3 g / L, 3,5 g / L, 4 g / L, 4,5 g / L e 5 g / L.
[054]Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma cepa manipulada C7 de Corynebacterium diphtheriae (β 197) em que 0 plasmídeo pBE33 foi transferido por eletroporação.
[055]O CRM197 produzido de acordo com a presente invenção foi quantificado com 0 Ensaio Imunossorvente Ligado à Enzima - Imunocaptura (IC-ELISA).
[056]Desenvolvimento da Cepa Manipulada de Corynebacterium diphtheriae com Aumento do Número de Cópias do Gene CRM197 em um Plasmídeo de Vetor de Expressão.
[057]Corynebcaterium diphtheria C7 (β-197) ATCC 53821,0 gene que codifica para CRM197 existe como uma cópia única e a proteína CRM197 mutante é secretada no meio de cultura sob regulação de ferro. O rendimento de CRM197 aumenta três vezes na cepa de Corynebacterium diphtheriae C7 que tem duas cópias do corinefago beta (ATCC 39255). Isso sugere que 0 número de cópias dos genes está ligado ao aumento da produtividade. De modo a tornar comercialmente viável a produção de CRM197 a partir de Corynebacterium diphtheriae, é desejável aumentar 0 nível de expressão. Integrar mais números de cópias no genoma bacteriano é tecnicamente desafiador. Os integrantes de fagos de múltiplas cópias são geneticamente instáveis e perdem as cópias adicionais do gene CRM. Os presentes inventores pretendiam melhorar os níveis de expressão do CRM197 aumentando as cópias genéticas de CRM197 entregues em plasmídeos tendo um marcador de seleção de antibióticos, juntamente com os elementos reguladores nativos de CRM197. Por conseguinte, os inventores desenvolveram a cepa de Corynebacterium diphtheriae tendo aumento do número de cópias do gene CRM197, e avaliaram a estabilidade da cepa. A cepa modificada apresentou níveis mais altos de expressão de CRM197 em comparação
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13/19 com as cepas não modificadas de Corynebacterium.
[058]A presente invenção é mais especificamente ilustrada com referência aos exemplos dados abaixo. No entanto, dever-se-ia entender que a presente invenção não é limitada por um exemplo de qualquer maneira, mas inclui variações dos mesmos dentro dos parâmetros aqui descritos, como pode ser conhecido dos versados na técnica.
Exemplo 1 [059]Aprimoramento da expressão de CRM197 por cópia epissômica de CRM197:
[060]Foi preparado um vetor que pode replicar estavelmente em Corynebacterium diphtheriae C7 (β 197). O isolamento do plasmídeo nativo de Corynebacterium diphtheriae C7 foi realizado utilizando um protocolo de isolamento de plasmídeo grande, como descrito por T.C Currier e outros, Anal Biochem. 1976; 76 (2): 431441. Utilizando a preparação de DNA de plasmídeo nativo, a origem de replicação de 1,87Kb (oriR) foi amplificada. Simultaneamente, a sequência kanR de 1,033Kb foi amplificada usando 0 DNA modelo pUC4-KIXX e a extremidade cega ligada a oriR para gerar pBE30. Além disso, uma sequência gênica de 2,13 Kb de CRM197 compreendendo a região promotora pTox (Boyd e outros, 1988), a sequência cru e terminadora prevista foi amplificada a partir do DNA genômico de Corynebacterium diphtheriae C7 (β 197) e clonada no sítio de restrição Spel exclusivo projetado no pBE30. A mutação GAG neste amplicon foi verificada por ensaio de PCR específico para alelos (Pushnova e outros, Analytical Biochemistry. 1998; 260: 24 a 29) e sequenciamento de DNA. O plasmídeo assim obtido foi designado como pBE33 (Figura 1).
[061 ]O plasmídeo pBE33 foi transferido por eletroporação seguindo os procedimentos otimizados para Corynebacterium diphtheriae C7 (β 197). As colônias transformadas de Corynebacterium diphtheriae C7 (β 197) (pBE33) foram
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14/19 confirmadas por PCR de colônia específica e isolamento de plasmídeo e digestão por restrição. A expressão de CRM197 em colônias foi analisada por SDS-PAGE e Western blotting. O CRM197 no meio foi quantificado por ELISA e HPLC e apresentado como concentração de CRM197 expressa por litro do meio de cultura.
Exemplo 2 [062]Produção de CRM197 com a cepa manipulada de Corynebacterium diphtheriae C7Ep em meios de base - isentos de componentes de origem animal.
[063]A cepa C7Ep de Corynebacterium diphtheriae foi usada para este processo. Um cultivo em duas etapas foi seguido para a preparação do inóculo no frasco de agitação. O meio para 0 cultivo em frascos de agitação compreende Extrato de Levedura (YE) 10 g / L, Peptona Vegetal 15 g / L, KH2PO4 4,3 g / L, Triptofano 50 mg / L, Glicose 4,0 g / L, Ácido nicotínico 0,8 mg / L, Ácido pimélico 0,08 mg / L, CuSO4.5H2O 25 mg / L, ZnSO4.5H2O 12,5 mg / L, MnCl2.4H2O 6,25 mg / L, Cistina 0,5 g / L, Canamicina 25 mg / L, Glicose 4,0 g / L.
[064]A 20 L de meio fermentador, foi adicionado 5% de inóculo para iniciar 0 processo. O meio para 0 cultivo de fermentadores compreende YE 15 g / L, Peptona Vegetal 30 g / L, KH2PO4 4,3 g / L, Triptofano 50 mg / L, Ácido nicotínico 0,8 mg / L, Ácido pimélico 0,08 mg / L, CUSO4.5H2O 25 mg / L, ZnSO4.5H2O 12,5 mg / L, MnCl2.4H2O 6,25 mg / L, Cistina 0,5 g / L, Canamicina 25 mg / L, Glicose 4,0 g / L.
[065]A cultura foi agitada a 300 RPM durante todo 0 lote. A temperatura foi mantida a 35Q C e 0 pH foi mantido a 7,4 usando ácido ortofosfórico a 20% e NaOH a 5N. A cultura foi aerada usando 1,0 vvm de ar. A cultura foi enriquecida com oxigênio para manter 0 nível de Oxigênio Dissolvido (DO) em 20%. Após as primeiras horas, os níveis de DO continuam caindo abaixo de 20% quando 0 limite de enriquecimento de O2 é atingido. O nível de DO para 0 restante do lote permanece próximo de zero com 0 aumento nas horas finais. Quando a glicose residual no caldo cai abaixo de 0,5 g / L, 40% de glicose é fornecida com 2 g / L / h. O lote foi colhido após 14 horas de
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15/19 cultivo quando as densidades celulares atingiram cerca de 90 unidades de DO 600 nm. A espuma no reator foi controlada por antiformador de espuma orgânico a 30%. A produção de CRM197 foi alcançada para uma titulação de 60 a 65 mg / L de caldo de fermentação.
[066]Uma fermentação realizada em condições semelhantes usando a cepa não manipulada de Corynebacterium diphtheriae C7 CRM197 produziu cerca de 35 a 40 mg / L de CRM197, que é menor do que a cepa manipulada. Isso mostra a influência das cópias extras de genes no aumento da produção de CRM197.
Exemplo 3:
[067]Produção de CRM197 com a cepa manipulada de Corynebacterium diphtheriae C7Ep em meio de base isento de componentes de origem animal, seguindo 0 modelo de equilíbrio de fluxo metabólico.
[068]A cepa C7Ep de Corynebacterium diphtheriae foi usada para este processo. Um cultivo em duas etapas foi seguido para a preparação do inóculo no frasco de agitação. O meio para 0 cultivo em frascos de agitação compreende YE 10 g / L, Peptona Vegetal 15g / L, KH2PO4 4,3 g / L, Triptofano 50 mg / L, Glicose 4,0 g / L, Ácido nicotínico 0,8 mg / L, Ácido pimélico 0,08 mg / L, CUSO4.5H2O 25 mg / L, ZnSO4.5H2O 12,5 mg / L, MnCl2.4H2O 6,25 mg / L, Cistina 0,5 g / L, Canamicina 25 mg / L, Glicose 4,0 g / L.
[069]A 20 L de meio fermentação, foi adicionado 5% de inóculo para iniciar 0 processo. O meio para 0 cultivo de fermentadores compreende YE 15 g / L, Peptona Vegetal 30 g / L, KH2PO4 4,3 g / L, Triptofano 50 mg / L, Ácido nicotínico 0,8 mg / L, Ácido pimélico 0,08 mg / L, CUSO4.5H2O 25 mg / L, ZnSO4.5H2O 12,5 mg / L, MnCl2.4H2O 6,25 mg / L, Cistina 0,5 g / L, Canamicina 25 mg / L, Glicose 4,0 g / L.
[070]A cultura foi agitada a 300 RPM durante todo 0 lote. A temperatura foi mantida a 35Q C e 0 pH foi mantido em 7,4 usando ácido ortofosfórico a 20% e hidróxido de amônio a 12,5%. A cultura foi aerada usando 1,0 vvm de ar. A cultura foi
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16/19 enriquecida com oxigênio para manter o nível de DO em 20%. Foi introduzido um modelo que segue a taxa metabólica de conversão no dado ponto no tempo, este modelo recebe a entrada do parâmetro de DO residual em correspondência com as alterações em relação ao pH, CO2, geração de calor. Na fase logarítmica, os níveis de DO continuam caindo abaixo de 20%, apesar do limite de enriquecimento de O2 ter sido alcançado. O nível de DO para 0 restante do lote permanece próximo de zero com 0 aumento nas horas finais. Quando a glicose residual no caldo cai abaixo de 0,5 g / L, 40% de glicose é alimentada para justificar 0 modelo de fluxo metabólico. O lote foi colhido após 14 horas de cultivo quando as densidades celulares atingiram cerca de 90 unidades de DO 600 nm. A espuma no reator foi controlada por antiformador de espuma orgânico a 30%. A produção de CRM197 foi alcançada com uma titulação de 150 mg / L de caldo de fermentação.
Exemplo 4:
[071]Produção de CRM197 de acordo com a presente invenção [072]Um cultivo de três etapas foi seguido para a preparação do inóculo. As duas primeiras etapas foram realizadas nos frascos de agitação. O meio para 0 cultivo em frasco de agitação compreende YE 10 g / L, Peptona Vegetal 15 g / L, KH2PO4 4,3 g / L, Triptofano 50 mg / L, Glicose 4,0 g / L, solução de sal traço YC 2 ml / L, suplemento de cistina 1 ml / L, canamicina 25 mg / L, glicose 4,0 g / L.
[073]A composição do meio de base para 0 fermentador de sementes foi YE 15 g / L, Peptona Vegetal 30 g / L, KH2PO4 4,3 g / L, Triptofano 50 mg / L, Ácido nicotínico 0,8 mg / L, Ácido pimélico 0,08 mg / L, CuSO4.5H2O 25 mg / L, ZnSO4.5H2O
12,5 mg / L, MnCI2.4H2O 6,25 mg / L, Cistina 0,5 g / L, Canamicina 25 mg / L, Glicose 4,0 g / L.
[074]É apresentada a seguir a composição do meio de fermentação (Tabela I) e os ingredientes que foram projetados seguindo 0 modelo de Placket Burmann.
Tabela I
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s. No. Componentes do Meio Quantidade Unidades s. No. Componentes do Meio Quantidade Unidades
1 Alanina 0,1 g/L 18 Valina 1 mg/L
2 Arginina 0,1 g/L 19 Potássio 2 mg/L
3 Ácido aspártico 0,5 g/L 20 Magnésio 1 mg/L
4 Cisteína 0,5 g/L 21 Tiamina 0,1 mg/L
5 Ácido glutâmico 1 g/L 22 Biotina 4 mg/L
6 Glutamina 0,1 g/L 23 Cálcio 2 mg/L
7 Glicina 0,5 g/L 24 Cloreto 0,5 mg/L
8 Histidina 1 g/L 25 Colina 0,1 mg/L
9 Isoleucina 1 g/L 26 Cobre 10 mg/L
10 Leucina 0,5 g/L 27 Ácido Fólico 1,6 mg/L
11 Lisina 0,1 g/L 28 Manganês 1 mg/L
12 Metionina 1 g/L 29 Ácido Nicotinâmico 100 mg/L
13 Fenil Alanina 0,5 g/L 30 Ácido Pantotênico 50 mg/L
14 Prolina 0,1 g/L 31 Ácido Pimélico 20 mg/L
15 Serina 0,1 g/L 32 Riboflavina 50 mg/L
16 Treonina 0,1 g/L 33 Sulfato 20 mg/L
17 Triptofano 0,1 g/L 34 Zinco 7 mg/L
[075]A 20 L de fermentador com componentes acima com o meio de base (YE 15 g / L, Peptona Vegetal 30 g / L, KH2PO4 4,3 g I L, Triptofano 50 mg I L, Ácido nicotinico 0,8 mg / L, Ácido pimélico 0,08 mg / L, C11SO4.5H2O 25 mg / L, ZnSCU.õHLO
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12,5 mg / L, MnCl2.4H2O 6,25 mg / L, Cistina 0,5 g / L, Canamicina 25 mg / L, Glicose 4,0 g / L), 5% de inóculo a partir do fermentador de sementes foi adicionado para iniciar o processo. A temperatura foi mantida a 35Q C e o pH foi mantido em 7,4 a 7,6 usando ácido ortofosfórico a 20%, hidróxido de amônio a 12,5% e modelo baseado na modulação do fluxo metabólico (Figura 2) da alimentação de glicose e OTR. A cultura foi aerada usando 1,0 vvm de ar. A cultura foi enriquecida com oxigênio para manter o nível de DO em 20%. Na fase logarítmica, os níveis de DO continuam caindo abaixo de 20%, apesar do limite de enriquecimento de O2 ter sido alcançado. O nível de DO para 0 restante do lote permanece próximo de zero com 0 aumento nas horas finais. Quando a glicose residual no caldo cai abaixo de 0,5 g / L, a alimentação com solução de glicose a 40% foi administrada a 4,5 g / L / h. Intermitentemente, vitaminas e elementos traço foram suplementados nos seguintes níveis: Ácido nicotínico 6,425 mg / L, Ácido pimélico 0,465 mg / L, CUSO4.5H2O 25 mg / L, ZnSO4.5H2O 12,5 mg / L, MnCl2.4H2O 6,25 mg / L, Tiamina 0,08 mg / L, Ácido pantotênico 0,25 mg / L, Biotina 0,006 mg / L, Riboflavina 0,3 mg / L, Ácido fólico 0,06 mg / L. O lote foi colhido após 18 horas de cultivo quando as densidades celulares atingiram cerca de 132 unidades de DO 600 nm. A espuma no reator foi controlada por antiformador de espuma orgânico a 30%. A produção de CRM197 atingiu uma titulação de 450 a 500 mg / L de caldo de fermentação.
Exemplo 5 [076]Comparação dos rendimentos de CRM197 usando Corynebacterium diphtheriae C7 nativo e uma cepa manipulada de Corynebacterium diphtheriae C7Ep.
[077]Uma fermentação foi realizada usando meio básico não derivado de origem animal, Aprimoramentos de Processo pré-modelo e Meio e Processo de acordo com a presente invenção usando Corynebacterium diphtheriae C7 nativo e cepa modificada de Corynebacterium diphtheriae.
[078]A única cepa lisogênica de Corynebacterium diphtheriae C7 e a cepa
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19/19 manipulada com cópias extras localizadas epissomicamente do gene CRM197 (C7Ep) foram usadas para otimização do processo. Em um meio YC típico sem ferro tendo componentes de origem animal, C7 forneceu 22 a 25 mg / L de CRM197 enquanto C7Ep forneceu 40 a 45 mg / L. Quando 0 meio foi modificado substituindo-se os componentes animais por peptonas vegetais, a cepa C7 resultou em 40 a 45 mg / L de CRM197 e C7Ep forneceu 65 mg / L de CRM197. Nas condições de processo, quando modificadas pela alteração dos parâmetros, C7Ep produziu 120 a 150 mg / L de CRM197. Um modelo foi desenvolvido usando entradas do processo de base. O resultado final do método otimizado resultou em 120 mg / L de CRM197 de C7 e > 500 mg / L de CRM197 a partir de C7Ep. Os rendimentos são comparados na Tabela II abaixo:
Tabela II - Comparação do rendimento de Corynebacterium diphtheriae C7 nativo com 0 rendimento de C7Ep epissomicamente modificada em diferentes condições de processo.
S. No Organismo Rendimentos de CRM197 em mg / L por ELISA
Meio básico isento de derivados de origem animal Aprimoramentos de Processo pré- modelo Meio e processo como pela presente invenção
1 Corynebacterium C7 (nativo) 20-25 35-40 110-120
2 Corynebacterium C7 Ep (epissoma incorporado em cópia extra do gene) 60-65 120 - 150 >500
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Claims (15)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método aprimorado para a produção de CRM197 com alto rendimento usando a cepa manipulada de Corynebacterium diphtheriae com aumento do número de cópias do gene CRM197, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende cultivar a cepa em um meio de fermentação que compreende mais de 10 aminoácidos e está isento de componentes de origem animal.
  2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que 0 método compreende suplementar 0 meio com nutrientes.
  3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que 0 suplemento com nutrientes é baseado no modelo de fluxo metabólico.
  4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que os aminoácidos são selecionados a partir de Alanina, Arginina, Ácido aspártico, Cisteína, Ácido Glutâmico, Glutamina, Glicina, Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina, Fenil Alanina, Prolina, Serina, Treonina, Triptofano, Valina e sais dos mesmos.
  5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que cada aminoácido é usado em uma quantidade de cerca de 0,05 a 2 g / L.
  6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que 0 meio de fermentação contém combinação de Fenil Alanina, Arginina e outros aminoácidos em que a quantidade de Fenil Alanina e Arginina é menor que cerca de 1 g/L.
  7. 7. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que os nutrientes são selecionados a partir de vitaminas tal como Ácido Nicotínico, Tiamina, Ácido Pantotênico, Biotina, Riboflavina, Ácido Fólico; Ácido Pimélico; Fosfato, uma fonte de nitrogênio e metais traço.
  8. 8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que 0 meio de fermentação é um produto sem ferro
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    2/3 e completamente isento de componentes de origem animal.
  9. 9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição do meio de fermentação compreende o meio de fermentação base que compreende Extrato de Levedura, Peptona Vegetal, Di-Hidrogênio Fosfato de Potássio (KH2PO4), Triptofano, Glicose, Solução de sal traço YC.
  10. 10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende suplementar 0 meio com glicose durante todo 0 processo de fermentação.
  11. 11. Método aprimorado para a produção de CRM197, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:
    i) cultivar a cepa manipulada de Corynebacterium diphtheriae com aumento do número de cópias do gene CRM197 em um meio de fermentação isento de componentes de origem animal e que compreende meio de base e mais de 10 aminoácidos selecionados a partir de Alanina, Arginina, Ácido aspártico, Cisteína, Ácido glutâmico, Glutamina, Glicina, Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina, Fenil alanina, Prolina, Serina, Treonina, Triptofano, Valina e sais dos mesmos, e ii) suplementar 0 meio com glicose e nutrientes com base no modelo de fluxo metabólico.
  12. 12. Método aprimorado para a produção de CRM197, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende cultivar a cepa manipulada de Corynehacterium diphtheriae com aumento do número de cópias do gene CRM197 em um meio de fermentação isento de componentes de origem animal e que compreende mais de 10 aminoácidos e suplementar 0 meio com nutrientes com base no modelo de fluxo metabólico, em que cada aminoácido é usado em uma quantidade de cerca de 0,05 a 2 g / L.
  13. 13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que a fermentação é realizada a uma temperatura
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    3/3 entre 30Q C a 40Q C e a um pH na faixa de 7,0 a 8,0, de preferência, de 7,4 a 7,6.
  14. 14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o rendimento de CRM197 obtido é superior a 150 mg / L, 200 mg / L, 300 mg / L, 500 mg / L, 1 g / L, 1,5 g / L, 2 g / L, 2,5 g / L, 3 g / L,
    3,5 g / L, 4 g / L, 4,5 g / L, 5 g / L.
  15. 15. Método para fabricar vacina conjugada, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende conjugar polissacarídeos a partir de Salmonella typhi, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae com CRM197 preparado de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.
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