KR20070060798A

KR20070060798A - 피에이엔 디 유전자가 파괴된 코리네박테리움을 이용한엘-라이신의 제조방법

Info

Publication number: KR20070060798A
Application number: KR1020050120829A
Authority: KR
Inventors: 박영훈; 임상조; 권도현; 김형준
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2005-12-09
Filing date: 2005-12-09
Publication date: 2007-06-13

Abstract

본 발명은 코리네박테리움의 아스파테이트 1-디카르복시레이즈 효소 (aspartate 1-decarboxylase)를 암호화 하는 유전자 panD를 파괴시킨 L-라이신 생산 균주 및, 이를 이용한 L-라이신의 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명에 의한 L-라이신의 제조방법은, 기존의 균주에 비하여, 생산성이 향상되는 효과가 있다.

코리네박테리움, 칼슘 판토쎄네이트, 아스파테이트 1-디카르복시레이즈, L-라이신, L-아미노산

Description

피에이엔 디 유전자가 파괴된 코리네박테리움을 이용한 엘-라이신의 제조방법{Method for the preparation of L-lysine using Corynebacterium having disrupted panD gene}

도 1은 본 발명의 재조합 벡터인 pCR-panD 의 개열지도이다.

본 발명은 코리네박테리움의 아스파테이트 1-디카르복시레이즈(aspartate 1-decarboxylase : 이하 panD ) 유전자를 파괴시킴으로써 칼슘 판토쎄네이트 요구주를 제작하고, 이를 직접발효법으로 배양하여 발효액 중에 L-라이신을 축적시키고, 그로부터 L-라이신을 회수함을 특징으로 하는 L-라이신의 제조 방법에 관한 것이다.

코리네박테리움 균주(Corynebacterium), 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 L-아미노산 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. L-아미노산, 특히 L-라이신은 동물사료, 사람의 의약품 및 화장품 산업에 사용되고 있으며 코리네박테리움 균주의 발효에 의해 생성되고 있다. 이와 같이 코리네박테리움 균주를 이용한 L-아미노산의 제법은 중요하기 때문에 그 제조방법을 개선하기 위해 많은 시도가 행해지고 있다.

그 중에서 재조합 DNA 기술을 이용하여 각각의 L-아미노산 생합성-관련 유전자를 증폭시켜 L-아미노산 생성에 미치는 효과를 연구하고 L-아미노산 생산 코리네박테리움 균주를 개량하려는 연구가 많이 있어 왔다[Kinoshita, "Glutamic Acid Bacteria in : Biology of industrial Microorganisms, Demain and Solomon(Eds), Benjamin Chummings, London, UK, 1985, 115-142; Hiliger, BioTec 2, 40-44(1991); Eggeling, Amino Acids 6, 261-272(1994); Jetten and Sinskey, Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995); 및 Sahm et al, Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)].

또한, 특정유전자를 파괴시키거나 감쇠발현(Underexpression)시킴으로써 L-아미노산 생산 코리네박테리움 균주를 개량하려는 연구가 있었다. 예를 들면, 데구사-휠스 악티엔게젤샤프트의 대한민국 특허공개 제2001-51915호 및 제2001-62279호에는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유래된 sucC 및 sucD 유전자 및 zwa2 유전자를 감쇠발현(underexpression)시켜 코리네형 박테리아로부터 L-아미노산의 생산성을 증대시키는 방법이 기술되어 있다.

또한, 외부의 다른 박테리아유래의 유전자를 도입하는 경우도 있다. [일본 특허공보 제(평)7-121228호]에서는 에스케리키아 콜리유래의 시트르산 신타제를 암호화하는 유전자의 도입하는 방법이 기술되어 있다.

L-아미노산 생산 코리네박테리움 균주의 경우, 각종 탄소원으로부터 해당과 정(Glycolysis)을 거쳐 생성된 파이루베이트(pyruvate)는 옥살로아세테이트(oxaloacetate)를 거쳐 아스파테이트로 전환되며, 아스파테이트는 이소루신(isoleucine), 루신(leucine), 쓰레오닌(Threonine), 메치오닌(Methionine) 및 라이신(lysine)과 같은 아미노산류로 전환되며 또한 베타알라닌(b-alanine)을 경유하여 판토쎄네이트(pantothenate)를 생성하는 전구체가 된다. 이러한 이유로 특정 아미노산의 생산량을 증가시키고자 할 경우에는 아스파테이트로부터 유래하는 기타 아미노산 및 판토쎄네이트의 생산을 저해시켜 줌으로 인해서 궁극적으로 원하는 아미노산만이 생산되는 전략으로 균주를 개량하여 왔다.

현재까지 코리네박테리움에서 아스파테이트로부터 이소루신, 루신, 쓰레오닌, 메치오닌 및 라이신 및 판토쎄네이트를 생성하는 대사경로 및 주요 유전자는 모두 밝혀져 있으며, 이들을 이용한 각종 아미노산 생산균주 개량의 연구가 활발히 진행 중에 있다.

라이신, 쓰레오닌, 메치오닌 및 이소로이신을 생합성하기 위해서 아스파테이트는 아스파토 카이나아제 효소에 의해 아스파틸포스페이트로 전환되어야 하며, 본 경로는 아스파테이트를 공통 전구체로 사용하는 기타 경로들과 경쟁적인 관계에 있다. 이러한 경쟁 경로로는 대략 알지니노석시네이트 합성효소(EC 6.3.4.5)에 의해 매개되는 경로, 아데닐로석시네이트 합성효소(EC 6.3.4.4)에 의해 매개되는 경로, 아스파테이트 카바모일 전환효소(EC 2.1.3.2)에 의해 매개되는 경로, 아스파라진 합성효소(EC 6.3.5.4)에 의해 매개되는 경로, 아스파타아제(EC 4.3.1.1)에 의해 매개되는 경로, 및 아스파테이트 1-디카르복시레이즈(EC 4.1.1.11)에 의해 매개되는 베타알라닌을 거쳐서 판토쎄네이트를 합성하는 경로등이 있다.

아스파테이트로 부터 베타 알라닌의 생합성에 관여하는 효소인 아스파테이트 1-디카르복시레이즈 및 유전자 panD는 이미 발표되었으며 이를 이용한 판토쎄네이트 생산균주의 개발도 보고된 바 있으나 (Applied and Environmental Microbiology 65(1999) 1530-9), 이를 이용한 라이신 생산에 관해서는 현재까지 보고된 바가 없다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 상기 논문에 기초하여 코리네박테리움에서 아스파테이트로부터 베타 알라닌을 거쳐 판토쎄네이트를 생성하는 경로의 첫번째 유전자인 아스파테이트 1-디카르복시레이즈(aspartate 1-decarboxylase : panD ) 유전자를 클로닝 한 후, L-라이신 생산균주에서 이 유전자를 파괴하여 칼슘 판토쎄네이트에 대한 요구성 확인 및 L-라이신 생산성을 향상시킬 수 있다는 사실을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 panD 유전자가 파괴된 코리네형 세균을 제조하기 위한 재조합 벡터 및 이를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은, 상기 형질전환체를 이용함으로써, 생산성이 향상된 L-라이신의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 상기 목적 및 기타 목적들은 하기 설명되는 본 발명에 의하여 모두 달성될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,

L-라이신 생성용 변이 미생물에서, 코리네박테리움(Corynebacterium)속 미생물의 panD 유전자의 활성을 파괴하는 단계; 를 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 L-라이신 생성용 변이 미생물의 제조방법을 제공한다.

상기 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물의 panD 유전자의 활성을 파괴하는 방법은, panD 유전자의 일부를 포함하는 재조합 벡터를 L-라이신 생성용 미생물에 형질전환시키는 것일 수 있다.

상기 재조합 벡터는 도 1의 개열지도를 가지는 벡터 pCR-panD일 수 있다.

또한, 본 발명은, 상기의 방법에 의하여 제조된 L-라이신 생성용 변이 미생물을 제공한다.

상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) KFCC10881-CJP5112 (수탁번호 : KCCM-10703P)일 수 있다.

또한, 본 발명은, 상기 미생물을 L-라이신을 생성하기에 적절한 조건하에서 배양하는 단계; 및 상기 배양액에서 L-라이신을 회수하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 L-라이신의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서는 아직까지 기능이 밝혀지지 않은 코리네박테리움의 아스파테이트 1-디카르복시레이즈로 예상되는 유전자를 미국국립보건원 젠뱅크(NIH GeneBank) 로부터 탐색하여 확보한 후, 위의 염기서열 정보를 이용하여 코리네박테리움 L-라이신 생산균주의 아스파테이트 1-디카르복시레이즈 유전자를 파괴하였다. 이로부터 얻어진 파괴균주가 칼슘 판토쎄네이트 요구주의 특성을 보임을 확인함으로써 위의 후보유전자가 판토쎄네이트 생합성에 관련된 유전자임을 확인하였다.

한 가지 관점으로, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 코리네박테리아의 아스파테이트 1-디카르복시레이즈 유전자가 포함된 재조합 벡터를 포함한다.

다른 관점으로, 본 발명은 상기의 재조합벡터를 이용하여 아스파테이트 1-디카르복시레이즈 유전자를 파괴시킨 형질전환 세포를 포함한다. 본 발명에서 사용 가능한 숙주세포로는 그람양성 박테리아에 속하는 미생물을 사용할 수 있으며, 특히 코리네박테리움(Corynebacterium) 속에 속하는 미생물을 사용하는 것이 바람직하다.

또한 다른 관점으로, 본 발명은 상기의 제공된 코리네박테라움 균주를 L-라이신을 생성하기에 적절한 조건하에서 배양하고 L-라이신을 회수하여 L-라이신을 제조하는 방법을 제공한다.

본원 명세서에 사용된 용어 '벡터'는 적합한 숙주 내에서 DNA의 발현을 실시할 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코 딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터"는 때로 상호교환적으로 사용된다.

본 발명에서 사용되는 코리네박테리아 균주로는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032외에 다른 코리네박테리움속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 적당한 균주로는 공지된 야생형균주, 코리네박테리움 써모아미노게네스(thermoaminogenes) FERM BP-1539, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC 14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼(lactofermentum) ATCC 13869, 및 이들로부터 제조된 L-아미노산 생산 돌연변이체 또는 균주, 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC11001이 있다.

본 발명에 따라 사용되는 코리네박테리아 균주는 배치 공정(batch process) 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식 또는 회분식으로 배양할 수 있다. 이들 공지된 배양 방법은 문헌[Chmiel, (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991); 및 Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)]에 기술되어 있다.

사용되는 배양 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리아 균주에 대한 배양 배지는 문헌["Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 찾아 볼 수 있다. 사용될 수 있는 당원으로는 글루코즈, 사카로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유해야 한다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양은 원하는 L-아미노산의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성된다.

L-아미노산은 음이온 교환 크로마토그래피 및 후속으로 닌히드린 유도체화에 의해 분석할 수 있다(Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190).

이하 하기의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 범위가 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 1]

코리네박테리움 유래 panD 유전자 검색 및 panD 유전자 파괴용 재조합벡터 제작

최근 보고된 코리네박테리움의 panD 유전자를 탐색, 분리한 논문 (Applied and Environmental Microbiology 65(1999) 1530-9)에 기초하여 미국국립보건원의 유전자은행(NIH GenBank) 을 근거로 하여 panD 유전자의 염기서열 정보(서열번호 1)를 확보하였다(NCBI 등록번호 AF116184). 보고된 염기서열에 근거하여 아래 표 1에서 기재된 한쌍의 프라이머(서열번호3, 서열번호4)를 합성하고 코리네박테리움 글루타미쿰 야생주(ATCC13032)의 염색체 DNA를 주형으로 하여 연쇄중합법(PCR법) [Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories](PCR 조건: Denaturing=96℃,30초 / Annealing=52℃,30초 / Polymerization=72℃, 15초, 30회)에 의해 200 염기쌍의 panD 유전자 내부지역 단편(서열번호 2)을 증폭한 뒤 TOPO Cloning Kit(Invitrogen)을 이용하여 대장균 플라스미드 pCR2.1에 클로닝하여 pCR-panD 플라스미드를 얻었다.

프라이머 1	5'-cgccgccggattgatcgaag-3'
프라이머 2	5'-tgatgcggaagccaaggcgt-3'

[ 실시예 2]

L-라이신 생산 코리네박테리움에서의 panD 파괴 및 칼슘 판토쎄네이트 요구성 확인

상기 실시예 1에서 제작한 pCR-panD 를 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881에 전기펄스법으로 형질전환한 후 (Appl. Microbiol.Biotechnol.(1999) 52:541-545 에 의한 형질전환법 이용),카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별배지에서 panD 유전자파괴 균주를 획득하였다(KFCC-10881-CJP5112).

균체로 유입된 pCR- panD 벡터는 상동성에 의하여 염색체상의 panD 유전자 사이로 삽입되게 되는데, 이 과정에서 염색체상의 panD 유전자는 파괴되고 또한 pCR-panD 벡터에 내재되어 있는 카나마이신 저항성 항생제 유전자를 보유하게 되며, 따라서 카나마이신 저항성을 획득하게 된다. 형질전환 실험 후, 카나마이신(kanamycin) 25 mg/L를 함유한 선별배지에서 panD 유전자파괴 균주를 선별하였으며, 유전자의 파괴여부는 서열 3,4의 프라이머 및 서열 3과 M13 reverse 프라이머 (Invitrogen)를 이용한 DNA 연쇄중합법 (PCR)을 통하여 확인하였다.

PCR 반응 조건은 다음과 같다. (PCR 조건: Denaturing = 96℃,30초 / Annealing = 52℃,30초 / Polymerization = 72℃,15초, 30회). 연쇄중합반응의 산물을 DNA 전기영동법으로 확인한 결과, 서열 3,4 프라이머 조합을 이용한 연쇄중합반응에서는 예상대로 대조군으로 사용한 KFCC-10881 균주 및 제작균주인 KFCC-10881-CJP5112 에서 약 0.2 kb 크기의 DNA 단편이 검출되었으며, 서열 3과 M13 reverse 프라이머 조합을 이용한 반응의 경우, KFCC-10881 균주에서는 어떠한 DNA 단편도 검출되지 않았고 KFCC-10881-CJP5112에서는 약 0.29 kb의 DNA 단편이 검출되었다.

이상의 결과를 통해 KFCC10881의 염색체상의 panD 유전자가 pCR- panD 유전자 파괴 벡터의 삽입에 의해 파괴되었음을 확인할 수 있었다. 이에 상기의 유전자 panD 가 파괴된 코리네박테리움 라이신 생산균주 를 2005년 11월 16일자로 사단법인 한국종균협회에 기탁하고, 기탁번호 제KCCM-10703P호를 부여받았다.

유전자 panD가 실제로 판토쎄네이트 생합성 경로에 포함되는 유전자임을 확인하기 위해서, 파괴된 KFCC-10881-CJP5112(KCCM-10703P)의 칼슘 판토쎄네이트 요구성을 알아보았다. 칼슘 판토쎄네이트가 함유되지 않은 하기의 최소배지(Biotechnology Letters vol.11(1) 11-16(1989))에서 모균주인 KFCC-10881와 함께 세포의 성장을 관찰하였다(표 2).

	KFCC-10881	KCCM-10703P (KFCC-10881-CJP5112)
최소배지 + 칼슘 판토쎄네이트 (100mg/L)	+	+
최소배지	+	-

상기 표 2의 결과에 의해, 본 발명에서 이용한 유전자 panD 가 실제로 판토쎄네이트 생합성에 관여하는 효소임을 확인할 수 있었다.

최소배지 ( pH 7.0)

포도당 10 g, (NH4)2SO4 4 g, KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NaCl 1 g, MgSO4 0.2 g, FeSO4 7H2O 20 mg, FeCl3 2 mg, ZnSO4 7H2O 0.5 mg, CuCl2 2H2O 0.2 mg, MnSO4 H2O 2 mg, (NH4)7Mo4O24 4H2O 0.1 mg, Na2B4O7 10H2O 0.2 mg, CaCl2 56 mg/l, Na3Citrate 2H2O 1.14 g/l, 바이오틴 1 mg, 티아민 염산염 10 mg, 니코틴아마이드 3000 ㎍, (증류수 1리터 기준)

[ 실시예 3]

panD 파괴 L-라이신 생산균주에서의 라이신 생산

상기 실시예 2에서와 같이 칼슘 판토쎄네이트 요구성을 갖는 L-라이신 생산균주인 코리네박테리아 글루타니쿰 KFCC-10881-CJP5112 균주를 L-라이신 생산을 위해 아래와 같은 방법으로 배양하였다.

하기의 종 배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 모균주 KFCC-10881와 KFCC-10881-CJP5112를 접종하고 30℃에서 20 시간 동안 진탕 배양(200 rpm) 한다. 하기의 생산 배지 24 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 120시간동안 진탕배양(200 rpm)한다. 배양 종료후 아미노산 분석기에 의해 L-라이신의 생산량을 측정한다. 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881와 KFCC-10881-CJP5112에 대한 배양액 중의 L-라이신 대한 결과는 아래 표 3와 같다.

균 주	라이신 (g/l)
균 주	배치 1	배치 2	배치 3
KFCC-10881	45	45	44.7
KCCM-10703P (KFCC-10881-CJP5112)	47.7	46.9	47.9

종배지 ( pH 7.0)

원당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7 H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아마이드 2000 ㎍ (공정수 1 리터 기준)

생산배지 ( pH 7.0)

포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, Soy Protein 2.5 g, Corn Steep Solids 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아마이드 3000 ㎍, CaCO3 30 g, (공정수 1리터 기준)

상기의 표 3.에서 알 수 있는 바와 같이 유전자 panD 파괴균주 KCCM-10703P(KFCC-10881-CJP5112)의 경우 모균주 KFCC-10881 대비 라이신 생산이 평균 5.8%나 증가되었음을 확인할 수 있었다.

이상에서 설명한 바와 같이 본 발명은 코리네박테리움의 아스파테이트 1-디카르복시레이즈(panD)의 파괴를 위한 발현벡터 및 이를 포함한 칼슘 판토쎄네이트 요구주의 특성을 가지는 L-라이신 생산균주를 제공함으로써, 생산성이 향상된 L-라이신의 제조방법을 제공하는 효과가 있는 유용한 발명인 것이다.

상기에서 본 발명은 기재된 구체예를 중심으로 상세히 설명되었지만, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

<110> CJ Corp. <120> Method for the preparation of L-lysine using Corynebacterium having disrupted panD gene <130> PA05-0397 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 411 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 atgctgcgca ccatcctcgg aagtaagatt caccgagcca ctgtcactca agctgatcta 60 gattatgttg gctctgtaac catcgacgcc gacctggttc acgccgccgg attgatcgaa 120 ggcgaaaaag ttgccatcgt agacatcacc aacggcgctc gtctggaaac ttatgtcatt 180 gtgggcgacg ccggaacggg caatatttgc atcaatggtg ccgctgcaca ccttattaat 240 cctggcgatc ttgtgatcat catgagctac cttcaggcaa ctgatgcgga agccaaggcg 300 tatgagccaa agattgtgca cgtggacgcc gacaaccgca tcgttgcgct cggcaacgat 360 cttgcggaag cactacctgg atccgggctt ttgacgtcga gaagcattta g 411 <210> 2 <211> 200 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 cgccgccgga ttgatcgaag gcgaaaaagt tgccatcgta gacatcacca acggcgctcg 60 tctggaaact tatgtcattg tgggcgacgc cggaacgggc aatatttgca tcaatggtgc 120 cgctgcacac cttattaatc ctggcgatct tgtgatcatc atgagctacc ttcaggcaac 180 tgatgcggaa gccaaggcgt 200 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 3 cgccgccgga ttgatcgaag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 4 tgatgcggaa gccaaggcgt 20

Claims

L-라이신 생성용 변이 미생물에서, 코리네박테리움(Corynebacterium)속 미생물의 panD 유전자의 활성을 파괴하는 단계; 를 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 L-라이신 생성용 변이 미생물의 제조방법.
제1항에 있어서,

상기 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물의 panD 유전자의 활성을 파괴하는 방법이,

panD 유전자의 일부를 포함하는 재조합 벡터를 L-라이신 생성용 미생물에 형질전환시키는 것임을 특징으로 하는 L-라이신 생성용 변이 미생물의 제조방법
제2항에 있어서,

상기 재조합 벡터가 도 1의 개열지도를 가지는 벡터 pCR-panD인 것을 특징으로 하는 L-라이신 생성용 변이 미생물의 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조된 L-라이신 생성용 변이 미생물.
제4항에 있어서,

상기 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) KFCC10881-CJP5112 (수탁번호 : KCCM-10703P)인 미생물.
제4항의 미생물을 L-라이신을 생성하기에 적절한 조건하에서 배양하는 단계; 및

상기 배양액에서 L-라이신을 회수하는 단계;

를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 L-라이신의 제조방법