BRPI0615390A2 - bactéria corineforme, e, método para produzir ácido l-glutámico - Google Patents

Abstract

BACTéRIA CORINEFORME, E, MéTODO PARA PRODUZIR áCIDO L-GLUTáMICO. Um método para a produção de ácido L-glutâmico compreedendo as etapas de cultivar uma bactéria corineforme que é capaz de produzir ácido L-glutâmico e é modificada de modo a inativar gluX em um meio de cultura para produzir e acumular ácido L-glutâmico no meio de cultura ou na célula, e colher o ácido L-glutâmico do meio de cultura.

Description

"BACTÉRIA CORINEFORME, E5 MÉTODO PARA PRODUZIR ÁCIDO

L-GLUTÂMICO"

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção diz respeito à indústria de fermentação, e diz respeito a um método para produzir eficientemente ácido L-glutâmico com o uso de uma bactéria corineforme. FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

O ácido L-glutâmico é convencionalmente produzido pela fermentação com o uso das bactérias corineformes pertencentes ao gênero Brevibacterium, Corynebacterium ou coisa semelhante, tendo uma capacidade de produzir o ácido L-glutâmico. De modo a melhorar a produtividade destas bactérias corineformes, cepas bacterianas isoladas da natureza, ou cepas mutantes artificiais ou cepas modificadas por recombinação de genes delas, são usadas.

Como bactérias corineformes cuja capacidade de produzir ácido L-glutâmico é melhorada pelas técnicas de recombinação de genes, até hoje desenvolvidas, são as bactérias corineformes das quais a atividade da glutamato desidrogenase, a atividade da citrato sintase e a atividade da piruvato carboxilase são intensificadas (documento de Patente 1), as bactérias das quais a atividade α-cetoglutarato desidrogenase, ou as atividades da a- cetoglutarato desidrogenase e isocitrato liase, são reduzidas (Documentos de Patente 2 e 3), e assim por diante.

Neste ínterim, a seqüência de nucleotídeos inteira do cromossoma de Corynebacterium glutamicum já foi determinada (Documento não patente 1). Entretanto, cerca de 40 % de 3099 de suas orfs putativas apresentam baixa homologia a genes de outros microorganismos de cujas funções são conhecidos, e codificam proteínas cujas funções são desconhecidas, e a influência da deleção destes genes não ficou conhecida até a presente data. Documento de patente 1: Publicação da Patente Internacional WOOO/18935

Documento de patente 2: Publicação da Patente Internacional W095/34672

Documento de patente 3: Patente Japonesa Aberta ao Público (KOKAI, JP-A) n- 01-296994

Documento não Patente 1 :Appl Microbiol Biotechnol^ 62 (2- .3), pp.99-109 (2003) APRESENTAÇÃO DA INVENÇÃO

Um objeto da presente invenção é prover uma bactéria corineforme cuja capacidade de produzir ácido L-glutâmico é melhorada, e prover um método para produzir eficientemente o ácido L-glutâmico com o uso de uma tal bactéria.

Os inventores da presente invenção conduziram várias pesquisas de modo a obterem o objeto acima mencionado. Como um resultado, eles observaram que, se o gene gluX fosse inativado nas bactérias corineformes, a sua capacidade de produzir ácido L-glutâmico poderia ser melhorada, e assim consumada a presente invenção.

Isto é, a presente invenção fornece o seguinte.

(1) Uma bactéria corineforme tendo a capacidade de produzir ácido L-glutâmico, o qual é modificado de modo que o gene gluX fique inativado.

(2) A bactéria corineforme de acordo com (1), que é modificada de modo que a quantidade de expressão do gene gluX seja reduzida pela introdução de uma mutação dentro do gene gluX no cromossoma ou em uma sua região de controle da expressão.

(3) A bactéria corineforme de acordo com (1) ou (2), em que o gene gluX no cromossoma é rompido.

(4) Um método para produzir ácido L-glutâmico, o qual compreende cultivar a bactéria corineforme de acordo com qualquer um de (1) a (3) em um meio para produzir e acumular o ácido L-glutâmico, e coletar o ácido L-glutâmico do meio. BREVE EXPLANAÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1: Um desenho apresentando o procedimento de construção do plasmídeo pBS3.

Figura 2: Um desenho apresentando o procedimento de construção do plasmídeo pBS4S.

Figura 3: Um desenho apresentando o procedimento de construção do plasmídeo pBXGXD para rompimento do gluX. DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

Daqui por diante, as formas de realização da presente invenção serão explanadas em detalhes. <1> Bactéria corineforme da presente invenção

As bactérias corineformes usadas para a presente invenção incluem as bactérias de Corynebactéria e aquelas bactérias que foram anteriormente classificadas no gênero Brevibaeterium^ mas que foram reclassificadas no gênero Corynebacterium [Int. J. Syst. Baeteriol., 41, 255 (1981)], e ainda incluem bactérias pertencentes ao gênero Brevibacterium, que fica extremamente perto do gênero Corynebacterium. Exemplos específicos incluem os seguintes:

Corynebaeterium acetoaeidophilum Corynebacterium acetoglutamieum Corynebaeterium alcanolyticum Corynebaeterium callunae Corynebacterium glutamieum Corynebaeterium lilium Corynebaeterium melassecola

Corynebaeterium thermoaminogenes (Corynebaeterium efficiens)

Corynebacterium herculis

Brevibacterium divarieatum

Brevibacterium flavum

Brevibaeterium immariophilum

Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamieum)

Brevibacterium roseum

Brevibaeterium saceharolytieum

Brevibaeterium thiogenitalis

Brevibacterium ammoniagenes

Brevibaeterium álbum

Brevibaeterium eerinum

Microbacterium ammoniaphilum

Especificamente, as seguintes cepas podem ser incluídas:

Corynebaeterium aeetoaeidophilum ATCC 13870

Corynebaeterium aeetoglutamieum ATCC 15806

Corynebaeterium aleanolytieum ATCC 21511

Corynebaeterium eallunae ATCC 15991

Corynebacterium glutamieum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869

Corynebaeterium Hlium ATCC 15990

Corynebaeterium melasseeola ATCC 17965

Corynebaeterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539)

Corynebaeterium herculis ATCC 13868

Brevibaeterium divarieatum ATCC 14020

Brevibaeterium flavum ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418 (FERM BP-2205) Brevibacterium immariophilum ATCC 14068 Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamieum) ATCC 13869

Brevibaeterium roseum ATCC 13825 Brevibaeterium saecharolytieum ATCC 14066 Brevibaeterium thiogenitalis ATCC 19240 Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871, ATCC 6872 Brevibaeterium album ATCC 15111 Brevibaeterium eerinum ATCC 15112

Mierobaeterium ammoniaphilum ATCC 15354

Estas cepas acham-se disponíveis da American Type Culture Collection. Isto é, cada cepa recebe um número de registro. As cepas podem ser ordenadas com o uso deste número de registro. O número de registro correspondente a cada cepa é listado no catálogo da ATCC. A cepa AJ12340 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (correntemente International Patent Organism Depositary5 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology no Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-5466, Japão) em 27 de outubro de 1987 sob as provisões do Tratado de Budapeste, e lhe foi dado um número de acesso de FERM BP-1539. A cepa AJ12418 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry em 5 de janeiro de 1989, sob as disposições do Tratado de Budapeste, e à qual foi dado um número de acesso de FERM BP-2205.

Na presente invenção, "capacidade de produzir ácido L- glutâmico" significa uma capacidade para acumular ácido L-glutâmico em um meio quando a bactéria corineforme da presente invenção seja cultivada no meio. A bactéria da presente invenção pode ter esta capacidade de produzir ácido L-glutâmico como uma característica de uma cepa selvagem da bactéria corineforme, ou a capacidade pode ser uma característica comunicada pela reprodução. Além disso, a capacidade de produzir ácido L-glutâmico pode ser comunicada pela modificação da bactéria de modo que o gluX seja inativado da maneira descrita mais abaixo.

A fim de comunicar a capacidade de produzir o ácido L- glutâmico por reprodução, podem ser usados métodos convencionalmente utilizados para reprodução das bactérias corineformes, por exemplo aquelas usadas para a aquisição de cepas mutantes de regulação metabólica, construção de cepas recombinantes em que uma enzima do sistema de biossíntese de uma substância objeto seja intensificada [referir-se a uAmino Acid Fermentatiorí\ a Japan Scientific Societies Press (Gakkai Shuppan Center), 1- Edição, publicada em 30 de maio de 1986, pp. 77 a 100] e assim por diante. Nesses métodos, a mutação de regulação metabólica a ser comunicada, ou a intensificação das enzimas do sistema de biossíntese para uma substância objeto e assim por diante podem ser individualmente comunicadas ou realizadas, ou duas ou mais delas podem ser comunicadas em combinação. A comunicação da mutação de regulação metabólica com a intensificação de uma enzima do sistema de biossíntese pode ser combinada.

Daqui por diante, são descritos os métodos para comunicar a capacidade de produzir ácido L-glutâmico. Exemplos do método para comunicar a capacidade de produzir ácido L-glutâmico mediante reprodução incluem intensificar a expressão de um gene codificando uma enzima envolvida na biossíntese do ácido L-glutâmico. Exemplos da enzima envolvida na biossíntese do ácido L-glutâmico incluem a glutamato desidrogenase, glutamina sintetase, glutamato sintase, isocitrato desidrogenase, aconitato hidratase, citrato sintase, fosfoenolpiruvato carboxilase, piruvato carboxilase, piruvato desidrogenase, piruvato quinase, fosfoenolpiruvato sintase, enolase, fosfogliceromutase, fosfoglicerato quinase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, triose fosfato isomerase, frutose, frutose bifosfato aldolase, fosfofrutoquinase, glicose fosfato isomerase, e assim por diante.

A intensificação da expressão destes genes pode ser obtida pela introdução de um plasmídeo de amplificação obtido pela introdução de um fragmento de DNA contendo qualquer destes genes em um plasmídeo adequado, por exemplo, um vetor plasmídeo contendo pelo menos um gene responsável pela replicação do plasmídeo em bactérias corineformes, pelo aumento do número de cópias destes genes em um cromossoma mediante conjugação, transferência de genes, etc., mediante a introdução de uma mutação em uma região promotora destes genes, ou mediante a substituição de um promotor por um promotor mais forte (referir-se à Publicação de Patente Internacional WO 00/18935).

Quando um gene seja amplificado em um plasmídeo ou no cromossoma, o promotor para expressão do gene pode ser qualquer promotor, contanto que um promotor que funcione nas bactérias corineformes seja escolhido, e ele possa ser um promotor inerente do gene usado. A quantidade de expressão dos genes pode também ser controlada pela escolha adequada do promotor. Exemplos das bactérias corineformes modificadas de modo que a expressão do gene da citrato sintase, do gene da fosfoenolpiruvato carboxilase, do gene da glutamato desidrogenase, e/ou do gene da isocitrato desidrogenase seja intensificada, incluem os microorganismos descritos na Publicação da Patente Internacional WO 00/18935 e na Publicação da Patente Européia n- 1010755.

Além disso, a modificação para comunicar a capacidade de produzir o ácido L-glutâmico pode também ser obtida pela redução ou supressão da atividade de uma enzima que catalise uma ramificação de reação de uma via biossintética do ácido L-glutâmico para produzir outro composto. Exemplos de enzimas que catalisam uma reação para sintetizar um composto que não o ácido L-glutâmico, incluem a isocitrato liase, a-cetoglutarato desidrogenase, acetil fosfato transferase, acetato quinase, ácido acetoidróxi sintase, acetolactato sintase, acetil formiato transferase, lactato desidrogenase, glutamato decarboxilase, 1-pirrolina desidrogenase, e assim por diante.

De modo a reduzir ou suprimir a atividade de qualquer uma das enzimas descritas acima, uma mutação que reduza ou suprima a atividade intracelular da enzima pode ser introduzida no gene da enzima acima mencionada em um cromossoma, mediante um método usual de mutagênese. Por exemplo, isso pode ser obtido pela supressão do gene codificando a enzima em um cromossoma, ou pela modificação de uma seqüência de controle da expressão, tal como um promotor, seqüência de Shine-Dalgamo (SD), operador, terminador e atenuador mediante recombinação de genes. Além do mais, isso pode também ser obtido pela introdução de uma mutação para substituição de aminoácidos (mutação sem sentido), ou uma mutação de deslocamento de matriz que adicione ou suprima um ou dois nucleotídeos em uma região codificando a enzima em um cromossoma, ou pela supressão do gene parcial ou inteiramente [Journal of Biological Chemistry, 272: 8611- 8617 (1997)]. Além disso, a atividade enzimática pode também ser reduzida ou suprimida pela construção de um gene codificando uma enzima mutante da qual a região codificadora é suprimida, e substituindo-se o gene normal pelo gene construído em um cromossoma mediante recombinação homóloga ou coisa parecida. Exemplos de bactérias corineformes das quais a atividade da α-cetoglutarato desidrogenase é reduzida, incluem as seguintes cepas descritas nas Patentes Japonesas Abertas ao Público n~ 07-834672, 06- 237779,01-296994, etc.

cepa AS Brevibacterium lactofermentum (WO 95/34672) cepa AJ12821 Brevibacterium lactofermentum (FERM BP-4172; ver FR9401748) cepa AJ12822 Brevibacteriumflavum (FERM BP-4173; ver FR9401748)

cepaAJ12823 Corynebacterium glutamicum (FERM BP-4174; ver FR9401748)

Outros métodos de comunicar a capacidade de produzir ácido L-glutâmico incluem comunicar resistência aos análogos de ácido orgânico ou inibidores respiratórios, ou sensibilidade ao inibidor da síntese da parede celular. Exemplos de tais métodos incluem, por exemplo, comunicar resistência à benzopirona ou às naftoquinonas (JP56-1889A), comunicar resistência a HOQNO (JP56-140895A), comunicar resistência ao ácido a- cetomalônico (JP57-2689A), comunicar resistência à guanidina (JP56-35981 A), comunicar sensibilidade à penicilina (JP0488994A), etc.

Exemplos específicos de tais bactérias incluem as seguintes cepas:

Brevibaeterium flavum AJl 1355 (FERM P-5007; JP56-1889A)

Corynebacterium glutamicum AJl 1368 (FERM P-5020; JP56-1889A)

Brevibaeterium flavum AJl 1217 (FERM P-4318; JP57-2689A)

Corynebaeterium glutamicum AJl 1218 (FERM P-4319; JP57-2689A)

Brevibacterium flavum AJl 1564 (FERM P-5472; JP56-140895A)

Brevibacterium flavum AJl 1439 (FERM P-5136; JP56-35981A)

Corynebacterium glutamicum H7684 (FERM BP-3004; JP04-88994A)

A cepa precursora da qual a bactéria corineforme da presente invenção é obtida, pode também ser uma bactéria corineforme que produz ácido L-glutâmico sob condições que induzam a produção do ácido L- glutâmico, tal como a condição restrita à biotina, a condição de tensoativo adicionado e a condição de penicilina adicionada (daqui em diante referida como "condições de produção do ácido L-glutâmico" por conveniência). As "condições de produção do ácido L-glutâmico" significam condições que uma substância que induz a produção de ácido L-glutâmico é adicionada a um meio que contém uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, sais inorgânicos e uma quantidade de traço de nutrientes orgânicos, tais como aminoácidos e vitaminas, se necessários, e condições em que a quantidade de uma substância que iniba a produção do ácido L-glutâmico seja limitada em um meio. As substâncias que induzem a produção de ácido L-glutâmico incluem antibióticos tais como a penicilina G e tensoativos incluindo ácidos graxos saturados, tais como Tween 40, 60 ou coisa parecida. A substância que inibe a produção de ácido L-glutâmico inclui a biotina (Fermentação de Aminoácidos, Japan Scientific Societies Press 1986).

Aqui, a concentração das substâncias acima em um meio sob condições de produção do ácido L-glutâmico, são como segue. A concentração de biotina é menor do que 30 μg/litro, preferivelmente menor do que 20 μg/litro, mais preferível menor do que 10 μg/litro, e o meio pode não conter biotina em absoluto. A concentração de penicilina no meio não é menor do que 0,1 U/ml, preferivelmente não menor do que 0,2 U/ml, mais preferível não menor do que 0,4 U/ml. A concentração de tensoativo no meio não é menor do que 0,5 g/litro, preferivelmente não menor do que 1 g/litro, mais preferível não menor do que 2g/litro. Entretanto, qualquer concentração destas substâncias pode ser aplicada, contanto que a produção de ácido L- glutâmico seja induzida. Além disso, quando um meio contenha antibiótico e tensoativo, é preferível que o meio contenha alta concentração de biotina. Em um tal caso, é preferível que o meio contenha mais do que 50 μg/litro, preferivelmente mais do que 100 μ§/1ίΐτο, mais preferível mais do que 200 μ^ϋΐτο, de biotina.

Exemplos da cepa precursora usada na presente invenção incluem as cepas do tipo selvagem das bactérias corineformes descritas acima, ou as seguintes cepas:

Brevibacterium flavum AJl 1217 (FERM P-4318; JP57-2689A)

Corynebacterium glutamicum AJl 1218 (FERM P-4319; JP57-2689A)

Brevibacterium lactofermentum AJl 1426 (FERM P-5123; JP56-048890A)

Corynebacterium glutamicum AJl 1440 (FERM P-5137; JP56-048890A)

Brevibaeterium lactofermentum AJl 1796 (FERM P-6402; JP5 8-158192A)

A bactéria corineforme da presente invenção da presente invenção é uma bactéria corineforme que tem a capacidade de produzir o ácido L-glutâmico acima mencionado, e é modificado de modo que o gene gluX seja inativado. A bactéria corineforme da presente invenção pode ser obtida pela modificação de uma bactéria corineforme tendo capacidade de produzir ácido L-glutâmico, de modo que o gene gluX seja inativado. Na reprodução da bactéria corineforme da presente invenção, ou a comunicação da capacidade de produzir ácido L-glutâmico ou a modificação para inativar o gene gluX, podem ser realizadas primeiro.

A expressão "sendo modificado de modo que o gene gluX seja inativado" corresponde a um estado em que o número das moléculas da proteína GluX codificada pelo gene gluX por célula é reduzido em comparação com aquele da cepa precursora ou de uma cepa tipo selvagem, um estado em que a atividade da proteína GluX por molécula seja reduzida, um estado em que a molécula da proteína GluX não mais seja em absoluto produzida, e assim por diante. Por exemplo, a expressão significa que a quantidade da proteína codificada pelo gene gluX é reduzida em comparação com aquela de uma cepa não modificada ou uma cepa selvagem, que a quantidade de expressão do gene gluX é reduzida, que a conformação tridimensional da proteína é modificada, e assim a proteína GluX normal não possa ser produzida, ou que a proteína GluX que pode ser produzida pela cepa do tipo selvagem ou cepa não modificada da bactéria corineforme não possa ser produzida em absoluto. A bactéria corineforme do tipo selvagem usada como a referência para a comparação, é, por exemplo, Corynebacterium glutamicwn (.Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869 ou ATCC 13032.

A redução da quantidade de expressão do gene gluX pode ser confirmada comparando-se a quantidade de mRNAdog/ztY com aquela de uma cepa do tipo selvagem ou não modificada. Exemplos do método para confirmar a quantidade de expressão incluem a hibridização de Northern e RT-PCR [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA) 2001]. 0 grau de redução da quantidade de expressão não é particularmente limitado contanto que ele seja reduzido em comparação com aquele de uma cepa do tipo selvagem ou cepa não modificada. Entretanto, ele é desejavelmente reduzido, por exemplo, em pelo menos 75 %, 50 %, 25 % ou 10 % ou menos, em comparação com uma cepa selvagem ou cepa não modificada, ou a expressão pode ser completamente eliminada.

A redução da quantidade da proteína codificada pelo gene gluX pode ser confirmada por detecção com base em Western blotting usando anticorpos [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA) 2001]. 0 grau de redução da quantidade de produção não é particularmente limitado contanto que ele seja reduzido em comparação com aquele de uma cepa selvagem ou cepa não modificada. Entretanto, ele é desejavelmente reduzido, por exemplo, em pelo menos 75 %, 50 %, 25 % ou .10 % ou menos, em comparação com uma cepa selvagem ou cepa não modificada, ou a atividade pode ser completamente eliminada, o que significa que a proteína não é produzida em absoluto.

A proteína referida na presente invenção codificada pelo gene gluX (proteína GluX) é uma proteína tendo uma função de melhorar a quantidade de produção do ácido L-glutâmico através da inativação do gene gluX em um cromossoma. Aqui, os exemplos da proteína GluX das bactérias corineformes incluem a proteína (SEQ ID NO: 17) codificada pelo gene gluX de Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869 ou Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. (números dos nucleotídeos 1001 a 1279 da SEQ ID NO: 16). O gene gluX de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 é codificado pelos nucleotídeos 2475838 a 2476119 na seqüência de genomas registrada como Acesso do Genbank n~ NC_003450, e é registrada como NCG12252. Além disso, tendo em vista que a seqüência de nucleotídeos do gene gluX pode diferir dependendo da espécie ou das cepas das bactérias corineformes, o gene gluK pode ser uma variante da seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos números 1001 a 1279 da SEQ ID NO: 16. As variantes do gene gluX podem ser pesquisadas com referência à seqüência da seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos números 1001 a 1279 da SEQ ID NO: 16 usando BLAST ou coisa parecida (http://blast.genoma.jp/). Além disso, as variantes do gene gluX incluem os homólogos do gene gluX,, por exemplo os genes que podem ser amplificados por PCR usando um cromossoma de uma bactéria corineforme como um gabarito e oligonucleotídeos sintéticos das SEQ ID NOS: 13 e 14.

Exemplos da proteína GluX incluem aqueles tendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17. Entretanto, tendo em vista que os códons usados podem diferir dependendo das espécies ou das cepas das bactérias corineformes, e que a seqüência de nucleotídeos do gene codificando GluX podem diferir, gluX pode codificar tais seqüências de aminoácidos como descrito acima, incluindo substituição, deleção, inserção ou adição de um ou vários resíduos de aminoácidos, contando que a função da proteína GluX não mude. Aqui, o número denotado pelo termo "vários" é, por exemplo, 2 a 20, preferivelmente 2 a 10, mais preferível 2 a 5. A substituição, deleção, inserção ou adição acima mencionada de um ou vários resíduos de aminoácidos é uma mutação conservativa que permite a produção normal da proteína GluX. As substituições conservativas incluem: substituições entre si de Phe, Trp e Tyr no caso de aminoácidos aromáticos, substituições entre si de Leu, Ile e Val no caso de aminoácidos hidrofóbicos, substituições entre si de Gln e Asn no caso de aminoácidos polares, substituições entre si de Arg, Lys e His no caso de aminoácidos básicos, substituições entre si de Asp e Glu no caso de aminoácidos acídicos, e substituições entre si de Ser e Thr no caso de aminoácidos contendo o grupo hidroxila. Mutações conservativas típicas são substituições conservativas, as quais incluem: substituição de Ala por Ser ou Thr, substituição de Arg por Gln, His ou Lys, substituição de Asn por Glu, Gln, Lys, His ou Asp, substituição de Asp por Asn, Glu ou Gln, substituição de Cys por Ser ou Ala, substituição de Gln por Asn, Glu, Lys, His5 Asp ou Arg, substituição de Glu por zGly, Asn, Gln, Lys ou Asp, substituição de Gly por Pro, substituição de His por Asn, Lys, Gln, Arg ou Tyr, substituição de Ile por Leu, Met, Val ou Phe, substituição de Leu por lie, Met, Val ou Phe, substituição de Lys por Asn, Glu, Gln, His ou Arg, substituição de Met por Ilej Leu, Val ou Phe, substituição de Phe por Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu, substituição de Ser por Thr ou Ala, substituição de Thr por Ser ou Ala, substituição de Trp por Phe ou Tyr, substituição de Tyr por His, Phe ou Trp, e substituição de Val por Met, Ile ou Leu.

Uma variante do gene gluX pode também ser um DNA que seja capaz de hibridizar com a seqüência de nucleotídeos consistindo de 1001 a 1279 da SEQ ID NO: 16, ou uma sonda que possa ser preparada da seqüência de nucleotídeos sob condições estringentes. As "condições estringentes" são condições sob as quais um assim chamado híbrido específico é formado, e um híbrido não específico não é formado. Exemplos das condições estringentes incluem aquelas sob as quais os DNAs altamente homólogos hibridizam-se entre si, por exemplo DNAs de não menos do que80, 90, 95 ou 97 % homólogos, hibridizam-se entre si, e DNAs menos homólogos do que os acima não hibridizam-se entre si, ou condições de lavagem uma vez ou preferivelmente 2 ou 3 vezes em uma concentração de sal e temperatura correspondente à lavagem de hibridização típica de Southern, isto é, 1 χ SSC, 0,1 % de SDS a 60°C, preferivelmente 0,1 χ SSC,0,1 % de SDS a 60°C, mais preferível 0,1 χ SSC, 0,1 % de SDS a 68°C. O comprimento da sonda pode ser arbitrariamente selecionado, dependendo das condições de hibridização. Entretanto, o comprimento é usualmente de 100 pares de base a 1000 pares de base.

A expressão "modificado de modo que o gene gluX seja inativado" significa que a modificação é realizada de modo que a proteína GluX não funcione normalmente. As bactérias modificadas dessa maneira podem ser obtidas por reprodução de uma bactéria em que uma mutação seja introduzida na proteína GluX com o uso de um reagente ou coisa parecida de modo que a proteína não funcione normalmente, uma bactéria em que uma mutação é introduzida no gene gluX mediante técnicas de engenharia de genes ou coisa parecida, de modo que a quantidade da proteína GluX seja reduzida, ou a bactéria não mais produza a proteína GluX, ou coisa parecida.

Isto pode ser obtido, por exemplo, suprimindo-se o gene gluX no cromossoma, ou modificando-se uma seqüência de controle da expressão, tal como um promotor, seqüência de Shine Dargarno (SD), ou coisa parecida. Além disso, a modificação pode também ser obtida pela introdução de uma substituição de aminoácido (mutação de sentido errado), um códon de parada (mutação sem sentido), ou uma mutação de deslocamento que adicione ou delete um ou dois nucleotídeos dentro de uma região codificadora, ou mediante deleção de uma porção ou do gene inteiro [Journal of biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515 (1998), Journal of Biological Chemistry 266,20833-20839(1991)].

Como a região a ser deletada, ou uma região no lado do término N ou uma região no lado do término C, podem ser deletadas, contanto que uma proteína GluX que não funcione normalmente seja produzida. Além disso, a inativação do gene gluX pode também ser obtida pela introdução de um transpóson carregando um gene de resistência a antibióticos ou um gene útil para a produção de ácido L-glutâmico dentro da região codificadora de gluX.

A introdução de tais mutações, como descrito acima, no gene gluX pode ser obtida, por exemplo, pelo preparo de um gene do tipo de deleção obtido por tal modificação, gene este que inclua a deleção de uma seqüência parcial de gluX,, e não produza a proteína GluX que funciona normalmente, e a transformação de uma bactéria corineforme com um DNA contendo o gene para causar a recombinação homóloga do gene do tipo deleção e do gene em um cromossoma, e por esse meio romper o gene gluX em um cromossoma. Tal rompimento de gene utilizando a substituição de genes com base na recombinação homóloga já foi estabelecido, e exemplos do método para isso incluem os métodos que usam um DNA linear denominado "integração Red-conduzida" desenvolvida por Datsenko e Wanner (.Proc. Natl Acad. Sei. USA, 2000, VoL 97, n- 12, pp. 6640-6645), ou métodos usando um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensível à temperatura (Patente U.S. n° 6.303.383, Patente Japonesa Aberta ao Público n- 05-007491) e assim por diante. Além disso, tal rompimento de gene com base na substituição de genes utilizando recombinação homóloga como descrito acima, também pode ser realizado com o uso de um plasmídeo que não apresente uma capacidade de replicação em um hospedeiro, ou um plasmídeo que seja capaz de transferência conjugativa para bactérias corineformes.

Exemplos do plasmídéo sensível à temperatura para bactéria corineforme incluem p48K e pSFKT2 (ver a Patente Japonesa Aberta ao Público n- 2000-262288 para estes), pHSC4 (ver a Patente Francesa Aberta ao Público n- 2667875, 1992, e a Patente Japonesa Aberta ao Público n° 5-7491) e assim por diante. Estes plasmídeos podem autonomamente replicar em 25°C pelo menos, mas não podem autonomamente replicar em 37°C nas bactérias corineformes. O Escherichia coli AJ12571 abrigando pHSC4 foi depositado no National Institute of Bioscience and Human-Technology, a Agency of Industrial Science and Technology, o Ministry of International Trade and Industry [correntemente, a corporação administrativa independente, o National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1- Chrome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, Código postal: 305-5466)] em 11 de outubro de 1990, recebendo o número de acesso de FERM P-11763. Depois, o depósito foi transformado em um depósito internacional sob as diretrizes do Tratado de Budapeste em 26 de agosto de 1991, recebendo um número de acesso de FERM BP-3524.

Como o plasmídeo que não replica nas bactérias corineformes, um plasmídeo que seja replicável em Escheriehia coli é preferido, e exemplos incluem pHSG299 (Takara Bio Inc.), pHSG399 (Takara Bio Inc.) e assim por diante. Exemplos do plasmídeo capaz de transferência conjugativa incluem pK19mobsacB [J. Baeteriologyi 174: 5462-5465 (1992)]. Exemplos do gene tipo deleção modificado de modo que não produza a proteína GluX incluem o gene que inclui a deleção da região inteira ou parcial da SEQ ID NO: 16, o gene introduzido com uma mutação de sentido errado, o gene introduzido com um transpóson ou um gene marcador, o gene introduzido com uma mutação sem sentido, e o gene introduzido com uma mutação de deslocamento, mas os exemplos não se limitam a estes.

A inativação do gene gluX pode ser realizada pelos seguintes métodos. O gene do tipo deleção do gene gluX pode ser obtido pelos seguintes métodos. O gene gluX pode ser obtido pelo preparo de um DNA cromossômico de uma bactéria corineforme pelo método de Saito e Miura [referir-se a H. Saito e K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963); Textfor Bioengineering Experimentsi Editado pela Society for Bioscience and Bioengineering, Japão, pp. 97-98, Baifukan, 1992), e realizando-se a Pcr com ele usando oligonucleotídeos construídos com base nas seqüências de bancos de dados conhecidos, tais como o Genbank, e o gene pode ser clonado usando-se oligonucleotídeos sintéticos das SEQ ID NOS: 13 e 14. O gene do tipo deleção pode ser obtido pela amplifícação do comprimento completo do gene gluX por PCR, e digerindo-se o produto de PCR com uma enzima de restrição que clive um sítio interno, ou pela amplifícação de uma parte da região codificadora do gene gluX por PCR.

Depois, o gene do tipo deleção é introduzido em um plasmídeo que é sensível à temperatura nas bactérias corineformes, ou um plasmídeo que não possa replicar-se nas bactérias corineformes, e uma bactéria corineforme seja transformada com o plasmídeo recombinante. A transformação pode ser realizada de acordo com um método que tenha sido relatado até hoje. Exemplos do método de transformação incluem tratar células receptoras com cloreto de cálcio de modo a aumentar a permeabilidade quanto ao DNAj o que foi relatado quanto ao Escherichia eoli K-12 [Mandei, M. e Higa, A., J. Mol Biol, 53, 159 (1970)], e preparar células competentes das células que estejam na fase de crescimento, seguido pela transformação com DNA, o que foi relatado quanto ao Bacillus subtilis [(Duncans C. H., Wilson, G. A. e Young, F. E., Gene, 1, 153 (1977)]. Alternativamente, a introdução de um DNA recombinante nas células receptoras, o que foi relatado como sendo aplicável aos Bacillus subtilis, aetinomyeetes, e leveduras [Chang, S. e Choen, S. N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, Μ. J., Ward, J. Μ. e Hopwood, O. A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J. B. e Fink, G. R., Proc. Natl Sei, USA, 75, 1929 (1978)], pode ser empregada. Além disso, a transformação das bactérias corineformes pode também ser realizada pelo método do pulso elétrico (JP2-207791 A). Quando a transformação é realizada com um plasmídeo que não replique nas bactérias corineformes, o gene gluX no plasmídeo e o gene gluX em um cromossoma são recombinados no transformante obtido como descrito acima. Quando um plasmídeo sensível à temperatura é usado, o transformante é cultivado em uma temperatura em que a origem de replicação sensível à temperatura não funciona (25°C) para se obter uma cepa introduzida com o plasmídeo. A cepa introduzida com o plasmídeo é cultivada em uma alta temperatura para eliminar o plasmídeo sensível à temperatura, e esta cepa é aplicada a uma placa contendo um antibiótico. Tendo em vista que o plasmídeo sensível à temperatura não pode proliferar na alta temperatura, a cepa da qual o plasmídeo é eliminado não pode crescer sobre a placa contendo um antibiótico, mas uma cepa em que o gene gluX no plasmídeo e o gene gluXçm um cromossoma são recombinados aparece, embora ela apareça em uma freqüência extremamente baixa.

Na cepa introduzida com o DNA recombinante em um cromossoma conforme descrito acima, a recombinação com a seqüência de genes gluX originalmente existente no cromossoma é produzida, e assim dois dos genes de fusão do gene gluX cromossômico e do gene gluX do tipo deleçao, e a outra porção do DNA recombinante (porção de vetor, origem de replicação sensível à temperatura, e marcador de resistência ao medicamento) entre os genes de fusão, são introduzidos no cromossoma.

Depois, de modo a deixar apenas o gene gluX do tipo deleção no DNA cromossômico, o gene gluXé eliminado junto com a porção de vetor (incluindo a origem de replicação sensível à temperatura e o marcador de resistência ao medicamento) do DNA cromossômico. Neste caso, o gene gluX normal é deixado no DNA cromossômico, e o gene gluX do tipo deleção é excisado, ou, ao contrário, o gene gluX do tipo deleção é deixado no DNA cromossômico, e o gene gluX normal é excisado. Mediante a seleção de uma cepa em que o gene gluX do tipo deleção é deixado no cromossoma por PCR ou hibridização de Southern, uma cepa em que o gene g/wXseja rompido pode ser obtida.

Além disso, o gene gluX codificando a levansacarase, que fatalmente funciona nas bactérias corineformes, pode também ser usado como um marcador da recombinaçao homóloga [Schafer, A. et ai., Gene, 145, pp. 69-73 (1994)]. Isto é, se a levansacarase for expressa nas bactérias corineformes, a levan produzida por assimilação da sacarose fatalmente funciona, e portanto elas não podem crescer. Portanto, se uma cepa em que um vetor codificando a levansacarase permanece em um cromossoma for cultivada sobre uma placa contendo sacarose, a cepa não pode crescer e, assim, apenas uma cepa em que o vetor seja eliminado pode ser selecionada sobre uma placa contendo sacarose.

Como o gene sacB ou seu gene homólogo, as seguintes seqüências podem ser usadas.

Bacillus subtilis: sacB Número de Acesso do GenBank X02730 (SEQID NO: 7)

Bacillus amyloliquefaeiens: sacB Número de Acesso do GenBank X52988

Zymomonas mobilis: sacB Número de Acesso do GenBank

L33402

Bacillus stearothermophilus: surB Número de Acesso do GenBank U34874

Lactobacillus sanfransiseensis: frfA Número de Acesso do GenBank AJ508391

Aeetobaeter xylinus: IsxA Número de Acesso do GenBank ΑΒ034152

Gluconacetobacter diazotrophicus: IsdA Número de Acesso do GenBank L41732

A inativação do gluX também pode ser obtida, além da deleção acima mencionada do gene codificando gluX em um cromossoma, pela introdução de uma mutação que inative gluX pela modificação de uma seqüência de controle da expressão, tal como promotor, seqüência de Shine- Dalgarno (SD), operador, terminador e atenuador, ou coisa parecida. Uma seqüência de controle da expressão em um cromossoma pode ser confirmada com o uso do programa de análise de genes tal como o Genetics, ou um vetor para análise de expressão tal como um vetor de sonda promotora, ou à base de informação conhecida, tal como aquela obtida do Genbank ou coisa parecida. A mutação que inativa gluX é, por exemplo, uma mutação que substitui a região promotora de gluX por um promotor mais fraco, ou uma mutação que torne o promotor fora de uma seqüência de consenso. A introdução destas mutações pode ser obtida com o uso de um plasmídeo sensível à temperatura ou um plasmídeo que não tenha capacidade de replicação como no caso acima mencionado.

Além dos métodos de manipulação de genes mencionados acima, os exemplos do método para inativar gluX incluem, por exemplo, tratar uma bactéria corineforme com irradiação ultravioleta ou um mutágeno usado para mutagênese usual tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) ou ácido nitroso, e selecionar uma cepa em que o gluX seja inativado. Além disso, o gene gluX inativado pode também ser obtido pela introdução artificial de uma mutação no gluX por recombinação de genes com base em PCR propenso a erro, embaralhamento de DNA ou StEP-PCR (Firth, A. E., Patrick, W. M., Bioinformatics, 2 de junho de 2005, Statistics of protein Iibrary eonstruction)

<3> Produção de ácido L-glutâmico usando a bactéria corineforme da presente invenção

O ácido L-glutâmico pode ser eficientemente produzido pelo cultivo de uma bactéria corineforme obtida como descrito acima em um meio para produzir e acumular o ácido L-glutâmico no meio e coletar o ácido L- glutâmico do meio.

De modo a produzir o ácido L-glutâmico com o uso da bactéria corineforme da presente invenção, a cultura pode ser realizada por um método convencional usando-se um meio comum que contenha uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, um sal inorgânico e, opcionalmente, micronutrientes orgânicos tais como aminoácidos e vitaminas. Ou um meio sintético ou um meio natural podem ser usados. Quaisquer espécies de fontes de carbono e de nitrogênio podem ser usadas, contanto que elas possam ser utilizadas pela cepa sendo cultivada.

Sacarídeos tais como a glicose, glicerol, frutose, sacarose, maltose, manose, galactose, hidrolisado de amido, melados, e assim por diante, podem ser usados como a fonte de carbono. Além disso, ácidos orgânicos tais como o ácido acético e o ácido cítrico, e álcoois tais como o etanol, podem também ser usados sozinhos ou em combinação com outras fontes de carbono.

Amônia, sais de amônio tais como o sulfato de amônio, carbonato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio e acetato de amônio, nitratos, e assim por diante, podem ser usados como a fonte de nitrogênio.

Aminoácidos, vitaminas, ácidos graxos, ácidos nucléico, e peptona, casaminoácido, extrato de levedura, e produtos da decomposição da proteína de soja que contêm estas substâncias, podem ser usados como os micronutrientes orgânicos. Quando uma cepa mutante auxotrófica que requeira um aminoácido etc. para o crescimento é usada, um tal nutriente necessário é de preferência adicionado. Fosfatos, sais de magnésio, sais de cálcio, sais de ferro, sais de manganês, e assim por diante, podem ser usados como sais inorgânicos. O cultivo aeróbico é realizado pelo controle da temperatura de fermentação em 20 a 45°C, e ajuste do pH do meio de cultura em 5 a 9.

Quando o pH decresce durante a cultura, o meio é neutralizado pela adição de álcali, tal como carbonato de cálcio ou amônia gasosa. A cultura por cerca de 10 a cerca de 120 horas resulta em acúmulo de uma quantidade marcante de ácido L-glutâmico no meio, a qual é produzida através de uma via da biossíntese que utilize o ácido pirúvico como um intermediário.

Quando a bactéria corineforme usada para a presente invenção seja uma bactéria corineforme que produza o ácido L-glutâmico sob uma condição que induza a produção de ácido L-glutâmico, tal como a condição restrita à biotina, a condição de adição de tensoativo e a condição de adição de penicilina, o meio é preferivelmente ajustado para ficar sob qualquer de tais condições de produção de ácido L-glutâmico. Nisto, a concentração das substâncias acima em um meio é como segue. A concentração da biotina é de menos do que 30 μg/litro, preferivelmente menos do que 20 μg/litro, mais preferível menos do que 10 μg/litro, e o meio pode não conter biotina em absoluto. A concentração de penicilina no meio é de não menos do que 0,1 U/ml, preferivelmente de não menos do que 0,2 U/ml, e o mais preferível de não menos do que 0,4 U/ml. A concentração de tensoativos no meio é de não menos do que 0,5 g/litro, preferivelmente de não menos do que 1 g/litro, e o mais preferível de não menos do que 2 g/litro. Entretanto, qualquer concentração destas substâncias pode ser aplicada, contanto que a produção do ácido L-glutâmico seja induzida. Quanto antibiótico ou tensoativo é adicionado ao meio, é preferível que o meio contenha suficiente quantidade de biotina. Em um tal caso, é preferível que o meio contenha mais do que 50 μg/litro, preferivelmente mais do que 100 μg/litro, e o mais preferível mais do que 200 μg/litro, de biotina.

Além disso, a cultura também pode ser realizada com a precipitação do ácido L-glutâmico no meio, com o uso de um meio líquido ajustado para ficar sob uma condição tal em que o ácido L-glutâmico seja precipitado no meio. Exemplos da condição sob a qual o ácido L-glutâmico se precipita incluem o pH 5,0 a 4,0, preferivelmente pH 4,5 a 4,0, mais preferível pH 4,3 a 4,0, particularmente preferível pH 4,0.

O ácido L-glutâmico pode ser coletado do meio após a cultura mediante um método conhecido. Por exemplo, a coleta é obtida pela remoção das células do meio, e induzindo-se a cristalização mediante a concentração, a cromatografia de troca de íons, ou coisa parecida. Quando a cultura é realizada sob uma condição sob a qual o ácido L-glutâmico se precipita, o ácido L-glutâmico precipitado no meio pode ser coletado por centrifiigação ou filtração. Neste caso, o ácido L-glutâmico dissolvendo-se no meio pode ser precipitado e depois separados entre si. EXEMPLOS

Daqui em diante, a presente invenção será especificamente explanada com referência aos seguintes Exemplos. Entretanto, a presente invenção não fica limitada aos Exemplos. EXEMPLO 1

CONSTRUÇÃO DE UM VETOR PARAROMPER O GENE sacB (A) CONSTRUÇÃO DO pBS3

O gene sacB (SEQ ID NO: 7) foi obtido por PCR com o uso do DNA cromossômico de Bacillus subtilis como um gabarito, e os oligonucleotídeos das SEQ ID NOS: 1 e 2 como iniciadores. A PCR foi realizada com o uso de LA Taq (TaKaRa) com incubação a 94°C por 5 minutos e um ciclo de desnaturação em 94°C por 30 segundos, recozendo-se a49°C por 30 segundos e extensão em 72°C por 2 minutos, o que foi repetido25 vezes. O produto de PCR foi purificado em uma forma convencional, e depois embotado na extremidade mediante digestão com Bgill e BamHl. Este fragmento foi introduzido no pHSG299 que havia sido clivado com Avall e extremidade embotada. Usando-se este DNAj células competentes de Escherichia coli JMl 09 (Takara Bio Inc.) foram transformadas, e as células foram aplicadas ao meio LB contendo 25 μg/ml de canamicina (daqui em diante abreviada Km), e cultivadas durante a noite. Depois, as colônias que apareceram foram coletadas, e as colônias isoladas individuais foram separadas para se obter transformantes. Os plasmídeos foram extraídos dos transformantes, e um plasmídeo em que o produto da PCR objetiva foi introduzido foi designado pBS3. O esquema de construção do pBS3 é mostrado na Figura 1. (B) CONSTRUÇÃODO pBS4S

Uma vez um sítio de reconhecimento da enzima de restrição Smal esteja contido no gene de resistência à canamicina presente no pBS3, um plasmídeo carregando um gene de resistência à canamicina do qual o sítio Smal foi rompido por substituição de nucleotídeo não causando substituição de aminoácidos, foi obtido por PCR de cruzamento. Primeiro, a PCR é realizada com o uso de pBS3 como um gabarito e dos DNAs sintéticos das SEQ ID NOS: 3e 4 como iniciadores para se obter um produto de amplificação da seqüência do lado do término N do gene de resistência à canamicina. Além disso, de modo a se obter um produto de amplificação da seqüência do lado do término C do gene de resistência à Km5 a PCR foi realizada com o uso de pBS3 como um gabarito e dos DNAs sintéticos das SEQ ID NOS: 5 e 6 como iniciadores. O produto de PCR objetiva pôde ser obtido pela realização da PCR usando-se Pyrobest DNA Polymerase (Takara Bio Inc.) com incubação a 98°C por 5 minutos, e um ciclo de desnaturação em 98°C por 10 segundos, recozendo-se a 57°C por 30 segundos, e extensão em 12°C por 1 minuto, o que foi repetido por 25 vezes. As seqüências das SEQ ID NOS: 4 e 5 são parcialmente complementares entre si, e o sítio de Smal que havia sido ocorrido nestas seqüências foi rompido por substituição de nucleotídeos, não causando a substituição de aminoácidos. Depois, de modo a obter-se um fragmento de gene mutante de resistência à canamicina, em que o sítio de Smal havia sido rompido, os produtos de genes acima mencionados das seqüências do gene de resistência à canamicina foram misturados em moles substancialmente equivalentes, e a PCR foi realizada com o uso desta mistura como um gabarito e os DNAs sintéticos das SEQ ID NOS: 3 e 6 como iniciadores para se obter um produto de amplificação do gene de resistência à Km introduzidos com uma mutação. O produto de PCR pôde ser obtido pela realização da PCR com o uso de Pyrobest DNA Polymerase (Takara Bio Inc.) com incubação em 98°C por 5 minutos e um ciclo de desnaturação em 98°C por 10 segundos, recozendo-se a 57°C por 30 segundos, e extensão em 72°C por 1,5 minuto, o que foi repetido por 25 vezes.

O produto da PCR foi purificado de uma maneira convencional, depois digerido com Banll, e introduzido no sítio de Banll de pBS3 acima descrito. Células competentes de Escherichia coli JMl09 (Takara Bio Inc.) foram transformadas com o DNA obtido, e as células foram aplicadas no meio LB contendo 25 μg/ml de canamicina e cultivadas durante a noite. Depois, as colônias isoladas foram separadas das colônias desenvolvidas para se obter os transformantes. Os plasmídeos foram extraídos dos transformantes obtidos, e um plasmídeo em que o produto da PCR objetiva havia sido introduzido foi designado pBS4S. O esquema de construção do pBS4S é apresentado na Figura 2.

EXEMPLO 2

PREPARAÇÃO DA CEPA DEFICIENTE DE gluX DE C. glutamicum ATCC 13869

Um plasmídeo para deletar o gene gluX foi preparado. Um cromossoma foi extraído de C. glutamicum ATCC 13869 usando-se O Kit Bacterial Genomic DNA Purif. (MS Techno Systems), e a PCR foi realizada com o uso deste cromossoma como um gabarito e uma combinação dos iniciadores das SEQ ID NOS: 9 e 10, e uma combinação dos iniciadores das SEQ ID NOS: 11 e 12 para amplificar fragmentos de cerca de 650 pares de base, respectivamente. A PCR foi realizada usando-se Ex Taq (Takara Bio Inc.) com um ciclo de desnaturação em 94°C por 30 segundos, recozendo-se a55°C por 10 segundos, e extensão em 72°C por 1 minuto, o que foi repetido por 25 vezes. Os iniciadores das SEQ ID NOS: 9el0 foram projetados para amplificar a região dos nucleotídeos números 401 a 1040 da SEQ ID NO: 16, e os iniciadores das SEQ ID NOS:l 1 e 12 foram projetados para amplificar a região dos nucleotídeos 1241 a 1920 da SEQ ID NO: 16. Depois, a PCR foi realizada com o uso de uma solução preparada pela mistura destes dois fragmentos como gabaritos, e os iniciadores das SEQ ID NOS: 13 e 14 para amplificar um fragmento de cerca de 1,3 kb. A PCR foi realizada com o uso de Ex Taq (Takara Bio Inc.) com um ciclo de desnaturação em 94°C por 30 segundos, recozendo-se a 55°C por 10 segundos, e extensão em 72°C por 1,5 minuto, o que foi repetido por 25 vezes. Os iniciadores das SEQ ID NOS: 13 e 14 foram projetados para adicionar uma seqüência de BamHl na extremidade 5', e amplificar a região dos nucleotídeos números 441 a 1870 da SEQ ID NO: 16 (incluindo deleção da região dos nucleotídeos números 1041 a 1240). O fragmento amplificado foi completamente digerido comifo/wHI, e ligado ao vetor pBS4S descrito no Exemplo 1, o qual havia sido de forma semelhante completamente digerido com BamEl [O Kit de Ligação Ver. 2 (Takara Bio Inc.) foi usado] para construir um vetor para rompimento de gluX, pBSGXD. O esquema de construção é apresentado na Figura 3.

O pBSGXD foi introduzido no C glutamicum ATCC 13869 pelo método do pulso elétrico (Patente Japonesa Aberta ao Público n° 2-207791), e as células foram aplicadas ao meio de ágar CM-Dex (5 g/litro de glicosa, 10 g/litro de polipeptona, 10 g/litro de extrato de levedura, 1 g/litro de KH2PO4, 0,4 g/litro de MgS04-7H20, 0,01 g/litro de FeS04-7H20, 0,01 g/litro de MnS04-4-5H20, 3 g/litro de uréia, 1,2 g/litrode hidrolisado protéico de feijão-soja, 20 g/litro de ágar, ajustado a pH 7,5 com NaOH) contendo 25μg/ml de canamicina. A cultura foi realizada em 31,5°C, e depois foi confirmado por PCR que a cepa desenvolvida era uma cepa recombinante de uma vez em que pBSGXD havia sido incorporado no cromossoma por recombinação homóloga. O fato de a cepa candidata ter sido uma cepa recombinante de uma vez pode ser facilmente confirmado pela realização de PCR com o uso de um cromossoma da cepa como um gabarito, uma seqüência específica em pBS4S (SEQ ID NO: 15) e uma seqüência no cromossoma (SEQ ID NO: 9) como iniciadores. Uma vez a seqüência de pBS4S não esteja presente no cromossoma de uma cepa não recombinante, qualquer fragmento amplificado por PCR não aparece para a cepa não recombinante, e portanto a diferenciação se torna possível.

A cepa recombinante de uma vez obtida foi cultivada em 31,5°C por um dia inteiro no meio líquido CM-Dex contendo 25 μg/ml de canamicina, e este meio foi a apropriadamente diluído, e aplicado a placas SD10 (tendo uma composição do meio CM-Dex mencionado acima, no qual 5 g/litro de glicose tenha sido substituídos por 100 g/litro de sacarose). Várias cepas cultivadas sobre as placas SlO e apresentando sensibilidade à canamicina, foram selecionadas, e a PCR foi realizada usando-se os cromossomas destas cepas como um gabarito e as seqüências de SEQ ID NOS: 13 e 14 como iniciadores para confirmar que uma cepa entre elas era uma cepa objetiva deficiente de gluX. Tendo em vista que a região dos nucleotídeos números 1041 a 1240 é deletada na cepa deficiente, o fragmento amplificado fica mais curto do que aquele da cepa não deficiente e, portanto, a diferenciação se torna possível. A cepa deficiente obtida como descrito foi designada ATCC 13869 AgluX. EXEMPLO 3 MEDIÇÃO DA QUANTIDADE DE PRODUÇÃO DO ACIDO GLUTÂMICO DA CEPA ATCC13869AgluX

A capacidade de produção do ácido glutâmico da cepa ATCC13869AgluX foi examinada realizando-se a cultura com o uso de um frasco de Sakaguchi. As cepas ATCC 13869 e ATCC13869AgluX foram cultivadas em 31,5°C no meio de ágar CM-2B (10 g/litro de polipeptona, 5 g/litro de extrato de levedura, 5 g/litro de NaCl, 10 μ/litro de biotina, 20 g/litro de ágar, ajustado a pH 7,0 com KOH) por um dia inteiro, e inoculado em 20 ml de um meio de cultura de semente (50 g/litro de glicose, 30 g/litro de sulfato de amônio, 1 g/litro de KH2PO4, 0,4 g/litro de MgS04-7H20, 0,01 g/litro de FeS04-7H20, 0,01 g/litro de MnS04-4-5H20, 200 μ^Ιϋτο de vitamina BI, 0,48 g/litro de hidrolisado de proteína de soja, 300 μg/litro de biotina, ajustado a pH 8,0 com KOH). Um grama do carbonato de cálcio que havia sido submetido a esterilização térmica seca de antemão, foi adicionado ao meio, e depois a cultura foi realizada em 31,5°C com agitação em uma velocidade de 115 rpm. Depois, confirmou-se que o açúcar total foi completamente consumido, 1 ml do meio de cultura de semente foi inoculado em 20 ml de um meio de cultura principal (50 g/litro de glicose, 30 g/litro de sulfato de amônio, 1 g/litro de KH2PO4, 0,4 g/litro de MgS04-7H20, 0,01 g/litro de FeS04-7H20, 0,01 g/litro de MnS04-4-5H20, 200 μg/litro de vitamina BI, 0,48 g/litro de hidrolisado de proteína de soja, 300 μg/litro de biotina, ajustado a pH 8,0 com KOH), seguido pela adição de 1 g de carbonato de cálcio que havia sido submetido a esterilização térmica seca de antemão, e depois a cultura foi realizada em 31,5°C com agitação em uma velocidade de 115 rpm. Após 2,5 horas do início da cultura, 4 g/litro de Tween 40 (Sigma) foram acrescentados. As quantidades de células (a absorção foi medida em 620 nm), as quantidades acumuladas de ácido glutâmico, e as quantidades remanescentes do sacarídeo após 17,5 horas, são apresentadas na Tabela 1. Foi confirmado que o acúmulo de ácido glutâmico pela cepa ATCC13869AgluX aumentou em comparação com aquele da ATCC13869, e assim foi confirmado que a deleção do gene gluK foi eficaz quanto ao melhoramento na produção do ácido glutâmico.

TABELA 1 <table>table see original document page 31</column></row><table>

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

De acordo com a presente invenção, a levedura de fermentação do ácido L-glutâmico pode ser aumentada em um método para produzir ácido L-glutâmico mediante fermentação, com o uso de uma bactéria corineforme. Além disso, a presente invenção pode ser usada para reprodução das bactérias produtoras de ácido L-glutâmico. LISTAGEM DAS SEQÜÊNCIAS

<110> Ajinomoto Co., Inc.

<120> Bactéria produtora de ácido L-glutâmico e método para a produção de ácido L-glutâmico

<130> C58 4-C7324

<150> JP2005-245213 <151> 2005-08-26

<160> 17

<170> PatentIn versão 3.1

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador sacB 1

<400> 1

cgggatcctt tttaacccat caca 24

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador sacB 2

<4 00> 2

gaagatcttc aaaaggttag gaatacggt 29

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador sacB 3

<400> 3

ccttttgaag atcgaccagt tgg 23

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador sacB 4

<400> 4

tacctggaat gctgttttcc cagggatcgc agtggtgagt aacc

44 <210> 5

<2ll> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador sacB 5

<400> 5

cctgggaaaa cagcattcca ggtattag 28

<210> β <211> 23 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> Iniciador sacB β < 4 0 0 > 6

tgcaggtcga ctctagagga tcc 23

<210> 7

<211> 2014

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<221> CDS

<222> (464 ) .. (1885)

<223> sacB

<400> 7

gatccttttt aacccatcac atatacctgc cgttcactat tatttagtga aatgagatat 60

tatgatattt tctgaattgt gattaaaaag gcaactttat gcccatgcaa cagaaactat 120 aaaaaataca gagaatgaaa agaaacagat agatttttta gttctttagg cccgtagtct 180 gcaaatcctt ttatgatttt ctatcaaaca aaagaggaaa atagaccagt tgcaatccaa 24 0 acgagagtct aatagaatga ggtcgaaaag taaatcgcgc gggtttgtta ctgataaagc 300 aggcaagacc taaaatgtgt aaagggcaaa gtgtatactt tggcgtcacc ccttacatat 360 tttaggtctt tttttattgt gcgtaactaa cttgccatct tcaaacagga gggctggaag 420 aagcagaccg ctaacacagt acataaaaaa ggagacatga acg atg aac atcaaa 475

Met Asn Ile Lys 1

aag ttt gca aaa caa gca aca gta tta acc ttt act acc gca ctg ctg 523

Lys Phe Ala Lys Gln Ala Thr Val Leu Thr Phe Thr Thr Ala Leu Leu 5 10 15 20

gca gga ggc gca act caa gcg ttt gcg aaa gaa acg aac caa aag cca 571

Ala Gly Gly Ala Thr Gln Ala Phe Ala Lys Glu Thr Asn Gln Lys Pro

25 30 35

tat aag gaa aca tac ggc att tcc cat att aca cgc cat gat atg ctg 619

Tyr Lys Glu Thr Tyr Gly Ile Ser His Ile Thr Arg His Asp Met Leu

40 45 50

caa ate cct gaa cag caa aaa aat gaa aaa tat caa gtt cct gaa ttc 667

Gln Ile Pro Glu Gln Gln Lys Asn Glu Lys Tyr Gln Val Pro Glu Phe

55 60 65

gat tcg tcc aca att aaa aat ate tet tet gca aaa ggc ctg gac gtt 715

Asp Ser Ser Thr Ile Lys Asn Ile Ser Ser Ala Lys Gly Leu Asp Val

70 75 80

tgg gac age tgg cca tta caa aac gct gac ggc act gtc gca aac tat 763 Trp Asp Ser Trp Pro Leu Gln Asn Ala Asp Gly Thr Val Ala Asn Tyr 85 90 95 100

cac ggc tac cac ate gtc ttt gea tta gcc gga gat cct aaa aat gcg 811

His Gly Tyr His Ile Val Phe Ala Leu Ala Gly Asp Pro Lys Asn Ala

105 110 115

gat gac aca tcg att tac atg ttc tat caa aaa gtc ggc gaa act tet 859

Asp Asp Thr Ser Ile Tyr Met Phe Tyr Gln Lys Val Gly Glu Thr Ser

120 125 130

att gac age tgg aaa aac gct ggc cgc gtc ttt aaa gac age gac aaa 907

Ile Asp Ser Trp Lys Asn Ala Gly Arg Val Phe Lys Asp Ser Asp Lys

135 140 145

ttc gat gea aat gat tet ate cta aaa gac caa aca caa gaa tgg tca 955

Phe Asp Ala Asn Asp Ser Ile Leu Lys Asp Gln Thr Gln Glu Trp Ser

150 155 160

ggt tca gcc aca ttt aca tet gac gga aaa ate cgt tta ttc tac act 1003

Gly Ser Ala Thr Phe Thr Ser Asp Gly Lys Ile Arg Leu Phe Tyr Thr 165 170 175 180

gat ttc tcc ggt aaa cat tac ggc aaa caa aca ctg aca act gea caa 1051

Asp Phe Ser Gly Lys His Tyr Gly Lys Gln Thr Leu Thr Thr Ala Gln

185 190 195

gtt aac gta tca gea tca gac age tet ttg aac ate aac ggt gta gag 1099

Val Asn Val Ser Ala Ser Asp Ser Ser Leu Asn Ile Asn Gly Val Glu

200 205 210

gat tat aaa tca ate ttt gac ggt gac gga aaa acg tat caa aat gta 1147

Asp Tyr Lys Ser Ile Phe Asp Gly Asp Gly Lys Thr Tyr Gln Asn Val

215 220 225

cag cag ttc ate gat gaa ggc aac tac age tca ggc gac aac cat acg 1195

Gln Gln Phe Ile Asp Glu Gly Asn Tyr Ser Ser Gly Asp Asn His Thr

230 235 240

ctg aga gat cct cac tac gta gaa gat aaa ggc cac aaa tac tta gta 1243

Leu Arg Asp Pro His Tyr Val Glu Asp Lys Gly His Lys Tyr Leu Val 245 250 255 260

ttt gaa gea aac act gga act gaa gat ggc tac caa ggc gaa gaa tet 1291

Phe Glu Ala Asn Thr Gly Thr Glu Asp Gly Tyr Gln Gly Glu Glu Ser

265 270 275

tta ttt aac aaa gea tac tat ggc aaa age aca tca ttc ttc cgt caa 1339

Leu Phe Asn Lys Ala Tyr Tyr Gly Lys Ser Thr Ser Phe Phe Arg Gln

280 285 290

gaa agt caa aaa ctt ctg caa age gat aaa aaa cgc acg gct gag tta 1387

Glu Ser Gln Lys Leu Leu Gln Ser Asp Lys Lys Arg Thr Ala Glu Leu

295 300 305

gea aac ggc gct ctc ggt atg att gag cta aac gat gat tac aca ctg 1435

Ala Asn Gly Ala Leu Gly Met Ile Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Thr Leu

310 315 320

aaa aaa gtg atg aaa ccg ctg att gea tet aac aca gta aca gat gaa 1483

Lys Lys Val Met Lys Pro Leu Ile Ala Ser Asn Thr Val Thr Asp Glu 325 330 335 340

att gaa cgc gcg aac gtc ttt aaa atg aac ggc aaa tgg tac ctg ttc 1531

Ile Glu Arg Ala Asn Val Phe Lys Met Asn Gly Lys Trp Tyr Leu Phe

345 350 355

act gac tcc cgc gga tca aaa atg acg att gac ggc att acg tet aac 1579

Thr Asp Ser Arg Gly Ser Lys Met Thr Ile Asp Gly Ile Thr Ser Asn

360 365 370

gat att tac atg ctt ggt tat gtt tet aat tet tta act ggc cca tac 1627 Asp Ile Tyr Met Leu Gly Tyr Val Ser Asn Ser Leu Thr Gly Pro Tyr

375 380 385

aag ccg ctg aac aaa act ggc ctt gtg tta aaa atg gat ctt gat cct 1675

Lys Pro Leu Asn Lys Thr Gly Leu Val Leu Lys Met Asp Leu Asp Pro

390 395 400

aac gat gta acc ttt act tac tca cac ttc gct gta cct caa gcg aaa 1723

Asn Asp Val Thr Phe Thr Tyr Ser His Phe Ala Val Pro Gln Ala Lys 405 410 415 420

gga aac aat gtc gtg att aca age tat atg aca aac aga gga ttc tac 1771 Gly Asn Asn Val Val Ile Thr Ser Tyr Met Thr Asn Arg Gly Phe Tyr 425 430 435 gca gac aaa caa tca acg ttt gcg cca age ttc ctg ctg aac ate aaa 1819 Ala Asp Lys Gln Ser Thr Phe Ala Pro Ser Phe Leu Leu Asn Ile Lys 440 445 450 ggc aag aaa aca tet gtt gtc aaa gac age ate ctt gaa caa gga caa 1867 Gly Lys Lys Thr Ser Val Val Lys Asp Ser Ile Leu Glu Gln Gly Gln 455 460 465 tta aca gtt aac aaa taa aaacgcaaaa gaaaatgccg atatcctatt 1915 Leu Thr Val Asn Lys 470 ggcattttct tttatttctt atcaacataa aggtgaatcc catatgaact atataaaagc 1975 aggcaaatgg ctaaccgtat tcctaacctt ttgaagatc 2014

<210> 8 <211> 473 <212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 8

Met Asn Ile Lys Lys Phe Ala Lys Gln Ala Thr Val Leu Thr Phe Thr .1 5 10 15

Thr Ala Leu Leu Ala Gly Gly Ala Thr Gln Ala Phe Ala Lys Glu Thr 20 25 30

Asn Gln Lys Pro Tyr Lys Glu Thr Tyr Gly Ile Ser His Ile Thr Arg 35 40 45

His Asp Met Leu Gln Ile Pro Glu Gln Gln Lys Asn Glu Lys Tyr Gln 50 55 60

Val Pro Glu Phe Asp Ser Ser Thr Ile Lys Asn Ile Ser Ser Ala Lys .65 70 75 80

Gly Leu Asp Val Trp Asp Ser Trp Pro Leu Gln Asn Ala Asp Gly Thr 85 90 95

Val Ala Asn Tyr His Gly Tyr His Ile Val Phe Ala Leu Ala Gly Asp 100 105 110

Pro Lys Asn Ala Asp Asp Thr Ser Ile Tyr Met Phe Tyr Gln Lys Val 115 120 125

Gly Glu Thr Ser Ile Asp Ser Trp Lys Asn Ala Gly Arg Val Phe Lys 130 135 140

Asp Ser Asp Lys Phe Asp Ala Asn Asp Ser Ile Leu Lys Asp Gln Thr .145 150 155 160

Gln Glu Trp Ser Gly Ser Ala Thr Phe Thr Ser Asp Gly Lys Ile Arg 165 170 175

Leu Phe Tyr Thr Asp Phe Ser Gly Lys His Tyr Gly Lys Gln Thr Leu 180 185 190

Thr Thr Ala Gln Val Asn Val Ser Ala Ser Asp Ser Ser Leu Asn Ile 195 200 205

Asn Gly Val Glu Asp Tyr Lys Ser Ile Phe Asp Gly Asp Gly Lys Thr 210 215 220

Tyr Gln Asn Val Gln Gln Phe Ile Asp Glu Gly Asn Tyr Ser Ser Gly .225 230 235 240

Asp Asn His Thr Leu Arg Asp Pro His Tyr Val Glu Asp Lys Gly His 245 250 255

Lys Tyr Leu Val Phe Glu Ala Asn Thr Gly Thr Glu Asp Gly Tyr Gln 260 265 270

Gly Glu Glu Ser Leu Phe Asn Lys Ala Tyr Tyr Gly Lys Ser Thr Ser 275 280 285

Phe Phe Arg Gln Glu Ser Gln Lys Leu Leu Gln Ser Asp Lys Lys Arg 290 295 300

Thr Ala Glu Leu Ala Asn Gly Ala Leu Gly Met Ile Glu Leu Asn Asp .305 310 315 320 iIl

"J

Asp Tyr Thr Leu Val Thr Trp Tyr

Ile Thr 370 Thr Gly 385

Asp Leu

Pro Gln

Arg Gly

Leu Asn 450 Glu Gln 465

Asp Glu 340 Leu Phe 355

Ser Asn

Pro Tyr

Asp Pro

Ala Lys 420 Phe Tyr

435

Ile Lys Gly Gln

Lys Lys 325

Ile Glu

Thr Asp

Asp Ile

Lys Pro 390 Asn Asp 405

Gly Asn

Ala Asp

Gly Lys

Leu Thr 470

Val Met

Arg Ala

Ser Arg 360 Tyr Met

375

Leu Asn

Val Thr

Asn Val

Lys Gln 440 Lys Thr 455

Val Asn

Lys

Asn 345

Gly

Leu

Lys

Phe

Val 425 Ser

Ser

Lys

Pro Leu 330

Val Phe

Ser Lys

Gly Tyr

Thr Gly 395 Thr Tyr 410

Ile Thr Thr Phe Val Val

Ile Ala

Lys Met

Met Thr 365 Val Ser 380

Leu Val

Ser His

Ser Tyr

Ala Pro 445 Lys Asp 460

Ser

Asn 350

Ile

Asn

Leu

Phe

Met 430 Ser

Ser

Asn Thr 335

Gly Lys

Asp Gly

Ser Leu

Lys Met 400 Ala Val 415

Thr Asn Phe Leu Ile Leu

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador gluX 1

<4 00> 9

ggcagcgatg aagcattgct 20

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador gluX 2

<4 00> 10

agggcaatga agtcaagcag ctggacggat cgtggagatc 4 0

<210> <211> <212> <213>

11 40 DNA

Artificial

<220>

<223> Iniciador gluX 3 <400> 11

gatctccacg atccgtccag ctgcttgact tcattgccct

40

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Iniciador gluX 4 <400> 12

ttccgtttgc gctggtgttg 20

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador gluX 5

<4 00> 13

gccgggatcc ttcccgctgc atccgcgagc tgtaccgcat 40

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador gluX 6

<4 00> 14

gccgggatcc ttatccacag acccagccgc tattcgacaa

40

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Inieiador gluX 7

<400> 15

gctteeggct cgtatgttgt g 21

<210> 16

<211> 2283

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222> (1001)..(1279)

<4 00> 16

gggtactteg eeaggggtgg gggtgtattc cacacgagtt aaceeaaggc gactttccgt 60

attcctattc accaccacgc cgatctteca cagattgccc agcatttcta cggcacgctg 120

cgctttgccg ggtccggaaa actctttata tataaggttt ggttcggtga cagatccgag 180

acgcctgcgc cacatatcct gattttcctg aaagtccggc gccacggcgt catcgcttcc 240

cggctccaca tcggtgtgct gataaaaaat ctcaatctca gggatagcga tcattagtgg 300

gtgcgcagtt tcagaaggct ggaacccaaa cgagcgccat tcagaatcgc tgcgcacatc 360

gagcttgcca atcaggctgg tcagcgcgtc aaaggtgtca ggcagcgatg aagcattgct 420

tgtcgacgca ccccccttgg ttcccgctgc atccgcgagc tgtaccgcat caagaagttg 480

gatagccaac gatgcacctt gtttggtggt caagttgggt agtgcacgta ctgtttccac 540

aatgaactgt tccacgcggc ttcgggctgc gggatcttgt tctttagaga tccgatcgat 600 <formula>formula see original document page 38</formula>

Claims (4)

1. Bactéria corineforme, caracterizada pelo fato de ter a capacidade de produzir ácido L-glutâmico, o qual é modificado de modo a que o gene gluX seja inativado.

2. Bactéria corineforme de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é modificada de modo que a quantidade de expressão do gene gluX seja reduzida pela introdução de uma mutação no gene gluX no cromossoma ou em uma sua região de controle da expressão.

3. Bactéria corineforme de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o gene gluX no cromossoma é rompido.

4. Método para produzir ácido L-glutâmico, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a bactéria corineforme como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 em um meio, para produzir e acumular ácido L-glutâmico, e coletar ácido L-glutâmico do meio.