JP4239334B2 - 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−グルタミン酸生産菌及びそれを用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は、食品、医薬品等として重要なアミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】
【０００３】
従来、Ｌ−グルタミン酸は、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するブレビバクテリウム属やコリネバクテリウム属に属するコリネ型細菌を用いて発酵法により工業生産されている（アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、１９８６年）。これらのコリネ型細菌は、生産性を向上させるために、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。
【０００４】
また、組換えＤＮＡ技術により、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素の遺伝子を増強することによって、Ｌ−グルタミン酸の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。例えば、特開昭63-214189号公報には、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、アコニット酸ヒドラターゼ遺伝子、及びクエン酸シンターゼ遺伝子を増強することによって、Ｌ−グルタミン酸の生産能を増加させる技術が開示されている。
【０００５】
しかし、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌の育種に利用することは知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、Ｌ−グルタミン酸の需要の一層の増大に応えるために、高いＬ−グルタミン酸生産能を有する菌株を育種し、より安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌のピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を増強することによって、Ｌ−グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌を取得することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
【０００８】
（１）細胞中のピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が増強され、かつＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌。
（２）前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性の増強が、前記細菌細胞内のピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めることによるものである（１）のコリネ型細菌。
【０００９】
（３）ピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がエシェリヒア属細菌由来である（２）のコリネ型細菌。
（４）前記（１）〜（３）のいずれか一項に記載のコリネ型細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−グルタミン酸を採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。
【００１０】
（５）前記培地がビタミンＢ1を２０μｇ／Ｌ以上含有することを特徴とする（４）の方法。
（６）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（７）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（６）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号９の塩基番号２３６０〜５１２５からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号９の塩基番号２３６０〜５１２５からなる塩基配列又は同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（８）前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である（７）のＤＮＡ。
【００１１】
本発明において「Ｌ−グルタミン酸生産能」とは、本発明のコリネ型細菌を培地に培養したときに、培地中にＬ−グルタミン酸を蓄積する能力をいう。このＬ−グルタミン酸生産能は、コリネ型細菌の野生株の性質として有するものであってもよく、育種によって付与または増強された性質であってもよい。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
＜１＞本発明のコリネ型細菌
本発明のコリネ型細菌は、細胞中のピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が増強され、かつＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌である。
【００１４】
コリネ型細菌は、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合された細菌を含み（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
【００１５】
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス）
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
【００１６】
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ１３８７０
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１５８０６
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ＡＴＣＣ２１５１１
コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０２０、１３０３２、１３０６０
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１５９９０
コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６５
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９）
コリネバクテリウム・ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８６８
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ＡＴＣＣ１４０２０
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０６７
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ＡＴＣＣ１４０６８
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３６６５、ＡＴＣＣ１３８６９、
ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ１３８２５
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ＡＴＣＣ１４０６６
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス） ＡＴＣＣ６８７１
ブレビバクテリウム・アルバム ＡＴＣＣ１５１１１
ブレビバクテリウム・セリヌム ＡＴＣＣ１５１１２
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１５３５４
【００１７】
これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受けることができる。すなわち、各菌株ごとに対応する登録番号が付与されており、この登録番号を引用して分譲を受けることができる。各菌株に対応する登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、AJ12340株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-1539の受託番号でブダペスト条約に基づいて寄託されている。
【００１８】
＜２＞ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性の増幅
コリネ型細菌細胞中のピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を増幅するには、ピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子断片を、該細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組み換えＤＮＡを作製し、これをＬ−グルタミン酸生産能を有する宿主細菌に導入して形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が増幅される。
【００１９】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼは、エシェリヒア・コリでは、E1、E2、E3の３個のサブユニットからなるヘテロオリゴマーであり、それぞれaceE遺伝子、aceF遺伝子およびlpd遺伝子にコードされ、これらの遺伝子はオペロンを形成している。本発明にいうピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子又はピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子とは、このようなピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体をコードするオペロン、又は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するモノマーをコードする遺伝子をいう。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するモノマーとしては、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのpdhA遺伝子によりコードされるE1サブユニットが挙げられる。
【００２０】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、コリネ型細菌由来の遺伝子、及びエシェリヒア属細菌等の他の生物由来の遺伝子のいずれも使用することができる。
【００２１】
エシェリヒア・コリＫ−１２のピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている（FEMS Microbiology Letters、第44巻、417頁、1987年）ので、その塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば配列表配列番号１及び２に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリ染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法（ＰＣＲ：polymerase chain reaction； White,T.J. et al ;Trends Genet. 5,185(1989)参照）によって、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を取得することができる。他の微生物由来のピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子も、同様にして取得され得る。コリネ型細菌由来の遺伝子については後述する。
【００２２】
染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（H.Saito and K.Miura Biochem.Biophys.Acta, 72,619,(1963)）等により調製することができる。
【００２３】
ＰＣＲ法により増幅されたピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、エシェリヒア・コリ及び／又はコリネ型細菌の細胞内において自律複製可能なベクターＤＮＡに接続して組換えＤＮＡを調製し、これをエシェリヒア・コリ細胞に導入しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、宿主の細胞内で自立複製可能なプラスミドベクターが好ましく、例えば pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010等が挙げられる。
【００２４】
コリネ型細菌で機能するベクターとは、例えばコリネ型細菌で自律複製出来るプラスミドである。具体的に例示すれば、以下のものが挙げられる。
【００２５】
ｐＡＭ ３３０ 特開昭５８−６７６９９号公報参照
ｐＨＭ １５１９ 特開昭５８−７７８９５号公報参照
ｐＡＪ ６５５ 特開昭５８−１９２９００号公報参照
ｐＡＪ ６１１ 同 上
ｐＡＪ １８４４ 同 上
ｐＣＧ １ 特開昭５７−１３４５００号公報参照
ｐＣＧ ２ 特開昭５８−３５１９７号公報参照
ｐＣＧ ４ 特開昭５７−１８３７９９号公報参照
ｐＣＧ １１ 同 上
ｐＨＫ４ 特開平５−７４９１号公報参照
【００２６】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子とコリネ型細菌で機能するベクターを連結して組み換えＤＮＡを調製するには、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。
【００２７】
上記のように調製した組み換えＤＮＡをコリネ型細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。本発明の実施例で用いた形質転換の方法は、電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）である。
【００２８】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性の増幅は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をコリネ型細菌の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。コリネ型細菌に属する微生物の染色体ＤＮＡ上にピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平２−１０９９８５号公報に開示されているように、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内のピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数が上昇する結果、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が増幅される。
【００２９】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性の増幅は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体ＤＮＡ上又はプラスミド上のピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される（特開平１−２１５２８０号公報参照）。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰRプロモーター、ＰLプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。これらのプロモーターへの置換により、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が強化されることによってピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が増幅される。発現調節配列の増強は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００３０】
また、本発明のコリネ型細菌は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ以外の他のＬ−グルタミン酸生合成を触媒する酵素の活性が高められていてもよい。このようなＬ−グルタミン酸生合成を触媒する酵素としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミンシンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ等がある。
【００３１】
さらに、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損していてもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、αケトグルタール酸デヒドロゲナーゼ（αＫＧＤＨ）、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ、等がある。これらの酵素の中では、αＫＧＤＨが好ましい。
【００３２】
さらに、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌に、界面活性剤等のビオチン作用抑制物質に対する温度感受性変異を付与することにより、過剰量のビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質の非存在下でＬ−グルタミン酸を生産させることができる（WO96/06180号参照）。このようなコリネ型細菌としては、WO96/06180号に記載されているブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029が挙げられる。AJ13029株は、1994年９月２日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号FERM P-14501として寄託され、１９９５年８月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5189が付与されている。
【００３３】
＜３＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（pdhA）は、例えばブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９株の染色体ＤＮＡから、該染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１１に示す塩基配列を有するプライマー及び配列表の配列番号１２に示す塩基配列を有するプライマーを用いたPCRにより取得することができる。
【００３４】
pdhA遺伝子は、上記のようにしてＰＣＲにより取得されたものであるが、本発明のＤＮＡの塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションによって、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの染色体ＤＮＡリブラリーから取得することもできる。
【００３５】
ゲノムＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換等の方法は、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1.21(1989)に記載されている。
【００３６】
本発明のＤＮＡは、コードされるピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードするものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、前記「数個」は、２から４００個、好ましくは、２から１００個、より好ましくは２から２０個である。
【００３７】
上記のようなピルビン酸デヒドロゲナーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、ピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００３８】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、ピルビン酸デヒドロゲナーゼを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）も含まれる。
【００３９】
上記のような変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、発現産物のピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を調べることにより、ピルビン酸デヒドロゲナーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を有するピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号９の塩基番号２３６０〜５１２５からなる塩基配列を有するＤＮＡ又は同塩基配列を有するＤＮＡから調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼを有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、ピルビン酸デヒドロゲナーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。前記プローブは、配列番号９のＤＮＡからＰＣＲによって適当な領域を増幅することによって得ることができる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば４０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００４０】
このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を、公知の方法（Methods in Enzymology、第9巻、248〜249頁、1966年）で測定することによって容易に取り除くことができる。
【００４１】
＜４＞本発明のコリネ型細菌を用いたＬ−グルタミン酸の生産
コリネ型細菌に属し、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が増幅され、かつＬ−グルタミン酸生産能を有する菌株を用いてＬ−グルタミン酸を生産させるには、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用いて常法により行うことができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源及び窒素源は、培養する菌株の利用可能なものならばいずれの種類を用いてもよい。
【００４２】
炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、シュクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。
【００４３】
窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用される。
【００４４】
有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が使用され、生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添する事が必要である。
【００４５】
無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
本発明のコリネ型細菌は、通常のＬ−グルタミン酸生産菌の培養に用いる培地に必要とするよりも少量のビタミンＢ1存在下、例えば２０μg／Ｌ以下のビタミンＢ1存在下でも、従来の方法と同程度のＬ−グルタミン酸を生産することができる。また、本発明のコリネ型細菌の培養に用いる培地に、ビタミンＢ1を２０μg／Ｌ以上、好ましくは５００μg／Ｌ以上含有させることにより、Ｌ−グルタミン酸の生産量を増大させることができる。
【００４６】
培養方法は、発酵温度２０〜４５℃、ｐＨを５〜９に制御しつつ通気培養を行う。培養中にｐＨが下がる場合には、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和する。かくして１０時間〜４日間程度培養することにより培養液中に著量のＬ−グルタミン酸が蓄積される。
【００４７】
培養終了後の培養液からＬ−グルタミン酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。
【００４８】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００４９】
【実施例１】
＜１＞エシェリヒア・コリＫ−１２のピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
エシェリヒア・コリＫ−１２のピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている（FEMS Microbiology Letters、第44巻、417頁、1987年）。報告されている塩基配列に基づいて配列表配列番号１及び２に示すプライマーを合成し、エシェリヒア・コリＫ−１２由来ＪＭ１０９株（宝酒造社製）の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法によりピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を増幅した。
【００５０】
合成したプライマーの内、配列番号１は、FEMS Microbiology Letters、第44巻、417頁、1987年に記載されているピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列図の1039番目から1071番目の塩基に至る配列に相当するが、1039番目と1042番目と1046番目の塩基をAに、1040番目と1043番目の塩基をTに、1044番目の塩基をGに変更し、制限酵素XhoIの認識配列を挿入している。配列番号２は、FEMS Microbiology Letters、第44巻、417頁、1987年に記載されているピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列図の7700番目から7732番目の塩基に至る配列に相当するが、7726番目と7727番目と7730番目の塩基をAに、7729番目の塩基をCに、7724番目の塩基をTに変更し、制限酵素XhoIの認識配列を挿入した塩基配列の逆ストランドを５′側から表記したものである。
【００５１】
エシェリヒア・コリＪＭ１０９株の染色体ＤＮＡの調製は常法によった（生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年）。また、ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ法最前線（関谷剛男ほか編、共立出版社、１９８９年）１８５頁に記載されている標準反応条件を用いた。
【００５２】
生成したＰＣＲ産物を常法により精製後、制限酵素XbaIとXhoIを反応させ、制限酵素XbaIとXhoIで切断したpHSG396（宝酒造社製）とライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した後、エシェリヒア・コリＪＭ１０９のコンピテントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）１０μｇ／ｍｌ、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）４０μｇ／ｍｌ及びクロラムフェニコール20μｇ／ｍｌを含むＬ培地（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、バクトイーストエキストラクト５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．２）に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。
【００５３】
形質転換株からアルカリ法（生物工学実験書、日本生物工学会編、１０５頁、培風館、１９９２年）を用いてプラスミドを調製した後、ベクターに挿入されたＤＮＡ断片の制限酵素地図を作成し、報告されているピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の制限酵素地図（FEMS Microbiology Letters、第44巻、417頁、1987年）と比較し、同一制限酵素地図を有するＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドをpHSGEPDHと名付けた。
【００５４】
さらに、調製したプラスミドpHSGEPDHは、制限酵素XbaIとSacIを反応させ、制限酵素XbaIとSacIで切断したpMW219（ニッポンジーン製）とライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した後、エシェリヒア・コリＪＭ１０９のコンピテントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）１０μｇ／ｍｌ、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）４０μｇ／ｍｌ及びカナマイシン25μｇ／ｍｌを含むＬ培地（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、バクトイーストエキストラクト５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．２）に塗布し、一晩培養後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。形質転換株からアルカリ法（生物工学実験書、日本生物工学会編、１０５頁、培風館、１９９２年）を用いてプラスミドを調製した後、ベクターに挿入されたＤＮＡ断片の制限酵素地図を作成し、報告されているピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の制限酵素地図と比較し、同一制限酵素地図を有するＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドをpMWEPDHと名付けた。
【００５５】
さらに、クローニングされたピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が発現していることを確認するため、JM109株及び、pMWEPDHを保持するJM109株のピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性をWillms等の方法（Methods in Enzymology、第9巻、248〜249頁、1966年）により測定した。その結果、表１に示すように、pMWEPDHを保持するJM109株ではJM109株の約４倍のピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を示すことから、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が発現していることを確認した。
【００５６】
【表１】
【００５７】
＜２＞エシェリヒア・コリＫ−１２株由来ＪＭ１０９株のピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子およびコリネ型細菌の複製起点を有するプラスミドの作製
エシェリヒア・コリＪＭ１０９株のピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子およびコリネ型細菌の複製起点を有するプラスミドを構築するために、既に取得されているコリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドpHM1519（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)）由来の複製起点を持つプラスミドpHK4（特開平５−７４９１号）を制限酵素BamHI及びKpnIで消化して、複製起点を含む遺伝子断片を取得し、得られた断片をＤＮＡ平滑末端化キット（宝酒造社製、Blunting kit）を用い平滑末端化した後、XbaIリンカー（宝酒造社製）を用いて、上記＜１＞でクローニングされたエシェリヒア・コリＪＭ１０９株のピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を保持するプラスミドpMWEPDHのXbaI部位に挿入した。本プラスミドをpEPDHと名付けた。
【００５８】
（３）コリネ型細菌へのpEPDHの導入と培養評価
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029を電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）によりプラスミドｐEPDHで形質転換し、得られた形質転換株を得た。得られた形質転換株AJ13029／pEPDHを用いてＬ−グルタミン酸生産のための培養を以下のように行った。２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＣＭ２Ｂプレート培地にて培養して得たAJ13029／pEPDH株の菌体を、グルコース 30g、KH2PO4 1g、MgSO4・7H2O 0.4g、(NH4)2SO4 30g、FeSO4・7H2O 0.01g、MnSO4・7H2O 0.01g、大豆加水分解液１５ｍｌ、サイアミン塩酸塩 200μg、ビオチン 60μg、カナマイシン25mg及びCaCO3 50g を純水１Ｌ中に含む培地（KOHを用いてpH8.0に調整されている）に接種し31.5℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。得られた培養物を、上記と同じ組成の培地に５％量接種し、37℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。コントロールとして、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029株をpHK4で電気パルス法により形質転換した菌株を上記と同様にして培養した。
【００５９】
培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１０により測定した。このときの結果を表２に示した。
なお、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029は平成６年９月２日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４５０１として寄託され、１９９５年８月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５１８９が付与されている。
【００６０】
【表２】
【００６１】
（４）Ｌ−グルタミン酸生産性に対するビタミンB1添加効果の評価
ピルビン酸デヒドロゲナーゼの補酵素チアミン二リン酸（TPP）の前駆体であるビタミンB1（サイアミン）の添加効果を調べるために、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性増強株AJ13029／pEPDH株を、ビタミンB1の濃度を変えた培地でＬ−グルタミン酸生産のための培養を以下のように行った。
【００６２】
２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＣＭ２Ｂプレート培地にて培養して得たAJ13029／pEPDH株の菌体を、グルコース 30g、KH2PO4 1g、MgSO4・7H2O 0.4g、(NH4)2SO4 30g、FeSO4・7H2O 0.01g、MnSO4・7H2O 0.01g、大豆加水分解液15ml、ビオチン 60μg、カナマイシン25mg及びCaCO3 50gを純水１Ｌ中に含む培地（KOHを用いてpH8.0に調整されている）１Ｌに接種し、31.5℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。得られた培養物を、サイアミン塩酸塩をそれぞれ0、10μg、20μg、200μg、2mg、又は20mg含むこと以外は上記と同じ組成の培地に、５％量接種し、37℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。コントロールとして、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029株を、前記pHK4で電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）により形質転換した菌株を、上記と同様にして培養した。培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１０により測定した。このときの結果を表３及び図１に示した。
【００６３】
【表３】
【００６４】
以上の結果から、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入してピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を増強したコリネ型細菌に属するＬ−グルタミン酸生産菌は、Ｌ−グルタミン酸収率が向上することが判明した。
【００６５】
また、コリネ型細菌に属するＬ−グルタミン酸生産菌、及び、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入してピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を増強したコリネ型細菌に属するＬ−グルタミン酸生産菌は、いずれも培地中のビタミンB1濃度が20μg/L以上の培地中で培養することにより収率が向上することが判明した。
【００６６】
【実施例２】
＜１＞ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１３８６９のpdhA遺伝子のクローニング
大腸菌、緑膿菌および結核菌のピルビン酸デヒドロゲナーゼのE1サブユニット間で相同性の高い領域を選び、配列番号３および配列番号４に示すプライマーを合成し、Advanced Genetic Technologies Corp.製Bacterial Genomic DNA Purification Kitによって調製したブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体を鋳型とし、ＰＣＲテクノロジー（ヘンリーエーリッヒ編、ストックトンプレス、１９８９年）８頁に記載されている標準反応条件でＰＣＲを行い、反応液をアガロースゲル電気泳動したところ、約１．３キロベースのＤＮＡ断片増幅していることが判明した。
【００６７】
得られたＤＮＡは、配列番号３および配列番号４の合成DNAを用いて、両端の塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定は、DNA Sequencing Kit（Applied Biosystems社製）を用いてSangerの方法（J. Mol. Biol., 143, 161（1980））に従って行った。決定された塩基配列をアミノ酸に翻訳して、大腸菌、緑膿菌および結核菌のピルビン酸デヒドロゲナーゼのE1サブユニットと比較したところ、相同性が高かったので、ＰＣＲにより増幅したDNA断片はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９のピルビン酸デヒドロゲナーゼのE1サブユニットをコードするpdhA遺伝子の一部であると判断し、その遺伝子の上流および下流部分のクローニングを、以下に示すようにして行った。
【００６８】
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１３８６９染色体を制限酵素EcoRI、BamHI、HindIII、PstI、SalI、XbaI（宝酒造社製）で消化したDNA断片から、上流部分をクローニングするために配列表配列番号５および配列番号６に示したプライマーを使い、下流部分をクローニングするために配列番号７および配列番号８に示したプライマーを使い、LA PCR in vitro cloning Kit（宝酒造製）を用いて、それぞれクローニングを行った。このキットでPCRを行った結果、上流部分はEcoRI、HindIII、PstI、SalI、XbaIで消化した断片でそれぞれ約0.5、2.5、3.0、1.5、1.8キロベースのDNA断片が増幅され、また下流部分はBamHI、HindIII、PstIで消化した断片でそれぞれ約1.5、1.0、3.5キロベースのDNA断片が増幅されたので、このDNA断片を上記と同様の方法で塩基配列の決定を行った。
【００６９】
その結果、増幅されたDNA断片にはさらに約920アミノ酸のオープン・リーディング・フレームが含まれており、さらにその上流にはプロモーター領域と推定される領域が存在することも明らかとなった。このオープン・リーディング・フレームの塩基配列から推定される産物のアミノ酸配列は既知の大腸菌などのピルビン酸デヒドロゲナーゼE1サブユニットと相同性が高いことから、このオープン・リーディング・フレームがブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１３８６９のピルビン酸デヒドロゲナーゼのE1サブユニットをコードするpdhA遺伝子であると推定された。このオープン・リーディング・フレーム及びプロモーター領域ならびにターミネーターと推定される領域を含む塩基配列を配列表配列番号９に示した。また、前記このオープン・リーディング・フレームから推定される産物のアミノ酸配列を、配列番号９及び１０に示した。なお、タンパク質のＮ末端にあるメチオニン残基は開始コドンであるATGに由来するため、タンパク質本来の機能とは無関係であることが多く、翻訳後ペプチダーゼの働きにより除去されることがよく知られており、上記タンパク質の場合にもＮ末端側のメチオニン残基の除去が生じている可能性がある。ただし、配列番号７に示したATGの６ベース上流にGTGの配列があり、ここからアミノ酸が翻訳されている可能性もある。
【００７０】
また、大腸菌など他の微生物のピルビン酸デヒドロゲナーゼは、E1、E2およびE3の３つのサブユニットから構成されており、これらをコードする遺伝子はオペロンであることが多いが、ここで明らかとなったpdhA遺伝子の下流約３キロベース中にはピルビン酸デヒドロゲナーゼのE2およびE3サブユニットと考えられるオープン・リーディング・フレームは存在しなかった。その代わり、このオープン・リーディング・フレームの下流にはターミネーターと推定される配列が存在していることが明らかとなっていることから、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１３８６９のピルビン酸デヒドロゲナーゼのE2およびE3サブユニットは染色体上の他の部分に存在していると考えられた。
【００７１】
＜２＞pdhA増幅株のグルタミン酸収率向上効果の評価
（１）pdhA増幅用プラスミドの構築
前記のpdhA遺伝子の塩基配列に基づいて、配列番号１１及び１２に示すプライマーを合成し、Advanced Genetic Technologies Corp.製Bacterial Genomic DNA Purification Kitによって調製したブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１３８６９の染色体を鋳型とし、ＰＣＲテクノロジー（ヘンリーエーリッヒ編、ストックトンプレス、１９８９年）８頁に記載されている標準反応条件でＰＣＲを行い、pdhA遺伝子を増幅した。合成したプライマーの内、配列番号１１は、配列表配列番号９に示すpdhA遺伝子の塩基配列の1397番目から1416番目の塩基に至る配列に相当しており、配列番号１２は、配列表配列番号９の5355番目から5374番目の塩基に至る配列に相当する塩基配列の逆ストランドを５’側から表記したものである。
生成したＰＣＲ産物を常法により精製後、制限酵素SalIとEcoT22Iで消化した。
【００７２】
一方、エシェリシア・コリと、コリネ型細菌の双方の菌体中で自律複製可能なプラスミドベクターを作製した。
まず、ストレプトコッカス・フェカリスの薬剤耐性遺伝子を持つベクターを構築した。ストレプトコッカス・フェカリスのカナマイシン耐性遺伝子を、同遺伝子を含む公知のプラスミドからPCRにより増幅した。ストレプトコッカス・フェカリスのカナマイシン耐性遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている（Trieu-Cuot,P. and Courvalin,P.:Gene 23（3）, 331-341（1983））。この配列を基に配列番号１３および１４に示すプライマーを合成し、pDG783（Anne-Marie Guerout- Fleury et al., Gene, 167, 335-337(1995)）を鋳型としてPCRを行ない、カナマイシン耐性遺伝子とそのプロモーターを含むDNA断片を増幅した。
【００７３】
上記DNA断片を宝酒造社製のSUPREC02にて精製した後、制限酵素HindIIIとHincIIで完全分解し平滑末端化した。平滑末端化は宝酒造社製のBlunting Kitにより行なった。このDNA断片と、配列番号１５および１６に示すプライマーを用いてpHSG399(S.Takeshita et al : Gene 61,63-74(1987)参照)を鋳型としてPCRを行って得られた増幅産物を精製し平滑末端化したDNA断片とを、混合し連結した。連結反応は宝酒造社製 DNA ligation kit ver2にて行なった。連結したDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造社製）を形質転換し、IPTG（イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド）10μg/ml、X-Gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D−ガラクトシド）40μg/ml及びカナマイシン25μg/mlを含むL培地（バクトトリプトン10g/L、バクトイーストエキストラクト5g/L、NaCl 5g/L、寒天15g/L、pH7.2）に塗布し、一晩培養後、出現した青色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。
【００７４】
形質転換株からアルカリ法（生物工学実験書、日本生物工学会編、105頁、培風館、1992年）を用いてプラスミドを調製し、制限酵素地図を作成し、図２に示す制限酵素地図と同等であるものをpK1と名付けた。このプラスミドはエシェリヒア・コリ中にて安定に保持され、宿主にカナマイシン耐性を付与する。また、lacZ'遺伝子を含むため、クローニングベクターに適している。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869より抽出したプラスミドpAM330(特開昭58-67699号公報参照)を制限酵素HindIIIで完全分解したのち平滑末端化し、これと、上記pK1を制限酵素BsaAIで完全分解したものを、連結した。連結後のDNAを用いてブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869を形質転換した。形質転換の方法は、電気パルス法（特開平2-207791号参照）を用いた。形質転換体の選択は、カナマイシン25μg/mlを含むM-CM2Bプレート(ポリペプトン10g/L、酵母エキス10g/L、NaCl 5g/L、ビオチン10μg/L、寒天15g/L、pH7.2)にて行った。二晩培養後、コロニーを釣り上げ単コロニー分離し、形質転換体とした。形質転換体からプラスミドDNAを調製し、制限酵素地図を作成し、図３に示す制限酵素切断地図と同一の制限酵素地図を持つものをpSFK6と命名した。このプラスミドは、エシェリシア・コリとコリネ型細菌中で自律複製でき、宿主にカナマイシン耐性を付与する。
【００７５】
上記プラスミドpSFK6を制限酵素SalIとPstIで切断した。これと上記ＰＣＲ産物のSalI-EcoT22I断片をライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した後、エシェリヒア・コリＪＭ１０９のコンピテントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）１０μｇ／ｍｌ、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）４０μｇ／ｍｌ及びカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＬ培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、バクトイーストエキストラクト５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２）に塗布し、一晩培養後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。
【００７６】
形質転換株からアルカリ法（生物工学実験書、日本生物工学会編、１０５頁、培風館、１９９２年）を用いてプラスミドを調製した後、ベクターに挿入されたＤＮＡ断片の制限酵素地図を作成し、配列番号９に示すpdhA遺伝子の制限酵素地図と比較し、同一制限酵素地図を有するＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドをpSFKBPDHAと名付けた。
【００７７】
（２）ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１３８６９およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029へのpSFKBPDHAの導入とフラスコ培養評価
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029を、電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）によりプラスミドpSFKBPDHAで形質転換し、形質転換株を得た。得られた形質転換株ＡＴＣＣ１３８６９／pSFKBPDHA、及びAJ13029／pSFKBPDHAを用いて、Ｌ−グルタミン酸生産のための培養を以下のように行った。２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＣＭ２Ｂプレート培地にて培養して得たAJ13029／pSFKBPDHA株の菌体を、グルコース３０ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ３０ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．０１ｇ、大豆加水分解液１５ｍｌ、サイアミン塩酸塩２００μｇ、ビオチン６０μｇ、カナマイシン２５ｍｇ及びＣａＣＯ3 ５０ｇを純水１Ｌ中に含む培地(ＫＯＨを用いてｐＨ８．０に調整されている）に接種し,３１．５℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。
【００７８】
得られた培養物を、ビオチンを添加していないこと以外は同じ組成の培地に５％量接種し、ＡＴＣＣ１３８６９は３１．５℃、AJ13029は３７℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。コントロールとして、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９及びAJ13029株をpSFK6で、電気パルス法により形質転換した菌株を上記と同様にして培養した。培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１０により測定した。結果を表４に示した。
【００７９】
【表４】
【００８０】
これらの結果から、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１３８６９およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029において、pdhA遺伝子の単独増幅でもＬ−グルタミン酸収率向上に効果があることが明らかとなった。
【００８１】
【発明の効果】
本発明のピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が増強されたコリネ型細菌に属するＬ−グルタミン酸生産菌は、従来よりも効率よくＬ−グルタミン酸を生産することができる。
【００８２】
また、培地にビタミンB1を20μg/L添加することにより、Ｌ−グルタミン酸収率を一層向上させることができる。
また、本発明により、新規なpdhA遺伝子が提供される。
【００８３】
【配列表】
【００８４】
【００８５】
【００８６】
【００８７】
【００８８】
【００８９】
【００９０】
【００９１】
【００９２】
【００９３】
【００９４】
【００９５】
【００９６】
【００９７】
【００９８】
【００９９】
【図面の簡単な説明】
【図１】 コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産性に対するビタミンB1の効果を示す図。
【図２】プラスミドpK1の構築過程を示す図。
【図３】プラスミドpSFK6の構築過程を示す図。
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−グルタミン酸生産菌及びそれを用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は、食品、医薬品等として重要なアミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】
【０００３】
従来、Ｌ−グルタミン酸は、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するブレビバクテリウム属やコリネバクテリウム属に属するコリネ型細菌を用いて発酵法により工業生産されている（アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、１９８６年）。これらのコリネ型細菌は、生産性を向上させるために、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。
【０００４】
また、組換えＤＮＡ技術により、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素の遺伝子を増強することによって、Ｌ−グルタミン酸の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。例えば、特開昭63-214189号公報には、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、アコニット酸ヒドラターゼ遺伝子、及びクエン酸シンターゼ遺伝子を増強することによって、Ｌ−グルタミン酸の生産能を増加させる技術が開示されている。
【０００５】
しかし、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌の育種に利用することは知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、Ｌ−グルタミン酸の需要の一層の増大に応えるために、高いＬ−グルタミン酸生産能を有する菌株を育種し、より安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌のピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を増強することによって、Ｌ−グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌を取得することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
【０００８】
（１）細胞中のピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が増強され、かつＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌。
（２）前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性の増強が、前記細菌細胞内のピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めることによるものである（１）のコリネ型細菌。
【０００９】
（３）ピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がエシェリヒア属細菌由来である（２）のコリネ型細菌。
（４）前記（１）〜（３）のいずれか一項に記載のコリネ型細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−グルタミン酸を採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。
【００１０】
（５）前記培地がビタミンＢ1を２０μｇ／Ｌ以上含有することを特徴とする（４）の方法。
（６）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（７）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（６）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号９の塩基番号２３６０〜５１２５からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号９の塩基番号２３６０〜５１２５からなる塩基配列又は同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（８）前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である（７）のＤＮＡ。
【００１１】
本発明において「Ｌ−グルタミン酸生産能」とは、本発明のコリネ型細菌を培地に培養したときに、培地中にＬ−グルタミン酸を蓄積する能力をいう。このＬ−グルタミン酸生産能は、コリネ型細菌の野生株の性質として有するものであってもよく、育種によって付与または増強された性質であってもよい。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
＜１＞本発明のコリネ型細菌
本発明のコリネ型細菌は、細胞中のピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が増強され、かつＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌である。
【００１４】
コリネ型細菌は、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合された細菌を含み（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
【００１５】
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス）
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
【００１６】
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ１３８７０
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１５８０６
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ＡＴＣＣ２１５１１
コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０２０、１３０３２、１３０６０
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１５９９０
コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６５
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９）
コリネバクテリウム・ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８６８
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ＡＴＣＣ１４０２０
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０６７
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ＡＴＣＣ１４０６８
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３６６５、ＡＴＣＣ１３８６９、
ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ１３８２５
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ＡＴＣＣ１４０６６
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス） ＡＴＣＣ６８７１
ブレビバクテリウム・アルバム ＡＴＣＣ１５１１１
ブレビバクテリウム・セリヌム ＡＴＣＣ１５１１２
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１５３５４
【００１７】
これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受けることができる。すなわち、各菌株ごとに対応する登録番号が付与されており、この登録番号を引用して分譲を受けることができる。各菌株に対応する登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、AJ12340株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-1539の受託番号でブダペスト条約に基づいて寄託されている。
【００１８】
＜２＞ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性の増幅
コリネ型細菌細胞中のピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を増幅するには、ピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子断片を、該細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組み換えＤＮＡを作製し、これをＬ−グルタミン酸生産能を有する宿主細菌に導入して形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が増幅される。
【００１９】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼは、エシェリヒア・コリでは、E1、E2、E3の３個のサブユニットからなるヘテロオリゴマーであり、それぞれaceE遺伝子、aceF遺伝子およびlpd遺伝子にコードされ、これらの遺伝子はオペロンを形成している。本発明にいうピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子又はピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子とは、このようなピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体をコードするオペロン、又は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するモノマーをコードする遺伝子をいう。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するモノマーとしては、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのpdhA遺伝子によりコードされるE1サブユニットが挙げられる。
【００２０】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、コリネ型細菌由来の遺伝子、及びエシェリヒア属細菌等の他の生物由来の遺伝子のいずれも使用することができる。
【００２１】
エシェリヒア・コリＫ−１２のピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている（FEMS Microbiology Letters、第44巻、417頁、1987年）ので、その塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば配列表配列番号１及び２に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリ染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法（ＰＣＲ：polymerase chain reaction； White,T.J. et al ;Trends Genet. 5,185(1989)参照）によって、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を取得することができる。他の微生物由来のピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子も、同様にして取得され得る。コリネ型細菌由来の遺伝子については後述する。
【００２２】
染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（H.Saito and K.Miura Biochem.Biophys.Acta, 72,619,(1963)）等により調製することができる。
【００２３】
ＰＣＲ法により増幅されたピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、エシェリヒア・コリ及び／又はコリネ型細菌の細胞内において自律複製可能なベクターＤＮＡに接続して組換えＤＮＡを調製し、これをエシェリヒア・コリ細胞に導入しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、宿主の細胞内で自立複製可能なプラスミドベクターが好ましく、例えば pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010等が挙げられる。
【００２４】
コリネ型細菌で機能するベクターとは、例えばコリネ型細菌で自律複製出来るプラスミドである。具体的に例示すれば、以下のものが挙げられる。
【００２５】
ｐＡＭ ３３０ 特開昭５８−６７６９９号公報参照
ｐＨＭ １５１９ 特開昭５８−７７８９５号公報参照
ｐＡＪ ６５５ 特開昭５８−１９２９００号公報参照
ｐＡＪ ６１１ 同 上
ｐＡＪ １８４４ 同 上
ｐＣＧ １ 特開昭５７−１３４５００号公報参照
ｐＣＧ ２ 特開昭５８−３５１９７号公報参照
ｐＣＧ ４ 特開昭５７−１８３７９９号公報参照
ｐＣＧ １１ 同 上
ｐＨＫ４ 特開平５−７４９１号公報参照
【００２６】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子とコリネ型細菌で機能するベクターを連結して組み換えＤＮＡを調製するには、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。
【００２７】
上記のように調製した組み換えＤＮＡをコリネ型細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。本発明の実施例で用いた形質転換の方法は、電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）である。
【００２８】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性の増幅は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をコリネ型細菌の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。コリネ型細菌に属する微生物の染色体ＤＮＡ上にピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平２−１０９９８５号公報に開示されているように、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内のピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数が上昇する結果、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が増幅される。
【００２９】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性の増幅は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体ＤＮＡ上又はプラスミド上のピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される（特開平１−２１５２８０号公報参照）。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰRプロモーター、ＰLプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。これらのプロモーターへの置換により、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が強化されることによってピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が増幅される。発現調節配列の増強は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００３０】
また、本発明のコリネ型細菌は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ以外の他のＬ−グルタミン酸生合成を触媒する酵素の活性が高められていてもよい。このようなＬ−グルタミン酸生合成を触媒する酵素としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミンシンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ等がある。
【００３１】
さらに、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損していてもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、αケトグルタール酸デヒドロゲナーゼ（αＫＧＤＨ）、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ、等がある。これらの酵素の中では、αＫＧＤＨが好ましい。
【００３２】
さらに、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌に、界面活性剤等のビオチン作用抑制物質に対する温度感受性変異を付与することにより、過剰量のビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質の非存在下でＬ−グルタミン酸を生産させることができる（WO96/06180号参照）。このようなコリネ型細菌としては、WO96/06180号に記載されているブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029が挙げられる。AJ13029株は、1994年９月２日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号FERM P-14501として寄託され、１９９５年８月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5189が付与されている。
【００３３】
＜３＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（pdhA）は、例えばブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９株の染色体ＤＮＡから、該染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１１に示す塩基配列を有するプライマー及び配列表の配列番号１２に示す塩基配列を有するプライマーを用いたPCRにより取得することができる。
【００３４】
pdhA遺伝子は、上記のようにしてＰＣＲにより取得されたものであるが、本発明のＤＮＡの塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションによって、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの染色体ＤＮＡリブラリーから取得することもできる。
【００３５】
ゲノムＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換等の方法は、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1.21(1989)に記載されている。
【００３６】
本発明のＤＮＡは、コードされるピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードするものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、前記「数個」は、２から４００個、好ましくは、２から１００個、より好ましくは２から２０個である。
【００３７】
上記のようなピルビン酸デヒドロゲナーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、ピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００３８】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、ピルビン酸デヒドロゲナーゼを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）も含まれる。
【００３９】
上記のような変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、発現産物のピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を調べることにより、ピルビン酸デヒドロゲナーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を有するピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号９の塩基番号２３６０〜５１２５からなる塩基配列を有するＤＮＡ又は同塩基配列を有するＤＮＡから調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼを有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、ピルビン酸デヒドロゲナーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。前記プローブは、配列番号９のＤＮＡからＰＣＲによって適当な領域を増幅することによって得ることができる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば４０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００４０】
このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を、公知の方法（Methods in Enzymology、第9巻、248〜249頁、1966年）で測定することによって容易に取り除くことができる。
【００４１】
＜４＞本発明のコリネ型細菌を用いたＬ−グルタミン酸の生産
コリネ型細菌に属し、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が増幅され、かつＬ−グルタミン酸生産能を有する菌株を用いてＬ−グルタミン酸を生産させるには、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用いて常法により行うことができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源及び窒素源は、培養する菌株の利用可能なものならばいずれの種類を用いてもよい。
【００４２】
炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、シュクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。
【００４３】
窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用される。
【００４４】
有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が使用され、生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添する事が必要である。
【００４５】
無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
本発明のコリネ型細菌は、通常のＬ−グルタミン酸生産菌の培養に用いる培地に必要とするよりも少量のビタミンＢ1存在下、例えば２０μg／Ｌ以下のビタミンＢ1存在下でも、従来の方法と同程度のＬ−グルタミン酸を生産することができる。また、本発明のコリネ型細菌の培養に用いる培地に、ビタミンＢ1を２０μg／Ｌ以上、好ましくは５００μg／Ｌ以上含有させることにより、Ｌ−グルタミン酸の生産量を増大させることができる。
【００４６】
培養方法は、発酵温度２０〜４５℃、ｐＨを５〜９に制御しつつ通気培養を行う。培養中にｐＨが下がる場合には、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和する。かくして１０時間〜４日間程度培養することにより培養液中に著量のＬ−グルタミン酸が蓄積される。
【００４７】
培養終了後の培養液からＬ−グルタミン酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。
【００４８】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００４９】
【実施例１】
＜１＞エシェリヒア・コリＫ−１２のピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
エシェリヒア・コリＫ−１２のピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている（FEMS Microbiology Letters、第44巻、417頁、1987年）。報告されている塩基配列に基づいて配列表配列番号１及び２に示すプライマーを合成し、エシェリヒア・コリＫ−１２由来ＪＭ１０９株（宝酒造社製）の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法によりピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を増幅した。
【００５０】
合成したプライマーの内、配列番号１は、FEMS Microbiology Letters、第44巻、417頁、1987年に記載されているピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列図の1039番目から1071番目の塩基に至る配列に相当するが、1039番目と1042番目と1046番目の塩基をAに、1040番目と1043番目の塩基をTに、1044番目の塩基をGに変更し、制限酵素XhoIの認識配列を挿入している。配列番号２は、FEMS Microbiology Letters、第44巻、417頁、1987年に記載されているピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列図の7700番目から7732番目の塩基に至る配列に相当するが、7726番目と7727番目と7730番目の塩基をAに、7729番目の塩基をCに、7724番目の塩基をTに変更し、制限酵素XhoIの認識配列を挿入した塩基配列の逆ストランドを５′側から表記したものである。
【００５１】
エシェリヒア・コリＪＭ１０９株の染色体ＤＮＡの調製は常法によった（生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年）。また、ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ法最前線（関谷剛男ほか編、共立出版社、１９８９年）１８５頁に記載されている標準反応条件を用いた。
【００５２】
生成したＰＣＲ産物を常法により精製後、制限酵素XbaIとXhoIを反応させ、制限酵素XbaIとXhoIで切断したpHSG396（宝酒造社製）とライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した後、エシェリヒア・コリＪＭ１０９のコンピテントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）１０μｇ／ｍｌ、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）４０μｇ／ｍｌ及びクロラムフェニコール20μｇ／ｍｌを含むＬ培地（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、バクトイーストエキストラクト５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．２）に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。
【００５３】
形質転換株からアルカリ法（生物工学実験書、日本生物工学会編、１０５頁、培風館、１９９２年）を用いてプラスミドを調製した後、ベクターに挿入されたＤＮＡ断片の制限酵素地図を作成し、報告されているピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の制限酵素地図（FEMS Microbiology Letters、第44巻、417頁、1987年）と比較し、同一制限酵素地図を有するＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドをpHSGEPDHと名付けた。
【００５４】
さらに、調製したプラスミドpHSGEPDHは、制限酵素XbaIとSacIを反応させ、制限酵素XbaIとSacIで切断したpMW219（ニッポンジーン製）とライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した後、エシェリヒア・コリＪＭ１０９のコンピテントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）１０μｇ／ｍｌ、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）４０μｇ／ｍｌ及びカナマイシン25μｇ／ｍｌを含むＬ培地（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、バクトイーストエキストラクト５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．２）に塗布し、一晩培養後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。形質転換株からアルカリ法（生物工学実験書、日本生物工学会編、１０５頁、培風館、１９９２年）を用いてプラスミドを調製した後、ベクターに挿入されたＤＮＡ断片の制限酵素地図を作成し、報告されているピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の制限酵素地図と比較し、同一制限酵素地図を有するＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドをpMWEPDHと名付けた。
【００５５】
さらに、クローニングされたピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が発現していることを確認するため、JM109株及び、pMWEPDHを保持するJM109株のピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性をWillms等の方法（Methods in Enzymology、第9巻、248〜249頁、1966年）により測定した。その結果、表１に示すように、pMWEPDHを保持するJM109株ではJM109株の約４倍のピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を示すことから、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が発現していることを確認した。
【００５６】
【表１】
＜２＞エシェリヒア・コリＫ−１２株由来ＪＭ１０９株のピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子およびコリネ型細菌の複製起点を有するプラスミドの作製
エシェリヒア・コリＪＭ１０９株のピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子およびコリネ型細菌の複製起点を有するプラスミドを構築するために、既に取得されているコリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドpHM1519（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)）由来の複製起点を持つプラスミドpHK4（特開平５−７４９１号）を制限酵素BamHI及びKpnIで消化して、複製起点を含む遺伝子断片を取得し、得られた断片をＤＮＡ平滑末端化キット（宝酒造社製、Blunting kit）を用い平滑末端化した後、XbaIリンカー（宝酒造社製）を用いて、上記＜１＞でクローニングされたエシェリヒア・コリＪＭ１０９株のピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を保持するプラスミドpMWEPDHのXbaI部位に挿入した。本プラスミドをpEPDHと名付けた。
【００５８】
（３）コリネ型細菌へのpEPDHの導入と培養評価
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029を電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）によりプラスミドｐEPDHで形質転換し、得られた形質転換株を得た。得られた形質転換株AJ13029／pEPDHを用いてＬ−グルタミン酸生産のための培養を以下のように行った。２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＣＭ２Ｂプレート培地にて培養して得たAJ13029／pEPDH株の菌体を、グルコース 30g、KH2PO4 1g、MgSO4・7H2O 0.4g、(NH4)2SO4 30g、FeSO4・7H2O 0.01g、MnSO4・7H2O 0.01g、大豆加水分解液１５ｍｌ、サイアミン塩酸塩 200μg、ビオチン 60μg、カナマイシン25mg及びCaCO3 50g を純水１Ｌ中に含む培地（KOHを用いてpH8.0に調整されている）に接種し31.5℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。得られた培養物を、上記と同じ組成の培地に５％量接種し、37℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。コントロールとして、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029株をpHK4で電気パルス法により形質転換した菌株を上記と同様にして培養した。
【００５９】
培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１０により測定した。このときの結果を表２に示した。
なお、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029は平成６年９月２日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４５０１として寄託され、１９９５年８月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５１８９が付与されている。
【００６０】
【表２】
（４）Ｌ−グルタミン酸生産性に対するビタミンB1添加効果の評価
ピルビン酸デヒドロゲナーゼの補酵素チアミン二リン酸（TPP）の前駆体であるビタミンB1（サイアミン）の添加効果を調べるために、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性増強株AJ13029／pEPDH株を、ビタミンB1の濃度を変えた培地でＬ−グルタミン酸生産のための培養を以下のように行った。
【００６２】
２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＣＭ２Ｂプレート培地にて培養して得たAJ13029／pEPDH株の菌体を、グルコース 30g、KH2PO4 1g、MgSO4・7H2O 0.4g、(NH4)2SO4 30g、FeSO4・7H2O 0.01g、MnSO4・7H2O 0.01g、大豆加水分解液15ml、ビオチン 60μg、カナマイシン25mg及びCaCO3 50gを純水１Ｌ中に含む培地（KOHを用いてpH8.0に調整されている）１Ｌに接種し、31.5℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。得られた培養物を、サイアミン塩酸塩をそれぞれ0、10μg、20μg、200μg、2mg、又は20mg含むこと以外は上記と同じ組成の培地に、５％量接種し、37℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。コントロールとして、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029株を、前記pHK4で電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）により形質転換した菌株を、上記と同様にして培養した。培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１０により測定した。このときの結果を表３及び図１に示した。
【００６３】
【表３】
以上の結果から、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入してピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を増強したコリネ型細菌に属するＬ−グルタミン酸生産菌は、Ｌ−グルタミン酸収率が向上することが判明した。
【００６５】
また、コリネ型細菌に属するＬ−グルタミン酸生産菌、及び、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入してピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を増強したコリネ型細菌に属するＬ−グルタミン酸生産菌は、いずれも培地中のビタミンB1濃度が20μg/L以上の培地中で培養することにより収率が向上することが判明した。
【００６６】
【実施例２】
＜１＞ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１３８６９のpdhA遺伝子のクローニング
大腸菌、緑膿菌および結核菌のピルビン酸デヒドロゲナーゼのE1サブユニット間で相同性の高い領域を選び、配列番号３および配列番号４に示すプライマーを合成し、Advanced Genetic Technologies Corp.製Bacterial Genomic DNA Purification Kitによって調製したブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体を鋳型とし、ＰＣＲテクノロジー（ヘンリーエーリッヒ編、ストックトンプレス、１９８９年）８頁に記載されている標準反応条件でＰＣＲを行い、反応液をアガロースゲル電気泳動したところ、約１．３キロベースのＤＮＡ断片増幅していることが判明した。
【００６７】
得られたＤＮＡは、配列番号３および配列番号４の合成DNAを用いて、両端の塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定は、DNA Sequencing Kit（Applied Biosystems社製）を用いてSangerの方法（J. Mol. Biol., 143, 161（1980））に従って行った。決定された塩基配列をアミノ酸に翻訳して、大腸菌、緑膿菌および結核菌のピルビン酸デヒドロゲナーゼのE1サブユニットと比較したところ、相同性が高かったので、ＰＣＲにより増幅したDNA断片はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９のピルビン酸デヒドロゲナーゼのE1サブユニットをコードするpdhA遺伝子の一部であると判断し、その遺伝子の上流および下流部分のクローニングを、以下に示すようにして行った。
【００６８】
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１３８６９染色体を制限酵素EcoRI、BamHI、HindIII、PstI、SalI、XbaI（宝酒造社製）で消化したDNA断片から、上流部分をクローニングするために配列表配列番号５および配列番号６に示したプライマーを使い、下流部分をクローニングするために配列番号７および配列番号８に示したプライマーを使い、LA PCR in vitro cloning Kit（宝酒造製）を用いて、それぞれクローニングを行った。このキットでPCRを行った結果、上流部分はEcoRI、HindIII、PstI、SalI、XbaIで消化した断片でそれぞれ約0.5、2.5、3.0、1.5、1.8キロベースのDNA断片が増幅され、また下流部分はBamHI、HindIII、PstIで消化した断片でそれぞれ約1.5、1.0、3.5キロベースのDNA断片が増幅されたので、このDNA断片を上記と同様の方法で塩基配列の決定を行った。
【００６９】
その結果、増幅されたDNA断片にはさらに約920アミノ酸のオープン・リーディング・フレームが含まれており、さらにその上流にはプロモーター領域と推定される領域が存在することも明らかとなった。このオープン・リーディング・フレームの塩基配列から推定される産物のアミノ酸配列は既知の大腸菌などのピルビン酸デヒドロゲナーゼE1サブユニットと相同性が高いことから、このオープン・リーディング・フレームがブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１３８６９のピルビン酸デヒドロゲナーゼのE1サブユニットをコードするpdhA遺伝子であると推定された。このオープン・リーディング・フレーム及びプロモーター領域ならびにターミネーターと推定される領域を含む塩基配列を配列表配列番号９に示した。また、前記このオープン・リーディング・フレームから推定される産物のアミノ酸配列を、配列番号９及び１０に示した。なお、タンパク質のＮ末端にあるメチオニン残基は開始コドンであるATGに由来するため、タンパク質本来の機能とは無関係であることが多く、翻訳後ペプチダーゼの働きにより除去されることがよく知られており、上記タンパク質の場合にもＮ末端側のメチオニン残基の除去が生じている可能性がある。ただし、配列番号７に示したATGの６ベース上流にGTGの配列があり、ここからアミノ酸が翻訳されている可能性もある。
【００７０】
また、大腸菌など他の微生物のピルビン酸デヒドロゲナーゼは、E1、E2およびE3の３つのサブユニットから構成されており、これらをコードする遺伝子はオペロンであることが多いが、ここで明らかとなったpdhA遺伝子の下流約３キロベース中にはピルビン酸デヒドロゲナーゼのE2およびE3サブユニットと考えられるオープン・リーディング・フレームは存在しなかった。その代わり、このオープン・リーディング・フレームの下流にはターミネーターと推定される配列が存在していることが明らかとなっていることから、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１３８６９のピルビン酸デヒドロゲナーゼのE2およびE3サブユニットは染色体上の他の部分に存在していると考えられた。
【００７１】
＜２＞pdhA増幅株のグルタミン酸収率向上効果の評価
（１）pdhA増幅用プラスミドの構築
前記のpdhA遺伝子の塩基配列に基づいて、配列番号１１及び１２に示すプライマーを合成し、Advanced Genetic Technologies Corp.製Bacterial Genomic DNA Purification Kitによって調製したブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１３８６９の染色体を鋳型とし、ＰＣＲテクノロジー（ヘンリーエーリッヒ編、ストックトンプレス、１９８９年）８頁に記載されている標準反応条件でＰＣＲを行い、pdhA遺伝子を増幅した。合成したプライマーの内、配列番号１１は、配列表配列番号９に示すpdhA遺伝子の塩基配列の1397番目から1416番目の塩基に至る配列に相当しており、配列番号１２は、配列表配列番号９の5355番目から5374番目の塩基に至る配列に相当する塩基配列の逆ストランドを５’側から表記したものである。
生成したＰＣＲ産物を常法により精製後、制限酵素SalIとEcoT22Iで消化した。
【００７２】
一方、エシェリシア・コリと、コリネ型細菌の双方の菌体中で自律複製可能なプラスミドベクターを作製した。
まず、ストレプトコッカス・フェカリスの薬剤耐性遺伝子を持つベクターを構築した。ストレプトコッカス・フェカリスのカナマイシン耐性遺伝子を、同遺伝子を含む公知のプラスミドからPCRにより増幅した。ストレプトコッカス・フェカリスのカナマイシン耐性遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている（Trieu-Cuot,P. and Courvalin,P.:Gene 23（3）, 331-341（1983））。この配列を基に配列番号１３および１４に示すプライマーを合成し、pDG783（Anne-Marie Guerout- Fleury et al., Gene, 167, 335-337(1995)）を鋳型としてPCRを行ない、カナマイシン耐性遺伝子とそのプロモーターを含むDNA断片を増幅した。
【００７３】
上記DNA断片を宝酒造社製のSUPREC02にて精製した後、制限酵素HindIIIとHincIIで完全分解し平滑末端化した。平滑末端化は宝酒造社製のBlunting Kitにより行なった。このDNA断片と、配列番号１５および１６に示すプライマーを用いてpHSG399(S.Takeshita et al : Gene 61,63-74(1987)参照)を鋳型としてPCRを行って得られた増幅産物を精製し平滑末端化したDNA断片とを、混合し連結した。連結反応は宝酒造社製 DNA ligation kit ver2にて行なった。連結したDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造社製）を形質転換し、IPTG（イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド）10μg/ml、X-Gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D−ガラクトシド）40μg/ml及びカナマイシン25μg/mlを含むL培地（バクトトリプトン10g/L、バクトイーストエキストラクト5g/L、NaCl 5g/L、寒天15g/L、pH7.2）に塗布し、一晩培養後、出現した青色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。
【００７４】
形質転換株からアルカリ法（生物工学実験書、日本生物工学会編、105頁、培風館、1992年）を用いてプラスミドを調製し、制限酵素地図を作成し、図２に示す制限酵素地図と同等であるものをpK1と名付けた。このプラスミドはエシェリヒア・コリ中にて安定に保持され、宿主にカナマイシン耐性を付与する。また、lacZ'遺伝子を含むため、クローニングベクターに適している。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869より抽出したプラスミドpAM330(特開昭58-67699号公報参照)を制限酵素HindIIIで完全分解したのち平滑末端化し、これと、上記pK1を制限酵素BsaAIで完全分解したものを、連結した。連結後のDNAを用いてブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869を形質転換した。形質転換の方法は、電気パルス法（特開平2-207791号参照）を用いた。形質転換体の選択は、カナマイシン25μg/mlを含むM-CM2Bプレート(ポリペプトン10g/L、酵母エキス10g/L、NaCl 5g/L、ビオチン10μg/L、寒天15g/L、pH7.2)にて行った。二晩培養後、コロニーを釣り上げ単コロニー分離し、形質転換体とした。形質転換体からプラスミドDNAを調製し、制限酵素地図を作成し、図３に示す制限酵素切断地図と同一の制限酵素地図を持つものをpSFK6と命名した。このプラスミドは、エシェリシア・コリとコリネ型細菌中で自律複製でき、宿主にカナマイシン耐性を付与する。
【００７５】
上記プラスミドpSFK6を制限酵素SalIとPstIで切断した。これと上記ＰＣＲ産物のSalI-EcoT22I断片をライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した後、エシェリヒア・コリＪＭ１０９のコンピテントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）１０μｇ／ｍｌ、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）４０μｇ／ｍｌ及びカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＬ培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、バクトイーストエキストラクト５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２）に塗布し、一晩培養後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。
【００７６】
形質転換株からアルカリ法（生物工学実験書、日本生物工学会編、１０５頁、培風館、１９９２年）を用いてプラスミドを調製した後、ベクターに挿入されたＤＮＡ断片の制限酵素地図を作成し、配列番号９に示すpdhA遺伝子の制限酵素地図と比較し、同一制限酵素地図を有するＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドをpSFKBPDHAと名付けた。
【００７７】
（２）ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１３８６９およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029へのpSFKBPDHAの導入とフラスコ培養評価
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029を、電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）によりプラスミドpSFKBPDHAで形質転換し、形質転換株を得た。得られた形質転換株ＡＴＣＣ１３８６９／pSFKBPDHA、及びAJ13029／pSFKBPDHAを用いて、Ｌ−グルタミン酸生産のための培養を以下のように行った。２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＣＭ２Ｂプレート培地にて培養して得たAJ13029／pSFKBPDHA株の菌体を、グルコース３０ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ３０ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．０１ｇ、大豆加水分解液１５ｍｌ、サイアミン塩酸塩２００μｇ、ビオチン６０μｇ、カナマイシン２５ｍｇ及びＣａＣＯ3 ５０ｇを純水１Ｌ中に含む培地(ＫＯＨを用いてｐＨ８．０に調整されている）に接種し,３１．５℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。
【００７８】
得られた培養物を、ビオチンを添加していないこと以外は同じ組成の培地に５％量接種し、ＡＴＣＣ１３８６９は３１．５℃、AJ13029は３７℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。コントロールとして、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９及びAJ13029株をpSFK6で、電気パルス法により形質転換した菌株を上記と同様にして培養した。培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１０により測定した。結果を表４に示した。
【００７９】
【表４】
これらの結果から、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１３８６９およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029において、pdhA遺伝子の単独増幅でもＬ−グルタミン酸収率向上に効果があることが明らかとなった。
【００８１】
【発明の効果】
本発明のピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が増強されたコリネ型細菌に属するＬ−グルタミン酸生産菌は、従来よりも効率よくＬ−グルタミン酸を生産することができる。
【００８２】
また、培地にビタミンB1を20μg/L添加することにより、Ｌ−グルタミン酸収率を一層向上させることができる。
また、本発明により、新規なpdhA遺伝子が提供される。
【００８３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産性に対するビタミンB1の効果を示す図。
【図２】プラスミドpK1の構築過程を示す図。
【図３】プラスミドpSFK6の構築過程を示す図。
Claims (5)
- 細胞中のピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が、前記細胞内でピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、またはピルビン酸デヒドロゲナーゼのプロモーターを強力なものに置換することによって増強され、かつＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−グルタミン酸を採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造方法。
- ピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がエシェリヒア属細菌又はコリネ型細菌由来である請求項１記載の方法。
- 前記培地がビタミンＢ1を２０μｇ／Ｌ以上含有することを特徴とする請求項１または２記載の方法。
- ピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡである請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（Ａ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。 - ピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（ａ）配列番号９の塩基番号２３６０〜５１２５からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号９の塩基番号２３６０〜５１２５からなる塩基配列又は同塩基配列から調製されるプローブと０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件下でハイブリダイズし、かつ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
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