BRPI0603790B1

BRPI0603790B1 - microorganismo e método de produção de l-lisina

Info

Publication number: BRPI0603790B1
Application number: BRPI0603790-9A
Authority: BR
Inventors: Young Hoon Park; Hyun Min Koo; Sang Jo Lim; Jun Ok Moon; Young Lyeol Yang
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2005-11-30
Filing date: 2006-09-13
Publication date: 2020-12-22
Also published as: US7575899B2; CN1974761A; ATE484575T1; CN100519740C; KR20070056805A; US20070178564A1; JP2007151551A; EP1792975A1; BRPI0603790A; EP1792975B1; DE602006017494D1; JP4541345B2; KR100789270B1

Abstract

Microorganismo e método de produção de L-lisina. A presente invenção proporciona um microorganismo que pertence ao gênero Corynebacterium e tem um gene da desidrogenase NCg12053 inerente inativado e um método de produção de L-lisina que usa o mesmo. Usando o microorganismo, o rendimento de L-lisina é aumentado, visto que um gene da desidrogenase NCg12053 inerente está inativado. De acordo com o método, a L-lisina pode ser produzida com elevado rendimento.

Description

Referência Remissiva a Pedido de Patente Relacionado

Este Pedido reivindica o beneficio do Pedido de Patente Core- ano 10-2005-0115904, depositado em 30 de novembro de 2005, no Es- critório de Propriedade Intelectual Coreano, cuja revelação é aqui incor- porada na sua totalidade por referência.

Antecedentes da Invenção 1 - Campo da Invenção

A presente invenção relaciona-se a um microorganismo que pertence ao gênero Corynebacterium e tem produtividade intensificada de L-lisina e um método de produção de L-lisina que usa o mesmo.

2 - Descrição da Técnica Relacionada

Uma cepa do gênero Corynebacterium, particularmente Corynebacterium glutamicum, é um microorganismo que é extensivamen- te usado para produzir L-aminoácido. O L-aminoácido, particularmente a L-lisina, é usado para produzir alimentos para animais e medicamen- tos para humanos e também é usado na indústria farmacêutica. O L- aminoàcido é produzido pela fermentação da cepa de Corynebacterium, mas, visto que o método pelo qual o L-aminoácido é produzido usando o gênero Corynebacterium é importante, tem havido extensivas tentativas para melhorar o método.

Uma dessas tentativas para melhorar a produção de L-ami- noácido usando uma cepa do gênero Corynebacterium envolve destruir ou atenuar a expressão de um gene específico usando tecnologia de DNA recombinante. Por exemplo, na Patente US 6.872.553, é provido um processo para a preparação fermentativa de L-aminoácidos, incluindo o processo a) uma fase de crescimento do Corynebacterium em que a codi- ficação do DNA da carboxiquinase (pck) do piruvato de fosfoenol (PEP) é atenuada por um método de mutagénese selecionado do grupo que con- siste em mutagénese de inserção, por inserção de pelo menos um par de bases, mutagénese de apagamento, com apagamento de pelo menos um par de bases, e mutagénese de transição ou de transversão com a incor- poração de uma mutação de não sentido da atividade do referido poli- peptídio é reduzida em comparação com uma Corynebacterium não ate- nuada; b) uma fase de concentração do produto de L-aminoácido preten- dido no meio ou células da citada bactéria; e c) uma fase de isolamento de separação de dito produto de L-aminoácido.

Também tem havido extensiva pesquisa sobre os efeitos de amplificar os genes que se relacionam com a biossíntese do L-amino- ácido individual na produção de L-aminoácido e sobre a melhoria da ce- pa de Corynebacterium de produção de L-aminoácido (Eggeling, Aminoa- cids 6, 261-272 (1994).) Além disso, tem havido tentativas de introduzir um gene estranho de origem bacteriana diferente. Por exemplo, no Pedi- do Japonês Publicado Hei 7-121228, é provido um processo de cultura de um microorganismo que pertence ao gênero Corynebacterium ou ao gênero Brevibacterium e que possui um fragmento de DNA tendo infor- mações de gene relacionadas à síntese da sintase do ácido cítrico de um microorganismo e DNA recombinante de DNA de vetor e um método de produção de ácidos L-glutâmicos e L-prolina no meio.

Todavia, de acordo com os referidos métodos, é almejado o uso de uma cepa tendo produtividade intensificada de L-lisina.

Sumário da Invenção

A presente invenção proporciona um microorganismo que pertence ao gênero Corynebacterium e tem produtividade intensificada de L-lisina.

A presente invenção também provê um método de produção de L-lisina que usa o microorganismo do gênero Corynebacterium.

Breve Descrição dos Desenhos

As características e vantagens acima e outras da presente invenção tornar-se-ão mais evidentes pela descrição detalhada de moda- lidades exemplificativas com referência aos desenhos anexos em que: a Figura 1 é um diagrama que ilustra um vetor pCR-2053 clonado com um fragmento de gene NCgl2053 de cerca de 500 bp.

Descrição Detalhada da Invenção

De acordo com um aspecto da presente invenção, é provido um microorganismo que pertence ao gênero Corynebacterium que tem um gene da desidrogenase NCgl2053 inerente que é inativado e produz lisina. O gene da desidrogenase NCgl2053 inerente tem atividade de desidrogenase e existe inerentemente num microorganismo do gênero Corynebacterium (Nakagawa, Appl. Microbiol. Biotechnol. 62(2-3), 99-109 (2003).). A atividade do gene da desidrogenase é estimada a partir de uma análise da seqüência completa do genoma de Corynebacterium glu- tamicumATCC 13032. O gene da desidrogenase pode ter a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1.

Um microorganismo que pertence ao gênero Corynebacterium e tem um gene da desidrogenase NCgl2053 inerente inativado de acordo com uma modalidade da presente invenção pode ser Corynebacterium glutamicumATCC 13032, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP- 1539, Corynebacterium glutamicum KFCC 10881 ou Corynebacterium glu- tamicum KFCC 11001, mas, não fica limitado a estes exemplos.

A inativação pode ser introduzida usando qualquer método conhecido na técnica. No microorganismo da presente invenção, o termo “inativação” pretende significar que o gene da desidrogenase NCgl2053 é expresso mais baixo do que a expressão de uma cepa selvagem ou não é absolutamente expresso ou mesmo, se o gene da desidrogenase NC- gl2053 estiver expresso na desidrogenase NCgl2053, a desidrogenase NCgl2053 não tem nenhuma atividade ou tem atividade atenuada.

Numa modalidade da presente invenção, a inativação pode ser introduzida usando um método de mutagênese selecionado do grupo que consiste em mutagênese de inserção por inserção de pelo menos um par de bases no gene da desidrogenase NCgl2053, mutagênese de apa- gamento por apagamento de pelo menos um par de bases no gene da de- sidrogenase NCgl2053, e mutagênese de transição ou de transversão pe- la incorporação de um códon de não sentido.

Numa modalidade da presente invenção, a inativacâo pode ser introduzida transformando uma bactéria que pertence ao género Corynebacterium com um vetor tendo um marcador antibiótico e uma região parcial do gene da desidrogenase NCgl2053 e cultivando a bacté- ria transformada sob os antibióticos. Por exemplo, o vetor pode ser pCR- 2053, que inclui parte de um gene NCgl2053 de SEQ ID NO:2. A trans- formação de um vetor tendo uma parte do gene no microorganismo e a cultura sob o marcador selecionado conduz à recombinação homóloga de parte de uma seqüência do gene e um gene inerente do microorganismo. O gene inerente do microorganismo é recombinado através da recombi- nação homóloga e do microorganismo tendo o gene recombinante, ape- nas o microorganismo recombinante tendo o marcador acima descrito é selecionado. Como resultado, pode ser obtido o microorganismo que pertence ao gênero Corynebacterium e tem o gene da desidrogenase NC- gl2053 inerente inativado. Contudo, um método de obtenção do micro- organismo da presente invenção não fica limitado a esta recombinação homóloga e pode ser usado qualquer método conhecido na técnica. O microorganismo pode ser Corynebacterium glutamicum KFCC10881- CJP5102 (Acesso No. KCCM-10709P).

De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido um método de produção de L-lisina, que inclui: a cultura do microorga- nismo da presente invenção para produzir L-lisina num meio ou células e coletar a L-lisina a partir da cultura.

No método da presente invenção, pode ser cultivado o micro- organismo do gênero Corynebacterium usando quaisquer condições de cultura e método conhecido na técnica. Um exemplo de um meio de cul- tura para cultivar a cepa de Corynebacterium é o meio de cultura descri- to no Manual of Methods for General Bacteriologypela American Society for Bacteriology (Washington D.C., EUA, 1981).

Podem ser usadas no meio fontes de carboidrato que incluem o seguinte: açúcares e carboidratos tais como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido e celulose; óleos e gorduras, tais como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de rícino e óleo de coco: ácidos graxos tais como ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linolénico; álcoois, tais co- mo etanol; e ácidos orgânicos, tais como ácido acético. Os exemplos das fontes de açúcar mencionadas acima podem ser usados sozinhos ou em combinação. Os exemplos de fontes de nitrogênio incluem o seguinte: peptona, extratos de levedura, extratos de carne, extratos de malte, licor de milho embebido, alimento de soja e uréia ou compostos inorgânicos tais como sulfato de amónio, cloreto de amónio, fosfato de amónio, car- bonato de amónio, amónia e nitrato. As fontes de nitrogênio acima po- dem ser usadas sozinhas ou em combinação. Os exemplos de fontes de fósforo incluem o seguinte: dihidrogênio fosfato de potássio, hidrogênio fosfato de dipotássio ou os correspondentes sais de sódio dos mesmos. Também o meio de cultura pode incluir sais metálicos, tais como sulfato de magnésio ou sulfato de ferro, que é necessário para o crescimento. Além disso, podem ser usados materiais essenciais para o crescimento, tais como aminoácidos e vitaminas além dos ingredientes acima. Além disso, podem ser usados precursores adequados no meio de cultura. Os ingredientes acima podem ser adicionados ao meio de cultura durante o cultivo num modo de batelada ou de uma maneira contínua.

O pH do meio pode ser controlado usando um composto bá- sico tal como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amónia, ou um composto ácido, tal como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico. Também o uso de um agente anti-espumante tal como éster poliglicólico de graxo ácido pode suprimir a geração de espuma. Pode ser injetado oxigênio ou um gás contendo oxigênio tal como ar no meio, a fim de manter a condi- ção aeróbica. A temperatura do meio é de 20 a 45°C, de preferência de 25 a 40°C. A cultura pode ser realizada até que seja produzida uma quantidade pretendida de L-lisina, mas, a cultura é desejavelmente reali- zada durante de 10 a 160 horas.

A cultura pode ser realizada de várias maneiras incluindo em batelada, batelada de alimentação, batelada de alimentação repetida e de maneira contínua. Este método é bem conhecido na técnica e a presente invenção não fica limitada a ele.

O L-aminoácido pode ser separado e analisado através de cromatografia de permuta aniônica e geração derivada de ninidrina.

Para desenvolver o microorganismo e o método da presente invenção, os inventores da presente invenção primeiro cultivaram Cory- nebacterium glutamicumATCC 13032 na presença de L-lisina, analisa- ram os níveis de proteínas expressas a partir do Corynebacterium gluta- micum ATCC 13032 usando eletroforese bidimensional e compararam os níveis de proteínas expressas com aqueles de experiências comparativas em que a cultura foi realizada sem L-lisina. Como resultado, identifica- mos proteínas que são sobrexpressas na presença de L-lisina, isto é, pro- teínas a serem presumivelmente induzidas pela presença de lisina. Ba- seadas em informações das proteínas identificadas, foram determinadas informações de gene das proteínas acima usando os US National Institu- tes of Health GenBank (NIH GenBank) e as proteínas foram confirmadas serem NCgll835 e NCgl2053.

Além disso, foi confirmado se os genes acima são realmente induzidos na presença de lisina. Primeiro, uma região do ácido nucleico considerada ser um promotor dos genes acima foi amplificada por PCR e, depois, o ácido nucleico promotor amplificado foi fundido com o gene LacZ cujo promotor foi removido, para obter um gene de fusão do promo- tor dos genes acima identificados-seqüência de codificação LacZ. O gene de fusão obtido foi inserido num vetor e o vetor foi introduzido num mi- croorganismo. O microorganismo obtido foi cultivado na presença de lisina e foi confirmado se a proteína lacZ é expressa, medindo a atividade de β-galactosidase. Como resultado, foi confirmado que a expressão dos genes acima é induzida pela lisina.

Todavia, não é conhecido como os genes acima estão associ- ados com a biossíntese da lisina no microorganismo de produção de lisi- na. Os inventores da presente invenção mediram a quantidade de lisina produzida por inativação do gene NCgl2053 inerente de um microorga- nismo de Corynebacterium e confirmaram que a quantidade de lisina produzida estava realmente aumentada, além da identificação dos genes sobrexpressos na presença de lisina.

Exemplos

A presente invenção será, agora, descrita em maior detalhe com referência aos exemplos seguintes. Estes exemplos são apenas para propósitos ilustrativos e não se pretende que limitem o âmbito da pre- sente invenção.

Nos exemplos seguintes, foi preparado um microorganismo recombinante por inativação do gene NCgl2053 inerente de Corynebacte- rium glutamicum KFCC10881, o microorganismo recombinante cultivado para produzir lisina na cultura e foi medida a quantidade de lisina pro- duzida.

Exemplo 1 Produção de Vetor Para Inativar o Gene NCgl2053 Inerente do Microorganismo do Gênero Corynebacterium

Neste Exemplo, a fim de produzir um vetor tendo um marca- dor de antibiótico e parte da sequência de DNA de NCgl2053, foi amplifi- cado um fragmento de gene NCgl2053 de cerca de 5OObp (SEQ. ID. NO.2; 170 a 650 nucleotídeos de SEQ. ID. NO:1) usando uma PCR usando os oligonucleotídeos de SEQ ID. NOS. 3 e 4 como iniciadores e o DNA do cromossomo de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 como modelo (template),A PCR foi repetida 30 vezes por desnaturação a uma tempe- ratura de 96°C durante 30 segundos, anelamento a uma temperatura de 52°C durante 30 segundos e polimerização a uma temperatura de 72°C durante 30 segundos. O fragmento de gene NCgl2053 amplificado foi inserido no plasmídio E. coli pCF2.1 usando um kit TOPO Cloning (Invi- trogen, EUA) para produzir um plasmídio pCR-2053. A Figura 1 mostra um vetor pCR-2053 em que foi clonado um fragmento de gene NCgl2053 de cerca de 500 bp.

Exemplo 2 Produção da Cepa de Produção de L-Lisina Tendo o Gene NCgl2053 Inerente Inativado de Corynebacterium glutamicum KFCC10881

Usando o método de transformação ilustrado em Appl Mi- crobiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545, foi transformada Corynebacterium glutamicum KFCC 10881, que é uma cepa produtora de L-lisina, com o plasmidio pCR-2053 produzido no Exemplo 1 por um método de pulso , (elétrico e, depois, o microorganismo transformado foi cultivado no meio Aq;de seleção contendo 25mg/L de canamicina. Foi realizada uma PCR u- sando o DNA cromossômico das cepas transformadas como modelo (tem- plate)no segundo dia de cultura, a fim de confirmar se os genes NC- gl2053 foram destruídos. A PCR foi realizada usando os oligonucleotí- deos da SEQ ID. NO. 5 e 6 como iniciadores e o DNA cromossômico das cepas transformadas como modelo (template)para amplificar um frag- mento de gene NCgl2053 com um comprimento de cerca de 5.150 bp (de 118 a 775 nucleotídeos da SEQ ID. NO.l) contendo o plasmidio pCR- 2053. Como resultado, foi obtida uma cepa Corynebacterium glutamicum KFCC10881 em que os genes acima foram destruídos e a cepa, então, chamada Corynebacterium glutamicum KFCC 10881-CJP5102. Conside- ra-se que os genes acima estão destruídos incorporando o plasmidio pCR-2053 no meio de genes NCgl2053 inerentes de um DNA cromossô- mico através da recombinação homóloga.

A cepa Corynebacterium glutamicum KFCC 10881-CJP5102 foi depositada em 16 de novembro de 2005 no Korean Culture Center of Microorganisms, que é uma Autoridade de Depósito Internacional (IDA) sob o Tratado de Budapest (Acesso No. KCCM-10709P).

Exemplo 3

Produção de L-Lisina Usando

Corynebacterium glutamicum KFCC10881-CJP5102

A L-lisina foi produzida cultivando a cepa Corynebacterium glutamicum KFCC 10881-CJP5102 produzida no Exemplo 2.

Primeiro, um frasco de 250 ml de cantos arredondados tendo 25 ml do meio de semeadura descrito abaixo foi inoculado com a cepa pai de Corynebacterium glutamicum KFCC 10881 e KFCC 10881-CJP5102 e o resultante foi cultivado com agitação a 200 rpm a 30°C durante 20horas, 1 mL da solução de cultura resultante foi inoculado num frasco de 250 ml de cantos arredondados contendo 24 ml do meio de produção descrito abaixo e o resultado foi cultivado com agitação a 200 rpm a 30°C durante 120 horas. Depois que a cultura estava terminada, foi 5 medida a quantidade de L-lisina produzida usando um HPLC (Waters2457) Como resultado, foi determinado que Corynebacterium glutamicum KFCC10881 e KFCC10881-CJP5102 respectivamente produziram 45 g/1 e 49 g/1 de L-lisina numa forma de cloreto na cultura.

Meio de cultura de semeadura (pH 7,0) (por litro de água destilada)

Meio de produção (pH 7,0) 2000 μg(por litro da água destilada)

Exemplo 4 Coleta de L-Lisina a Partir de Meio de Cultura de Cepa de Corynebacterium glutamicum KFCC1O881-CJP51O2

Adicionando cloreto a 1 L de um caldo de fermentação de lisina obtido cultivando Corynebacterium glutamicum KFCC10881- CJP5102 num meio contendo melaço e açúcar bruto, o pH do caldo de fermentação foi ajustado para pH 2,0 e os íons de Ca foram transforma- dos em CaSO4 e CaCl2. Depois, os materiais de cultura fluíram para uma resina de permuta catiônica (Diaion SK-L10) reproduzidos na forma de íons de amónio na direção para cima e aderindo a lisina à resina. Depois que as bactérias residuais dentro da resina de permuta catiônica foram removidas por lavagem com água desmineralizada, a lisina de alta concentração foi coletada por eluição da resina com hidróxido de amónio 2N. A solução coletada foi concentrada e cristalizada por arrefecimento a 20°C, ao mesmo tempo que se ajustava o pH a 5,0. Foi obtido um pri- meiro produto úmido por separação centrífuga de uma pasta de cristali- zação completada e foi obtido um segundo produto úmido por concen- tração em batelada e cristalizando a solução-mãe. Foram obtidas 46,5 g de um produto de lisina seco com 98,5% de conteúdo de lisina combi- nando o primeiro e o segundo produtos úmidos e secando o produto combinado.

Embora a presente invenção tenha sido mostrada e descrita particularmente com referência a modalidades exemplificativas da mes- ma, ficará entendido por aqueles de capacidade ordinária na técnica que podem ser nela feitas várias mudanças de forma e detalhes, sem sair do espírito e âmbito da presente invenção, conforme definida pelas reivindicações seguintes.

Claims

1. Microorganismo Transgênico, caracterizado por que pertence ao gênero Corynebacterium, tem um gene inerente inativado da desidrogenase NCgl2053, tem uma sequência nucleotídea de SEQ ID NO:1 e produz L-lisina, em que o micro-organismo é Corynebacterium glutamicum KFCC10881-CJP5102 (Depósito No. KCCM-10709p) e em que o gene da desidrogenase NCgl2053 inerente intacto é inativado por processo não natural.

2. Método de Produção de L-Lisina, que realiza o cultivo de micro- organismo, para produzir L-lisina num meio ou células, coletando a L- lisina a partir da cultura, caracterizado por que o micro-organismo é conforme definido na Reivindicação 1.