KR20020073153A - Ｌ-아미노산의 제조법 및 신규 유전자 - Google Patents

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Abstract

L-리신 또는 L-글루탐산 등의 L-아미노산 생산능력을 갖는 코리네형 세균에 프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 유전자를 도입하며 프룩토스 포스포트랜스페라제 활성을 증강함으로써 이들 L-아미노산 생산능력을 향상시킨다.

Description

Ｌ- 아미노산의 제조법 및 신규 유전자{Process for producing L-amino acid and novel gene}
종래부터 L-리신 및 L-글루탐산 등의 L-아미노산은 이들 L-아미노산 생산능력을 갖는 브레비박테리움속이나 코리네박테리움속에 속하는 코리네형 세균을 사용하여 발효법에 의해 공업 생산되고 있다. 이들 코리네형 세균에는, 생산성을 향상시키기 위해 자연계에서 분리된 균주 또는 당해 균주의 인공 변이주가 사용되고 있다.
또한, 재조합 DNA 기술에 의해 L-아미노산의 생합성 효소를 증강시킴으로써 L-아미노산의 생산능력을 증가시키는 각종 기술이 개시되어 있다. 예를 들면, L-리신 생산능력을 갖는 코리네형 세균에 있어서 L-리신 및 L-트레오닌에 의한 피드백 저해가 해제된 아스파르트키나제를 암호화하는 유전자(변이형 lysC), 디하이드로디피콜린산 리덕타제 유전자(dapB), 디하이드로디피콜린산 신타제 유전자(dapA), 디아미노피멜산 데카복실라제 유전자(lysA) 및 디아미노피멜산 데하이드로게나제 유전자(ddh)(W0 96/40934), lysA 및 ddh[일본 공개특허공보 제(평)9-322774호], lysC, lysA 및 포스포에놀피루브산카복실라제 유전자(ppc)[일본 공개특허공보 제(평)10-165180호], 변이형 lysC, dapB, dapA, lysA 및 아스파라긴산아미노트랜스페라제 유전자(aspC)[일본 공개특허공보 제(평)10-215883호]를 도입함으로써 상기 세균의 L-리신 생산능력이 향상되는 것이 공지되어 있다.
또한, 에스케리키아속 세균에서는 dapA, 변이형 lysC, dapB, 디아미노피멜산 데하이드로게나제 유전자(ddh)(또는 테트라하이드로디피콜린산 숙시닐라제 유전자(dapD) 및 숙시닐 디아미노피멜산 데아실라제 유전자(dapE)]를 순차적으로 증강하면 L-리신 생산능력이 향상되는 것이 공지되어 있다(W0 95/16042). 또한, W0 95/16042에서는 테트라하이드로디피콜린산 숙시닐라제가 숙시닐 디아미노피멜산 트랜스아미나제라고 오기되어 있다.
한편, 코리네박테리움속 또는 브레비박테리움속 세균에서 에스케리키아 콜리 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 시트르산 신타제를 암호화하는 유전자의 도입이 L-글루탐산 생산능력의 증강에 효과적인 것으로 보고되어 있다[일본 특허공보 제(평)7-121228호]. 또한, 일본 공개특허공보 제(소)61-268185호에는 코리네박테리움속 세균 유래의 글루탐산 데하이드로게나제 유전자를 함유하는 재조합 DNA를 보유한 세포가 개시되어 있다. 또한, 일본 공개특허공보 제(소)63-214189호에는글루탐산 데하이드로게나제 유전자, 이소시트르산 데하이드로게나제 유전자, 아코니트산 하이드라타제 유전자 및 시트르산 신타제 유전자를 증강함으로써 L-글루탐산의 생산능력을 증가시키는 기술이 개시되어 있다.
그러나, 프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 유전자의 구조는 코리네형 세균에서는 보고되어 있지 않으며, 프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 유전자를 코리네형 세균의 육종에 이용하는 것도 공지되어 있지 않다.
또한, 브레비박테리움속 세균 등의 코리네형 세균의 프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 유전자는 공지되어 있지 않다.
본 발명은 발효법에 의한 L-아미노산의 제조법, 특히 L-리신 및 L-글루탐산의 제조법, 및 상기 방법에 사용하는 미생물 및 신규 유전자에 관한 것이다. L-리신은 사료 첨가물 등으로서, L-글루탐산은 조미료 원료 등으로서, 널리 사용되고 있다.
본 발명은 종래보다 더욱 개량된 발효법에 의한 L-리신 또는 L-글루탐산 등의 L-아미노산의 제조법 및 여기에 사용하는 균주를 제공하는 것을 과제로 한다. 또한 본 발명의 다른 과제는 상기 균주의 작제에 적절하게 이용할 수 있는 코리네형 세균의 프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기한 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 한 결과, 프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 유전자를 코리네형 세균에 도입하여 프룩토스 포스포트랜스페라제 활성을 증폭함으로써 L-리신 또는 L-글루탐산의 생산량을 증대시킬 수 있는 것을 밝혀냈다. 또한, 브레비박테리움 락토페르멘툼의 프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 유전자를 단리하는 것에 성공하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 하기와 같다.
(1) 세포 중의 프룩토스 포스포트랜스페라제 활성이 증강되며 또한 L-아미노산 생산능력을 갖는 코리네형 세균.
(2) L-아미노산이 L-리신, L-글루탐산, L-트레오닌, L-이소로이신 및 L-세린으로부터 선택되는 (1)의 코리네형 세균.
(3) 프룩토스 포스포트랜스페라제 활성의 증강이 상기 세균 세포내의 프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 유전자의 카피수의 증가에 의한 (1)의 코리네형 세균.
(4) 프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 유전자가 에스케리키아속 세균 유래인 (3)의 코리네형 세균.
(5) 프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 유전자가 코리네형 세균 유래인 (3)의 코리네형 세균.
(6) 상기 (1) 내지 (5) 중의 어느 하나의 코리네형 세균을 배지에 배양하여 당해 배양물 중에 L-아미노산을 생성 축적시켜 배양물로부터 L-아미노산을 채취하는 것을 특징으로 하는 L-아미노산의 제조법.
(7) L-아미노산이 L-리신, L-글루탐산, L-트레오닌, L-이소로이신 및 L-세린으로부터 선택되는 (6)의 방법.
(8) 상기 배지가 탄소원으로서 프룩토스를 함유하는 것을 특징으로 하는 (6) 또는 (7)에 기재된 방법.
(9) 하기 (A) 또는 (B)에 기재된 단백질을 암호화하는 DNA.
(A) 서열목록 중 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질.
(B) 서열목록 중 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지는 한편, 프룩토스 포스포트랜스페라제 활성을 갖는 단백질.
(10) 하기 (a) 또는 (b)에 기재된 DNA인 (9)의 DNA.
(a) 서열목록 중 서열번호 13에 기재된 염기 서열중에서 염기번호881 내지 2944로 이루어진 염기 서열을 함유하는 DNA.
(b) 서열목록 중 서열번호 13에 기재된 염기 서열 중에서 염기번호881 내지 2944로 이루어진 염기 서열 또는 상기 염기 서열로부터 조제되어 수득되는 프로브와 스트린전트한 조건하에 하이브리드화 되는 한편, 프룩토스 포스포트랜스페라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
<1> 본 발명의 코리네형 세균
본 발명의 코리네형 세균은 L-아미노산 생산능력을 가지며 세포중의 프룩토스 포스포트랜스페라제 활성이 증강된 코리네형 세균이다. L-아미노산으로서는 L-리신, L-글루탐산, L-트레오닌, L-이소로이신, L-세린 등을 들 수 있다. 이들 중에서는 L-리신 및 L-글루탐산이 바람직하다. 이하에서 본 발명의 실시 형태를, 주로 L-리신 생산능력 또는 L-글루탐산 생산능력을 갖는 코리네형 세균에 관해 설명하지만, 본 발명은 목적하는 L-아미노산 고유의 생합성계가 프룩토스 포스포트랜스페라제보다 하류에 위치하는 것에 관해서 동일하게 적용될 수 있다.
본 발명에서 말하는 코리네형 세균으로서는 버지즈 매뉴얼 오브 디터미네티브 박테리올로지(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology) 제8판 599페이지(1974)에 정의되어 있는 일군의 미생물이며, 호기성, 그램 양성, 비항산(抗酸)성, 포자 형성능을 갖지 않는 간균이며, 종래 브레비박테리움속으로 분류되어 왔지만 현재 코리네박테리움속 세균으로서 통합된 세균을 포함하며[참조: Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1981)] 또한 코리네박테리움속과 근연인 브레비박테리움속 세균 및 마이크로박테리움속 세균을 포함한다. L-리신 또는 L-글루탐산의 제조에 적절하게 사용되는 코리네형 세균의 균주로는, 예를 들면 하기에 기재된 것을 들 수 있다.
코리네박테리움 아세트아시도필룸 ATCCl3870
코리네박테리움 아세트글루타미쿰 ATCCl5806
코리네박테리움 칼루내 ATCCl5991
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCCl3032
(브레비박테리움 디바리카탐) ATCCl4020
(브레비박테리움 락토페르멘툼) ATCC13869
(코리네박테리움 릴리움) ATCCl5990
(브레비박테리움 플라붐) ATCCl4067
코리네박테리움 메라세콜라 ATCCl7965
브레비박테리움 사카로리티쿰 ATCCl4066
브레비박테리움 임마리오필룸 ATCCl4068
브레비박테리움 로세움 ATCCl3825
브레비박테리움 티오게니탈리스 ATCCl9240
마이크로박테리움 암모니아필람 ATCCl5354
코리네박테리움 테르모아미노게네스) AJ12340(FERM BP-1539)
이들을 입수하기 위해서는 예를 들면, 아메리칸 타입 컬처 콜렉션(American Type Culture Collection, 주소: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America)에서 분양 받을 수 있다. 즉, 각 미생물마다 대응하는 등록번호가 부여되어 있으며 이러한 등록번호를 인용하여 분양 받을 수 있다. 각 미생물에 대응하는 등록번호는 아메리칸 타입 컬처 콜렉션의 카탈로그에 기재되어 있다. 또한, AJ12340주는 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(우편번호 305-8566 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 3고)에 부다페스트 조약에 기초하여 기탁되어 있다.
또한, 상기한 균주 이외에도 이들 균주로부터 유도된 L-리신 또는 L-글루탐산 등의 L-아미노산 생산능력을 갖는 변이주 등도 본 발명에 이용될 수 있다. 이러한 인공변이주로서는 다음과 같은 것이 있다. S-(2-아미노에틸)-시스테인(이하, 「AEC」라고 약칭한다) 내성 변이주[예: 브레비박테리움 락토페르멘툼 AJ 11082(NRRL B-11470), 일본 특허공보 제(소)56-1914호, 제(소)56-1915호, 제(소)57-14157호, 제(소)57-14158호, 제(소)57-30474호, 제(소)58-10075호, 제(소)59-4993호, 제(소)61-35840호, 제(소)62-24074호, 제(소)62-36673호, 제(평)5-11958호, 제(평)7-112437호 및 제(평)7-112438호 참조], 이의 성장에 L-호모세린등의 아미노산을 필요로 하는 변이주[일본 특허공보 제(소)48-28078호 및 제(소)56-6499호], AEC에 내성을 나타내며 또한 L-로이신, L-호모세린, L-프롤린, L-세린, L-아르기닌, L-알라닌, L-발린 등의 아미노산을 요구하는 변이주(미국 특허 제3,708,395호 및 제3,825,472호), DL-α-아미노-ε-카프로락탐, α-아미노-라우릴락탐, 아스파라긴산-동족체, 설파제, 퀴노이드 및 N-라울로일로이신에 내성을 나타내는 L-리신 생산 변이주, 옥살로아세트산 탈탄산 효소(데카복실라제) 또는 호흡계 효소 저해제에 내성을 나타내는 L-리신 생산 변이주[일본 공개특허공보 제(소)50-53588호, 제(소)50-31093호, 제(소)52-102498호, 제(소)53-9394호, 제(소)53-86089호, 제(소)55-9783호, 제(소)55-9759호, 제(소)56-32995호, 제(소)56-39778호, 제(소)53-43591호 및 제(소)53-1833호], 이노시톨 또는 아세트산을 요구하는 L-리신 생산 변이주[일본 공개특허공보 제(소)55-9784호 및 제(소)56-8692호], 플루오로피루브산 또는 34℃ 이상의 온도에 대하여 감수성을 나타내는 L-리신 생산 변이주[일본 공개특허공보 제(소)55-9783호 및 제(소)53-86090호], 에틸렌글리콜에 내성을 나타내며 L-리신를 생산하는 브레비박테리움속 또는 코리네박테리움속의 생산 변이주(미국 특허 제4,411,997호).
또한, L-트레오닌 생산능력을 갖는 코리네형 세균으로는 코리네박테리움 아세트아시도필룸 AJ12318(FERM BP-1172)(참조: 미국 특허 제5,188,949호) 등을, L-이소로이신 생산능력을 갖는 코리네형 세균으로서는 브레비박테리움 플라붐 AJ12149(FERM BP-759)(참조: 미국 특허 제4,656,135호) 등을 들 수 있다.
<2> 프룩토스 포스포트랜스페라제 활성의 증폭
코리네형 세균 세포 중의 프룩토스 포스포트랜스페라제 활성을 증폭시키기 위하여, 프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 유전자 단편을, 당해 세균으로 기능하는 벡터, 바람직하게는 멀티카피형 벡터와 연결하여 재조합 DNA를 제조하고 이것을 L-리신 또는 L-글루탐산 생산능력을 갖는 코리네형 세균에 도입하여 형질전환시키면 바람직하다. 형질전환주의 세포 내의 프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 유전자의 카피 수가 상승한 결과, 프룩토스 포스포트랜스페라제 활성이 증폭된다. 프룩토스 포스포트랜스페라제는, 에스케리키아 콜리에서는 fruA 유전자에 암호화되어 있다.
프룩토스 포스포트랜스페라제 유전자는 코리네형 세균의 유전자를 사용하는 것이 바람직하지만, 에스케리키아속 세균 등 기타 생물에서 유래된 유전자의 어느 것이나 사용할 수 있다.
에스케리키아 콜리의 fruA 유전자의 염기 서열은 이미 명백하게 밝혀져 있으므로(Genbank/EMBL/DDBJ accetion No. M23196) 이의 염기 서열에 근거하여 제조한 프라이머, 예를 들면, 서열목록의 서열번호 1 및 2에 기재된 프라이머를 사용하여 에스케리키아 콜리 염색체 DNA를 주형으로 하는 PCR법[PCR: polymerase chain reaction; 참조문헌: White, T. J. et al; Trends Genet. 5, 185(1989)]에 의해 fruA 유전자를 수득할 수 있다.
또한, 코리네형 세균, 예를 들면, 브레비박테리움 락토페르멘툼 유래의 fruA 유전자는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 마이코플라즈마 게니탈리움(Mycoplasma genitalium), 크산토모나스 콤페스트리스(Xanthomonas compestris) 등의 공지된 fruA 유전자로부터 예상되는 아미노산 서열간에 상동성이 높은 영역을 선택하고, 이러한 영역의 아미노산 서열에 근거하여 PCR용 프라이머를 합성하여 브레비박테리움 락토페르멘툼를 주형으로 하는 PCR 반응을 실시함으로써 부분 서열로서 수득할 수 있다. 상기한 프라이머로서는 서열번호 3 및 서열번호 4에 기재된 올리고뉴클레오타이드를 들 수 있다.
이어서 상기와 동일하게 수행하여 수득되는 fruA 유전자의 부분 서열을 이용하여, 역(inverse) PCR[Genetics, 120, 621-623(1988)]법 또는 LA-PCR 인 비트로 클로닝 키트(In Vitro Cloning Kit)(다카라 슈조[Takara shuzo])를 사용하는 방법 등에 의해 fruA 유전자의 5′미지 영역 및 3′미지 영역을 수득한다. LA-PCR 인 비트로 클로닝 키트를 사용하는 경우, fruA 유전자의 3′미지 영역은 예를 들면, 1차 PCR로서 서열번호 5 및 서열번호 9에 기재된 프라이머에 의한 PCR을, 2차 PCR로서 서열번호 6 및 서열번호 10에 기재된 프라이머에 의한 PCR을 실시함으로써 수득할 수 있다. 또한, fruA 유전자 부분 단편의 5′미지 영역은 예를 들면, 1차 PCR로서 서열번호 7 및 서열번호 9에 기재된 프라이머에 의한 PCR을, 2차 PCR로서 서열번호 8 및 서열번호 10에 기재된 프라이머에 의한 PCR을 실시함으로써 수득할 수 있다. 이와 동일하게 수행하여 수득되는 fruA 유전자의 전체 길이를 포함하는 DNA 단편의 염기 서열을 서열번호 13에 기재한다. 또한, 이러한 염기 서열로부터 추정되는 오픈 리딩 프레임을 아미노산 서열로 번역한 서열을 서열번호 14에 기재한다.
또한, 본 발명에 의해 브레비박테리움 락토페르멘툼의 fruA 유전자 및 이의인접 영역의 염기 서열이 명백해졌으므로 이들 인접 영역의 염기 서열에 근거하여 설계한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하는 PCR에 의해 fruA 유전자 전체 길이를 함유하는 DNA 단편을 수득할 수 있다.
기타 세균의 프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 유전자도 동일하게 수행하여 수득할 수 있다.
본 발명의 fruA 유전자는 암호화되는 단백질의 프룩토스 포스포트랜스페라제 활성이 손상되지 않는 한, 1 또는 복수의 위치에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 것이라도 바람직하다. 여기서 「수개」란 아미노산 잔기의 단백질의 입체구조에서 위치나 종류에 따라서도 상이하지만 구체적으로는 2 내지 200개, 바람직하게는 2 내지 50개, 보다 바람직하게는 2 내지 20개이다.
상기와 같은 프룩토스 포스포트랜스페라제와 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는, 예를 들면 부위 특이적 변이법에 의해 특정한 부위의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하도록 fruA의 염기 서열을 개변함으로써 수득된다. 또한, 상기와 같은 개변된 DNA는 종래부터 공지되어 있는 변이처리에 의해서도 수득될 수 있다. 변이처리로는 변이 처리전의 DNA를 하이드록실아민 등으로 시험관 내(in vitro) 처리하는 방법 및 변이 처리전의 DNA를 보유하는 미생물, 예를 들면, 에스케리키아속 세균을 자외선 조사 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 또는 아질산 등의 통상적인 변이처리에 사용되고 있는 변이제에 의해 처리하는 방법을 들 수 있다.
상기와 같은 변이를 갖는 DNA를 적당한 세포에서 발현시켜 발현 산물의 활성을 조사함으로써 프룩토스 포스포트랜스페라제와 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA가 수득된다. 또한, 변이를 갖는 프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 DNA 또는 이것을 보유하는 세포로부터 예를 들면, 서열목록 중 서열번호 13에 기재된 염기 서열중 염기번호881 내지 2944로 이루어진 염기 서열 또는 이의 일부를 갖는 프로브와 스트린전트한 조건하에 하이브리드화하며 또한, 프룩토스 포스포트랜스페라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 단리함으로써 프룩토스 포스포트랜스페라제와 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA가 수득된다. 여기서 말하는 「스트린전트한 조건」이란 소위 특이적인 하이브리드가 형성되고 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 지칭한다. 이러한 조건을 명확하게 수치화하는 것은 곤란하지만 일례를 기재하면 상동성이 높은 DNA끼리 예를 들면, 50% 이상의 상동성을 갖는 DNA끼리 하이브리드화하며 이보다 상동성이 낮은 DNA끼리는 하이브리드화하지 않는 조건 또는 통상적인 서든 하이브리드화(Southern hybridization)의 세정 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도로 세정을 실시하는 조건을 들 수 있다.
프로브로서 서열번호 13의 염기 서열의 일부 서열을 사용할 수 있다. 이러한 프로브는 서열번호 13의 염기 서열에 근거하여 제조된 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하여 서열번호 13의 염기 서열을 함유하는 DNA 단편을 주형으로 하는 PCR에 의해 제조될 수 있다. 프로브로서 300bp 정도 길이의 DNA 단편을 사용하는 경우에는 하이브리다이제이션의 세정 조건은 50℃, 2×SSC, 0.1% SDS를 들 수 있다.
상기와 같은 조건으로 하이브리드화하는 유전자 중에는 도중에 스톱 코돈이 발생한 것이나 활성 중심의 변이에 의해 활성을 잃은 것도 포함되지만 이들에 관해서는 시판되는 활성 발현 벡터에 연결하여 프룩토스 포스포트랜스페라제 활성을 문헌[참조: Mori, M. & Shiio, I., Agric. Biol. Chem., 51, 129-138(1987)]에 기재된 방법으로 측정함으로써 용이하게 선별할 수 있다.
프룩토스 포스포트랜스페라제와 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA로는 구체적으로, 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열과 바람직하게는 55% 이상, 보다 바람직하게는 60% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 가지며 또한 프룩토스 포스포트랜스페라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 들 수 있다.
염색체 DNA는 DNA 공여체인 세균으로부터 예를 들면, 사이토(Saito) 및 미우라(Miura)의 방법[참조문헌: H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619(1963), 생물공학 실험서, 일본생물공학회편, 97 내지 98페이지, 하이후칸, 1992년] 등에 의해 조제할 수 있다.
PCR법에 의해 증폭된 프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 유전자는 에스케리키아 콜리 및/또는 코리네형 세균의 세포내에서 자율 복제할 수 있는 벡터 DNA에 접속하여 재조합 DNA를 조제하며 이것을 에스케리키아 콜리 세포에 도입하면 이후의 조작이 쉽게 수행된다. 에스케리키아 콜리 세포내에서 자율 복제할 수 있는 벡터로서는, 플라스미드 벡터가 바람직하며 숙주 세포내에서 자립 복제할 수 있는 것이 바람직하며 예를 들면, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399,pHSG398, RSF1010 등을 들 수 있다.
코리네형 세균의 세포내에서 자율 복제할 수 있는 벡터로서는 pAM330[일본 공개특허공보 제(소)58-67699호 참조], pHM1519[일본 공개특허공보 제(소)58-77895호 참조] 등을 들 수 있다. 또한, 이들 벡터로부터 코리네형 세균 속에서 플라스미드를 자율 복제할 수 있게 하는 능력을 갖는 DNA 단편을 추출하여 에스케리키아 콜리용의 벡터에 삽입하면 에스케리키아 콜리 및 코리네형 세균의 양쪽에서 자율 복제할 수 있는 소위 셔틀 벡터(shuttle vector)로서 사용할 수 있다. 이러한 셔틀 벡터로서는 하기의 것을 들 수 있다. 또한, 각각의 벡터를 보유하는 미생물 및 국제기탁기관의 수탁번호를 괄호 내에 기재한다.
pAJ655 에스케리키아 콜리 AJ11882(FERM BP-136)
코리네박테리움 글루타미쿰 SR8201(ATCC39135)
pAJ1844 에스케리키아 콜리 AJ11883(FERM BP-137)
코리네박테리움 글루타미쿰 SR8202(ATCC39136)
pAJ611 에스케리키아 콜리 AJ11884(FERM BP-138)
pAJ3148 코리네박테리움 글루타미쿰 SR 8203(ATCC39137)
pAJ440 바실러스 서브틸리스 AJ11901(FERM BP-140)
pHC4 에스케리키아 콜리 AJ12617(FERM BP-3532)
프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 유전자와 코리네형 세균으로 기능하는 벡터를 연결하여 재조합 DNA를 조제하는 프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 유전자의 말단에 상응하는 제한효소로 벡터를 절단한다. 연결은 T4 DNA리가제 등의 리가제를 사용하여 실시하는 것이 보통이다.
상기한 바와 같이 조제한 재조합 DNA를 코리네형 세균에 도입하는 것은 지금까지 보고되어 있는 형질전환법에 따라 실시하면 바람직하다. 예를 들면, 에스케리키아 콜리 K-12에 관해 보고되어 있는 바와 같이 수용균 세포를 염화칼슘으로 처리하여 DNA의 투과성을 증가시키는 방법[참조문헌: Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Bio1., 53, 159(1970)]이 있으며, 바실러스 서브틸리스에 관해 보고되어 있는 바와 같이 증식 단계의 세포로부터 콤피턴트 셀(competent cell)을 조제하여 DNA를 도입하는 방법[참조문헌: Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E., Gene, 1, 153(1977)]이 있다. 또는 바실러스 서브틸리스, 방선(放線)균류 및 효모에 관해 공지되어 있는 바와 같이 DNA 수용균의 세포를 재조합 DNA를 용이하게 도입하는 프로토플라스트 또는 스페로플라스트의 상태로 하여 재조합 DNA를 DNA 수용균에 도입하는 방법[참조문헌: Chang, S. and Choen, S. N., Molec. Gen. Genet., 168, 111(1979); Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, 0. A., Nature, 274, 398(1978)]; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929(1978)]도 응용할 수 있다. 본 발명의 실시예에서 사용하는 형질전환의 방법은 전기 펄스법[일본 공개특허공보 제(평)2-207791호 참조]이다.
프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 활성의 증폭은 프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 유전자를 상기 숙주의 염색체 DNA 상에 다량으로 카피 존재시킴으로써 달성할 수 있다. 코리네형 세균에 속하는 미생물의 염색체 DNA 위에 프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 유전자를 다량 카피로 도입하는 데는 염색체 DNA 상에 다량으로 카피 존재하는 서열을 표적으로 이용하여 상동 재조합에 의해 실시한다. 염색체 DNA 상에 다량 카피 존재하는 서열로는 리피티브 DNA 및 전이 인자의 말단부에 존재하는 역반복(inverted repeat)을 이용할 수 있다. 또는 일본 공개특허공보 제(평)2-109985호에 개시되어 있는 바와 같이 프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 유전자를 트랜스포존(transposon)에 탑재시키고 이것을 전이시켜 염색체 DNA 상에 다량으로 카피 도입할 수 있다. 어느 방법에 따라서도 형질전환주 내의 프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 유전자의 카피수가 상승하는 결과, 프룩토스 포스포트랜스페라제 활성이 증폭된다.
프룩토스 포스포트랜스페라제 활성의 증폭은 유전자 증폭에 의한 것 외에 염색체 DNA 상 또는 플라스미드 상의 프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 유전자의 프로모터 등의 발현 조절서열을 강력한 것으로 치환함으로써도 달성된다[일본 공개특허공보 제(평)1-215280호 참조]. 예를들면, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파지의 PR프로모터 및 PL프로모터 등이 강력한 프로모터로서 공지되어 있다. 이들 프로모터로의 치환에 의해 프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 유전자의 발현이 강화됨으로써 프룩토스 포스포트랜스페라제 활성이 증폭된다.
또한, 본 발명의 코리네형 세균은 프룩토스 포스포트랜스페라제 활성에 추가하여 기타 아미노산 생합성 경로 또는 해당계(glycolysis system) 등의 효소 유전자를 강화함으로써 이들 효소 활성이 증강될 수 있다. 예를 들면, L-리신의 제조에 이용할 수 있는 유전자의 예로서는 L-리신 및 L-트레오닌에 의한 상승적인 피드백 저해가 실질적으로 해제된 아스파르트키나제 α 서브유니트 단백질 또는 β 서브유니트 단백질을 암호화하는 유전자(국제공개 팜플렛 W0 94/25605), 코리네형 세균 유래의 야생형 포스포에놀피루브산카복실라제 유전자[일본 공개특허공보 제(소)60-87788호], 코리네형 세균 유래의 야생형 디하이드로디피콜린산 신테타제를 암호화하는 유전자[일본 특허공보 제(평)6-55149호] 등이 공지되어 있다.
또한, L-글루탐산의 제조에 이용할 수 있는 유전자의 예로서는 글루탐산 데하이드로게나제[GDH, 일본 공개특허공보 제(소)61-268185호], 글루타민 신테타제, 글루탐산 신타제, 이소시트르산 데하이드로게나제[일본 공개특허공보 제(소)62-166890호, 일본 공개특허공보 제(소)63-214189호], 아코니트산 하이드라타제[일본 공개특허공보 제(소)62-294086호], 시트르산 신타제, 피루브산 카복실라제[일본 공개특허공보 제(소)60-87788호, 제(소)62-55089호], 포스포에놀피루브산 카복실라제, 포스포에놀피루브산 신타제, 프룩토스 포스포트랜스페라제, 포스포글리세로뮤타제, 포스포글리세린산 키나제, 글리세르알데히드-3-인산 데하이드로게나제, 트리오스인산 이소메라제, 프룩토스 비스포스페이트 알도라제, 포스포프룩토키나제[일본 공개특허공보 제(소)63-102692호], 글루코스포스페이트 이소메라제 등이 있다.
또한 목적하는 L-아미노산의 생합성 경로로부터 분기하여 상기 L-아미노산 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 활성이 저하되거나 결손될 수 있다. 예를 들면, L-리신의 생합성 경로로부터 분기하여 L-리신 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소로서는 호모세린 데하이드로게나제가 있다(참조: W095/23864호). 또한, L-글루탐산의 생합성 경로로부터 분기하여 L-글루탐산 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소로서는 α케토글루타르산 데하이드로게나제, 이소시트르산 리아제, 인산 아세틸트랜스페라제, 아세트산 키나제, 아세트하이드록시산 신타제, 아세트락트산 신타제, 포름산 아세틸트랜스페라제, 락트산 데하이드로게나제, 글루탐산 데카복실라제, 1-피롤린산 데하이드로게나제 등이 있다.
또한, L-글루탐산 생산능력을 갖는 코리네형 세균에 계면활성제 등의 비오틴(biotin) 작용 저해물질에 대한 온도 감수성 변이를 부여함으로써 과잉량의 비오틴을 함유하는 배지중에서 비오틴 작용 저해물질의 비존재 하에 L-글루탐산을 생산시킬 수 있다(W0 96/06180호 참조). 이러한 코리네형 세균으로는 W0 96/06180호에 기재되어 있는 브레비박테리움 락토페르멘툼 AJ13029를 들 수 있다. AJ13029주는 1994년 9월 2일 부로 공업기술원 생명공학공업기술연구소(우편번호 305-8566 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 3고)에 수탁번호 FERM P-14501로서 기탁되어 있으며, 1995년 8월 1일에 부다페스트 조약에 근거하는 국제기탁으로 이관되고 수탁번호 FERM BP-5189가 부여되어 있다.
또한, L-리신 및 L-글루탐산 생산능력을 갖는 코리네형 세균에 비오틴 작용 저해물질에 대한 온도 감수성 변이를 부여함으로써 과잉량의 비오틴을 함유하는 배지중에서 비오틴 작용 저해물질의 비존재 하에 L-리신 및 L-글루탐산을 동시에 생산시킬 수 있다(W0 96/06180호 참조). 이러한 균주로서는 W0 96/06180호에 기재되어있는 브레비박테리움 락토페르멘툼 AJ12993주를 들 수 있다. 상기 주는 1994년 6월 3일 부로 공업기술원 생명공학공업기술연구소(우편번호 305-8566 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 3고)에 수탁번호 FERM P-14348로 기탁되어 있으며 1995년 8월 1일에 부다페스트 조약에 근거하는 국제기탁에 이관되고 수탁번호 FERM BP-5188이 부여되어 있다.
<3> L-아미노산의 생산
프룩토스 포스포트랜스페라제 활성이 증폭되는 동시에 L-아미노산 생산능력을 갖는 코리네형 세균을 적절한 배지에서 배양하면 L-아미노산이 배지에 축적된다. 예를 들면, 프룩토스 포스포트랜스페라제 활성이 증폭되는 동시에 L-리신산 생산능력을 갖는 코리네형 세균을 적절한 배지에서 배양하면 L-리신이 배지에 축적된다. 또한, 프룩토스 포스포트랜스페라제 활성이 증폭되는 동시에 L-글루탐산 생산능력을 갖는 코리네형 세균을 적절한 배지에 배양하면 L-글루탐산이 배지에 축적된다.
또한, 프룩토스 포스포트랜스페라제 활성이 증폭되는 동시에 L-리신 및 L-글루탐산 생산능력을 갖는 코리네형 세균을 배지에 배양하면 L-리신 및 L-글루탐산이 배지에 축적된다. L-리신과 L-글루탐산을 동시에 발효 생산하는 경우에는 L-리신 생산균을 L-글루탐산의 생산 조건하에서 배양하거나 L-리신 생산능력을 갖는 코리네형 세균과 L-글루탐산 생산능력을 갖는 코리네형 세균을 혼합 배양할 수도 있다[일본 공개특허공보 제(평)5-3793호].
본 발명의 미생물을 사용하여 L-리신 또는 L-글루탐산 등의 L-아미노산을 제조하는데 사용하는 배지는 탄소원, 질소원, 무기 이온 및 필요에 따라 기타 유기 미량 영양소를 함유하는 통상적인 배지이다. 탄소원으로서는 글루코스, 락토스,갈락토스, 프룩토스, 수크로스, 폐당밀, 전분 가수분해물 등의 탄수화물, 에탄올이나 이노시톨 등의 알콜류, 아세트산, 푸마르산, 시트르산, 숙신산 등의 유기산류를 사용할 수 있다. 본 발명에서는 이들 중에 프룩토스가 특히 적절하다. 통상적으로 코리네형 세균을 사용하는 발효법에 의한 L-아미노산의 생산에서는 배지의 탄소원으로서 프룩토스를 사용하면 수율이 저하되는 경향이 있지만, 본 발명에 사용되는 미생물은 프룩토스를 탄소원으로 하는 배지에서 L-아미노산을 효율적으로 생성한다. 이러한 효과는 특히 L-리신 생산에서 현저하다.
질소원으로서는 황산암모늄, 질산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 아세트산암모늄 등의 무기 또는 유기 암모늄염; 암모니아; 펩톤, 고기 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 대두 가수분해물 등의 유기질소; 암모니아 가스, 암모니아수 등을 사용할 수 있다.
무기 이온으로서는 인산칼륨, 황산마그네슘, 철 이온, 망간 이온 등이 소량 첨가된다. 유기 미량 영양소로서는 비타민 B1등의 요구 물질 또는 효모 추출물 등을 필요에 따라 적량 함유시키는 것이 바람직하다.
배양은 진탕 배양, 통기 교반 배양 등에 의한 호기적 조건하에 16 내지 72시간 동안 실시하는 것이 바람직하며 배양 온도는 30℃ 내지 45℃, 배양중 pH는 5 내지 9로 제어한다. 또한, pH 조정에는 무기 또는 유기의 산성 또는 알칼리성 물질, 또한 암모니아 가스 등을 사용할 수 있다.
발효액으로부터 L-아미노산의 채취는 통상적인 L-아미노산의 제조법과 동일하게 수행하여 실시할 수 있다. 예를 들면, L-리신의 채취는 통상적인 이온교환 수지법, 침전법, 기타 공지된 방법을 조합함으로써 실시할 수 있다. 또한, L-글루탐산을 채취하는 방법도 통상적인 방법에 따라 실시하면 바람직하며 예를 들면, 이온교환 수지법, 결정 석출법 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 L-글루탐산을 음이온 교환수지에 의해 흡착, 분리시키거나 중화 결정 석출시키면 바람직하다. L-리신 및 L-글루탐산의 양쪽을 제조하는 경우, 이들을 혼합물로서 사용하는 경우에는 이들 아미노산을 서로 분리시키는 것은 불필요하다.
이하, 본 발명을 실시예에 따라 보다 구체적으로 설명한다.
실시예1: fruA 유전자 도입 코리네형 세균의 작제
<1> 에스케리키아 콜리 JM 109주의 fruA 유전자의 클로닝
에스케리키아 콜리의 fruA 유전자의 염기 서열은 이미 명백하게 밝혀져 있다(Genbank/EMBL/DDBJ accetion No. M23196). 보고되어 있는 염기 서열에 근거하여 서열목록 중 서열번호 1 및 2에 기재된 프라이머를 합성하고 에스케리키아 콜리 JM 109주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR법에 의해 프룩토스 포스포트랜스페라제 유전자를 증폭한다.
합성한 프라이머 내의 서열번호 1은 문헌[참조: Genbank/EMBL/DDBJ accetion No. M23196]에 기재되어 있는 fruA 유전자의 염기 서열의 1번째 내지 24번째의 염기에 이르는 서열에 상당하며 서열번호 2는 2000번째 내지 1977번째의 염기에 이르는 서열에 상당한다.
에스케리키아 콜리 JM 109주의 염색체 DNA의 조제는 통상적인 방법에 따른다[참조문헌: 생물공학실험서, 일본생물공학회편, 97 내지 98페이지, 하이후칸, 1992년]. 또한 PCR 반응은 PCR법 최전선[참조문헌: 세키다니 오카오 외 편, 교리쓰슛판샤, 1989년] 185페이지에 기재되어 있는 표준 반응조건을 사용한다.
생성된 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 정제한 후, SmaI로 절단한 플라스미드 pHC4와 연결 키트(다카라 슈조)를 사용하여 연결한 다음, 에스케리키아 콜리 JM 109의 콤피턴트 셀(다카라 슈조)를 사용하여 형질전환을 실시하고, 클로람페니콜 30㎍/ml를 함유하는 L 배지(박토 트립톤 10g/L, 박토 이스트 추출물 5g/L, NaCl 5g/L, 한천 15g/L, pH 7.2)에 도포하며 일야 배양한 다음, 출현한 백색의 콜로니를 걷어내고 단일 콜로니 분리하여 형질전환주를 수득한다. 수득한 형질전환체에서 플라스미드를 추출하고 벡터에 fruA 유전자가 결합된 플라스미드 pHC4fru를 수득한다.
pHC4를 보유하는 에스케리키아 콜리는 프라이비트 넘버 AJ12617로 명명되며 1991년 4월 24일에 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(우편번호 305-8566 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 3고)에 수탁번호 FERM P-12215로서 기탁되었으며 1991년 8월 26일에 부다페스트 조약에 근거하는 국제기탁에 이관되고 수탁번호 FERM BP-3532가 부여되어 있다.
다음에 클로닝된 DNA 단편이 프룩토스 포스포트랜스페라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하고 있는 것을 확인하기 위해 JM 109주 및 pHC4fru를 보유하는 JM 109주의 프룩토스 포스포트랜스페라제 활성을 문헌[참조: Mori, M. & Shiio, I., Agric. Biol. Chem., 51, 129-138(1987)]에 기재된 방법에 따라 측정한다. 그 결과, pHC4fru를 보유하는 JM 109주는 pHC4fru를 보유하지 않는 JM 109주의 약 11배의 프룩토스 포스포트랜스페라제 활성을 나타내는 점으로부터 fruA 유전자가 발현되고 있는 것을 확인한다.
<2> 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산주로의 pHC4fru의 도입과 L-글루탐산 생산
브레비박테리움 락토페르멘툼 AJ13029를 전기 펄스법[일본 공개특허공보 제(평)2-207791호 참조]에 의해 플라스미드 pHC4fru로 형질전환하며 수득된 형질전환주를 수득한다. 수득된 형질전환주 AJ13029/pHC4fru를 사용하여 L-글루탐산 생산을 위한 배양을 아래와 같이 실시한다. 5㎍/ml의 클로람페니콜을 함유하는 CM2B 평판 배지에서 배양하여 수득한 AJ13029/pHC4fru주의 균체를 5㎍/ml의 클로람페니콜을 함유하는 하기 조성을 갖는 L-글루탐산 생산 배지에 접종하고 31.5℃에서 진탕 배양하며 배지중의 당이 소비될 때까지 진탕 배양한다. 수득된 배양물을 동일한 조성의 배지에 5% 양을 접종하며 37℃에서 배지중의 당이 소비될 때까지 진탕 배양한다. 대조군으로서 코리네박테리움속 세균 AJ13029주에 이미 수득된 코리네박테리움속 세균에서 자율복제될 수 있는 플라스미드 pHC4로 전기 펄스법에 의해 형질전환된 균주를 상기와 동일하게 수행하여 배양한다.
[L-글루탐산 생산 배지]
하기 성분(1L중)을 용해하고 KOH로 pH 8.0으로 조제하여 115℃에서 15분 동안 살균한다.
프룩토스 150g
KH2PO42g
MgSO47H2O 1.5g
FeSO47H2O 15mg
MnSO44H2O 15mg
대두 단백 가수분해액 50ml
비오틴 2mg
티아민 염산염 3mg
배양 종료후, 배양액 중의 L-글루탐산 축적량을 아사히가세이고교사(Asahi Chemical Industry Co., Ltd.)제 바이오텍 분석기 AS-210에 의해 측정한다. 이때의 결과를 표1에 기재한다.
균주 L-글루탐산 생성량(g/L)
AJ13029/pHC4 18.5
AJ13029/pHC4fru 20.5
<3> 코리네형 세균의 L-리신 생산주로의 pHC4fru의 도입과 L-리신 생산
브레비박테리움 락토페르멘툼 AJ11082를 전기 펄스법[일본 공개특허공보 제(평)2-207791호 참조]에 의해 플라스미드 pHC4fru로 형질전환하여 수득된 형질전환주를 수득한다. 수득된 형질전환주 AJ11082/pHC4fru를 사용하여 L-리신 생산을 위한 배양을 아래와 같이 실시한다. 5㎍/ml의 클로람페니콜을 함유하는 CM2B 평판 배지에서 배양하여 수득한 AJ11082/pHC4fru주의 균체를 5㎍/ml의 클로람페니콜을 함유하는 하기 조성의 L-리신 생산 배지에 접종하여 31.5℃에서 배지중의 당이 소비될 때까지 진탕 배양한다. 대조군으로서 코리네박테리움속 세균 AJ11082주에 이미 수득된 코리네박테리움속 세균에서 자율복제될 수 있는 플라스미드 pHC4로 전기 펄스법에 의해 형질전환된 균주를 상기와 동일하게 수행하여 배양한다.
브레비박테리움 락토페르멘툼 AJ11082는 1981년 1월 31일에 애그리컬쳐랄 리서치 컬쳐 콜렉션{Agricultural Research Culture Collection[미합중국 일리노이주 61604 피오리아 노스유니버시티 스트리트 1815(1815 N. University Street, Peoria, Illinois 61604, U.S.A.)]}에 국제기탁되고 수탁번호 NRRL B-11470이 부여되어 있다.
[L-리신 생산 배지]
탄산 칼슘 이외의 하기 성분(1L중)을 용해시키고 KOH로 pH 8.0로 조제하여 115℃에서 15분 동안 살균한 다음, 별도로 건열 살균한 탄산칼슘을 50g 가한다.
프룩토스 100g
(NH4)2SO455g
KH2PO41g
MgSO47H2O 1g
비오틴 500㎍
티아민 2000㎍
FeSO47H2O 0.01g
MnSO47H2O 0.01g
니코틴아미드 5mg
단백질 가수분해물(콩 농축물) 30ml
탄산칼슘 50g
배양 종료 후, 배양액 중의 L-리신 축적량을 아사히가세이고교사제 바이오텍 분석기 AS-210에 의해 측정한다. 이때의 결과를 표2에 기재한다.
균주 L-리신 생성량(g/L)
AJ11082/pHC4 24.9
AJ11082/pHC4fru 28.4
<4> 코리네형 세균의 L-리신 및 L-글루탐산 생산주로의 pHC4fru의 도입과 L-리신 및 L-글루탐산 동시 생산
브레비박테리움 락토페르멘툼 AJ12993를 전기 펄스법[일본 공개특허공보 제(평)2-207791호 참조]에 의해 플라스미드 pHC4fru로 형질전환하여 수득된 형질전환주를 수득한다. 수득된 형질전환주 AJ12993/pHC4fru를 사용하여 L-리신 및 L-글루탐산 생산을 위한 배양을 아래와 같이 실시한다. 5㎍/ml의 클로람페니콜을 함유하는 CM2B 평판 배지에서 배양하여 수득한 AJ12993/pHC4fru주의 균체를 5㎍/ml의 클로람페니콜을 함유하는 L-리신 생산 배지에 접종하고 31.5℃에서 배양한다. 배양을 개시하고 12시간 후에 배양 온도를 34℃로 쉬프트하며 배지중의 당이 소비될 때까지 진탕 배양한다. 대조군으로서 코리네박테리움속 세균 AJ12993주에 이미 수득된 코리네박테리움속 세균에서 자율복제될 수 있는 플라스미드 pHC4로 전기 펄스법에 의해 형질전환된 균주를 상기와 동일하게 수행하여 배양한다.
배양 종료 후, 배양액 중의 L-리신 및 L-글루탐산 축적량을 아사히가세이고교사제 바이오텍 분석기 AS-210에 의해 측정한다. 이때의 결과를 표3에 기재한다.
균주 L-리신 생성량(g/L) L-글루탐산 생성량(g/L)
AJ12993/pHC4 8.5 18.5
AJ12993/pHC4fru 9.7 20.3
실시예2: 브레비박테리움 락토페르멘툼의 fruA 유전자의 단리
<1> 브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC13869의 fruA 유전자의 부분 단편 수득
바실러스 서브틸리스, 에스케리키아 콜리, 마이코플라즈마 게니탈리움, 크산토모나스 콤페스트리스의 FruA 간에 아미노산 서열의 상동성이 높은 영역을 선택하며 이러한 영역의 아미노산 서열로부터 염기 서열을 추정하여 서열번호 3 및 서열번호 4에 기재된 올리고뉴클레오타이드를 합성한다. 한편, 세균 게놈 DNA 정제 키트(Bacterial Genome DNA Purification Kit; Advanced Genetic Technologies Corp.)를 사용하여 브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC13869의 염색체 DNA를 조제한다. 이러한 염색체 DNA 0.5㎍, 상기 올리고뉴클레오타이드 20pmol, dNTP 혼합물(dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 각 2.5mM) 4㎕, 10×ExTaq 완충제(다카라 슈조) 5㎕ 및 ExTaq(다카라 슈조) 1U에 멸균수를 가하여 총량 50㎕의 PCR 반응액을 조제한다. 이러한 반응액을 서멀 사이클러(Thermal Cycler) TP240(다카라 슈조)를 사용하여, 98℃에서 10초 동안 변성시키고, 45℃에서 30초 동안 어닐링시키고, 72℃에서 90초 동안 연장 반응시키는 조건으로 25사이클의 PCR을 실시하고 PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동한 바, 반응액에 약 1.2kb의 밴드가 포함되는 것이 판명됐다.
상기 반응물을 오리지널 TA 클로닝 키트(0riginal TA Cloning Kit; Invitrogen)를 사용하여 pCR2.1(Invitrogen)에 연결한다. 연결한 다음, 에스케리키아 콜리 JM109의 콤피턴트 셀(다카라 슈조)를 사용하여 형질전환을 실시하며 IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드) 10㎍/ml, X-Gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드) 40㎍/ml 및 가나마이신 25㎍/ml을 함유하는 L배지(박토트립톤 10g/L, 박토이스트 추출물 5g/L, NaCl 5g/L, 한천 15g/L, pH 7.2)에 도포하여 일야 배양한 다음, 출현한 백색의 콜로니를 걷어내고 단일 콜로니 분리하여 형질전환주를 수득한다.
형질전환주로부터 알칼리법[참조문헌:생물공학실험서, 일본생물공학회편, 105페이지, 하이후칸, 1992년]을 사용하여 플라스미드를 조제하고 서열번호 5 및 서열번호 6에 기재된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 삽입 단편의 양쪽 말단의 염기 서열을 상거(Sanger) 방법[참조문헌: J. Mol. Bio1., 143, 161(1980)]으로 결정한다. 구체적으로는 염기 서열의 결정에는 빅 다이 터미네이터 서열화 키트(Big dye terminator sequencing kit; Applied Biosystems)를 사용하여 유전자 분석기 ABI310(Genetic Analyzer ABI310; Applied Biosystems)으로 해석한다. 결정된 염기 서열을 아미노산 서열로 번역하여 바실러스 서브틸리스, 에스케리키아 콜리, 마이코플라즈마 게니탈리움, 크산토모나스 콤페스트리스의 fruA 유전자로부터 예측되는 아미노산 서열을 비교한 바, 높은 상동성을 나타내므로 클로닝된 단편은 브레비박테리움 락토페르멘툼 유래의 fruA 유전자라고 판단된다.
<2> 브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC13869의 fruA 유전자의 전체 염기 서열결정
상기<1>에서 조제한 플라스미드에 함유된 단편은 fruA 유전자의 부분 단편이며 또한 fruA 유전자 전체 길이의 염기 서열을 결정할 필요가 있다. 기지(旣知)의 영역에 인접하는 미지의 염기 서열을 결정하는 방법으로서 역(inverse) PCR[참조문헌: Genetics, 120, 621-623(1988)]법이나 LA-PCR 인 비트로 클로닝 키트(LA-PCR In Vitro Cloning Kit; 다카라 슈조)를 사용하는 방법 등이 있지만 여기서는 LA-PCR 인 비트로 클로닝 키트에 의해 미지 서열의 결정을 실시한다. 구체적으로는 <1>에서 결정한 염기 서열을 기초하여 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10에 기재된 올리고뉴클레오타이드를 합성하여 LA-PCR 인 비트로 클로닝 키트의 프로토콜에 따라 실시한다.
fruA 유전자 부분 단편의 3′미지 영역에 관해서는, 브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC13869의 염색체 DNA를 HindIII 처리후, 키트 내의 HindIII 어댑터와 연결한 다음, 1차 PCR로서 서열번호 7 및 서열번호 11에 의한 PCR을, 2차 PCR로서 서열번호 8 및 서열번호 12에 의한 PCR을 실시한다. 이러한 PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동한 바, 약 700bp의 밴드가 확인된다. 이러한 밴드를 Suprec ver.2(다카라 슈조)를 사용하여 정제하고 서열번호 8 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 <1>에 기재된 방법과 동일하게 수행하여 70Obp의 PCR 산물에 함유되는fruA 유전자의 염기 서열을 결정한다.
fruA 유전자 부분 단편의 5′미지 영역에 관해서는, 브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC13869의 염색체 DNA를 BamHI 처리후, 키트 내의 Sau3AI 어댑터와 연결한 다음, 1차 PCR로서 서열번호 9 및 서열번호 11에 의한 PCR을, 2차 PCR로서 서열번호 10 및 서열번호 12에 의한 PCR을 실시한다. 이러한 PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동한 바, 약 1500bp의 밴드가 확인된다. 이러한 밴드를 Suprec ver.2(다카라 슈조)를 사용하여 정제하고 서열번호 10 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 <1>에 기재된 방법과 동일하게 수행하여 1500bp의 PCR 산물에 함유되는 fruA 유전자의 염기 서열을 결정한다.
이와 같이 결정된 염기 서열 중에서 fruA 유전자를 함유하는 약 3380bp의 fruA 유전자를 포함한 염기 서열을 서열목록 중 서열번호 13에 기재한다. 이러한 염기 서열로부터 추정되는 오픈 리딩 프레임을 아미노산 서열로 번역한 서열을 서열번호 14에 기재한다. 즉, 서열목록 중 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질이 브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC13869의 FruA이다. 또한, 단백질 N말단 측에 있는 메티오닌 잔기는 개시 코돈인 ATG에서 유래하므로 단백질 원래의 기능과는 무관계한 것이 많으며 번역 후의 펩티다제의 작용에 의해 제거되는 것이 잘 알려져 있으며 단백질의 경우에도 메티오닌 잔기의 제거가 생길 가능성이 있다.
염기 서열 및 아미노산 서열 각각에 대해 기지의 서열과의 상동성 비교를 실시한다. 사용하는 데이터 베이스는 GeneBank 및 SWISS-PROT이다. 그 결과, 서열목록 중 서열번호 13에 기재된 DNA는 이미 보고되어 있는 fruA 유전자와 상동성을 갖는, 코리네박테리움속 세균에 속하는 신규한 유전자인 것으로 판명됐다.
서열번호 13에 기재된 DNA는 바실러스 서브틸리스, 에스케리키아 콜리, 마이코플라즈마 게니탈리움 및 크산토모나스 콤페스트리스 각각의 fruA와 아미노산 수준으로 각각 42.1%, 51.0%, 37.4% 및 45.5%의 상동성을 나타낸다. 또한, 염기 서열 및 아미노산 서열은 제니틱스-맥 컴퓨터 프로그램(Genetyx-Mac computer program; 소프트웨어가이하쓰, 도쿄)에 의해 해석한다. 상동성 해석은 리프먼(Lipman)과 피어슨(Peason)의 방법(Science, 227, 1435-1441, 1985)에 따라 실시한다.
본 발명에 따라 코리네형 세균의 L-리신 또는 L-글루탐산 등의 L-아미노산의 생산능력을 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 신규한 브레비박테리움 락토페르멘툼 유래의 프룩토스 포스포트랜스페라제 유전자가 제공된다. 상기 유전자는 본 발명에 따른 L-아미노산의 제조에 적합한 코리네형 세균 등의 육종에 적절하게 사용할 수 있다.

Claims (10)

  1. 세포 중의 프룩토스 포스포트랜스페라제 활성을 증강시키며 또한 L-아미노산 생산능력을 갖는 코리네형 세균.
  2. 제1항에 있어서, L-아미노산이 L-리신, L-글루탐산, L-트레오닌, L-이소로이신 및 L-세린으로부터 선택되는 코리네형 세균.
  3. 제1항에 있어서, 프룩토스 포스포트랜스페라제 활성의 증강이 세균 세포내의 프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 유전자의 카피수를 증가시키는 것에 의한 코리네형 세균.
  4. 제3항에 있어서, 프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 유전자가 에스케리키아속 세균 유래인 코리네형 세균.
  5. 제3항에 있어서, 프룩토스 포스포트랜스페라제를 암호화하는 유전자가 코리네형 세균 유래인 코리네형 세균.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따른 코리네형 세균을 배지에 배양하고, 당해 배양물 중에 L-아미노산을 생성 축적시켜 배양물로부터 L-아미노산을 채취하는 것을 특징으로 하는 L-아미노산의 제조법.
  7. 제6항에 있어서, L-아미노산이 L-리신, L-글루탐산, L-트레오닌, L-이소로이신 및 L-세린으로부터 선택되는 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 배지가 탄소원으로서 프룩토스를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. (A)서열목록 중 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는
    (B)서열목록 중 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지며, 또한 프룩토스 포스포트랜스페라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
  10. 제9항에 있어서, DNA가
    (a)서열목록 중 서열번호 13에 기재된 염기 서열 중에서 염기번호 881 내지 2944로 이루어진 염기 서열을 포함하는 DNA, 또는
    (b)서열목록 중 서열번호 13에 기재된 염기 서열중에서 염기번호 881 내지 2944로 이루어진 염기 서열 또는 상기 염기 서열로부터 조제될 수 있는 프로브와, 스트린전트한 조건하에 하이브리드화하며 또한, 프룩토스 포스포트랜스페라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA로 정의되는 DNA.
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Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2373863T3 (es) 1995-06-07 2012-02-09 Ajinomoto Co., Inc. Procedimiento de producción de l-lisina.
PL341895A1 (en) * 1999-08-12 2001-02-26 Ajinomoto Kk Plasmide autonomously replicable in corynebacter bacteria
JP3932945B2 (ja) 2002-03-27 2007-06-20 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2004166595A (ja) 2002-11-20 2004-06-17 Ajinomoto Co Inc メチロトローフを用いたｌ−アミノ酸の製造法
EP1484410B1 (en) * 2003-06-05 2011-11-02 Ajinomoto Co., Inc. Fermentation methods using modified bacteria with increased byproduct uptake.
RU2337140C2 (ru) * 2003-07-29 2008-10-27 Адзиномото Ко., Инк. Способ продуцирования l-лизина или l-треонина с помощью бактерий escherichia, имеющих аттенуированную активность малеинового фермента
JP4380305B2 (ja) * 2003-11-21 2009-12-09 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
ES2331956T3 (es) * 2004-01-30 2010-01-21 Ajinomoto Co., Inc. Microorganismo que produce l-aminoacidos y procedimiento para producir l-aminoacidos.
US7344874B2 (en) * 2004-03-04 2008-03-18 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
US7300776B2 (en) * 2004-04-26 2007-11-27 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid-producing bacterium and a method for producing L-amino acid
US7482140B2 (en) * 2004-06-15 2009-01-27 Ajinomoto Co., Inc. L-tyrosine-producing bacterium and a method for producing L-tyrosine
US7205132B2 (en) * 2004-09-10 2007-04-17 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
US7794989B2 (en) * 2004-12-28 2010-09-14 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
WO2006078039A1 (en) 2005-01-18 2006-07-27 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid producing microorganism and a method for producing l-amino acid
US20070004014A1 (en) * 2005-06-29 2007-01-04 Yuichiro Tsuji Method for producing l-threonine
BRPI0620880B1 (pt) * 2006-01-04 2018-10-09 Evonik Degussa Gmbh método para a produção de metionina, pelo cultivo de um microorganismo, e, microorganismo
US20090038005A1 (en) * 2007-07-31 2009-02-05 Cisco Technology, Inc. Privilege-based access system
KR101294935B1 (ko) * 2011-04-01 2013-08-08 씨제이제일제당 (주) 에세리키아 속 균주에서 유래된 프락토키나제 유전자가 도입된 코리네박테리움 속 균주 및 상기 균주를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법
KR101518860B1 (ko) * 2013-10-11 2015-05-12 씨제이제일제당 (주) L-아미노산의 생산 방법
EP4095244A4 (en) * 2021-04-12 2023-06-21 CJ Cheiljedang Corporation NOVEL SUGAR PHOSPHATE ISOMERASE/EPIMERASE VARIANT AND METHOD FOR PRODUCING L-LYSINE USING THE SAME

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07108228B2 (ja) * 1990-10-15 1995-11-22 味の素株式会社 温度感受性プラスミド
JP3473042B2 (ja) * 1992-04-28 2003-12-02 味の素株式会社 変異型アスパルトキナーゼ遺伝子
US5876983A (en) * 1993-08-24 1999-03-02 Ajinomoto Co., Inc. Mutant phosphoenolpyruvate carboxylase, its gene, and production method of amino acid
DK0754756T3 (da) * 1994-03-04 2006-03-13 Ajinomoto Kk Fremgangsmåde til fremstilling af L-lysin
EP0756007A3 (en) * 1995-06-30 1997-10-29 Ajinomoto Kk Gene-marking process with artificial transposon
JP4035855B2 (ja) * 1996-06-05 2008-01-23 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法
SK285201B6 (sk) * 1996-12-05 2006-08-03 Ajinomoto Co., Inc. Rekombinantná DNA, autonómne reprodukovaná v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu, vektor pVK7
JP4075087B2 (ja) * 1996-12-05 2008-04-16 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法
JP3997631B2 (ja) * 1998-01-12 2007-10-24 味の素株式会社 発酵法によるｌ−セリンの製造法
JP4066543B2 (ja) * 1998-01-12 2008-03-26 味の素株式会社 発酵法によるｌ−セリンの製造法
US6884614B1 (en) * 1999-07-01 2005-04-26 Basf Aktiengesellschaft Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins
JP4623825B2 (ja) * 1999-12-16 2011-02-02 協和発酵バイオ株式会社 新規ポリヌクレオチド
US6395528B1 (en) * 2000-01-27 2002-05-28 Ajinomoto Co., Inc. Phosphoserine phosphatase gene of coryneform bacteria

Also Published As

Publication number Publication date
BR0016656A (pt) 2002-11-05
CN1230525C (zh) 2005-12-07
DE60041083D1 (de) 2009-01-22
JP4306169B2 (ja) 2009-07-29
US20040121428A1 (en) 2004-06-24
WO2001048146A1 (fr) 2001-07-05
AU2223601A (en) 2001-07-09
ATE417094T1 (de) 2008-12-15
ZA200204724B (en) 2003-12-13
EP1241246A1 (en) 2002-09-18
EP1241246A4 (en) 2004-03-24
CN1434860A (zh) 2003-08-06
EP1241246B1 (en) 2008-12-10

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