WO2001048146A1 - Procede de production d'acide l-amine et nouveau gene - Google Patents

Procede de production d'acide l-amine et nouveau gene Download PDF

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WO2001048146A1
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seq
dna
coryneform bacterium
lysine
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Masakazu Sugimoto
Yuta Nakai
Hisao Ito
Osamu Kurahashi
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Ajinomoto Co., Inc.
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
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    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an L-amino acid by a fermentation method, particularly to a method for producing L-lysine and L-glutamic acid, a microorganism used in the method, and a novel gene.
  • L-Lysine is widely used as a feed additive and L-glucamic acid is widely used as a seasoning material.
  • L-amino acids such as L-lysine and L-glutamic acid have been produced by fermentation using a coryneform bacterium belonging to the genus Brevipacterium or Corynepacterium, which has the ability to produce these L-amino acids. It is industrially produced.
  • coryneform bacteria strains isolated from the natural world or artificial mutants of the strains are used in order to improve productivity.
  • 63-214189 discloses that the glutamate dehydrogenase gene, the isocitrate dehydrogenase gene, the aconitate hydratase gene, and the citrate synthase gene are enhanced. Techniques for increasing the ability to produce L-glucamic acid have been disclosed.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing L-amino acids such as L-lysine or L-glutamic acid by a fermentation method which has been further improved than before, and a strain used therefor.
  • Another object of the present invention is to provide a gene encoding fructose phosphotransferase of a coryneform bacterium which can be suitably used for the construction of the strain.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above problems, and as a result, introduced a gene encoding fructoose phosphotransferase into a coryneform bacterium. It has been found that the production of L-lysine or L-glutamic acid can be increased by amplifying the cutose phosphotransferase activity. In addition, the inventors succeeded in isolating the gene encoding fructose phosphotransferase of Brevibacterium lactofermentum, thereby completing the present invention. That is, the present invention is as follows.
  • Coryneform bacterium having enhanced fructose phosphotransferase activity in cells and having the ability to produce amino acids.
  • L-amino acid is selected from L-lysine, L-glutamic acid, L-threonine, L-isoleucine, and L-serine.
  • fructose phosphotransferase activity is due to an increase in the copy number of a gene encoding fructose phosphotransferase in the bacterial cell. Coryneform bacteria.
  • the coryneform bacterium according to any one of (1) to (5) is cultured in a medium, L-amino acids are produced and accumulated in the culture, and L_amino acids are collected from the culture.
  • L-amino acid is selected from L-lysine, L-glutamic acid, L-threonine, L-isoleucine, and L-serine.
  • the medium is characterized by containing fructose as a carbon source (6) or
  • the coryneform bacterium of the present invention is a coryneform bacterium having L-amino acid-producing ability and having enhanced fructose phosphotransferase activity in cells.
  • L-amino acids include L-lysine, L-glutamic acid, L-threonine, L-isoleucine, L-serine and the like. Among these, L-lysine and L-glutamic acid are preferred.
  • an embodiment of the present invention will be described mainly with respect to a coryneform bacterium having L-lysine-producing ability or L_glutamic acid-producing ability. The same applies for those located downstream from the phosphotransferase.
  • the coryneform bacterium as referred to in the present invention includes a group of bacteria defined in Beggie's Manual of Determinative, Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th edition, p. 599 (1974). It is a microorganism that is an aerobic, Gram-positive, non-acid-fast, and non-spore-forming bacillus, including bacteria that were previously classified as Brevibacterium but are now integrated as Corynepacterium ( Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)), and also include bacteria of the genus Brevipacterium and Microbatterium which are closely related to the genus Corynepacterium.
  • the strains of coryneform bacteria suitably used for the production of L-lysine or L-glutamic acid include, for example, those shown below. Corynebacterium acetate film ATCC13870
  • Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539) To obtain them, for example, use the American Type 'Culture Collection (American Type Culture Collection, Address 12301 Parklawn Drive, Rockvil le, Maryland 20852, United States) of America). That is, a registration number corresponding to each microorganism is assigned, and the microorganism can be ordered by referring to this registration number. The registration number corresponding to each microorganism can be found in the catalog of the American Type Cultureya Collection. Also, AJ12340 strain was deposited with the Ministry of International Trade and Industry at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Postal Code 305-85666, 1-3-1 Tsukuba-Higashi, Ibaraki, Japan) under the Budapest Treaty. I have.
  • mutants having L-amino acid-producing ability such as L-lysine or L-glucamic acid derived from these strains can also be used in the present invention.
  • Such artificial mutants include the following. S- (2-aminoethyl) cysteine (hereinafter abbreviated as "AEC") resistant mutant (for example, Brevipacterium 'Lactofamentum AJ11082 (NRRL B-11470), Japanese Patent Publication No.
  • JP-B-56-1915 JP-B-57-14157, JP-B-57-14158, JP-B-57-30474, JP-B-58-10075, JP-B-59-4993, JP-B-61-35840, Tokiko Sho 62-24074, Tokiko No. 62-36673, Japanese Patent Publication No. 5-11958, Japanese Patent Publication No. 7-112437, Japanese Patent Publication No. 7-112438), mutants that require amino acids such as L-homoserine for their growth (Japanese Patent Publication No. 48-28078) No.
  • coryneform bacteria having L-threonine-producing ability examples include corynebacterium .acetoacidophilum AJ12318 (FER BP-1172) (see US Pat. No. 5,188,949) and the like.
  • Examples of the coryneform bacterium having the function include Brevipakterium flavum AJ12149 (FERM BP-759) (see US Pat. No. 4,656,135).
  • a gene fragment encoding fructose phosphotransferase is ligated to a vector that functions in the bacterium, preferably a multicopy type vector.
  • Recombinant DNA may be prepared and introduced into a coryneform bacterium having the ability to produce L-lysine or L-glucamic acid, for transformation.
  • Fructose in the cells of the transformed strain Increased copy number of the gene encoding sufotransferase results in amplification of fructose phosphotransferase activity.
  • Fructose phosphotransferase is encoded by the fruA gene in Escherichia coli.
  • the fructosylphosphotransferase gene is preferably a coryneform bacterium gene, but any gene derived from other organisms such as a bacterium belonging to the genus Escherichia can be used.
  • coryneform bacteria such as the fruA gene derived from Brevipacterium 'lactofarmentum include Bacillus subtilis, Escherichia coli, and Mycoplasma genitalium. (Mycoplasma genitalium), Xanthomonas compestris (Xanthomonas compestris), etc., and select a region with high homology between amino acid sequences predicted from known fruA genes, and the amino acid sequence of that region.
  • a primer for PCR can be synthesized on the basis of the above, and a partial sequence can be obtained by performing a PCR reaction using Brevibacterium lactofermentum as type II. Examples of the primer include the oligonucleotides shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
  • the inverse PCR (Genetics, 120, 621-623 (1988)) method, or LA-PCR in vitro cloning kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) Obtain the 5 'unknown region and the 3 unknown region of the fruA gene by the method using When LA-PCR in vitro cloning kit is used, the 3 'unknown region of the fruA gene may be, for example, a primary PCR using a primer shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 9, a secondary PCR using SEQ ID NO: 6, and It can be obtained by performing PCR using the primer shown in SEQ ID NO: 10.
  • the 5 ′ unknown region of the fruA gene partial fragment can be obtained by, for example, using primary primers shown in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID CR can be obtained by performing PCR using the primers shown in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 10 as secondary PCR.
  • the nucleotide sequence of a DNA fragment containing the entire length of the fruA gene thus obtained is shown in SEQ ID NO: 13.
  • a sequence obtained by translating the open reading frame deduced from this nucleotide sequence into an amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 14.
  • the present invention has revealed the fruA gene of Brevibacterium lactofermentum and the nucleotide sequences of the flanking regions thereof, and thus the oligonucleotide designed based on the nucleotide sequences of these flanking regions was used as a primer. By PCR, a DNA fragment containing the full length of the fruA gene can be obtained.
  • the fruA gene of the present invention may have one or several amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions at one or more positions, as long as the fructose phosphotransferase activity of the encoded protein is not impaired. It may encode fructose phosphotransferase containing the following.
  • the term “several” depends on the position and type of amino acid residue in the protein three-dimensional structure, but is specifically 2 to 200, preferably 2 to 50. And more preferably 2 to 20.
  • DNA encoding a protein substantially identical to fructose phosphotransferase as described above can be obtained by substituting, deleting, or inserting an amino acid residue at a specific site by, for example, site-directed mutagenesis.
  • FluA can be obtained by modifying the nucleotide sequence of fluA so that it contains an inversion, an addition or an inversion. Further, the modified DNA as described above can also be obtained by a conventionally known mutation treatment.
  • Examples of the mutation treatment include a method in which DNA before the mutation treatment is treated in vitro with hydroxylamine or the like, and a method for irradiating a microorganism holding the DNA before the mutation treatment, for example, a bacterium belonging to the genus Escherichia with ultraviolet irradiation or N-methyl-1N, 12- Examples of the method include treatment with a mutagen that is commonly used for mutagenesis such as 1-N-nitrosogazine (NTG) or nitrous acid.
  • NTG 1-N-nitrosogazine
  • the DNA encoding the protein is obtained.
  • a base sequence consisting of base numbers 881-2944 out of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 in the sequence listing or Isolation of DNA encoding a protein having hybridizing activity with a probe having a part thereof under stringent conditions and having fructophosphophosphotransferase activity can also be performed by isolating fructophosphotransferase.
  • a DNA encoding a protein substantially identical to the above is obtained.
  • stringent conditions refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. Although it is difficult to quantify this condition clearly, one example is that DNAs with high homology, for example, DNAs with 50% or more homology, hybridize, and the homology is higher. 60 ° C, lx SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 lx SSC, 0.1%, which is the condition under which low DNA does not hybridize with each other or washing conditions for normal Southern hybridization. Conditions for washing at a salt concentration equivalent to SDS are listed.
  • a partial sequence of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 can also be used as a probe.
  • a probe can be prepared by PCR using an oligonucleotide prepared based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 as a primer and a DNA fragment containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 as type III.
  • washing conditions for hybridization are 50 ° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS.
  • fructose phosphotransferase activity can be easily selected by measuring the fructose phosphotransferase activity by the method described in Mori, M. & Shiio, 1-Climbing, Agric. Biol. Chem., 51, 129-138 (1987). Can be.
  • the DNA encoding a protein substantially the same as fructose phosphotransferase has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, preferably 55% or more, more preferably 60% or more, and still more preferably Over 80% homology And a DNA encoding a protein having fructosyl phosphotransferase activity.
  • Chromosomal DNA can be obtained from bacteria that are DNA donors, for example, by the method of Saito and Miura (H. Saito and .Miura Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Bioengineering Experiments, Japan Society for Biotechnology) Pp. 97-98, Baifukan, 1992).
  • the gene encoding fructose phosphotransferase amplified by the PCR method is connected to a vector DNA capable of autonomous replication in cells of Escherichia coli and / or coryneform bacteria to prepare recombinant DNA, If this is introduced into Escherichia coli cells, subsequent operations will be slow.
  • a vector capable of autonomously replicating in Escherichia coli cells a plasmid vector is preferred, and a vector capable of autonomous replication in a host cell is preferable.
  • Examples of vectors that can replicate autonomously in the cells of coryneform bacteria include PAM330 (see Japanese Patent Publication No. 58-67699) and pHM1519 (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-77895).
  • PAM330 see Japanese Patent Publication No. 58-67699
  • pHM1519 see Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-77895.
  • a DNA fragment capable of autonomously replicating plasmid in a coryneform bacterium is extracted from these vectors and inserted into the Escherichia coli vector, autonomous replication in both Escherichia coli and coryneform bacteria is achieved.
  • Not possible Can be used as a shuttle vector.
  • the accession numbers of the microorganisms holding the respective vectors and the international depository organizations are shown in parentheses.
  • PAJ611 Escherichia Cori AJ11884 (FERM BP-138)
  • the cells of a DNA recipient such as those known for Bacillus' subtilis, actinomycetes and yeast, can be transformed into protoplasts or spheroid blasts that readily incorporate the recombinant DNA, and the recombinant DNA Method for introduction into bacteria (Chang, S. and Chond, SN, Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979) Bibb, MJ, Ward, JMand Hopwood, 0.A., Nature, 274, 398 ( 1978); Hinnen, A., Hicks, JBand Fink, GR, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)).
  • the transformation method used in the examples of the present invention is the electric pulse method (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-207791).
  • Amplification of the activity of encoding fructose phosphotransferase can also be achieved by the presence of multiple copies of the gene encoding fructose phosphotransferase on the chromosomal DNA of the host.
  • homologous recombination is performed by using a sequence present in the chromosomal DNA in a multiple copy as a target.
  • Sequences present in multiple copies on chromosomal DNA include native DNA and inverted repeats at the end of transposable elements. Available.
  • a gene encoding fructophosphotransferase is mounted on a transposon, transferred, and placed on chromosomal DNA. It is also possible to introduce multiple copies into the system. Either method increases the copy number of the fructose phosphotransferase-encoding gene in the transformant, resulting in amplification of fructosylphosphotransferase activity.
  • Amplification of fructose phosphotransferase activity can be achieved not only by the above-described gene amplification, but also by using expression control sequences such as the promoter of the gene encoding fructose phosphotransferase on chromosomal DNA or plasmid. This can also be achieved by substituting a compound (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-215280). For example, lac promoter evening one, trp promoter Isseki one, trc promoter Isseki one, known tac flop port motor, promoter Isseki one lambda phage, as P L promoter Isseki flop port motor-Chief is strong ing. The substitution with these promoters enhances the expression of the gene encoding fructosylphosphotransferase, thereby amplifying the fructosylphosphotransferase activity.
  • coryneform bacterium of the present invention can enhance the enzyme activity of other amino acid biosynthetic pathways or glycolytic pathways, in addition to the fructose phosphotransferase activity, so that their enzymatic activities are enhanced.
  • genes that can be used for the production of L-lysine include aspartokinase subunit protein in which synergistic feedback inhibition by L-lysine and: L-threonine has been substantially released.
  • a gene encoding a subunit protein W094 / 25605 International Publication Pamphlet
  • a wild-type phosphoenorubyruvate carboxylase gene derived from a coryneform bacterium Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-87788
  • a gene encoding a dihydrodipicolinate synthase Japanese Patent Publication No. 6-55149 is known.
  • genes that can be used for the production of L-glutamic acid include glutamate dehydrogenase (GDH, Japanese Patent Application Laid-Open No. Sho 61-268185), glutamine synthase, and glutamate synthase. , Isoquenate dehydrogenase (Japanese Patent Application Laid-Open No. Sho 62-166890, Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-214189), hydric aconitate (Japanese Patent Application Laid-Open No. Sho 62-294,086), quinic acid synthase, pyruvate carboxylase (Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-87778, Japanese Patent Application Laid-Open No. No.
  • an enzyme that catalyzes a reaction that diverges from a target L-amino acid biosynthetic pathway to produce a compound other than the same L-amino acid may be reduced or lacking.
  • homoserine dehydrogenase is an enzyme that catalyzes a reaction that produces a compound other than L-lysine by branching off from the biosynthetic pathway of L-lysine (see W095 / 23864).
  • enzymes that catalyze the reaction of producing a compound other than L-glutamic acid by branching off from the L-glutamic acid biosynthetic pathway include: ketoglutarate dehydrogenase, isoquenate lyase, phosphate Acetyl transferase, acetate kinase, acetate hydroxysynthesis, acetate lactate synthase, acetyl formate transferase, lactate dehydrogenase, glutamate decarboxylase, 1-pyrophosphate dehydrogenase , Etc.
  • a biotin action inhibitor such as a surfactant to a coryneform bacterium capable of producing L-glutamic acid
  • the biotin action inhibitor in a medium containing an excessive amount of biotin can be added.
  • L-glutamic acid can be produced in the absence of E. coli (see W096 / 06180).
  • Examples of such coryneform bacteria include Brevipacterium lactofermentum AJ13029 described in W096 / 06180.
  • the AJ 13029 strain was granted to the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Institute of Industrial Science and Technology (Postal Code 305-8566, 1-3 1-3 Tsukuba-Higashi, Ibaraki, Japan) on September 2, 1994, with accession number FERM P-14501. And transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on August 1, 1995, and given accession number FERM BP-5189.
  • a coryneform bacterium capable of producing L-lysine and L-glutamic acid is given a temperature-sensitive mutation against a substance that suppresses the action of piotin, so that an excessive amount of L-Lysine and L-glutamic acid can be produced simultaneously in a medium containing tin in the absence of a biotin-inhibiting substance (see W096 / 06180).
  • a coryneform bacterium capable of producing L-lysine and L-glutamic acid is given a temperature-sensitive mutation against a substance that suppresses the action of piotin, so that an excessive amount of L-Lysine and L-glutamic acid can be produced simultaneously in a medium containing tin in the absence of a biotin-inhibiting substance (see W096 / 06180).
  • Examples of such a strain include the Brevibacterium 'lactofermentum AJ12993 strain described in W096 / 06180.
  • the strain was submitted to the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Institute of Industrial Science and Technology (Postal Code: 305-8566, 1-3 1-3 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan) on June 3, 1994, with accession number FERM P. -Deposited at 14348, transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on August 1, 1995, and given accession number FERM BP-5188.
  • a coryneform bacterium having an increased fructoses phosphotransferase activity and capable of producing L-amino acids is cultured in a suitable medium, the L-amino acids accumulate in the medium.
  • a coryneform bacterium having an amplified fructophosphotransferase activity and capable of producing L-lysine acid is cultured in a suitable medium, L-lysine accumulates in the medium.
  • L-glutamic acid accumulates in the medium.
  • L-lysine and L-glucamate can be obtained. Accumulate in the medium.
  • the L-lysine-producing bacterium may be cultured under L-glucaminic acid-producing conditions, or L-lysine-producing ability
  • a coryneform bacterium having the ability to produce L-glucamic acid may be mixedly cultured (Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-37993).
  • the medium used to produce L-amino acids such as L-lysine or L-glucamic acid using the microorganism of the present invention contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and if necessary, other organic micronutrients.
  • Carbon sources include carbohydrates such as glucose, lactose, galactose, fructose, sucrose, molasses, starch hydrolysates, alcohols such as ethanol and inositol, acetic acid, Organic acids such as malic acid, citric acid and succinic acid can be used.
  • fructose is particularly preferred among these.
  • Nitrogen sources include inorganic or organic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium acetate, ammonium, peptone, meat extract, yeast extract, yeast extract, corn 'sticker, soybean Organic nitrogen such as hydrolyzate, ammonia gas, aqueous ammonia, etc. can be used.
  • inorganic or organic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium acetate, ammonium, peptone, meat extract, yeast extract, yeast extract, corn 'sticker, soybean Organic nitrogen such as hydrolyzate, ammonia gas, aqueous ammonia, etc.
  • inorganic ions small amounts of potassium phosphate, magnesium sulfate, iron ions, manganese ions and the like are added.
  • organic trace nutrients it is desirable to include a required substance such as a vitamin or a yeast extract in an appropriate amount as necessary.
  • the cultivation is preferably carried out for 16 to 72 hours under aerobic conditions such as shaking cultivation and aeration and stirring cultivation.
  • the cultivation temperature is 30 to 45 ° C
  • the pH during cultivation is Control to 5-9.
  • an inorganic or organic acidic or alkaline substance, ammonia gas or the like can be used.
  • L-amino acid can be collected from the fermentation liquor in the same manner as in the usual L-amino acid production method.
  • L-lysine can be collected usually by a combination of an ion exchange resin method, a precipitation method and other known methods.
  • the method for collecting L-glutamic acid may be a conventional method, such as an ion exchange resin method or a crystallization method.
  • L-glutamic acid may be adsorbed and separated by an anion exchange resin, or may be neutralized and crystallized.
  • the nucleotide sequence of the fruA gene of Escherichia coli has already been determined (Genbank / EMBL / DDBJ accetion No. M23196). Based on the reported nucleotide sequence, the primers shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 were synthesized, and the chromosomal DNA of Escherichia coli JM109 strain was transformed into type ⁇ to obtain the fructophosphotransferase gene by PCR. Amplified.
  • SEQ ID NO: 1 corresponds to the sequence from the 1st to 24th base of the fruA gene base sequence described in Genbank / EMBL / DDBJ accetion No. M23196
  • SEQ ID NO: 2 corresponds to the sequence from the 20000th base to the 1977th base.
  • the chromosome DNA of Escherichia coli JM109 strain was prepared by a conventional method (Bioengineering Experiments, edited by The Society of Biotechnology, Japan, pages 97-98, Baifukan, 1992).
  • PCR reaction standard reaction conditions described on page 185 of the PCR method forefront (edited by Takeo Sekiya et al., Kyoritsu Shuppan, 1989) were used.
  • the resulting PCR product was purified by a conventional method, ligated with Smal-cleaved plasmid pHC4 using a ligase kit (Takara Shuzo), and then combined with Escherichia coli JM109 competent cells (Takara Shuzo). Transformation was performed using L medium containing 30 g / ml of chloramphenicol (10 g / L of Bacto Tribton, 5 g / L of Bactoist Extract, 5 g / L of NaCl, 15 g / L of agar, pH7 .2), and after overnight culture, appeared white colonies were picked and separated into single colonies to obtain transformed strains. Plasmid was extracted from the obtained transformant to obtain a plasmid pHC4fru in which the fruA gene was bound to the vector.
  • Escherichia coli harboring pHC4 was named AJ12617, a private naming company, and on April 24, 1991, the Institute of Biotechnology and Industrial Technology of the Ministry of International Trade and Industry (ZIP code 305). -8566 Deposit No. 1-3-3, Tsukuba, Ibaraki Prefecture, Japan, deposited under the accession number F ERM P— 1 2 2 15 Has been transferred to an international deposit under the Treaty, and has been assigned the accession number FE RM BP—3532.
  • the JM109 strain and the JM109 strain carrying pHC4fr were Fructose phosphotransferase activity was measured by the method described in Mori, M. & Shiio, I., Agric. Biol. Chem., 51, 129-138 (198 7).
  • the JM109 strain carrying pH C4 fru shows about 11 times the fructophosphophosphotransferase activity of the JM109 strain not carrying pHC4 fru.
  • Brevibacterium lactofermentum AJ13029 was transformed with plasmid pHC4fru by the electric pulse method (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-207791) to obtain the obtained transformant.
  • culture for producing L-glucamic acid was performed as follows.
  • AJ13029 / pHC4fru strain obtained by culturing on a CM2B plate medium containing 5 ⁇ g / ml of guq ramphenicol was added to a L cell having the following composition containing 5 ⁇ g / ml of guq ramphenicol.
  • —Glucinic acid production medium was inoculated, shake-cultured at 31.5 ° C, and shake-cultured until the sugar in the medium was consumed.
  • the obtained culture was inoculated into a medium having the same composition in an amount of 5%, and cultured at 37 ° C with shaking until the sugar in the medium was consumed.
  • a strain obtained by transforming a plasmid pHC4 capable of autonomous replication with a previously obtained corynebacterium bacterium into the corynebacterium bacterium AJ13029 strain by the electric pulse method was cultured in the same manner as described above. .
  • a strain obtained by transforming a plasmid pHC4 capable of autonomous replication with a previously obtained Corynebacterium bacterium into an Aj11082 strain of Corynebacterium by an electric pulse method was cultured in the same manner as described above.
  • Brevibacterium lactofermentum AJ11082 was established on January 31, 1981, by the Agricultural 'Research Services' Culture Service Collection (Agricultural Research Services Culture Collection, Illinois, United States, 6). 6 1 6 04 Deposited internationally at 1815 N. University Street, Peoria, Illinois 61604 USA, Peoria North-University Street, with accession number NRRL B-11470.
  • Protein hydrolyzate (bean concentrate) 30 ml
  • Brevibacterium lactofermentum AJ12993 was transformed with plasmid pHC4fru by the electric pulse method (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-207791) to obtain the obtained transformant.
  • culture for producing L-lysine and L-glucamic acid was performed as follows.
  • the cells of the AJ12993 / pHC4fru strain obtained by culturing in a CM2B plate medium containing 5 ⁇ g / ml chloramphenicol were added to the L-lysine production medium containing 5 ⁇ g / ml chloramphenicol.
  • the cells were inoculated and cultured at 31.5 ° C.
  • the culture temperature was shifted to 34 ° C, and the culture was performed with shaking until the sugar in the medium was consumed.
  • a strain obtained by transforming a corynebacterium genus AJ12993 strain by the electric pulse method with a plasmid PHC4 capable of autonomously replicating by a previously obtained corynebacterium bacterium was cultured in the same manner as described above.
  • Example 2 Isolation of the fruA gene of Brevibacterium lactofermentum 1> Obtaining a partial fragment of the fruA gene of Brevibacterium * lactofermentum ATCC13869
  • the reaction was ligated to pCR2.1 (Invitrogen) using the Original TA Cloning Kit (Invitrogen). After connection, Escherichia Here's Kori JM109 competent cell
  • Plasmid was prepared from the transformant using the alkaline method (Biotechnological Experiments, edited by Biotechnology Society of Japan, p. 105, Baifukan, 1992), and the oligonucleotides shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 were prepared.
  • the nucleotide sequences at both ends of the inserted fragment were determined by the method of Sanger (J. Mol. Biol., 143, 161 (1980)). Specifically, the nucleotide sequence was determined using a Genetic Analyzer ABI310 (Applied Biosystems) using a Big dye terminator sequencing kit (Applied Biosystems).
  • the determined nucleotide sequence was translated into amino acids, and the amino acid sequences predicted from the fruA genes of Bacillus subtilis, Escherichia coli, Mycoplasma genitalium, and Xanthomonas constris were compared. Therefore, the cloned fragment was determined to be the fruA gene derived from Brevipacterium 'lactofamentum. 2> Determination of the entire nucleotide sequence of the fruA gene of ATCC13869 at Brevipacterium and Lactofermen
  • the fragment contained in the plasmid prepared in 1> above is a partial fragment of the fruA gene, and it is necessary to determine the full-length nucleotide sequence of the fruA gene.
  • Methods for determining the unknown base sequence adjacent to the known region include the inverse PCR (Genetics, 120, 621-623 (1988)) method and the method using LA-PCR in vitro cloning kit (Takara Shuzo). Here, the unknown sequence was determined using the LA-PCR in vitro cloning kit.
  • oligonucleotides shown in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10 were synthesized based on the base sequence determined in ⁇ 1>, and the oligonucleotides were prepared by LA-PCR in vitro cloning kit. The protocol was followed.
  • the chromosomal DNA of Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 was treated with HindIII, ligated with the HindII Adapter in the Kit, and the primary PCR was performed using SEQ ID NO: 7, PCR using SEQ ID NO: 11 was performed, and PCR using SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 12 was performed as secondary PCR.
  • this PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, a band of about 700 bp was observed.
  • This band was purified using Suprec ver.2 (manufactured by Takara Shuzo) and converted into a 700 bp PCR product using the oligonucleotides of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 12 in the same manner as described in ⁇ 1>.
  • the nucleotide sequence of the contained fruA gene was determined.
  • the chromosome MA of Brevibacterium lactofamentum ATCC13869 was treated with BamHI, ligated with the Sau3AI Adapter in the Kit, and the primary PCR was performed as SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 PCR was performed using the sequences 10 and 12 as the secondary PCR.
  • SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 11 PCR was performed using the sequences 10 and 12 as the secondary PCR.
  • nucleotide sequence containing the fruA gene of about 3380 bp including the fruA gene is shown in SEQ ID NO: 13 in the Sequence Listing.
  • the base estimated from this nucleotide sequence The sequence obtained by translating the pun reading frame into an amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 14. That is, the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 of the Sequence Listing is FniA of Brevibacterium lactofermentum ATCC13869.
  • methionine residue at the N-terminal side of the protein is derived from the initiation codon ATG, it is often unrelated to the original function of the protein, and is often removed by the action of the post-translational peptide. Is well known, and methionine residues may be removed in the case of the above-mentioned proteins.
  • the MA shown in SEQ ID NO: 13 is composed of fruA of Bacillus subtilis, Escherichia coli, Mycoplasma genitalium, and fruA of Xanthomonas compestris; Showed 42.1%, 51.0%, 37.4%, and 45.5% homology, respectively.
  • the base sequence and the amino acid sequence were analyzed using the Genetyx-Mac computer program (software development, Tokyo). Homology analysis was performed according to the method of Lipman and Peason (Science, 227, 1435-1441, 1985). Industrial applicability
  • the ability of coryneform bacteria to produce L-amino acid such as L-lysine or L-glucamic acid can be improved.
  • the present invention provides a novel fructose phosphotransferase gene derived from Brevibacterium lactofermentum. The gene can be suitably used for breeding coryneform bacteria and the like suitable for producing L-amino acids according to the present invention.

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Description

明細書
L一アミノ酸の製造法及び新規遺伝子 技術分野
本発明は、 発酵法による L一アミノ酸の製造法、 特に L一リジン及び L—グル 夕ミン酸の製造法、 及び同方法に用いる微生物及び新規遺伝子に関する。 L—リ ジンは飼料添加物等として、 L -グル夕ミン酸は調味料原料等として広く用いら れている。 背景技術
従来、 L一リジン及び L—グルタミン酸等の L—アミノ酸は、 これらの Lーァ ミノ酸生産能を有するブレビパクテリゥム属ゃコリネパクテリゥム属に属するコ リネ型細菌を用いて発酵法により工業生産されている。 これらのコリネ型細菌は、 生産性を向上させるために、 自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株 が用いられている。
また、 組換え D N A技術により L _アミノ酸の生合成酵素を増強することによ つて、 L _アミノ酸の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。 例えば、 L—リジン生産能を有するコリネ型細菌において、 Lーリジン及び L—スレオニ ンによるフィードバック阻害が解除されたァスバルトキナーゼをコ一ドする遺伝 子 （変異型 lysC) 、 ジヒ ドロジピコリン酸レダク夕一ゼ遺伝子 （dapB) 、 ジヒ ド ロジピコリン酸シン夕ーゼ遺伝子 （dapA) 、 ジアミノピメリン酸デカルポキシラ —ゼ遺伝子 （lysA) 、 及びジアミノピメリン酸デヒ ドロゲナーゼ遺伝子 （ddh)
(W096/40934) 、 lysA及び ddh (特開平 9一 322774号） 、 lysC、 lysA及びホスホェ ノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子 （ppc) (特開平 10- 165180号） 、 変異 型 lysC、 dapBs dapA、 lysA及びァスパラギン酸ァミノ トランスフェラ一ゼ遺伝子
( aspC) (特開平 10- 215883号） を導入することにより、 同細菌の L—リジン生 産能が向上することが知られている。
また、 ェシエリヒア属細菌においては、 dapA、 変異型 lysC、 dapB、 ジアミノビ メリン酸デヒ ドロゲナ一ゼ遺伝子 （ddh) (又はテトラヒ ドロジピコリン酸スク シニラーゼ遺伝子 （dapD) 及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ遺伝 子 （dapE) ) を順次増強すると L—リジン生産能が向上することが知られている (W0 95/16042 ) 。 尚、 W0 95/16042ではテトラヒドロジピコリン酸スクシ二ラー ゼがスクシ二ルジァミノピメリン酸トランスアミナーゼと誤記されている。
一方、 コリネパクテリゥム属またはブレビパクテリゥム属細菌において、 ェシ エリヒア · コリ又はコリネバクテリゥム · グル夕ミクム由来のクェン酸シン夕一 ゼをコ一ドする遺伝子の導入が、 L一グル夕ミン酸生産能の増強に効果的であつ たことが報告されている （特公平 7- 121228号） 。 また、 特開昭 61- 268185号公報 には、 コリネバクテリゥム属細菌由来のグル夕ミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を 含む組換え体 D N Aを保有した細胞が開示されている。 さらに、 特閧昭 63- 21418 9号公報には、 グルタミン酸デヒ ドロゲナーゼ遺伝子、 イソクェン酸デヒ ドロゲ ナーゼ遺伝子、 アコニッ ト酸ヒ ドラターゼ遺伝子、 及びクェン酸シン夕ーゼ遺伝 子を増強することによって、 L—グル夕ミン酸の生産能を増加させる技術が開示 されている。
しかし、 フルク トースホスホトランスフェラーゼをコ一ドする遺伝子の構造は コリネ型細菌では報告されておらず、 フルク トースホスホトランスフェラーゼを コードする遺伝子をコリネ型細菌の育種に利用することも知られていない。
尚、 ブレビパクテリゥム属細菌等のコリネ型細菌のフルク トースホスホトラン スフエラーゼをコ一ドする遺伝子は知られていない。 発明の開示
本発明は、 従来よりもさらに改良された発酵法による Lーリジン又は Lーグル 夕ミン酸等の L—アミノ酸の製造法、 及びそれに用いる菌株を提供することを課 題とする。 また本発明の他の課題は、 前記菌株の構築に好適に利用することがで きるコリネ型細菌のフルク トースホスホトランスフェラーゼをコ一ドする遺伝子 を提供することである。
本発明者等は、 上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、 フルク トー スホスホトランスフェラーゼをコ一ドする遺伝子をコリネ型細菌に導入し、 フル ク ト一スホスホトランスフェラ一ゼ活性を増幅することにより、 L一リジン又は L—グルタミン酸の生産量を増大させることができることを見出した。 また、 ブ レビバクテリゥム · ラク トフアーメンタムのフルク トースホスホトランスフェラ —ゼをコードする遺伝子を単離することに成功し、 本発明を完成するに至った。 すなわち本発明は、 以下のとおりである。
( 1 ) 細胞中のフルク トースホスホトランスフェラ一ゼ活性が増強され、 かっし —アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌。
( 2 ) 前記 L—アミノ酸が、 L一リジン、 L一グルタミン酸、 L—スレオニン、 L—イソロイシン、 L—セリンから選ばれる （ 1 ) のコリネ型細菌。
(3) 前記フルク トースホスホトランスフヱラーゼ活性の増強が、 前記細菌細胞 内のフルク トースホスホトランスフェラ一ゼをコ一ドする遺伝子のコピー数を高 めることによるものである前記 （ 1 ) のコリネ型細菌。
( 4 ) 前記フルク トースホスホトランスフェラ一ゼをコ一ドする遺伝子がェシェ リヒア属細菌由来である （ 3 ) のコリネ型細菌。
(5) 前記フルク トースホスホトランスフェラ一ゼをコ一ドする遺伝子がコリネ 型細菌由来である （ 3 ) のコリネ型細菌。
( 6 ) 前記 （ 1 ) 〜 （ 5 ) のいずれかのコリネ型細菌を培地に培養し、 該培養物 中に L—アミノ酸を生成蓄積せしめ、 該培養物から L _アミノ酸を採取すること を特徴とする L—アミノ酸の製造法。
( 7 ) 前記 L—アミノ酸が、 L—リジン、 L—グルタミン酸、 Lースレオニン、 L一イソロイシン、 L—セリンから選ばれる （ 6 ) の方法。
(8) 前記培地は炭素源としてフルク トースを含むことを特徴とする （6 ) 又は
( 7) 記載の方法。
( 9) 下記 （A) 又は （B) に示すタンパク質をコードする D NA。
(A) 配列表の配列番号 1 4に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
(B) 配列表の配列番号 1 4に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個 のアミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、 かつ、 フルク トースホスホトランスフェラ一ゼ活性を有するタンパク質。
( 1 0 ) 下記 （a) 又は （b) に示す DNAである （ 9 ) の DNA。 ( a ) 配列表の配列番号 1 3に記載の塩基配列のうち、 塩基番号 8 8 1〜 2 9 4 4からなる塩基配列を含む D N A。
( b ) 配列表の配列番号 1 3に記載の塩基配列のうち、 塩基番号 8 8 1〜 2 9 4 4からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとス トリンジェ ントな条件下でハイブリダィズし、 かつ、 フルク トースホスホトランスフェラ一 ゼ活性を有するタンパク質をコ一ドする D N A。 以下、 本発明を詳細に説明する。
< 1 >本発明のコリネ型細菌
本発明のコリネ型細菌は、 L—アミノ酸生産能を有し、 細胞中のフルク トース ホスホトランスフヱラーゼ活性が増強されたコリネ型細菌である。 L一アミノ酸 としては、 L—リジン、 L一グルタミン酸、 L—スレオニン、 L—イソロイシン、 L—セリン等が挙げられる。 これらの中では、 L一リジン及び L一グルタミン酸 が好ましい。 以下、 本発明の実施の形態を、 主として L—リジン生産能又は L _ グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌について説明するが、 本発明は、 目的 とする Lーァミノ酸固有の生合成系がフルク トースホスホトランスフェラーゼょ りも下流に位置するものについては同様に適用され得る。
本発明でいうコリネ型細菌としては、 バ一ジーズ · マニュアル · ォブ · デター ミネィティブ 、'クテリオロジ一 ( Bergey' s Manual of Determinative Bacteri ology) 第 8版 599頁 （1974) に定義されている一群の微生物であり、 好気性， グ ラム陽性， 非抗酸性， 胞子形成能を有しない桿菌であり、 従来ブレビバクテリウ ム属に分類されていたが現在コリネパクテリゥム属細菌として統合された細菌を 含み （Int . J. Syst. Bacteriol . , 41 , 255 ( 1981 ) ) 、 またコリネパクテリゥム 属と非常に近縁なブレビパクテリゥム属細菌及びミクロバテリゥム属細菌を含む。 L—リジン又は L—グルタミン酸の製造に好適に用いられるコリネ型細菌の菌株 としては、 例えば以下に示すものが挙げられる。 コリネバクテリゥム · ァセトァシドフィルム ATCC13870
コリネバタテリゥム · ァセ トグルタミクム ATCC15806
コリネバクテリウム · カルナェ ATCC15991 コリネバクテリゥム · グル夕ミクム ATCC13032
(ブレビバクテリウム · ディノ、リカタム） ATCC14020
(ブレビバクテリウム · ラク トフアーメンタム） ATCC13869
(コリネバクテリウム · リ リウム） ATCC15990
(ブレビバクテリウム · フラバム） ATCC14067
コリネバクテリゥム メラセコーラ ATCC17965
ブレビパクテリゥム サヅカロリティクム ATCC14066
ブレビバクテリゥム インマリオフィルム ATCC14068
ブレビバクテリゥム ロゼゥム ATCC13825
ブレビバクテリゥム チォゲ二夕リス ATCC19240
ミクロバクテリゥム アンモニアフィラム ATCC15354
コリネバクテリゥム サーモアミノゲネス AJ12340(FERM BP-1539) これらを入手するには、 例えばアメリカン · タイプ ' カルチヤ一 · コレクショ ン (American Type Culture Collection、 住所 12301 Parklawn Drive, Rockvil le， Maryland 20852, United States of America) より分譲を受けることができ る。 すなわち、 各微生物ごとに対応する登録番号が付与されており、 この登録番 号を引用して分譲を受けることができる。 各微生物に対応する登録番号はァメリ カン · タイプ ' カルチヤ一 · コレクションのカタログに記載されている。 また、 AJ12340株は、 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （郵便番号 305- 856 6 曰本国茨城県つくば巿東一丁目 1番 3号） にブダペス ト条約に基づいて寄託さ れている。
また、 上記菌株以外にも、 これらの菌株から誘導された L一リジン又は L—グ ル夕ミン酸等の L—アミノ酸生産能を有する変異株等も、 本発明に利用できる。 この様な人工変異株としては次の様なものがある。 S— ( 2—アミノエチル） 一 システィン （以下、 「AEC」 と略記する） 耐性変異株 （例えば、 ブレビパクテリ ゥム ' ラク トフアーメンタム AJ11082 (NRRL B-11470) 、 特公昭 56-1914号、 特公 昭 56-1915号、 特公昭 57- 14157号、 特公昭 57- 14158号、 特公昭 57-30474号、 特公 昭 58- 10075号、 特公昭 59- 4993号、 特公昭 61- 35840号、 特公昭 62-24074号、 特公 昭 62- 36673号、 特公平 5-11958号、 特公平 7-112437号、 特公平 7-112438号参照） 、 その成長に L—ホモセリン等のアミノ酸を必要とする変異株 （特公昭 48-28078号、 特公昭 56-6499号） 、 AECに耐性を示し、 更に L一口イシン、 L—ホモセリン、 L 一プロ リン、 L—セリ ン、 L—アルギニン、 L—ァラニン、 L—パリ ン等のアミ ノ酸を要求する変異株 （米国特許第 3708395号及び第 3825472号） 、 D L—ひ—ァ ミノー £—力プロラクタム、 ひーァミノ一ラウリルラクタム、 ァスパラギン酸一 アナログ、 スルファ剤、 キノイ ド、 N—ラウロイルロイシンに耐性を示す L—リ ジン生産変異株、 ォキザ口酢酸脱炭酸酵素 （デカルボキシラーゼ） または呼吸系 酵素阻害剤の耐性を示す L _リジン生産変異株 （特開昭 50-53588号、 特開昭 50-3 1093号、 特開昭 52- 102498号、 特開昭 53- 9394号、 特開昭 53-86089号、 特開昭 55-9 783号、 特開昭 55- 9759号、 特開昭 56- 32995号、 特開昭 56- 39778号、 特公昭 53- 435 91号、 特公昭 53-1833号） 、 イノシトールまたは酢酸を要求する L一リジン生産 変異株 （特開昭 55- 9784号、 特開昭 56- 8692号） 、 フルォロピルビン酸または 34°C 以上の温度に対して感受性を示す L _リジン生産変異株 （特開昭 55-9783号、 特 開昭 53- 86090号） 、 エチレングリコールに耐性を示し、 L—リジンを生産するブ レビバクテリゥム属またはコリネバクテリゥム属の生産変異株 （米国特許第 4411 997号） 。
また、 L—スレオニン生産能を有するコリネ型細菌としては、 コリネパクテリ ゥム . ァセトァシドフィラム AJ12318 ( FER BP-1172 ) (米国特許第 5， 188, 949号 参照） 等が、 L—イソロイシン生産能を有するコリネ型細菌としてはブレビパク テリゥム . フラバム AJ12149 ( FERM BP- 759 ) (米国特許第 4, 656, 135号参照） 等が 挙げられる。
< 2 >フルク ト一スホスホトランスフエラーゼ活性の増幅
コリネ型細菌細胞中のフルク トースホスホトランスフヱラーゼ活性を増幅する には、 フルクト一スホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子断片を、 該細 菌で機能するベクター、 好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組み換 え D N Aを作製し、 これを Lーリジン又は L _グル夕ミン酸生産能を有するコリ ネ型細菌に導入して形質転換すればよい。 形質転換株の細胞内のフルク トースホ スホトランスフェラ一ゼをコ一ドする遺伝子のコピー数が上昇する結果、 フルク トースホスホトランスフェラーゼ活性が増幅される。 フルク トースホスホトラン スフエラーゼは、 ェシェリヒア · コリでは fruA遺伝子にコ一ドされている。
フルク ト一スホスホトランスフェラーゼ遺伝子は、 コリネ型細菌の遺伝子を用 いることが好ましいが、 ェシヱリヒア属細菌等の他の生物由来の遺伝子のいずれ も使用することができる。
ェシエリヒア . コリの fruA遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている （Genb ank/EMBL/DDBJ accetion No. M23196 ) ので、 その塩基配列に基づいて作製した プライマー、 例えば配列表配列番号 1及び 2に示すブライマーを用いて、 ェシェ リヒア · コリ染色体 D N Aを铸型とする P C R法 （P C R ： polymerase chain r eaction； White, T. J . et al ； Trends Genet . 5， 185( 1989 )参照） によって、 fru A遺伝子を取得することができる。
また、 コリネ型細菌、 例えばブレビパクテリゥム ' ラク トフアーメンタム由来 の fruA遺伝子は、 バチルス · サブチリス （Baci l lus subti l is) 、 ェシエリヒア • コ 'リ ( Escherichia col i ) 、 マイコプラズマ ·ゲ二タリウム (Mycoplasma gen i tal ium) 、 キサン 卜モナス · コンペス 卜 'リス (Xanthomonas compestri s ) 等の 公知の f r u A遺伝子から予想されるアミノ酸配列間で相同性の高い領域を選択し、 その領域のアミノ酸配列に基づいて P C R用プライマーを合成し、 ブレビバクテ リウム · ラク トフアーメン夕ムを銪型とする P C R反応を行うことによって、 部 分配列として取得することができる。 前記プライマ一としては、 配列番号 3およ び配列番号 4に示すオリゴヌクレオチドが挙げられる。
次に、 前記のようにして取得される fruA遺伝子の部分配列を利用して、 invers e PCR ( Genetics , 120, 621-623 ( 1988) ) 法、 又は LA-PCR in vitro cloning ki t (宝酒造社製） を用いる方法等によって、 fruA遺伝子の 5 ' 未知領域及び 3， 未知領域を取得する。 LA- PCR in vitro cloning ki tを用いる場合、 fruA遺伝子 の 3 ' 未知領域は、 例えば、 一次 PCRとして配列番号 5、 配列番号 9に示すブラ イマ一による PCRを、 二次 PCRとして配列番号 6、 配列番号 1 0に示すプライマー による PCRを行うことにより取得できる。 また、 fruA遺伝子部分断片の 5 ' 未知 領域は、 例えば一次 PCRとして配列番号 7、 配列番号 9に示すプライマーによる P CRを、 二次 PCRとして配列番号 8、 配列番号 1 0に示すプライマ一による PCRを行 うことにより、 取得することができる。 このようにして得られる fruA遺伝子の全 長を含む D N A断片の塩基配列を配列番号 1 3に示す。 また、 この塩基配列から 推定されるオープン · リーディング · フレームをアミノ酸配列に翻訳した配列を 配列番号 1 4に示す。
また、 本発明によりブレビパクテリゥム · ラク トファ一メンタムの fruA遺伝子 及びその隣接領域の塩基配列が明らかとなったので、 これらの隣接領域の塩基配 列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドをプライマ一とする P C Rによって、 fruA遺伝子全長を含む D N A断片を取得することができる。
他の細菌のフルク トースホスホトランスフェラーゼをコ一ドする遺伝子も、 同 様にして取得され得る。
本発明の fruA遺伝子は、 コードされるタンパク質のフルク トースホスホトラン スフヱラーゼ活性が損なわれない限り、 1若しくは複数の位置での 1若しくは数 個のアミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含むフルク トースホスホト ランスフェラ一ゼをコードするものであってもよい。 ここで、 「数個」 とは、 ァ ミノ酸残基の夕ンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、 具 体的には 2から 2 0 0個、 好ましくは、 2から 5 0個、 より好ましくは 2から 2 0個である。
上記のようなフルク トースホスホトランスフェラ一ゼと実質的に同一のタンパ ク質をコードする D N Aは、 例えば部位特異的変異法によって、 特定の部位のァ ミノ酸残基が置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含むように、 fluAの塩基配列 を改変することによって得られる。 また、 上記のような改変された D N Aは、 従 来知られている変異処理によっても取得され得る。 変異処理としては、 変異処理 前の D N Aをヒ ドロキシルァミン等でインビト口処理する方法、 及び変異処理前 の D N Aを保持する微生物、 例えばェシエリヒア属細菌を、 紫外線照射または N —メチル一N，一二トロ一 N—二トロソグァ二ジン （NTG) もしくは亜硝酸等の通常 変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
上記のような変異を有する D N Aを、 適当な細胞で発現させ、 発現産物の活性 を調べることにより、 フルク トースホスホトランスフェラーゼと実質的に同一の タンパク質をコードする DN Aが得られる。 また、 変異を有するフルク トースホ スホトランスフェラーゼをコードする DNAまたはこれを保持する細胞から、 例 えば配列表の配列番号 1 3に記載の塩基配列のうち塩基番号 88 1〜2 944か らなる塩基配列又はその一部を有するプローブとス トリンジヱントな条件下でハ イブリダィズし、 かつ、 フルク ト一スホスホトランスフェラーゼ活性を有する夕 ンパク質をコードする DN Aを単離することによつても、 フルク トースホスホト ランスフェラーゼと実質的に同一のタンパク質をコードする DNAが得られる。 ここでいう 「ス ト リンジェン卜な条件」 とは、 いわゆる特異的なハイブリッ ドが 形成され、 非特異的なハイブリッ ドが形成されない条件をいう。 この条件を明確 に数値化することは困難であるが、 一例を示せば、 相同性が高い DN A同士、 例 えば 5 0 %以上の相同性を有する DNA同士がハイブリダィズし、 それより相同 性が低い D N A同士がハイプリダイズしない条件、 あるいは通常のサザンハイブ リダィゼ一シヨンの洗いの条件である 60°C、 l x S S C, 0. 1 %SD S、 好 ましくは、 0. l x S S C、 0. 1 % S D Sに相当する塩濃度で洗浄を行う条件 が挙げられる。
プローブとして、 配列番号 1 3の塩基配列の一部の配列を用いることもできる。 そのようなプローブは、 配列番号 1 3の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌク レオチドをプライマーとし、 配列番号 1 3の塩基配列を含む DNA断片を錶型と する P C Rによって作製することができる。 プローブとして、 300 b p程度の 長さの D N A断片を用いる場合には、 ハイプリダイゼーションの洗いの条件は、 50°C、 2 x S S C、 0. 1 %SD Sが挙げられる。
上記のような条件でハイプリダイズする遺伝子の中には途中にス トヅプコ ドン が発生したものや、 活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、 それ らについては、 市販の活性発現ベクターにつなぎ、 フルク トースホスホトランス フェラーゼ活性を、 Mori, M. & Shiio, 1攀， Agric. Biol. Chem., 51， 129-138 (1987)記載の方法で測定することによって、 容易に選別することができる。
フルク トースホスホトランスフェラーゼと実質的に同一のタンパク質をコ一ド する D NAとして具体的には、 配列番号 1 4に示すアミノ酸配列と、 好ましくは 55 %以上、 より好ましくは 60 %以上、 さらに好ましくは 80 %以上の相同性 を有し、 かつフルク ト一スホスホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を コードする D N Aが挙げられる。
染色体 D NAは、 D N A供与体である細菌から、 例えば、 斎藤、 三浦の方法 (H. Saito and . Miura Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)、 生物工学 実験書、 日本生物工学会編、 9 7〜 9 8頁、 培風館、 1 9 9 2年参照） 等により 調製することができる。
P C R法により増幅されたフルク トースホスホトランスフェラ一ゼをコードす る遺伝子は、 ェシヱリヒア · コリ及び/又はコリネ型細菌の細胞内において自律 複製可能なベクター D N Aに接続して組換え D N Aを調製し、 これをェシエリヒ ァ · コリ細胞に導入しておくと、 後の操作がしゃすくなる。 ェシエリヒア ' コリ 細胞内において自律複製可能なベクタ一としては、 プラスミ ドベクターが好まし く、 宿主の細胞内で自立複製可能なものが好ましく、 例えば pUC19、 pUC18、 pBR 322、 pHSG299 pHSG399, pHSG398、 RSF1010等が挙げられる。
コリネ型細菌の細胞内において自律複製可能なベクタ一としては、 PAM330 (特 開昭 58-67699号公報参照） 、 pHM1519 (特開昭 58-77895号公報参照） 等が挙げら れる。 また、 これらのベクターかちコリネ型細菌中でプラスミ ドを自律複製可能 にする能力を持つ D N A断片を取り出し、 前記ェシェリヒア ' コリ用のベクター に挿入すると、 ェシエリヒア · コリ及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ない わゆるシャ トルベクターとして使用することができる。 このようなシャ トルべク 夕一としては、 以下のものが挙げられる。 尚、 それそれのベクタ一を保持する微 生物及び国際寄託機関の受託番号をかっこ内に示した。
PAJ655 ェシエリヒア 'コリ AJ11882(FERM BP- 136)
コリネハ、、クテリゥム 'ク、、ルタミクム SR8201 (ATCC39135 )
PAJ184 ェシエリヒア'コリ AJ11883(FERM BP-137)
コリネハ、、クテリゥム 'ク、、ルタミクム SR8202(ATCC39136 )
PAJ611 ェシエリヒア'コリ AJ11884(FERM BP - 138)
PAJ3148 コリネハ、、クテリゥム 'ク"ルタミクム SR8203(ATCC39137)
PAJ440 ir^)^- ^7^'JXAJ11901(FERM BP-140) pHC4 Iシ Iリヒア ·]リ AJ12617(FERM BP- 3532) フルク トースホスホトランスフヱラ一ゼをコードする遺伝子とコリネ型細菌で 機能するべクタ一を連結して組み換え DNAを調製するには、 フルク トースホス ホトランスフェラーゼをコ一ドする遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクタ 一を切断する。 連結は、 T 4 D N Aリガ一ゼ等のリガ一ゼを用いて行うのが普通 である。
上記のように調製した組み換え DNAをコリネ型細菌に導入するには、 これま でに報告されている形質転換法に従って行えばよい。 例えば、 ェシエリヒア · コ リ K— 1 2について報告されているような、 受容菌細胞を塩化カルシウムで処 理して D N Aの透過性を增す方法 （Mandel，M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) があり、 バチルス ·ズブチリスについて報告されているような、 増 殖段階の細胞からコンビテン トセルを調製して DN Aを導入する方法 （ Duncan, C.H. , Wilson, G. A. and Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)) がある。 あるいは、 バチルス ' ズブチリス、 放線菌類及び酵母について知られているような、 DNA 受容菌の細胞を、 組換え DN Aを容易に取り込むプロ トプラス トまたはスフエロ ブラス トの状態にして組換え D N Aを D N A受容菌に導入する方法 （ Chang, S. a nd Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979) Bibb,M. J. ,Ward,J.M.and Hopwood,0. A., Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A. ,Hicks, J.B.and Fink,G.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)) も応用できる。 本発明の実施例 で用いた形質転換の方法は、 電気パルス法 （特開平 2— 20779 1号公報参照） である。
フルク トースホスホトランスフェラーゼをコ一ドする活性の増幅は、 フルク ト ースホスホトランスフヱラーゼをコ一ドする遺伝子を上記宿主の染色体 D N A上 に多コピー存在させることによつても達成できる。 コリネ型細菌に属する微生物 の染色体 D N A上にフルク トースホスホトランスフェラーゼをコ一ドする遺伝子 を多コピーで導入するには、 染色体 D N A上に多コピー存在する配列を標的に利 用して相同組換えにより行う。 染色体 DN A上に多コピー存在する配列としては、 レぺヅティブ DNA、 転移因子の端部に存在するィンバーティ ヅ ド · リピー卜が 利用できる。 あるいは、 特閧平 2— 1 0 9 9 8 5号公報に開示されているように、 フルク ト一スホスホトランスフェラ一ゼをコードする遺伝子をトランスポゾンに 搭載してこれを転移させて染色体 D N A上に多コピー導入することも可能である。 いずれの方法によっても形質転換株内のフルク トースホスホトランスフェラーゼ をコードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、 フルク トースホスホトランスフ エラーゼ活性が増幅される。
フルク トースホスホトランスフヱラーゼ活性の増幅は、 上記の遺伝子増幅によ る以外に、 染色体 D N A上又はプラスミ ド上のフルク トースホスホトランスフエ ラ一ゼをコードする遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換 することによつても達成される （特開平 1— 2 1 5 2 8 0号公報参照） 。 たとえ ば、 l a cプロモー夕一、 t r pプロモ一夕一、 t r cプロモ一夕一、 t a cプ 口モーター、 ラムダファージの プロモ一夕一、 P Lプロモ一夕一等が強力なプ 口モータ一として知られている。 これらのプロモーターへの置換により、 フルク トースホスホトランスフェラーゼをコ一ドする遺伝子の発現が強化されることに よってフルク ト一スホスホトランスフェラーゼ活性が増幅される。
また、 本発明のコリネ型細菌は、 フルクト一スホスホトランスフェラーゼ活性 に加えて、 他のアミノ酸生合成経路又は解糖系等の酵素遺伝子を強化することに よって、 それらの酵素活性が増強されてもよい。 例えば、 L—リジンの製造に利 用可能な遺伝子の例としては、 Lーリジン及び: L—スレオニンによる相乗的なフ ィ一ドバヅク阻害が実質的に解除されたァスパルトキナーゼひサブュニヅ ト蛋白 質又は サブュニッ ト蛋白質をコードする遺伝子 （W094/25605国際公開パンフレ ヅ ト） 、 コリネホルム細菌由来の野生型ホスホエノ一ルビルビン酸カルボキシラ —ゼ遺伝子 （特開昭 60-87788号公報） 、 コリネホルム細菌由来の野生型ジヒ ドロ ジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子 （特公平 6- 55149号公報） 等が知られ ている。
また、 L—グルタミン酸の製造に利用可能な遺伝子の例としては、 グルタミン 酸デヒ ドロゲナーゼ （G D H、 特開昭 6 1— 2 6 8 1 8 5号） 、 グルタミンシン テ夕ーゼ、 グルタミン酸シン夕ーゼ、 イソクェン酸デヒ ドロゲナーゼ （特開昭 6 2— 1 6 6 8 9 0号、 特開昭 6 3— 2 1 4 1 8 9号） 、 アコニッ ト酸ヒ ドラ夕一 ゼ （特開昭 6 2— 2 9 4 0 8 6号） 、 クェン酸シン夕一ゼ、 ピルビン酸カルボキ シラーゼ （特開昭 6 0— 8 7 7 8 8号、 特開昭 6 2— 5 5 0 8 9号） 、 ホスホェ ノールピルビン酸カルボキシラーゼ、 ホスホェノールピルビン酸シン夕一ゼ、 フ ルクトースホスホトランスフェラーゼ、 ホスホグリセロム夕一ゼ、 ホスホグリセ リン酸キナーゼ、 グリセルアルデヒド一 3—リン酸デヒ ドロゲナーゼ、 トリオ一 スリン酸イソメラ一ゼ、 フルク トースビスリン酸アルドラーゼ、 ホスホフルク ト キナーゼ （特開昭 6 3— 1 0 2 6 9 2号） 、 グルコースリン酸ィソメラ一ゼ等が ある。
さらに、 目的とする L—ァミノ酸の生合成経路から分岐して同 L—アミノ酸以 外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損していてもよ い。 例えば、 L一リジンの生合成経路から分岐して L—リジン以外の化合物を生 成する反応を触媒する酵素としては、 ホモセリンデヒ ドロゲナ一ゼがある （W0 9 5/23864参照） 。 また、 L—グルタミン酸の生合成経路から分岐して L一グル夕 ミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、 ひケトグルタール 酸デヒ ドロゲナ一ゼ、 イソクェン酸リア一ゼ、 リン酸ァセチルトランスフェラ一 ゼ、 酢酸キナーゼ、 ァセ トヒ ドロキシ酸シン夕一ゼ、 ァセ ト乳酸シン夕一ゼ、 ギ 酸ァセチルトランスフェラーゼ、 乳酸デヒドロゲナーゼ、 グルタミン酸デカルボ キシラーゼ、 1 _ピロリン酸デヒ ドロゲナ一ゼ、 等がある。
さらに、 L一グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌に、 界面活性剤等のビ ォチン作用抑制物質に対する温度感受性変異を付与することにより、 過剰量のビ ォチンを含有する培地中にてピオチン作用抑制物質の非存在下で L—グルタミン 酸を生産させることができる （W096/06180号参照） 。 このようなコリネ型細菌と しては、 W096/06180号に記載されているブレビパクテリゥム · ラク トファーメン タム AJ 13029が挙げられる。 AJ 13029株は、 1994年 9月 2日付けで工業技術院生命 工学工業技術研究所 （郵便番号 305 - 8566 日本国茨城県つくば巿東一丁目 1番 3 号） に、 受託番号 FERM P- 14501として寄託され、 1 9 9 5年 8月 1 日にブダぺス ト条約に基づく国際寄託に移管され、 受託番号 FERM BP-5189が付与されている。 また、 L一リジン及び L—グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌に、 ピオ チン作用抑制物質に対する温度感受性変異を付与することにより、 過剰量のピオ チンを含有する培地中にてピオチン作用抑制物質の非存在下で L—リジン及び L —グルタミン酸を同時生産させることができる （W096/06180号参照） 。 このよう な菌株としては、 W096/06180号に記載されているブレビバクテリウム ' ラク トフ ァ一メンタム AJ12993株が挙げられる。 同株は 1 9 9 4年 6月 3日付けで工業技 術院生命工学工業技術研究所 （郵便番号 305-8566 日本国茨城県つくば市東一丁 目 1番 3号） に、 受託番号 FERM P- 14348で寄託され、 1 9 9 5年 8月 1日にブダ ペスト条約に基づく国際寄託に移管され、 受託番号 FERM BP- 5188が付与されてい る。
< 3 > L—ァミノ酸の生産
フルク トースホスホトランスフェラ一ゼ活性が増幅され、 かつ、 L—アミノ酸 生産能を有するコリネ型細菌を好適な培地で培養すれば、 同 L _アミノ酸が培地 に蓄積する。 例えば、 フルク ト一スホスホトランスフヱラ一ゼ活性が増幅され、 かつ L—リジン酸生産能を有するコリネ型細菌を好適な培地で培養すれば、 L一 リジンが培地に蓄積する。 また、 フルク トースホスホトランスフェラーゼ活性が 増幅され、 かつ- ΓΓ一グル夕ミン酸生産能を有するコリネ型細菌を好適な培地で培 養すれば、 L -グル夕ミン酸が培地に蓄積する。
さらに、 フルク トースホスホトランスフェラ一ゼ活性が増幅され、 かつ L—リ ジン及び L—グル夕ミン酸生産能を有するコリネ型細菌を培地で培養すれば、 L -リジン及び L一グル夕ミン酸が培地に蓄積する。 L—リジンと L一グル夕ミン 酸を同時に醱酵生産する場合には、 L—リジン生産菌を L一グル夕ミン酸の生産 条件下で培養してもよいし、 あるいは L—リジン生産能を有するコリネ型細菌と L一グル夕ミン酸生産能を有するコリネ型細菌を混合培養してもよい （特開平 5 - 3 7 9 3号公報） 。
本発明の微生物を用いて L—リジン又は L—グル夕ミン酸等の L—アミノ酸を 製造するのに用いる培地は、 炭素源、 窒素源、 無機イオン及び必要に応じその他 の有機微量栄養素を含有する通常の培地である。 炭素源としては、 グルコース、 ラクトース、 ガラク トース、 フルク トース、 シュクロース、 廃糖蜜、 澱粉加水分 解物などの炭水化物、 エタノールやイノシトールなどのアルコール類、 酢酸、 フ マール酸、 クェン酸、 コハク酸等の有機酸類を用いることができる。 本発明にお いては、 これらの中ではフルク トースが特に好適である。 通常、 コリネ型細菌を 用いた発酵法による L一アミノ酸の生産においては、 培地の炭素源としてフルク トースを用いると収率が低下する傾向にあるが、 本発明に用いる微生物は、 フル ク トースを炭素源とする培地で L一アミノ酸を効率よく産生する。 この効果は、 特に L—リジン生産において顕著である。
窒素源としては、 硫酸アンモニゥム、 硝酸アンモニゥム、 塩化アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム、 酢酸アンモニゥム等の無機又は有機アンモニゥム塩、 アン モニァ、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 酵母エキス、 コーン ' スティ一プ リカー、 大豆加水分解物などの有機窒素、 アンモニアガス、 アンモニア水等を用 いることができる。
無機イオンとしては、 リン酸カリウム、 硫酸マグネシウム、 鉄イオン、 マンガ ンイオン等が少量添加される。 有機微量栄養素としては、 ビタミン などの要 求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有させることが望ましい。
培養は、 振とう培養、 通気撹拌培養等による好気的条件下で 1 6〜 7 2時間実 施するのがよく、 培養温度は 3 0 °C〜 4 5 °Cに、 培養中 p Hは 5〜 9に制御する。 尚、 p H調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、 更にアンモ ニァガス等を使用することができる。
発酵液からの L一アミノ酸の採取は、 通常の L—アミノ酸の製造法と同様にし て行うことができる。 例えば、 L—リジンの採取は、 通常イオン交換樹脂法、 沈 澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。 また、 Lーグル 夕ミン酸を採取する方法も常法によって行えばよく、 例えばイオン交換樹脂法、 晶析法等によることができる。 具体的には、 L—グルタミン酸を陰イオン交換樹 脂により吸着、 分離させるか、 または中和晶析させればよい。 L—リジン及び L —グル夕ミン酸の両方を製造する場合、 これらを混合物として用いる場合には、 これらのアミノ酸を相互に分離することは不要である。
発明の実施するための最良の形態 以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。 実施例 1 fruA遺伝子導入コリネ型細菌の構築
< 1 >ェシエリヒア ' コリ JM109株の fruA遺伝子のクローニング
ェシエリヒア · コリの fruA遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている （Genb ank/EMBL/DDBJ accetion No.M23196) 。 報告されている塩基配列に基づいて配列 表配列番号 1及び 2に示すプライマ一を合成し、 ェシエリヒア ' コリ JM109株の 染色体 DN Aを錶型にして P CR法によりフルク ト一スホスホ トランスフェラー ゼ遺伝子を.増幅した。
合成したプライマーの内、 配列番号 1は、 Genbank/EMBL/DDBJ accetion No. M 23196に記載されている fruA遺伝子の塩基配列の 1番目から 2 4番目の塩基に至 る配列に相当し、 配列番号 2は、 2 0 0 0番目から 1 9 7 7番目の塩基に至る配 列に相当する。
ェシエリヒア · コリ JM109株の染色体 D N Aの調製は常法によった （生物工学 実験書、 日本生物工学会編、 9 7〜 9 8頁、 培風館、 1 9 9 2年） 。 また、 P C R反応は、 P C R法最前線 （関谷剛男ほか編、 共立出版社、 1 9 8 9年） 1 8 5 頁に記載されている標準反応条件を用いた。
生成した P C R産物を常法により精製後、 Smalで切断したプラスミ ド p H C 4 と、 ライゲ一シヨンキヅ ト （宝酒造社製） を用いて連結した後、 ェシヱリヒア ' コリ JM109のコンビテン トセル （宝酒造社製） を用いて形質転換を行い、 クロラ ムフェニコール 3 0 g/mlを含む L培地 （バク ト ト リブトン 10g/L、 バク トイ一 ス トエキス トラク ト 5g/L、 NaCl 5g/L、 寒天 15g/L、 pH7.2) に塗布し、 一晩培養 後、 出現した白色のコロニーを釣り上げ、 単コロニー分離し、 形質転換株を得た。 取得した形質転換体よりプラスミ ドを抽出し、 ベクターに fruA遺伝子が結合した プラスミ ド p H C 4 f r uを得た。
p H C 4を保持するェシェリヒア ' コリは、 プライべ一トナンパ一 AJ12617と 命名され、 1 9 9 1年 4月 2 4日に、 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研 究所 （郵便番号 305-8566 日本国茨城県つくば巿柬一丁目 1番 3号） に受託番号 F ERM P— 1 2 2 1 5として寄託され、 1 9 9 1年 8月 2 6日に、 ブ夕ぺス ト条約に基く国際寄託に移管され、 受託番号 FE RM BP— 3 5 3 2が付与さ れている。
次に、 クローニングされた DNA断片がフルク ト一スホスホトランスフェラー ゼ活性を有するタンパク質をコードしていることを確認するため、 JM 1 0 9株 及び、 pHC 4 f ruを保持する JM 1 09株のフルク トースホスホトランスフ エラーゼ活性を Mori, M. & Shiio, I. , Agric. Biol. Chem., 51, 129-138 (198 7)に記載の方法により測定した。 その結果、 pH C 4 f r uを保持する JM 1 0 9株は、 p HC 4 f r uを保持しない J M 1 09株の約 1 1倍のフルク トースホ スホトランスフェラ一ゼ活性を示すことから、 fruA遺伝子が発現していることを
½ し/ o
< 2 >コリネ型細菌の L _グル夕ミン酸生産株への p H C 4 f r uの導入と L一 グル夕 ミン酸生産
ブレビバクテリウム . ラク トファーメン夕ム AJ13029を電気パルス法 （特開平 2 -207791号公報参照） によりブラスミ ド pHC4fruで形質転換し、 得られた形質転換 株を得た。 得られた形質転換株 AJ13029/pHC4fruを用いて L一グル夕ミン酸生産 のための培養を以下のように行った。 5〃g/mlのク口ラムフエ二コールを含む C M 2 Bプレート培地にて培養して得た AJ13029/pHC4fru株の菌体を、 5〃g/mlのク 口ラムフヱニコールを含む下記組成を有する L—グル夕ミン酸生産培地に接種し、 31.5°Cにて振とう培養し、 培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。 得られ た培養物を、 同じ組成の培地に 5 %量接種し、 37°Cにて培地中の糖が消費される まで振とう培養した。 コン トロールとしてコリネパクテリゥム属細菌 AJ13029株 に、 既に取得されているコリネバクテリゥム属細菌で自律複製可能なプラスミ ド pHC 4を電気パルス法により形質転換した菌株を上記と同様にして培養した。
〔L_グル夕ミン酸生産培地〕
下記成分 （ 1 L中） を溶解し、 K0Hで pH8.0に調製し、 115°Cで 15分殺菌する。 フルク ト一ス 150g
K H 2 P 04 2g
Mg S 04 · 7 H2O 1.5g
Figure imgf000019_0001
大豆蛋白加水分解液 50ml
ピオチン 2mg
サイアミン塩酸塩 3mg
培養終了後、 培養液中の L一グルタミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテツ クアナライザー A S— 2 1 0により測定した。 このときの結果を表 1に示した。
菌 株 L - -ダルタミン酸生成量（g/L)
AJ13029/pHC4 1 8. 5
AJ13029/pHC4fru 2 0. 5
< 3 >コリネ型細菌の L—リジン生産株への pHC4fruの導入と Lーリジン生産 ブレビバクテリ ウム ' ラク トファーメンタム AJ11082を電気パルス法 （特開平 2 - 207791号公報参照） によりプラスミ ド PHC4fruで形質転換し、 得られた形質転換 株を得た。 得られた形質転換株 AJ11082/pHC4fruを用いて L―リジン生産のため の培養を以下のように行った。 5μ g/mlのク口ラムフエ二コールを含む CM 2 B プレー卜培地にて培養して得た AJ11082/PHC4fru株の菌体を、 5 g/mlのクロラム フエ二コールを含む下記組成の L—リジン生産培地に接種し、 31.5°Cにて培地中 の糖が消費されるまで振とう培養した。 コントロールとしてコリネバクテリ ゥム 属細菌 AJ11082株に、 既に取得されているコリネバクテリ ゥム属細菌で自律複製 可能なプラスミ ド pHC4を電気パルス法により形質転換した菌株を上記と同様にし て培養した。
ブレビバクテリ ウム · ラク トファーメンタム AJ11082は、 1981年 1月 31日にァグ リカルチュラル ' リサーチ · サービス · カルチヤ一 · コ レクション （Agricultur al esearch Service Culture Collection) (ァメ リカ合衆国 ィリ ノィ州 6 6 1 6 04 ピオリア ノースュニバ一シティ通り 1 8 1 5 (1815 N. University Street, Peoria, Illinois 61604 U.S.A.)) に国際寄託され、 受託番号 NRRL B- 11470が付与されている。
〔L—リジン生産培地〕
炭酸カルシウム以外の下記成分 （ 1 L中） を溶解し、 K0Hで pH8.0に調製し、 11 5°Cで 15分殺菌した後、 別に乾熱殺菌した炭酸カルシウムを 50g加える。
フルク トース 100 g
Figure imgf000020_0001
ΚΗ2Ρ 04 1
Mg S 04 · 7 H20 1 g
ピオチン 500 us
チアミン 2000 us
Figure imgf000020_0002
ニコチンァ ミ ド' 5 mg
蛋白質加水分解物 （豆濃） 30 ml
炭酸カルシウム 50 g
培養終了後、 培養液中の L一リジン蓄積量を旭化成工業社製バイォテックアナ ライザ一 AS— 2 1 0により測定した。 このときの結果を表 2に示した。 表 2 菌 株 L—リジン生成量（g/L)
AJ11082/pHC4 24. 9
AJ11082/pHC4fru 28. 4
< 4 >コリネ型細菌の L—リジン及び L—グル夕 ミン酸生産株への pHC4fruの導 入と L—リジン及び L—グル夕ミン酸同時生産
ブレビパクテリゥム · ラク トファーメン夕ム AJ12993を電気パルス法 （特開平 2 -207791号公報参照） によりプラスミ ド pHC4fruで形質転換し、 得られた形質転換 株を得た。 得られた形質転換株 AJ12993/pHC4fruを用いて L —リジン及び L —グ ル夕ミン酸生産のための培養を以下のように行った。 5〃g/mlのクロラムフエ二 コールを含む C M 2 Bプレート培地にて培養して得た AJ12993/pHC4fru株の菌体 を、 5〃g/mlのクロラムフエ二コールを含む前記 L一リジン生産培地に接種して 3 1.5°Cにて培養した。 培養を開始してから 1 2時間後に培養温度を 3 4 °Cにシフ 卜 し、 培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。 コントロールとしてコリネ パクテリゥム属細菌 AJ12993株に、 既に取得されているコリネパクテリゥム属細 菌で自律複製可能なブラスミ ド PHC4を電気パルス法により形質転換した菌株を上 記と同様にして培養した。
培養終了後、 培養液中の L—リジン及び L—グル夕ミン酸蓄積量を旭化成工業 社製バイオテックアナライザー A S— 2 1 0により測定した。 このときの結果を 表 3に示した。
菌 株 L一リジン生成量（g/L ) L - -グル夕ミン酸生成量（g/L )
AJ12993/pHC4 8 . 5 1 8 . 5
AJ12993/pHC4fru 9 . 7 2 0 . 3
実施例 2 ブレビバクテリウム · ラク トファ一メンタムの fruA遺伝子の単離 く 1 >ブレビバクテリウム * ラク トファーメンタム ATCC13869の fruA遺伝子の部 分断片取得
バチルス . サブチリス （Baci l lus subti l is) 、 ェシエリヒア . コリ （Escheri chia col i ) 、 マイコプラズマ . ゲニタリウム （Mycoplasma genital ium) 、 キサ ントモナス · コンペス トリス （Xanthomonas compestri s) の FruA間でアミノ酸配 列の相同性の高い領域を選択し、 その領域のアミノ酸配列から塩基配列を推定し、 配列番号 3および配列番号 4に示すオリゴヌクレオチドを合成した。 一方、 Bact erial Genome DNA Purification Kit (Advanced Genetic Technologies Corp. ) を用いて、 ブレビパクテリゥム ' ラク トファ一メンタム ATCC13869の染色体 DNAを 調製した。 この染色体 DNAを 0.5〃g、 前記オリゴヌクレオチドをそれそれ 20pmol、 dNTP mixture (dATP, dGTP, dCTP, dTTP、 各 2.5mM) M 10X ExTaq Buffer
(宝酒造社製） 5〃1、 ExTaq (宝酒造） 1Uに滅菌水を加えて全量 50〃 1の PCR反応 液を調製した。 この反応液をサーマルサイクラ一 TP240 (宝酒造社製） を用いて、 変性 98°C 10秒、 会合 45°C 30秒、 伸長反応 72°C 90秒の条件で 25サイクルの PCRを 行ない、 PCR産物をァガロースゲル電気泳動したところ、 反応液に約 1.2kbのバン ドが含まれることが判明した。
前記反応物を Original TA Cloning Kit (Invitrogen) を用いて pCR2.1 (Invit rogen) に連結した。 連結した後、 ェシエリ ヒア ' コ リ JM109のコンビテン トセル
(宝酒造社製） を用いて形質転換を行い、 IPTG (イソプロピル-/? -D-チォガラク トビラノシ ド） 1 0〃g/ml、 X-Gal (5-ブロモ -4-クロ口- 3-イ ン ドリル- /5 -D—ガ ラク トシド） 4 0 g/ml及びカナマイシン 25〃g/mlを含む L培地 （バク ト トリプ トン 10g/L、 パク トイ一ス トエキス トラク ト 5g/L、 NaCl 5g/L、 寒天 15g/L、 pH7.2) に塗布し、 一晩培養後、 出現した白色のコロニーを釣り上げ、 単コロニー分離し、 形質転換株を得た。
形質転換株からアルカリ法 （生物工学実験書、 日本生物工学会編、 105頁、 培 風館、 1992年） を用いてプラスミ ドを調製し、 配列番号 5、 配列番号 6に示すォ リゴヌクレオチドを用いて、 挿入断片の両端の塩基配列を Sangerの方法 （J. Mol. Biol., 143, 161 (1980)) で決定した。 具体的には、 塩基配列の決定には Big d ye terminator sequencing kit (Applied Biosystems) を用いて Genetic Analyz er ABI310 (Applied Biosystems) で解析した。 決定された塩基配列をアミノ酸 に翻訳し、 バチルス ' サブチリス、 ェシエリヒア ' コリ、 マイコプラズマ ' ゲニ タリウム、 キサン トモナス · コンぺス ト リスの fruA遺伝子から予測されるアミノ 酸配列を比較したところ、 高い相同性を示したことから、 クローニングされた断 片はブレビパクテリゥム ' ラク トフアーメンタム由来の fruA遺伝子であると判断 した。 く 2 >ブレビパクテリゥム · ラク トファーメン夕ム ATCC13869の fruA遺伝子の全 塩基配列決定
上記く 1 >で調製したプラスミ ドに含まれる断片は fruA遺伝子の部分断片であ り、 さらに fruA遺伝子全長の塩基配列を決定する必要がある。 既知の領域に隣接 する未知の塩基配列を決定する方法として、 inverse PCR ( Geneti cs , 120 , 621- 623 ( 1988 ) ) 法や、 LA-PCR in vitro cloning ki t (宝酒造社製） を用いる方法 などがあるが、 ここでは LA- PCR in vi tro cloning kit により未知配列の決定を 行なった。 具体的には < 1 >で決定した塩基配列をもとに配列番号 7、 配列番号 8、 配列番号 9、 配列番号 1 0に示すオリゴヌクレオチドを合成し、 LA- PCR in vi tro cloning kit のプロ トコールに従い行った。
fruA遺伝子部分断片の 3， 未知領域に関しては、 ブレビバクテリウム · ラク ト フアーメンタム ATCC13869の染色体 DNAを Hindl l l処理後、 Kit内の Hindl l l Adapte rとライゲ一シヨン後、 一次 PCRとして配列番号 7、 配列番号 1 1による PCRを、 二次 PCRとして配列番号 8、 配列番号 1 2による PCRを行った。 この PCR産物をァ ガロースゲル電気泳動したところ、 約 700bpのバン ドが認められた。 このバン ド を Suprec ver .2 (宝酒造社製） を用いて精製し、 配列番号 8、 配列番号 1 2のォ リゴヌクレオチドを用いて、 く 1 >記載の方法と同様にして 700bpの PCR産物に含 まれる fruA遺伝子の塩基配列を決定した。
fruA遺伝子部分断片の 5 ' 未知領域に関してはブレビパクテリゥム · ラク トフ アーメンタム ATCC13869の染色体 MAを BamHI処理後、 Ki t内の Sau3AI Adapterとラ ィゲーシヨン後、 一次 PCRとして配列番号 9、 配列番号 1 1による PCRを、 二次 PC Rとして配列 1 0、 配列 1 2による PCRを行った。 この PCR産物をァガロースゲル 電気泳動したところ、 約 1500bpのバンドが認められた。 このバンドを Suprec ver. 2 (宝酒造社製） を用いて精製し、 配列番号 1 0、 配列番号 1 2のオリゴヌクレ ォチドを用いて、 く 1〉記載の方法と同様にして 1500bpの PCR産物に含まれる fru A遺伝子の塩基配列を決定した。
こう して決定された塩基配列のうち、 fruA遺伝子を含む約 3380bpの fruA遺伝子 を含む塩基配列を配列表配列番号 1 3に示す。 この塩基配列から推定されるォー プン · リ一ディング · フレームをアミノ酸配列に翻訳した配列を配列番号 1 4に 示した。 すなわち、 配列表配列番号 1 4に示されるアミノ酸配列からなるタンパ ク質がブレビバクテリウム · ラク トファーメンタム ATCC13869の FniAである。 な お、 たんばく質 N末端側にあるメチォニン残基は開始コ ドンである ATGに由来する ため、 たんぱく質本来の機能とは無関係であることが多く、 翻訳後べプチダーゼ の働きにより除去されることがよく知られており、 上記たんぱく質の場合にもメ チォニン残基の除去が生じている可能性がある。
塩基配列、 ァミノ酸配列おのおのについて既知の配列との相同性比較を行なつ た。 用いたデータベースは GeneBankおよび SWI SS- PR0Tである。 その結果、 配列表 配列番号 1 3に示される DNAは、 既に報告されている fruAと相同性を持つ、 コリ ネバクテリゥム属細菌では新規な遺伝子であることが判明した。
配列番号 1 3に示される MAは、 バチルス · ズブチリス、 ェシエリヒア ' コリ、 マイコプラズマ · ゲ二タリウム （Mycobacterium geneti l ium) 、 及びキサントモ ナス - コンペ卜 リ ウス (Xanthomonas compestris) の fruAと、 アミノ酸レべノレで 各々 4 2 . 1 %、 5 1 . 0 %、 3 7 . 4 %、 及び 4 5 . 5 %の相同性を示した。 尚、 塩基酉己歹リ及びアミノ酸酉己歹 ϋは、 Genetyx-Mac computer program (ソフ 卜ゥェ ァ開発、 東京） により解析した。 相同性解析は、 Lipmanと Peason ( Science, 227, 1435-1441 , 1985 )の方法にしたがって行った。 産業上の利用の可能性
本発明により、 コリネ型細菌の L一リジン又は L一グル夕ミン酸等の L一アミ ノ酸の生産能を向上させることができる。 また、 本発明により、 新規なブレビバ クテリゥム · ラク トフアーメンタム由来のフルク トースホスホトランスフェラ一 ゼ遺伝子が提供される。 同遺伝子は、 本発明による L一アミノ酸の製造に適した コリネ型細菌等の育種に好適に用いることができる。

Claims

請求の範囲
1 . 細胞中のフルク トースホスホトランスフェラーゼ活性が増強され、 かっし一 アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌。
2 . 前記 L一アミノ酸が、 L—リジン、 L一グルタミン酸、 Lースレオニン、 L 一イソロイシン、 L—セリンから選ばれる請求項 1記載のコリネ型細菌。
3 . 前記フルク トースホスホトランスフヱラーゼ活性の増強が、 前記細菌細胞内 のフルク トースホスホトランスフェラーゼをコ一ドする遺伝子のコピー数を高め ることによるものである請求項 1記載のコリネ型細菌。
4 . 前記フルク ト一スホスホトランスフェラーゼをコ一ドする遺伝子がェシェリ ヒア属細菌由来である請求項 3記載のコリネ型細菌。
5 . 前記フルク トースホスホトランスフェラーゼをコ一ドする遺伝子がコリネ型 細菌由来である請求項 3記載のコリネ型細菌。
6 . 請求項 1〜 5のいずれか一項に記載のコリネ型細菌を培地に培養し、 該培養 物中に L—アミノ酸を生成蓄積せしめ、 該培養物から L—アミノ酸を採取するこ とを特徴とする L—アミノ酸の製造法。
7 . 前記 L—アミノ酸が、 L一リジン、 L一グルタミン酸、 Lースレオニン、 L —イソロイシン、 L—セリンから選ばれる請求項 6記載の方法。
8 . 前記培地は炭素源としてフルク トースを含むことを特徴とする請求項 6又は 7記載の方法。
9 . 下記 （A ) 又は （B ) に示すタンパク質をコードする D N A。
( A ) 配列表の配列番号 1 4に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
( B ) 配列表の配列番号 1 4に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個の アミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、 か つ、 フルク トースホスホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
1 0 . 下記 （a ) 又は （b ) に示す D N Aである請求項 9記載の D N A。
( a ) 配列表の配列番号 1 3に記載の塩基配列のうち、 塩基番号 8 8 1〜 2 9 4 4からなる塩基配列を含む D N A。
( b ) 配列表の配列番号 1 3に記載の塩基配列のうち、 塩基番号 8 8 1〜 2 9 4 4からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとス トリンジェン 卜な条件下でハイブリダィズし、 かつ、 フルク トースホスホ トランスフェラーゼ 活性を有するタンパク質をコードする DNA。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7037690B2 (en) 2002-03-27 2006-05-02 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acid

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2373863T3 (es) 1995-06-07 2012-02-09 Ajinomoto Co., Inc. Procedimiento de producción de l-lisina.
PL341895A1 (en) * 1999-08-12 2001-02-26 Ajinomoto Kk Plasmide autonomously replicable in corynebacter bacteria
JP2004166595A (ja) 2002-11-20 2004-06-17 Ajinomoto Co Inc メチロトローフを用いたｌ−アミノ酸の製造法
EP1484410B1 (en) * 2003-06-05 2011-11-02 Ajinomoto Co., Inc. Fermentation methods using modified bacteria with increased byproduct uptake.
RU2337140C2 (ru) * 2003-07-29 2008-10-27 Адзиномото Ко., Инк. Способ продуцирования l-лизина или l-треонина с помощью бактерий escherichia, имеющих аттенуированную активность малеинового фермента
JP4380305B2 (ja) * 2003-11-21 2009-12-09 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
ES2331956T3 (es) * 2004-01-30 2010-01-21 Ajinomoto Co., Inc. Microorganismo que produce l-aminoacidos y procedimiento para producir l-aminoacidos.
US7344874B2 (en) * 2004-03-04 2008-03-18 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
US7300776B2 (en) * 2004-04-26 2007-11-27 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid-producing bacterium and a method for producing L-amino acid
US7482140B2 (en) * 2004-06-15 2009-01-27 Ajinomoto Co., Inc. L-tyrosine-producing bacterium and a method for producing L-tyrosine
US7205132B2 (en) * 2004-09-10 2007-04-17 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
US7794989B2 (en) * 2004-12-28 2010-09-14 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
WO2006078039A1 (en) 2005-01-18 2006-07-27 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid producing microorganism and a method for producing l-amino acid
US20070004014A1 (en) * 2005-06-29 2007-01-04 Yuichiro Tsuji Method for producing l-threonine
BRPI0620880B1 (pt) * 2006-01-04 2018-10-09 Evonik Degussa Gmbh método para a produção de metionina, pelo cultivo de um microorganismo, e, microorganismo
US20090038005A1 (en) * 2007-07-31 2009-02-05 Cisco Technology, Inc. Privilege-based access system
KR101294935B1 (ko) * 2011-04-01 2013-08-08 씨제이제일제당 (주) 에세리키아 속 균주에서 유래된 프락토키나제 유전자가 도입된 코리네박테리움 속 균주 및 상기 균주를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법
KR101518860B1 (ko) * 2013-10-11 2015-05-12 씨제이제일제당 (주) L-아미노산의 생산 방법
EP4095244A4 (en) * 2021-04-12 2023-06-21 CJ Cheiljedang Corporation NOVEL SUGAR PHOSPHATE ISOMERASE/EPIMERASE VARIANT AND METHOD FOR PRODUCING L-LYSINE USING THE SAME

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07108228B2 (ja) * 1990-10-15 1995-11-22 味の素株式会社 温度感受性プラスミド
JP3473042B2 (ja) * 1992-04-28 2003-12-02 味の素株式会社 変異型アスパルトキナーゼ遺伝子
US5876983A (en) * 1993-08-24 1999-03-02 Ajinomoto Co., Inc. Mutant phosphoenolpyruvate carboxylase, its gene, and production method of amino acid
DK0754756T3 (da) * 1994-03-04 2006-03-13 Ajinomoto Kk Fremgangsmåde til fremstilling af L-lysin
EP0756007A3 (en) * 1995-06-30 1997-10-29 Ajinomoto Kk Gene-marking process with artificial transposon
JP4035855B2 (ja) * 1996-06-05 2008-01-23 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法
SK285201B6 (sk) * 1996-12-05 2006-08-03 Ajinomoto Co., Inc. Rekombinantná DNA, autonómne reprodukovaná v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu, vektor pVK7
JP4075087B2 (ja) * 1996-12-05 2008-04-16 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法
JP3997631B2 (ja) * 1998-01-12 2007-10-24 味の素株式会社 発酵法によるｌ−セリンの製造法
JP4066543B2 (ja) * 1998-01-12 2008-03-26 味の素株式会社 発酵法によるｌ−セリンの製造法
US6884614B1 (en) * 1999-07-01 2005-04-26 Basf Aktiengesellschaft Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins
JP4623825B2 (ja) * 1999-12-16 2011-02-02 協和発酵バイオ株式会社 新規ポリヌクレオチド
US6395528B1 (en) * 2000-01-27 2002-05-28 Ajinomoto Co., Inc. Phosphoserine phosphatase gene of coryneform bacteria

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
H. DOMINGUEZ ET AL.: "Complete sucrose metabolism requires fructose phosphotransferase activity in corynebacterium glutamicum to ensure phosphorylation of liberated fructose", APPL. ENVIRON. MICROBIOL., vol. 62, no. 10, 1996, pages 3878 - 3880, XP002937887 *
K. JAHREIS ET AL.: "Nucleotide sequence of the ilvH-fruR gene region of escherichia coli K12 and salmonella typhimurium LT2", MOL. GEN. GENET., vol. 226, no. 1-2, 1991, pages 332 - 336, XP002937889 *
TREVORI PRIOR ET AL.: "Nucleotide sequence of fruA, the gene specifying enzyme II(fru) of the phosphoenolpyruvate-dependent sugar phosphotransferase system in escherichia coli K12", J. GEN. MICROBIOL., vol. 134, 1998, pages 2757 - 2768, XP002937888 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7037690B2 (en) 2002-03-27 2006-05-02 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acid
US7432085B2 (en) 2002-03-27 2008-10-07 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acid

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Publication number Publication date
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EP1241246B1 (en) 2008-12-10

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