KR102265924B1 - Pdk 불활성화에 의한 폴리펩타이드의 생산 - Google Patents
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Abstract
불활성화된 피루베이트 디하이드로지네이즈 카이네이즈 (pyruvate dehydrogenase kinase; PDK) 유전자를 포함하는 재조합 세포, 상기 재조합 세포를 포함하는 목적 폴리펩타이드 생산용 조성물, 및 상기 재조합 세포를 이용하여 목적 폴리펩타이드의 생산 방법이 제공된다.
Description
불활성화된 피루베이트 디하이드로지네이즈 카이네이즈 (pyruvate dehydrogenase kinase; PDK) 유전자를 포함하는 재조합 세포, 상기 재조합 세포를 포함하는 목적 폴리펩타이드 생산용 조성물, 및 재조합 세포를 이용하여 목적 폴리펩타이드의 생산 방법이 제공된다.
항체와 같은 단백질 제품 개발에 있어서, 경제적 생산을 위한 생산 공정 개발이 중요하다. 생산 공정 개발로서 host system 및 세포주 개발, 세포배양공정 개발, 분리정제공정 개발 등을 들 수 있다.
항체의 경우, 현재 허가를 거쳐 시판되고 있는 모든 항체 제품은 동물세포를 host로 이용하여 생산된다. 상기 동물 세포는 안전성이 검증되고 항체 활성에 중요한 glycosylation이 정상적으로 이루어진다는 장점으로 인해, 항체 생산을 위한 가장 적합한 system으로 인정받고 있다. 그러나 동물세포는 성장속도가 느리고 생산성이 낮은 단점이 있다. 치료용 항체의 수요를 충족시키기 위한 방법 중의 하나로, 형질 전환을 이용한 연구가 진행되고 있으며, 이와 같은 전략은 낮은 생산성을 보완 할 수 있다고 평가된다.
항체 등과 같은 단백질의 의학적 및 경제적 중요성이 증가하면서, 이를 경제적이며 안정적으로 생산하기 위한 생산 공정 개발의 중요성 또한 증가하고 있다.
일 예는 피루베이트 디하이드로지네이즈 카이네이즈 (pyruvate dehydrogenase kinase; PDK) 유전자의 불활성화를 위한 재조합 벡터를 제공한다.
다른 예는 불활성화된 PDK 유전자를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
다른 예는 불활성화된 PDK 유전자 및 목적 폴리펩타이드의 유전자를 포함하는 재조합 세포를 제공한다. 상기 재조합 세포는 상기 목적 폴리펩타이드의 생산을 위한 재조합 세포일 수 있다.
다른 예는 상기 재조합 벡터 또는 상기 재조합 세포를 포함하는 목적 폴리펩타이드 생산용 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 재조합 벡터 또는 재조합 세포를 이용하여 목적 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 제공한다.
또 다른 예는 세포, 예컨대 동물 세포에서 PDK 유전자를 불활성화시키는 단계를 포함하는, 상기 세포에서의 목적 폴리펩타이드의 생산 증진 방법을 제공한다.
피루베이트를 에너지로 전환시키는 피루베이트 디하이드로지네이즈의 활성을 저해하는 피루베이트 디하이드로지네이즈 카이네이즈 (pyruvate dehydrogenase kinase; PDK)를 불활성화시킴으로써, 피루베이트 디하이드로지네이즈의 활성을 증가시켜, 단백질의 발현율을 높이는 기술이 제공된다.
본 발명의 일 예는 피루베이트 디하이드로지네이즈 카이네이즈 (pyruvate dehydrogenase kinase; PDK) 유전자의 불활성화를 위한 재조합 벡터를 제공한다.
다른 예는 불활성화된 PDK 유전자를 포함하는 재조합 세포를 제공한다. 상기 재조합 세포는 수탁번호 KCLRF-BP-00328를 부여 받은 것일 수 있다.
다른 예는 불활성화된 PDK 유전자 및 목적 폴리펩타이드의 유전자를 포함하는 재조합 세포를 제공한다. 상기 재조합 세포는 상기 목적 폴리펩타이드의 생산을 위한 재조합 세포일 수 있다.
다른 예는 상기 재조합 벡터 또는 상기 재조합 세포를 포함하는 목적 폴리펩타이드 생산용 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 재조합 벡터 또는 재조합 세포를 이용하여 목적 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 제공한다.
또 다른 예는 세포, 예컨대 동물 세포에서 PDK 유전자를 불활성화시키는 단계를 포함하는, 상기 세포에서의 목적 폴리펩타이드의 생산 증진 방법을 제공한다.
피루베이트 디하이드로지네이즈 카이네이즈 (pyruvate dehydrogenase kinase; PDK; EC 2.7.11.2)는 피루베이트 디하이드로지네이즈 (pyruvate dehydrogenase)를 인산화시켜 불활성화시키는 인산화효소이다. 피루베이트 디하이드로지네이즈는 피루베이트를 아세틸-CoA로 변환시키고 산화시켜 에너지를 생산하는 역할을 한다. PDK는 상기 피루베이트 디하이드로지네이즈의 피루베이트 산화 활성을 저해하여, 피루베이트의 락테이트로의 변환을 증가시키는 작용을 한다. PDK는 PDK1, PDK2, PDK3, 및 PDK4를 포함하며, 본 명세서에서 PDK 또는 PDK 유전자라 함은 PDK1, PDK2, PDK3, 및 PDK4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 또는 PDK1 유전자, PDK2 유전자, PDK3 유전자, 및 PDK4 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 각각 의미한다. 상기 PDK는 동물, 예컨대, 원핵 동물 (예컨대 대장균 등) 또는 진핵 동물 (예컨대, 인간, 원숭이 등의 영장류, 햄스터, 래트, 마우스 등의 설치류와 같은 포유류 등)에서 유래하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 PDK는 CHO (Chinese hamster ovary) 세포 유래의 것일 수 있으며, 예컨대, CHO PDK1 (NCBI Accession No. EGV95676), CHO PDK2 (NCBI Accession No. EGW01786), CHO PDK3 (NCBI Accession No. EGV96253), 및 CHO PDK4 (NCBI Accession No. EGW06951, EGW06952)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 후술하는 동물 세포 중 어느 하나에서 유래하거나 내재하는 것일 수 있다. 상기 PDK 유전자의 불활성화는 세포의 게놈 내 PDK 유전자의 전체의 결실, PDK 유전자 일부의 결실 또는 치환, PDK 유전자 내의 염기 삽입, PDK 유전자의 발현 억제제의 처리 등에 의하여 수행될 수 있다. 또한 상기 불활성화된 PDK 유전자는 PDK 유전자의 전체의 결실, PDK 유전자 일부의 결실 또는 치환, PDK 유전자 내의 염기 삽입, 및/또는 PDK 유전자의 발현 억제제가 처리되어 PDK를 발현하지 않거나 정상적인 기능을 갖는 PDK가 발현하지 않는 PDK 유전자를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 PDK 유전자는 PDK를 암호화하는 전장 DNA, cDNA, 또는 mRNA를 의미하는 것일 수 있으며, 숙주세포 내에 존재하는 내재적 유전자일 수 있다.
상기 PDK 유전자의 전체의 결실은 PDK 유전자를 완전히 제거된 것을 의미한다.
상기 PDK 유전자의 일부의 결실 또는 치환은 PDK 유전자의 코딩 부위, 비코딩 부위, 또는 발현 조절 부위 (예컨대, 프로모터 등)의 일부가 제거되거나 다른 종류의 염기로 치환되어 PDK가 발현되지 않거나 해독틀(reading frame)의 변형으로 정상적인 기능을 갖는 PDK가 발현되지 않는 것을 의미한다. 예컨대, 상기 PDK 유전자의 일부의 결실 또는 치환은 PDK 유전자의 코딩 부위, 비코딩 부위, 또는 발현 조절 부위 (예컨대, 프로모터 등)의 염기서열 중 하나 이상의 염기, 예컨대 1개 내지 1000개, 1개 내지 500개, 1개 내지 300개, 1개 내지 200개, 1개 내지 100개, 1개 내지 50개, 1개 내지 30개, 1개 내지 20개, 1개 내지 10개, 1개 내지 7개, 1개 내지 5개, 2개 내지 1000개, 2개 내지 500개, 2개 내지 300개, 2개 내지 200개, 2개 내지 100개, 2개 내지 50개, 2개 내지 30개, 2개 내지 20개, 2개 내지 10개, 2개 내지 7개, 2개 내지 5개, 5개 내지 1000개, 5개 내지 500개, 5개 내지 300개, 5개 내지 200개, 5개 내지 100개, 5개 내지 50개, 5개 내지 30개, 5개 내지 20개, 5개 내지 10개, 10개 내지 1000개, 10개 내지 500개, 10개 내지 300개, 10개 내지 200개, 10개 내지 100개, 10개 내지 50개, 10개 내지 30개, 또는 10개 내지 20개의 염기가 제거되거나, 야생형에 존재하는 염기와 다른 종류의 염기 또는 변형된 염기(예컨대, methylation, 등)로 치환된 것을 의미할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 결실 또는 치환은 PDK를 암호화하는 유전자의 코딩 부위, cDNA, mRNA, 비코딩 부위, 또는 발현 조절 부위(예컨대, 프로모터 등)에서 이루어지는 것일 수 있다.
상기 PDK 유전자 임의의 위치에의 염기 삽입은 PDK 유전자의 염기서열 중의 임의의 위치에 임의의 염기가 삽입되어 PDK가 발현되지 않거나 정상적인 기능을 갖는 PDK가 발현되지 않는 것을 의미한다. 예컨대, 상기 PDK 유전자의 임의의 위치에의 염기 삽입은 PDK 유전자의 염기서열 임의의 위치에 하나 이상의 염기, 예컨대 1개 내지 1000개, 1개 내지 500개, 1개 내지 300개, 1개 내지 200개, 1개 내지 100개, 1개 내지 50개, 1개 내지 30개, 1개 내지 20개, 1개 내지 10개, 1개 내지 7개, 1개 내지 5개, 1개 내지 3개, 2개 내지 1000개, 2개 내지 500개, 2개 내지 300개, 2개 내지 200개, 2개 내지 100개, 2개 내지 50개, 2개 내지 30개, 2개 내지 20개, 2개 내지 10개, 2개 내지 7개, 2개 내지 5개, 2개 내지 3개, 5개 내지 1000개, 5개 내지 500개, 5개 내지 300개, 5개 내지 200개, 5개 내지 100개, 5개 내지 50개, 5개 내지 30개, 5개 내지 20개, 5개 내지 10개, 10개 내지 1000개, 10개 내지 500개, 10개 내지 300개, 10개 내지 200개, 10개 내지 100개, 10개 내지 50개, 10개 내지 30개, 또는 10개 내지 20개의 임의의 염기가 삽입된 것을 의미할 수 있다. 상기 임의의 염기의 종류에는 특별한 제한이 없으며, A, T (또는 U), G, C, 및 변형된 염기 (예컨대, methylation, 등)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 삽입이 일어나는 위치는, 예컨대, PDK를 암호화하는 유전자의 코딩 부위, cDNA, mRNA, 비코딩 부위, 또는 발현 조절 부위(예컨대, 프로모터 등) 내에 위치할 수 있다.
상기 PDK 유전자의 발현 억제제는 PDK 유전자를 특이적으로 인식 및/또는 결합하여 유전자의 발현 또는 기능을 저해하는 화학 물질 (소분자 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염), 단백질 (예컨대, 항체 또는 항원 결합 단편), 단쇄 또는 이중쇄 핵산 분자 (예컨대, 압타머, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA (small interfering RNA), shRNA (small hairpin RNA), miRNA (microRNA), 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 PDK 유전자의 발현 억제제는 PDK 유전자의 전부 또는 일부 (예컨대, 5 내지 100 bp, 5 내지 50bp, 5 내지 30bp, 또는 5 내지 25bp)에 특이적으로 결합 하는 (또는 상보적 염기서열을 갖는) 단쇄 또는 이중쇄 핵산 분자 (예컨대, 압타머, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA (small interfering RNA), shRNA (small hairpin RNA), miRNA (microRNA), 등)일 수 있다.
상기 PDK 유전자의 PDK 유전자의 일부 결실, 치환 또는 임의의 염기 삽입은 PDK 유전자의 특정 부위 (이하 "표적 부위") 내에서 일어나는 것일 수 있다. 상기 표적 부위는 PDK 유전자의 일부 결실, 치환 또는 임의의 염기 삽입이 일어날 부위를 포함하는 PDK 유전자 (예컨대, 서열번호 109, 서열번호 111 또는 서열번호 113) 내의 연속하는 약 5 내지 100 bp, 예컨대, 5 내지 50bp, 10 내지 50bp, 20 내지 50bp, 5 내지 40bp, 10 내지 40bp, 20 내지 40bp, 5 내지 30bp, 10 내지 30bp, 또는 20 내지 30bp의 염기 서열 부위일 수 있다. 상기 PDK 유전자의 일부 결실 및 치환은 PDK 유전자 (예컨대, 서열번호 109, 서열번호 111 또는 서열번호 113) 내의 연속하는 약 5 내지 100 bp, 예컨대, 5 내지 50bp, 10 내지 50bp, 20 내지 50bp, 5 내지 40bp, 10 내지 40bp, 20 내지 40bp, 5 내지 30bp, 10 내지 30bp, 또는 20 내지 30bp의 염기 서열 부위 내의 하나 이상, 예컨대 1 내지 50개, 1 내지 40개, 1 내지 30개, 1 내지 20개, 또는 1 내지 10개의 염기가 결실 또는 다른 염기로 치환된 것일 수 있다.
일 구체예에서, PDK1 유전자(예컨대, 서열번호 109)의 일부 결실, 치환 또는 임의의 염기 삽입의 경우, 상기 표적 부위는 PDK1 유전자(예컨대, 서열번호 109)의 235번째부터 241번째까지의 연속하는 염기 서열을 포함하는 총 길이 23 내지 100bp, 23 내지 50bp, 23 내지 40bp, 또는 23 내지 30bp의 연속하는 염기 서열일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 115의 염기서열 (서열번호 109의 219번째부터 241번째까지의 연속하는 23bp의 염기 서열)을 포함하는 것일 수 있다. PDK1 유전자의 일부 결실, 치환 또는 임의의 염기 삽입은 상기 표적 부위, 즉, 서열번호 109의 235번째부터 241번째까지의 연속하는 염기 서열을 포함하는 총 길이 23 내지 100bp, 23 내지 50bp, 23 내지 40bp, 또는 23 내지 30bp의 연속하는 염기 서열 중에서 선택된 하나 이상(예컨대, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 7개, 1 내지 5개, 2 내지 20개, 2 내지 15개, 2 내지 10개, 2 내지 7개, 또는 2 내지 5개)의 염기, 예컨대 서열번호 115의 염기 서열 중에서 선택된 하나 이상 (예컨대, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 7개, 1 내지 5개, 2 내지 20개, 2 내지 15개, 2 내지 10개, 2 내지 7개, 또는 2 내지 5개)의 염기가 결실, 다른 염기로 치환 또는 상기 하나 이상의 염기의 상류 또는 하류에 임의의 염기가 삽입되는 것일 수 있다. 일 예에서, PDK1 유전자의 일부 결실, 치환 또는 임의의 염기 삽입은 서열번호 109의 238번째부터 241번째까지의 염기서열(atgg)의 결실 또는 서열번호 109의 135번째부터 238번째까지의 염기서열(acca)의 결실일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
PDK2 유전자(예컨대, 서열번호 111)의 일부 결실, 치환 또는 임의의 염기 삽입의 경우, 상기 표적 부위는 PDK2 유전자(예컨대, 서열번호 111)의 172번째부터 194번째까지의 연속하는 염기 서열을 포함하는 총 길이 23 내지 100bp, 23 내지 50bp, 23 내지 40bp, 또는 23 내지 30bp의 연속하는 염기 서열일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 118의 염기서열 (서열번호 111의 172번째부터 194번째까지의 연속하는 23bp의 염기 서열)을 포함하는 것일 수 있다. PDK2 유전자의 일부 결실, 치환 또는 임의의 염기 삽입은 상기 표적 부위, 즉, 서열번호 111의 172번째부터 194번째까지의 연속하는 염기 서열을 포함하는 총 길이 23 내지 100bp, 23 내지 50bp, 23 내지 40bp, 또는 23 내지 30bp의 연속하는 염기 서열 중에서 선택된 하나 이상(예컨대, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 7개, 1 내지 5개, 2 내지 20개, 2 내지 15개, 2 내지 10개, 2 내지 7개, 또는 2 내지 5개)의 염기, 예컨대 서열번호 118의 염기 서열 중에서 선택된 하나 이상(예컨대, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 7개, 1 내지 5개, 2 내지 20개, 2 내지 15개, 2 내지 10개, 2 내지 7개, 또는 2 내지 5개)의 염기가 결실, 다른 염기로 치환 또는 상기 하나 이상의 염기의 상류 또는 하류에 임의의 염기가 삽입되는 것일 수 있다. 일 예에서, PDK2 유전자의 일부 결실, 치환 또는 임의의 염기 삽입은 서열번호 111의 177번째부터 183번째까지의 염기서열(gcgcctg)의 결실, 서열번호 111의 176번째부터 183번째까지의 염기서열(tgcgcctg)의 결실, 또는 서열번호 111의 179번째와 180번째 사이(즉, 179번째 염기의 3' 말단과 180번째 염기의 5' 말단 사이)의 1개 이상의 염기, 예컨대 1 내지 5개 또는 1 내지 3개의 염기(각각의 염기는 A, T (또는 U), G, C, 및 변형된 염기 (예컨대, methylation, 등)로 이루어진 군에서 선택됨, 예컨대, 'CC') 삽입일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
PDK3 유전자(예컨대, 서열번호 113)의 일부 결실, 치환 또는 임의의 염기 삽입의 경우, 상기 표적 부위는 PDK3 유전자(예컨대, 서열번호 113)의 38번째부터 60번째까지의 연속하는 염기 서열을 포함하는 총 길이 23 내지 100bp, 23 내지 50bp, 23 내지 40bp, 또는 23 내지 30bp의 연속하는 염기 서열일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 122의 염기서열 (서열번호 113의 38번째부터 60번째까지의 연속하는 23bp의 염기 서열)을 포함하는 것일 수 있다. PDK3 유전자의 일부 결실, 치환 또는 임의의 염기 삽입은 상기 표적 부위, 즉, 서열번호 113의 38번째부터 60번째까지의 연속하는 염기 서열을 포함하는 총 길이 23 내지 100bp, 23 내지 50bp, 23 내지 40bp, 또는 23 내지 30bp의 연속하는 염기 서열 중에서 선택된 하나 이상(예컨대, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 7개, 1 내지 5개, 또는 1 내지 3개)의 염기, 예컨대 서열번호 122의 염기 서열 중에서 선택된 하나 이상(예컨대, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 7개, 1 내지 5개, 또는 1 내지 3개)의 염기가 결실, 다른 염기로 치환 또는 상기 하나 이상의 염기의 상류 또는 하류에 임의의 염기가 삽입되는 것일 수 있다. 일 예에서, PDK3 유전자의 일부 결실, 치환 또는 임의의 염기 삽입은 서열번호 113의 45번째 위치(즉. 44번째 염기의 3' 말단과 45번째 염기의 5' 말단 사이)에 임의의 염기(A, T (또는 U), G, C, 또는 변형된 염기 (예컨대, methylation, 등), 예컨대, A)의 삽입일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 "PDK 유전자의 결실, 치환 또는 임의의 염기 삽입"은 앞서 설명한 PDK1 유전자의 결실, 치환 또는 임의의 염기 삽입; PDK2 유전자의 결실, 치환 또는 임의의 염기 삽입; PDK3 유전자의 결실, 치환 또는 임의의 염기 삽입; 또는 이들 중 2개 이상의 조합을 의미할 수 있다.
상기 PDK 유전자를 불활성화시키는 단계는 앞서 설명한 세포의 게놈 내 PDK 유전자의 전체의 결실, PDK 유전자 일부의 결실 또는 치환, 및 PDK 유전자 임의의 위치에의 염기 삽입에 의하여 수행되는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 PDK 유전자를 불활성화시키는 단계는,
1) PDK 유전자 전체 결실,
2) PDK 유전자 내의 연속하는 1개 내지 100개 염기 결실 또는 다른 염기로의 치환,
3) PDK 유전자의 코딩 부위, 비코딩 부위, 또는 발현 조절 부위에 A, T (또는 U), G, C, 및 변형된 염기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기를 총 1개 내지 100개 삽입, 및
4) PDK 유전자의 발현 억제제 처리
로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 의하여 수행되는 것일 수 있다.
상기 세포의 게놈 내 PDK 유전자의 전체의 결실, PDK 유전자 일부의 결실 또는 치환, 및 PDK 유전자 임의의 위치에의 염기 삽입은 본 발명이 속하는 기술 분야에 통상적인 모든 방법에 의할 수 있다.
일 예에서, 상기 세포의 게놈 내 PDK 유전자의 전체의 결실, PDK 유전자 일부의 결실 또는 치환, 및 PDK 유전자 임의의 위치에의 염기 삽입은 PDK 유전자의 불활성화를 위한 재조합 벡터를 사용하여 수행할 수 있다.
PDK 유전자의 불활성화를 위한 재조합 벡터는 앞서 설명한 바와 같은 세포의 게놈 내 PDK 유전자의 전체의 결실, PDK 유전자 일부의 결실 또는 치환, 또는 PDK 유전자 임의의 위치의 염기 삽입을 유도하는 벡터일 수 있다.
예컨대, 상기 PDK 유전자의 불활성화를 위한 재조합 벡터는 불활성화시키고자 하는 특정 유전자 (이하 "표적 유전자") 또는 상기 유전자의 특정 부위 (이하 "표적 부위")를 targeting 하는 (예컨대, 특이적으로 결합하거나 상보적 염기서열을 갖는) 폴리뉴클레오타이드 단편 (표적화 폴리뉴클레오타이드 단편) (예컨대, RNA 단편), 및 상기 표적 유전자 또는 표적 부위 내의 특정 위치를 절단하는 핵산 분해효소(예컨대, Cas 단백질 (e.g., Cas9 등) 등) 코딩 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 표적화 폴리뉴클레오타이드 단편과 핵산 분해효소는 각각 별개의 벡터에 포함되거나 동일한 벡터에 함께 포함되어 사용될 수 있다. 예컨대, 상기 PDK 유전자의 불활성화를 위한 재조합 벡터는 PDK 유전자 내의 표적 부위와 상보적 서열을 갖는 약 5 내지 100 bp, 예컨대, 5 내지 50bp, 10 내지 50bp, 20 내지 50bp, 5 내지 40bp, 10 내지 40bp, 20 내지 40bp, 5 내지 30bp, 10 내지 30bp, 또는 20 내지 30bp의 RNA 단편 및 Cas9를 각각 별개의 벡터 또는 동일한 벡터에 함께 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
목적 폴리펩타이드를 세포에서 발현시키기 위하여 목적 폴리펩타이드 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 발현 벡터로 사용할 수 있다.
상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 PDK 유전자 불활성화를 위한 재조합 벡터 및/또는 목적 폴리펩타이드 유전자를 포함하는 재조합 벡터에서, 상기 불활성화에 필요한 유전자 또는 목적 폴리펩타이드 유전자는 프로모터, 전사 종결 인자 등의 통상적인 유전자 발현 조절인자와 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 유전자 발현 조절 인자와 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 유전자 발현 조절 서열은 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다. 상기 재조합 벡터에 있어서, 유전자 발현 조절 인자가 상기 불활성화된 PDK 유전자 및/또는 목적 폴리펩타이드의 유전자에 작동 가능하게 연결되기 위해서, 상기 유전자 발현 조절 인자는 상기 불활성화된 PDK 유전자 및/또는 목적 폴리펩타이드의 유전자의 5' 말단 쪽에 연결된 것일 수 있다.
상기 프로모터는 특정 유전자의 전사 개시를 조절하는 전사 조절 인자 중 하나로, 통상적으로 약 100 내지 약 2000 bp 또는 약 100 내지 약 1000 bp 길이의 폴리뉴클레오타이드 단편이다. 일 구체예에서, 상기 프로모터는 세포, 예컨대, 바이러스 세포, 박테리아 세포, 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 또는 동물 세포에서 전사 개시를 조절할 수 있으면, 제한 없이 사용 가능하다. 예컨대, 상기 프로모터는 CMV 프로모터 (cytomegalovirus promoter), SV40 프로모터, 아데노바이러스 프로모터(major late promoter), pLλ 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, HSV의 tk 프로모터 등의 원핵 세포 또는 포유류 바이러스의 프로모터, 및 메탈로티오닌 프로모터(metallothionin promoter), 베타-액틴 프로모터 등의 동물 세포 프로모터 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다
용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 모든 수단을 의미한다. 상기 벡터는 목적 유전자 발현을 위한 요소 (elements)를 포함하는 것으로, 복제원점 (replication origin), 프로모터, 작동 유전자 (operator), 전사 종결 서열 (terminator) 등을 포함할 수 있고, 숙주 세포의 게놈 내로의 도입을 위한 적절한 효소 부위 (예컨대, 제한 효소 부위) 및/또는 숙주 세포 내로의 성공적인 도입을 확인하기 위한 선별 마커 및/또는 단백질로의 번역을 위한 리보좀 결합 부위 (ribosome binding site; RBS) 등을 추가로 포함할 수 있다 (도 1 참조). 상기 재조합 벡터는 프로모터 이외의 전사 조절 서열을 추가로 포함할 수 있다.
상기 전사 종결 서열은 폴리아데닐화 서열(pA) 등일 수 있고, 상기 복제 원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, BBV 복제원점 등일 수 있다.
상기 선별 마커는 재조합 벡터가 숙주 세포 내에 성공적으로 도입되었는지 여부를 확인하거나 안정적인 세포주 구축을기 위한 유전자로서, 예컨대 항생제와 같은 약물 저항 유전자, 대사 관련 유전자, 유전자 증폭 유전자 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 항생제 저항성 유전자는 본 발명의 핵심적 기술인 벡터의 최적의 조합에 따른 발현 효율에 크게 영향을 미치는 요소가 아니므로, 선별 마커로서 일반적으로 사용되는 항생제 저항 유전자 및/또는 대사 관련 효소 유전자 등을를 제한 없이 사용할 수 있다. 예컨대, 상기 항생제 저항 유전자선별 마커는 암피실린(ampicilin) 저항 유전자, 테트라사이클린(tetracyclin) 저항 유전자, 카나마이신(kanamycin) 저항 유전자, 클로람페니콜(chloroamphenicol) 저항 유전자, 스트렙토마이신 (streptomycin) 저항 유전자, 네오마이신(neomycin) 저항 유전자, 제오신 (Zeocin) 저항 유전자, 퓨로마이신 (Puromycin) 저항 유전자, 티미딘 키나아제 (TK) 유전자, 디하이드로폴레이트 환원효소 (Dihydrofolate reductase, DHFR) 유전자, 글루타민 합성효소 (Glutamine synthetase, GS) 유전자 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예컨대, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1, M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 기본으로 하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 세포는 숙주 세포에 앞서 설명한 방법에 의하여 PDK 유전자의 불활성화가 도입된 (즉, 숙주 세포의 게놈 유전자 내 PDK 유전자가 불활성화된) 것을 의미한다.
상기 숙주 세포로는 PDK 유전자를 포함하고, 재조합 벡터에 포함된 프로모터가 작동 가능한(즉, 전사 개시 기능을 나타낼 수 있고) 모든 종류의 동물 세포, 예컨대, 원핵 동물 세포 (예컨대, 대장균) 또는 진핵 동물 세포 (예컨대, 포유동물 세포)가 사용될 수 있다. 예컨대, 본 발명을 위해 적합한 포유동물 숙주 세포는 마우스 (예컨대, COP, L, C127, Sp2/0, NS-0, NS-1, At20 또는 NIH3T3), 래트 (PC12, PC12h, GH3, MtT), 햄스터 (예컨대, BHK, CHO, GS 유전자 결함 CHO, 또는 DHFR 유전자 결함 CHO), 원숭이 (예컨대, COS1, COS3, COS7, CV1 또는 Vero), 인간 (예컨대, Hela, HEK-293, 망막-유래 PER-C6, 이배체 섬유모세포로부터 유래된 세포, 골수종 세포 및 HepG2) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으니, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 숙주 세포는 생체에서 분리된 것일 수 있다. 일 예에서, 본 발명에서 불활성화되는 PDK 유전자는 상기한 동물 세포의 내재 유전자일 수 있다.
상기 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예컨대, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 발현 벡터가 도입된 재조합 세포(형질전환체)를 선별하는 방법은 통상적인 선별 마커를 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예컨대, 상기 선별 마커가 앞서 설명한 바와 같은 특정 항생제 저항 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 상기 세포를 배양함으로써 재조합 벡터가 도입된 재조합 세포를 용이하게 선별할 수 있다.
상기 목적 폴리펩타이드가 질병 또는 병적 증상의 예방, 치료 및/또는 경감과 관련된 기능을 갖는 것(예컨대, 항체)인 경우, 본 발명의 다른 예는 상기 목적 폴리펩타이드 유전자의 발현 벡터, 상기 목적 폴리펩타이드 유전자를 포함하는 재조합 세포 및 상기 재조합 세포의 배양물 (세포 포함 또는 무세포)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일 예에서, 상기 생산 방법은 상기 재조합 세포에서 상기 목적 폴리펩타이드를 발현시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 목적 폴리펩타이드를 발현시키는 단계는 상기 재조합 세포를 상기 목적 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 조건 및 세포 배양 배지 내에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 재조합 세포는 PDK 유전자가 불활성화되고 목적 폴리펩타이드의 유전자를 포함하는 것일 수 있다.
또한 상기 생산 방법은 상기 배양하는 단계 이후에, 상기 배양물로부터 상기 목적 폴리펩타이드를 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 폴리펩타이드의 수득 단계는 상기 재조합 세포의 파쇄물 및/또는 상기 배양 배지(폴리펩타이드가 배지로 분비되는 경우)로부터 폴리펩타이드를 분리하는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 상기 생산 방법은 수득된 폴리펩타이드가 목적하는 품질 및/또는 순도를 갖도록 하기 위한 추가의 처리 단계, 예컨대, 정제 및/또는 변형 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "목적 폴리펩타이드"는 펩타이드 결합(들)에 의해 함께 연결된 아미노산의 중합체를 포함하는 분자를 의미한다. 폴리펩타이드는 임의의 길이의 폴리펩타이드, 예컨대, 단백질 (예컨대, 50개 초과의 아미노산을 포함) 또는 펩타이드 (예컨대, 2 내지 49개의 아미노산 포함)일 수 있다.
본 발명에서의 "목적 폴리펩타이드"는 생체에서 목적하는 활성 (예컨대 특정 질병 또는 증상의 예방, 경감, 및/또는 치료 활성 또는 생체 필요 물질을 대체하는 활성)을 갖는 단백질 및/또는 펩타이드일 수 있으며, 예컨대, 효소 활성의 단백질 또는 펩타이드 (예컨대, 프로테아제, 키나제, 포스파타제 등), 수용체 단백질 또는 펩타이드, 수송체 단백질 또는 펩타이드, 살균 및/또는 내독소-결합 폴리펩타이드, 구조 단백질 또는 펩타이드, 면역 폴리펩타이드, 독소, 항생제, 호르몬, 성장 인자, 백신 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 예에서, 상기 목적 폴리펩타이드는 호르몬, 사이토카인, 조직 플라스미노겐 활성인자, 면역글로불린 (예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 변이체) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 면역글로불린은 임의의 이소타입 (예컨대, IgA, IgD, IgG, IgM 또는 IgE)의 것일 수 있으며, 예컨대, IgG (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4) 분자일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 본래 항체의 항원 결합 능력을 보유하는 단편으로, 약 20개 이상의 아미노산, 예컨대, 약 100개 이상의 아미노산을 포함하는 항체의 임의의 단편일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 항체의 항원 결합 부위, 예컨대, CDS, Fab 단편, F(ab)2 단편, Fv, scFv, 다수의 결합 도메인을 포함하는 멀티바디 (multibody) (예컨대, 디아바디 (diabody), 트리아바디 (triabody), 테트라바디 (tetrabody) 등), 단일 도메인 항체, 애피바디 (affibody) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이 상일 수 있다. 상기 항체 변이체는 항체와 동일한 결합 기능을 갖지만 본래 항체와 변경된 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편의 유도체이다. 상기 항체 및/또는 항원 결합 단편은 예컨대, 마우스 항체, 인간 항체, 키메라 (chimera) 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다. 상기 항체 및/또는 항원 결합 단편은 생체에서 분리된 것 또는 비자연 유래 (non-naturally occurring)의 것일 수 있다. 상기 항체 및/또는 항원 결합 단편은 합성적 또는 재조합적으로 생산된 것일 수 있다. 상기 항체는 단클론항체일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 목적 폴리펩타이드는 인슐린, 사람 성장 호르몬(hGH), 인슐린-유사 성장 인자, EGF, VERF 등의 각종 성장 인자, 각종 수용체, 조직 플라스미노겐 활성인자(tPA), 에리트로포이에틴(EPO), 사이토카인 (예컨대, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18과 같은 인터루킨), 인터페론(IFN)-알파, -베타, -감마, -오메가 또는 -타우, TNF-알파, 베타 또는 감마와 같은 종양 괴사 인자(TNF), TRAIL, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 목적 폴리펩타이드는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
상기 항 c-Met 항체는 c-Met의 특정 부위, 예컨대 SEMA 도메인 내의 특정 부위를 에피토프로 인식하는 것일 수 있으며, c-Met에 작용하여 세포내이동(internalization) 및 분해(degradation)를 유도하는 모든 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다.
HGF(Hepatocyte growth factor)의 수용체인 c-Met은 세포외 부위, 막투과 부위, 세포내 부위의 세 부분으로 구분되며, 세포외 부위의 경우, 이황화 결합에 의해 α-소단위체와 β-소단위체가 연결된 형태로 HGF 결합 도메인인 SEMA 도메인, PSI 도메인(plexin-semaphorins-integrin homology domain) 및 IPT 도메인(immunoglobulin-like fold shared by plexins and transcriptional factors domain)으로 이루어진다. c-Met 단백질의 SEMA 도메인은 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, c-Met의 세포외 부위에 존재하는 도메인으로서, HGF가 결합하는 부위에 해당한다. SEMA 도메인 중에서 특정 부위, 예컨대, 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 영역은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프 중 2번과 3번 프로펠러 도메인 사이의 루프(loop) 부위에 해당하며, 본 발명에서 제안되는 항 c-Met 항체의 에피토프로 작용할 수 있다.
용어, "에피토프(epitope)"는 항원 결정 부위(antigenic determinant)로서, 항체에 의해 인지되는 항원의 일부분을 의미하는 것으로 해석된다. 일 구체예에 따르면, 상기 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 연속하는 5개 이상의 아미노산을 포함하는 부위, 예컨대, c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71 내에 위치하는 연속하는 5개 내지 19개의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 에피토프는 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하여 연속하는 5 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다.
상기 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 2번과 3번 프로펠러 구조의 도메인 사이의 루프 부위 중 가장 바깥으로 위치한 부위에 해당하며, 상기 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 일 구체예에 따른 항체 또는 항원 결합 단편이 가장 특이적으로 결합하는 부위이다.
따라서, 항 c-Met 항체는 서열번호 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하는 연속하는 5 내지 19개의 아미노산을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72, 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는,
서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR), 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;
서열번호 7의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 15의 아미노산 서열, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;
상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는
상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합
을 포함하고,
상기 서열번호 4 내지 서열번호 9는 각각 하기 일반식 Ⅰ 내지 일반식 Ⅵ으로 표시되는 아미노산 서열인 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다:
일반식 Ⅰ
Xaa1-Xaa2-Tyr-Tyr-Met-Ser (서열번호 4),
일반식 Ⅱ
Arg-Asn-Xaa3-Xaa4-Asn-Gly-Xaa5-Thr (서열번호 5),
일반식 Ⅲ
Asp-Asn-Trp-Leu-Xaa6-Tyr (서열번호 6),
일반식 Ⅳ
Lys-Ser-Ser-Xaa7-Ser-Leu-Leu-Ala-Xaa8-Gly-Asn-Xaa9-Xaa10-Asn-Tyr-Leu-Ala (서열번호 7)
일반식 Ⅴ
Trp-Xaa11-Ser-Xaa12-Arg-Val-Xaa13 (서열번호 8)
일반식 Ⅵ
Xaa14-Gln-Ser-Tyr-Ser-Xaa15-Pro-Xaa16-Thr (서열번호 9)
상기 일반식 Ⅰ에서, Xaa1은 존재하지 않거나 Pro 또는 Ser이고, Xaa2는 Glu 또는 Asp이며,
상기 일반식 Ⅱ에서, Xaa3은 Asn 또는 Lys이며, Xaa4는 Ala 또는 Val이고, Xaa5는 Asn 또는 Thr이며,
상기 일반식 Ⅲ에서, Xaa6은 Ser 또는 Thr이고,
상기 일반식 Ⅳ에서, Xaa7은 His, Arg, Gln 또는 Lys이고, Xaa8은 Ser 또는 Trp이고, Xaa9은 His 또는 Gln이며, Xaa10는 Lys 또는 Asn이고,
상기 일반식 Ⅴ에서, Xaa11은 Ala 또는 Gly이며, Xaa12은 Thr 또는 Lys이고, Xaa13는 Ser 또는 Pro이며,
상기 일반식 Ⅵ에서, Xaa14은 Gly, Ala 또는 Gln이고, Xaa15는 Arg, His, Ser, Ala, Gly 또는 Lys이며, Xaa16는 Leu, Tyr, Phe 또는 Met이다.
일 구체예에서, 상기 CDR-H1은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-H2는 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-H3는 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 CDR-L1은 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-L2는 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-L3은 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은
서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H3)를 포함하는 중쇄 가변 영역;
서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
상기 중쇄 가변 영역과 상기 경쇄 가변 영역의 조합
을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 17, 서열번호 74, 서열번호 87, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 또는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 상기 중쇄 가변 영역, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 75, 서열번호 88, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99 또는 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 상기 경쇄 가변 영역, 또는 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 항 c-Met 항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00220인 하이브리도마 세포에서 생산되는, c-Met 단백질의 세포외 부위(extracellular region)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체일 수 있다 (대한민국 공개특허 제2011-0047698호 참조; 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함됨).
상기의 항 c-Met 항체는 대한민국 공개특허 제2011-0047698호에 정의된 항체를 모두 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는,
서열번호 62의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 64의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 66의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 및 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
서열번호 68의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 70의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 및 서열번호 108의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는 것일 수 있다.
예컨대, 상기 항-c-Met 항체는,
서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 또는
서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체
서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 및
서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체
로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항 c-Met 항체는 서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체일 수 있다.
한편, 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드는 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄이며, 서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드는 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에서 36번 (kabat numbering에 따름, 서열번호 68 내의 62번째 아미노산 위치) 히스티딘 (histidine)이 티로신 (tyrosine)으로 치환된 형태의 폴리펩타이드다. 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 생산량이 증가될 수 있다. 또한 상기 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드는 상기 서열번호 68의 아미노산 서열 중 1번째부터 20번째까지의 시그널 펩타이드를 제외한 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에서 kabat numbering에 의한 27e 위치(kabat numbering에 따름, 서열번호 108 내 32번째 위치; CDR-L1 내부)의 세린(Ser)이 트립토판(Trp)으로 치환된 것으로, 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 활성(예컨대, c-Met에 대한 결합친화도, c-Met 분해 활성 및 Akt 인산화 억제 활성 등)이 보다 증진될 수 있다.
상기 항 c-Met 항체 또는 항 EGFR 항체의 앞서 정의된 CDR 부위 또는 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역을 제외한 부위, 예컨대, 경쇄 불변 영역과 중쇄 불변 영역은 모든 서브타입의 면역글로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, 등) 유래의 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 본 발명에서의 항체의 항원 결합 단편은 상기한 상보성 결정 영역을 하나 이상 포함하는 항체 단편, 예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 목적 폴리펩타이드가 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 경우, 이를 암호화하는 목적 유전자는 상기 항 c-Met 항체의 앞서 설명한 중쇄 CDR 또는 경쇄 CDR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 앞서 설명한 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 앞서 설명한 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 목적 유전자는 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 63, 서열번호 65, 서열번호 67, 서열번호 69, 서열번호 76, 및 서열번호 77로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다
본 발명은 불활성화시킨 PDK를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 세포를 제공함으로써, 이는 항 c-Met 항체를 비롯한 다양한 치료용 단백질의 대량 생산에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 통상적인 재조합 벡터 구조를 개략적으로 보여주는 것이다.
도 2는 pRGEN_CHO-PDK1_U6_SG 벡터의 개열 지도이다.
도 3은 pRGEN_Cas9_CMV 발현벡터의 개열 지도 이다.
도 4는 pRGEN_CHO-PDK2_U6_SG 벡터의 개열 지도이다.
도 5는 pRGEN_CHO-PDK3_U6_SG 벡터의 개열 지도이다.
도 6은 PDK1 유전자 일부 결실 클론의 유전자 정보를 보여준다.
도 7은 PDK2 유전자 일부 결실 클론의 유전자 정보를 보여준다.
도 8은 PDK2 유전자 일부 결실 클론의 유전자 정보를 보여준다.
도 9은 PDK3 유전자 일부 결실 클론의 유전자 정보를 보여준다.
도 10은 항체 생산 벡터인 pCA-L3-1Y/IgG2-GS의 개열 지도이다.
도 11은 PDK 유전자 일부 결실 클론의 생존 세포 밀도 (VOD)를 보여주는 그래프이다.
도 12는 PDK 유전자 일부 결실 클론의 세포 생존률을 보여주는 그래프이다.
도 13은 PDK 유전자 일부 결실 클론의 항체 생산량을 보여주는 그래프이다.
도 2는 pRGEN_CHO-PDK1_U6_SG 벡터의 개열 지도이다.
도 3은 pRGEN_Cas9_CMV 발현벡터의 개열 지도 이다.
도 4는 pRGEN_CHO-PDK2_U6_SG 벡터의 개열 지도이다.
도 5는 pRGEN_CHO-PDK3_U6_SG 벡터의 개열 지도이다.
도 6은 PDK1 유전자 일부 결실 클론의 유전자 정보를 보여준다.
도 7은 PDK2 유전자 일부 결실 클론의 유전자 정보를 보여준다.
도 8은 PDK2 유전자 일부 결실 클론의 유전자 정보를 보여준다.
도 9은 PDK3 유전자 일부 결실 클론의 유전자 정보를 보여준다.
도 10은 항체 생산 벡터인 pCA-L3-1Y/IgG2-GS의 개열 지도이다.
도 11은 PDK 유전자 일부 결실 클론의 생존 세포 밀도 (VOD)를 보여주는 그래프이다.
도 12는 PDK 유전자 일부 결실 클론의 세포 생존률을 보여주는 그래프이다.
도 13은 PDK 유전자 일부 결실 클론의 항체 생산량을 보여주는 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1:
PDK
불활성화된
CHO
세포 클론 제작
Crispr-cas9 시스템 (ToolGen RNA-Guided Endonucleases (RGEN) system)을 활용하여 CHO 세포의 게놈 유전자에서 PDK1/2/3 유전자의 일부를 변형(제거 또는 삽입)시켜 불활성화시켰다.
구체적으로, 우선 다음과 같은 방법으로 PDK1 유전자 일부를 변형시켜 불활성화시켰다. 상기 PDK1 유전자 (서열번호 109)의 219번째부터 241번째까지의 염기서열 (caatgatgtcattccaaccatgg (23bp); 서열번호 115; sgRNA(single guide RNA) 방향: up)을 표적 부위로 하는 pRGEN_CHO-PDK1_U6_SG 벡터 (ToolGen; 서열번호 124; 선별마커: Ampicillin, 프로모터: U6, SalI/XbaI: 2052/438bp; 도 2 참조)와 Cas9 발현을 위한 pRGEN_Cas9_CMV 발현벡터 (ToolGen; 선별마커: Ampicillin, 프로모터: CMV, KpnI/XhoI: 4136/3247bp; 도 3 참조)를 준비하였다. 상기 CHO 세포로서 CHOK1SV GS Knockout (KO) host cell line (Sigma, CHOZN GS-/- ZFN-modified CHO cell line, #CHOGS, 글루타민 합성(GS) 유전자 넉아웃 시킴; 이하, 'GSKO 세포')을 준비하였다.
상기 준비된 GSKO 세포 5*106 cells에 Amaxa nucleofector sf kit (catalog# V4XC-2024)를 사용하여 총 10 ul DNA (pRGEN_CHO-PDK1_U6_SG: pRGEN_Cas9_CMV = 1:1) 를 세포내에 전달(transfection)하였다. 그 결과, PDK1 유전자 (서열번호 109) 중 일부가 제거된 클론들을 얻을 수 있었다 (도 6 및 표 3 참조).
PDK2와 PDK3 유전자의 경우도 상기 방법을 참조하여 유전자의 일부를 변형시켜 불활성화시켰다. PDK2 유전자의 일부 변형을 위하여, PDK2 유전자 (서열번호 111)의 172번째부터 194번째까지의 염기서열 (cctgtgcgcctggccaacatcat (23bp); 서열번호 118; sgRNA 방향: down)을 표적 부위로 하는 pRGEN_CHO-PDK2_U6_SG 벡터 (ToolGen; 서열번호 125; 선별마커: Ampicillin, 프로모터: U6, SalI/XbaI: 2052/438bp; 도 4 참조)를 사용하고, PDK3 유전자의 일부 변형을 위하여, PDK3 유전자 (서열번호 113)의 38번째부터 60번째까지의 염기서열 (ccaaacagatcgagcgctactcc (23bp); 서열번호 122; sgRNA 방향: down)을 표적 부위로 하는 pRGEN_CHO-PDK3_U6_SG 벡터 (ToolGen; 서열번호 126; 선별마커: Ampicillin, 프로모터: U6, SalI/XbaI: 2052/438bp; 도 5 참조)를 각각 사용하여 위와 같은 방법을 수행하였다 (pRGEN_Cas9_CMV 발현벡터는 공통으로 사용). 그 결과 PDK2 유전자의 일부가 제거된 클론 (2-8mPDK2_m1: 177-183 부위 (gcgcctg) 제거; 2-8mPDK2_m2: 176-183 부위 (tgcgcctg) 제거)과 PDK2 유전자의 중에 염기가 삽입된 클론 (2-33 mPDK2: 179번째와 180번째 사이에 부위에 CC 삽입), 및 PDK3 유전자의 중에 염기가 삽입된 클론 (2-8mPDK3: 44번째와 45번째 위치 사이에 'a' 삽입)을 얻었다 (표 4, 표 5, 및 도 7 내지 9 참조).
선택된 clone들에 대하여 gDNA를 template로 사용하여 PCR을 수행하였다. 이 때 gDNA는 qiagen의 QIAamp DNA mini kti(cat# 51306)을 사용하여 확보하였다. 아래의 표 1에 기재된 프라이머 및 Phusion (M0530, NEB)를 사용하여 아래의 표 2와 같은 조건으로 PCR을 수행하여 PCR product를 확보하였다.
PDK1 Forward | GGGAAACCCTTAACACTGCTC(서열번호 134) |
PDk1 reverse | ATC AAA AGC GAA AAG CCA AA(서열번호 135) |
PDK2 forward | TTGAGGTGACTTAGGCCAGAA (서열번호 136) |
PDK2 reverse | GCCAAGGGTTACTGCTGACA (서열번호 137) |
PDK3 forward | ACTGCCTCTGGTGCTTGTTT(서열번호 138) |
PDK3 reverse | TGAGAGTCCTTGGAGGAAGC(서열번호 139) |
온도 (℃) | 시간 | cycle | |
Pre | 94 | 5min | |
Cycle | 94 | 30 sec | 35 cycles |
68 | 30 sec | ||
post | 72 | 10 min |
상기 확보된 PCR product들은 pJET PCR cloning kit (thermo scientific, K1231)를 사용하여 cloning 후, top10 competent cell (Invitrogen, C4040-10) 에 transformation 후, 10개의 colony에서 얻은 DNA를 sequencing을 통하여 PDK의 제거 유무를 확인하였다.
상기 얻어진 각각의 클론들의 유전자 제거 부위 및 이로부터 얻어지는 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 아래의 표 3 내지 표 5에 나타내었으며 각각 clone들의 염기 서열 정보를 도 6 내지 도 9에 나타내었다 (도 6: PDK1 일부 결실, 도 7 및 도 8: PDK2 일부 결실, 도 9: PDK3 일부 결실).
클론명 | 유전자 결실 부위 (서열번호 109 기준) | 일부 결실 유전자로부터 코딩된 아미노산 서열 |
2-8mPDK1_M1 | 238-241 부위 (atgg) |
MFLRQELPVRLANIMKEISLLPDNLLRTPSVQLVQSWYIQSLQELLDFKDKSAEDAKTIYEFTDTVIRIRNRHNDVIPTPRV (서열번호 116; 일부 결실 유전자: 서열번호 128) |
2-8mPDK1_M2 | 235-238 부위 (acca) | MFLRQELPVRLANIMKEISLLPDNLLRTPSVQLVQSWYIQSLQELLDFKDKSAEDAKTIYEFTDTVIRIRNRHNDVIPWPRV (서열번호 117; 일부 결실 유전자: 서열번호129) |
2-33 mPDK1 | 238-241 부위 (atgg) | MFLRQELPVRLANIMKEISLLPDNLLRTPSVQLVQSWYIQSLQELLDFKDKSAEDAKTIYEFTDTVIRIRNRHNDVIPTPRV (서열번호 116; 일부 결실 유전자: 서열번호128) |
1-21mPDK1 | 238-241 부위 (atgg) | MFLRQELPVRLANIMKEISLLPDNLLRTPSVQLVQSWYIQSLQELLDFKDKSAEDAKTIYEFTDTVIRIRNRHNDVIPTPRV (서열번호 116; 일부 결실 유전자: 서열번호128) |
2-10 mPDK1 | Wild type/ 238-241 부위 (atgg) |
Heterologous WT/M1 |
1-4mPDK1 | 2-10과 동일 |
클론명 | 유전자 변형 부위 (서열번호 111 기준) | 일부 결실 유전자로부터 코딩된 아미노산 서열 |
2-8mPDK2_m1 | 177-183 부위 (gcgcctg) 결실 | MRWIRALLKNASLAGAPKYIEHFSKFSPSPLSMKQFLDFGSSNACEKTSFTFLRQELPVPTS (서열번호 119; 일부 결실 유전자: 서열번호130) |
2-8mPDK2_m2 | 176-183 부위 (tgcgcctg) 결실 | MRWIRALLKNASLAGAPKYIEHFSKFSPSPLSMKQFLDFGSSNACEKTSFTFLRQELPGQHHERD (서열번호 120; 일부 결실 유전자: 서열번호131) |
2-33 mPDK2 | 179번째와 180번째 염기 사이에 'cc' 삽입 | MRWIRALLKNASLAGAPKYIEHFSKFSPSPLSMKQFLDFGSSNACEKTSFTFLRQELPVPAWPTS (서열번호 121; 일부 결실 유전자: 서열번호132) |
클론명 | 유전자 변형 부위 (서열번호 113 기준) | 일부 변형 유전자로부터 코딩된 아미노산 서열 |
2-8mPDK3 | 44번째와 45번째 염기 사이에 'a' 삽입 | MRLFFRLLKQPVPKQDRALLPLLSVSALYQTVLGLRKR (서열번호 123; 일부 결실 유전자: 서열번호133) |
클론명 | PDK 유전자 일부 변형 포함 형태 |
2-8 | PDK1 및 PDK2 일부 결실 및 PDK3 일부 삽입 모두 포함 |
2-10 | PDK1 일부 결실 포함 |
1-31 | PDK1 일부 결실 포함 |
1-21 | PDK1 일부 결실 포함 |
1-4 | PDK1 일부 결실 포함 |
2-33 | PDK1 일부 결실 및 PDK2 일부 삽입 포함 |
상기 얻어진 PDK 유전자 일부 변형이 유도된 세포 중 PDK1 및 PDK2 일부 결실 및 PDK3 일부 삽입이 모두 유도된 세포 (2-8 클론 해당)를 대한민국 서울 시 종로구 연지동에 소재하는 한국세포주연구재단에 2014년 9월 3일자로 기탁하여 기탁번호 KCLRF-BP-00328을 부여 받았다.
실시예
2:
PDK
가 제거된 클론에서 목적
폴리펩타이드
생산 세포 제작
상기 실시예 1에서 PDK1, PDK2, 또는 PDK3 유전자 일부가 결실된 것으로 선택된 세포들에 항체 생산 벡터를 실시예 1에서 사용한 방법으로 세포내로 전달하였다. 상기 항체 생산 벡터는 항 c-Met 항체 (L3-1Y/IgG2) (중쇄: 서열번호 66; 경쇄: 서열번호 68)의 유전자 (중쇄 유전자: 서열번호 67; 경쇄 유전자: 서열번호 69)를 포함하는 것으로, 도 10의 구조를 갖도록 제작하였다 (pCA-L3-1Y/IgG2-GS, 서열번호 127). Transfection후 세포는 EX-CELL CD CHO Fusion media (sigma, 14365C)에 1X GSEM supplement (sigma G9785)를 첨가한 배지에 viability 가 90 % 이상 회복 될 때까지 glutamine negative selection을 진행하여, PDK 유전자가 일부 결실되고 항 c-Met 항체 유전자를 포함하는 재조합 세포를 선별하였다.
실시예
3:
PDK
가 제거된 클론에서의 항체 생산량, 세포 성장 및
대사산물
변화 시험
상기 실시예 2에서 각각 얻어진 세포를 EX-CELL CD CHO Fusion media (sigma, 14365C)에 1X GSEM supplement (sigma G9785)를 첨가한 배지에 5*105 cell/ml의 농도로 넣고 총 30 ml를 취하여 7일간 small scale batch culture를 진행함
배양 후 D0, D3, D5, 또는 D7 에 해당되는 일에 배양액 일부에 대하여 cedex automated cell counter (Roche)를 사용하여 생존 세포 밀도(viable cell density; VCD)와, 세포 생존률(viability)를 측정하고, Octet protein A sensor (Fortebio) 를 사용하여 항체 생산성을 확인하였다. 상기 얻어진 결과를 도 11 (VOD), 도 12 (Viability), 및 도 13 (항체 생산량)에 각각 나타내었으며, 배양 7일째(D7)의 항체 생산량을 표 7에 나타내었다. 비교를 위하여, PDK 유전자 불활성화가 도입되지 않은 CHOK1SV GS Knockout (KO) host cell line (Sigma)에 상기 실시예 2에 기재된 항체 생산 벡터(도 10 참조)가 도입된 세포에 대해서도 동일한 시험을 수행하였다 ('GSKO-UbcK' 로 표시).
Clone | Ab (mg/L) |
2-8 | 10.7 |
2-10 | 5.34 |
1-31 | 5 |
1-21 | 4.84 |
1-4 | 4.45 |
2-33 | 4.1 |
GSKO-UbcK | 2.1 |
도 11 내지 13 및 표 7에서 확인되는 바와 같이, PDK 유전자 일부 결실을 포함하는 클론들은, 대조군(PDK 유전자 결실 포함하지 않음)과 비교하여, 유사한 정도의 VOD 및 세포 생존률을 보이면서 항체 생산량이 적어도 2배 이상 현저히 높은 것을 확인할 수 있다.
실시예
3:
PDK
제거된
CHO
세포에서 생산된 항 c-
Met
항체의 정제
PDK 불활성화된 CHO 세포 (2-8 클론)에서 생산된 항 c-Met 항체를 protein A 친화성 컬럼을 사용하여 정제하였다.
상기 얻어진 결과를 표 8에 나타내었다.
Items | GSKO_ L3-1Y/IgG2 | PDK_ L3-1Y/IgG2 |
Antibody after Protein A purification | ||
A280 (by nanodrop) | About 0.5 mg/mL | About 1.0 mg/mL |
SEC-HPLC | 99% | 99% |
SDS-PAGE | L3-1Y/IgG2와 동일 | L3-1Y/IgG2와 동일 |
표 8에 나타난 바와 같이, SEC-HPLC와 SDS-PAGE 확인 결과, PDK 제거된 CHO 세포에서 생산된 항 c-Met 항체는 PDK이 제거되지 않은 CHO 세포와 동일한 발현 양상을 보임을 확인할 수 있다.
<110> Samsung Electronics Co. Ltd
<120> Production of a polypeptide by PDK inactivation
<130> DPP20141421KR
<160> 133
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain CDR1 of AbF46
<400> 1
Asp Tyr Tyr Met Ser
1 5
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain CDR2 of AbF46
<400> 2
Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain CDR3 of AbF46
<400> 3
Asp Asn Trp Phe Ala Tyr
1 5
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain CDR1 of c-Met antibody
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)
<223> X is Pro or Ser or absent
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)
<223> X is Glu or Asp
<400> 4
Xaa Xaa Tyr Tyr Met Ser
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain CDR2 of c-Met antibody
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)
<223> X is Asn or Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)
<223> X is Ala or Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)
<223> X is Asn or Thr
<400> 5
Arg Asn Xaa Xaa Asn Gly Xaa Thr
1 5
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain CDR3 of c-Met antibody
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)
<223> X is Ser or Thr
<400> 6
Asp Asn Trp Leu Xaa Tyr
1 5
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain CDR1 of c-Met antibody
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)
<223> X is His, Arg, Gln or Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)
<223> X is His or Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)
<223> X is Lys or Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)
<223> X is Ser or Trp
<400> 7
Lys Ser Ser Xaa Ser Leu Leu Ala Xaa Gly Asn Xaa Xaa Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain CDR2 of c-Met antibody
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)
<223> X is Ala or Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)
<223> X is Thr or Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)
<223> X is Ser or Pro
<400> 8
Trp Xaa Ser Xaa Arg Val Xaa
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain CDR3 of c-Met antibody
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)
<223> X is Gly, Ala or Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)
<223> X is Arg, His, Ser, Ala, Gly or Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)
<223> X is Leu, Tyr, Phe or Met
<400> 9
Xaa Gln Ser Tyr Ser Xaa Pro Xaa Thr
1 5
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain CDR1 of AbF46
<400> 10
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain CDR2 of AbF46
<400> 11
Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain CDR3 of AbF46
<400> 12
Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-L3 derived from L3-1 clone
<400> 13
Gln Gln Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Thr
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-L3 derived from L3-2 clone
<400> 14
Gly Gln Ser Tyr Ser Arg Pro Leu Thr
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-L3 derived from L3-3 clone
<400> 15
Ala Gln Ser Tyr Ser His Pro Phe Ser
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-L3 derived from L3-5 clone
<400> 16
Gln Gln Ser Tyr Ser Arg Pro Phe Thr
1 5
<210> 17
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain variable region of anti c-Met humanized
antibody(huAbF46-H4)
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain variable region of anti c-Met humanized
antibody(huAbF46-H4)
<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 19
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain variable region of anti c-Met humanized
antibody(huAbF46-H4)
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln
85 90 95
Ser Tyr Ser Arg Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 20
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain variable region of anti c-Met humanized
antibody(huAbF46-H4)
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln
85 90 95
Ser Tyr Ser His Pro Phe Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 21
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain variable region of anti c-Met humanized
antibody(huAbF46-H4)
<400> 21
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Ser Tyr Ser Arg Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-H1 derived from H11-4 clone
<400> 22
Pro Glu Tyr Tyr Met Ser
1 5
<210> 23
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-H1 derived from YC151 clone
<400> 23
Pro Asp Tyr Tyr Met Ser
1 5
<210> 24
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-H1 derived from YC193 clone
<400> 24
Ser Asp Tyr Tyr Met Ser
1 5
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-H2 derived from YC244 clone
<400> 25
Arg Asn Asn Ala Asn Gly Asn Thr
1 5
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-H2 derived from YC321 clone
<400> 26
Arg Asn Lys Val Asn Gly Tyr Thr
1 5
<210> 27
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-H3 derived from YC354 clone
<400> 27
Asp Asn Trp Leu Ser Tyr
1 5
<210> 28
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-H3 derived from YC374 clone
<400> 28
Asp Asn Trp Leu Thr Tyr
1 5
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-L1 derived from L1-1 clone
<400> 29
Lys Ser Ser His Ser Leu Leu Ala Ser Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-L1 derived from L1-3 clone
<400> 30
Lys Ser Ser Arg Ser Leu Leu Ser Ser Gly Asn His Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 31
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-L1 derived from L1-4 clone
<400> 31
Lys Ser Ser Lys Ser Leu Leu Ala Ser Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-L1 derived from L1-12 clone
<400> 32
Lys Ser Ser Arg Ser Leu Leu Ala Ser Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-L1 derived from L1-22 clone
<400> 33
Lys Ser Ser His Ser Leu Leu Ala Ser Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-L2 derived from L2-9 clone
<400> 34
Trp Ala Ser Lys Arg Val Ser
1 5
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-L2 derived from L2-12 clone
<400> 35
Trp Gly Ser Thr Arg Val Ser
1 5
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-L2 derived from L2-16 clone
<400> 36
Trp Gly Ser Thr Arg Val Pro
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-L3 derived from L3-32 clone
<400> 37
Gln Gln Ser Tyr Ser Lys Pro Phe Thr
1 5
<210> 38
<211> 1416
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of heavy chain of chAbF46
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> EcoRI restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(66)
<223> signal sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (67)..(417)
<223> VH - heavy chain variable region
<220>
<221> misc_feature
<222> (418)..(423)
<223> NdeI restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (418)..(1407)
<223> CH - heavy chain constant region
<220>
<221> misc_feature
<222> (1408)..(1410)
<223> TGA - stop codon
<220>
<221> misc_feature
<222> (1411)..(1416)
<223> XhoI restriction site
<400> 38
gaattcgccg ccaccatgga atggagctgg gtttttctcg taacactttt aaatggtatc 60
cagtgtgagg tgaagctggt ggagtctgga ggaggcttgg tacagcctgg gggttctctg 120
agactctcct gtgcaacttc tgggttcacc ttcactgatt actacatgag ctgggtccgc 180
cagcctccag gaaaggcact tgagtggttg ggttttatta gaaacaaagc taatggttac 240
acaacagagt acagtgcatc tgtgaagggt cggttcacca tctccagaga taattcccaa 300
agcatcctct atcttcaaat ggacaccctg agagctgagg acagtgccac ttattactgt 360
gcaagagata actggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagct 420
agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 780
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 960
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1140
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga ctcgag 1416
<210> 39
<211> 759
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of light chain of chAbF46
<220>
<221> misc_difference
<222> (1)..(6)
<223> EcoRI restriction site
<220>
<221> misc_difference
<222> (7)..(90)
<223> signal sequence
<220>
<221> misc_difference
<222> (91)..(432)
<223> VL - light chain variable region
<220>
<221> misc_difference
<222> (430)..(435)
<223> BsiWI restriction site
<220>
<221> misc_difference
<222> (433)..(750)
<223> CL - light chain constant region
<220>
<221> misc_difference
<222> (751)..(753)
<223> stop codon
<220>
<221> misc_difference
<222> (754)..(759)
<223> XhoI restriction site
<400> 39
gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60
ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gacattttga tgacccagtc tccatcctcc 120
ctgactgtgt cagcaggaga gaaggtcact atgagctgca agtccagtca gagtctttta 180
gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccagc agaaaccagg acgatctcct 240
aaaatgctga taatttgggc atccactagg gtatctggag tccctgatcg cttcataggc 300
agtggatctg ggacggattt cactctgacc atcaacagtg tgcaggctga agatctggct 360
gtttattact gtcagcagtc ctacagcgct ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg 420
gagctgaaac gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 480
ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 540
aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca 600
gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca 660
gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc 720
gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt tgactcgag 759
<210> 40
<211> 447
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of H1-heavy
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 41
<211> 447
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of H3-heavy
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
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Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
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His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of H4-heavy
<400> 42
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
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Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
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Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
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Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
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Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
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Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
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355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of H1-light
<400> 43
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Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 45
<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 45
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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210 215 220
<210> 46
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of H4-light
<400> 46
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
210 215
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of H1-heavy
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gataactggt ttgcttactg gggtcaagga accctggtca ccgtctcctc ggctagcacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
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ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660
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cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ctccgggtaa atgactcgag 1350
<210> 48
<211> 1350
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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tcctgtgcag cctctggatt caccttcact gactactaca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg gttgggcttt attagaaaca aagctaacgg ttacaccaca 180
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ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
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<210> 49
<211> 1350
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of H4-heavy
<400> 49
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gataactggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ccgtctcctc ggctagcacc 360
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ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ctccgggtaa atgactcgag 1350
<210> 50
<211> 669
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of H1-light
<400> 50
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
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atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaatc ctatagtgct 300
cctctcacgt tcggaggcgg taccaaggtg gagatcaaac gtacggtggc tgcaccatct 360
gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420
ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480
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tgactcgag 669
<210> 51
<211> 669
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of H2-light
<400> 51
gatattgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca agtccagtca gagtctttta gctagtggca accaaaataa ctacttggcc 120
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atcagcaggg tggaggctga ggatgttgga gtttattact gccagcagtc ctacagcgct 300
ccgctcacgt tcggacaggg taccaagctg gagctcaaac gtacggtggc tgcaccatct 360
gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420
ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480
caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540
ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600
gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660
tgactcgag 669
<210> 52
<211> 669
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of H3-light
<400> 52
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtctttta gctagcggca accaaaataa ctacttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca ttatttgggc atctacccgg 180
gtatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaatc ctatagtgct 300
cctctcacgt tcggaggcgg taccaaggtg gagatcaaac gtacggtggc tgcaccatct 360
gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420
ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480
caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540
ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600
gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660
tgactcgag 669
<210> 53
<211> 669
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of H4-light
<400> 53
gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60
atcacctgca agtccagtca gagtctttta gctagtggca accaaaataa ctacttggcc 120
tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg aaaatgctga ttatttgggc atccactagg 180
gtatctggag tcccttctcg cttctctgga tccgggtctg ggacggattt cactctgacc 240
atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca acttattact gtcagcagtc ctacagcgct 300
ccgctcacgt tcggacaggg taccaaggtg gagatcaaac gtacggtggc tgcaccatct 360
gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420
ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480
caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540
ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600
gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660
tgactcgag 669
<210> 54
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker between VH and VL
<400> 54
Gly Leu Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Ser Gly Val Gly Ser
20
<210> 55
<211> 1088
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide encoding scFv of huAbF46 antibody
<400> 55
gctagcgttt tagcagaagt tcaattggtt gaatctggtg gtggtttggt tcaaccaggt 60
ggttctttga gattgtcttg tgctgcttct ggttttactt tcaccgatta ttacatgtcc 120
tgggttagac aagctccagg taaaggtttg gaatggttgg gtttcattag aaacaaggct 180
aacggttaca ctaccgaata ttctgcttct gttaagggta gattcaccat ttctagagac 240
aactctaaga acaccttgta cttgcaaatg aactccttga gagctgaaga tactgctgtt 300
tattactgcg ctagagataa ttggtttgct tattggggtc aaggtacttt ggttactgtt 360
tcttctggcc tcgggggcct cggaggagga ggtagtggcg gaggaggctc cggtggatcc 420
agcggtgtgg gttccgatat tcaaatgacc caatctccat cttctttgtc tgcttcagtt 480
ggtgatagag ttaccattac ttgtaagtcc tcccaatctt tgttggcttc tggtaatcag 540
aacaattact tggcttggca tcaacaaaaa ccaggtaaag ctccaaagat gttgattatt 600
tgggcttcta ccagagtttc tggtgttcca tctagatttt ctggttctgg ttccggtact 660
gattttactt tgaccatttc atccttgcaa ccagaagatt tcgctactta ctactgtcaa 720
caatcttact ctgctccatt gacttttggt caaggtacaa aggtcgaaat caagagagaa 780
ttcggtaagc ctatccctaa ccctctcctc ggtctcgatt ctacgggtgg tggtggatct 840
ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct caggaactga caactatatg cgagcaaatc 900
ccctcaccaa ctttagaatc gacgccgtac tctttgtcaa cgactactat tttggccaac 960
gggaaggcaa tgcaaggagt ttttgaatat tacaaatcag taacgtttgt cagtaattgc 1020
ggttctcacc cctcaacaac tagcaaaggc agccccataa acacacagta tgttttttga 1080
gtttaaac 1088
<210> 56
<211> 5597
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> expression vector including polynucleotide encoding scFv of
huAbF46 antibody
<220>
<221> misc_difference
<222> (573)..(578)
<223> NheI restriction site
<220>
<221> misc_difference
<222> (588)..(938)
<223> huAbF46 VH
<220>
<221> misc_difference
<222> (939)..(1007)
<223> linker
<220>
<221> misc_difference
<222> (1008)..(1349)
<223> huAbF46 VL
<220>
<221> misc_difference
<222> (1350)..(1355)
<223> EcoRI restriction site
<220>
<221> misc_difference
<222> (1356)..(1397)
<223> V5 epitope
<220>
<221> misc_difference
<222> (1398)..(1442)
<223> (G4S)3 linker
<220>
<221> misc_difference
<222> (1443)..(1649)
<223> Aga2
<220>
<221> misc_difference
<222> (1650)..(1652)
<223> TGA(stop codon)
<220>
<221> misc_difference
<222> (1653)..(1660)
<223> PmeI restriction site
<400> 56
acggattaga agccgccgag cgggtgacag ccctccgaag gaagactctc ctccgtgcgt 60
cctcgtcttc accggtcgcg ttcctgaaac gcagatgtgc ctcgcgccgc actgctccga 120
acaataaaga ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat tggcagtaac 180
ctggccccac aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat gataatgcga 240
ttagtttttt agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat 300
taacagatat ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc 360
ggtttgtatt acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac 420
ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac cccggatcgg actactagca gctgtaatac 480
gactcactat agggaatatt aagctaattc tacttcatac attttcaatt aagatgcagt 540
tacttcgctg tttttcaata ttttctgtta ttgctagcgt tttagcagaa gttcaattgg 600
ttgaatctgg tggtggtttg gttcaaccag gtggttcttt gagattgtct tgtgctgctt 660
ctggttttac tttcaccgat tattacatgt cctgggttag acaagctcca ggtaaaggtt 720
tggaatggtt gggtttcatt agaaacaagg ctaacggtta cactaccgaa tattctgctt 780
ctgttaaggg tagattcacc atttctagag acaactctaa gaacaccttg tacttgcaaa 840
tgaactcctt gagagctgaa gatactgctg tttattactg cgctagagat aattggtttg 900
cttattgggg tcaaggtact ttggttactg tttcttctgg cctcgggggc ctcggaggag 960
gaggtagtgg cggaggaggc tccggtggat ccagcggtgt gggttccgat attcaaatga 1020
cccaatctcc atcttctttg tctgcttcag ttggtgatag agttaccatt acttgtaagt 1080
cctcccaatc tttgttggct tctggtaatc agaacaatta cttggcttgg catcaacaaa 1140
aaccaggtaa agctccaaag atgttgatta tttgggcttc taccagagtt tctggtgttc 1200
catctagatt ttctggttct ggttccggta ctgattttac tttgaccatt tcatccttgc 1260
aaccagaaga tttcgctact tactactgtc aacaatctta ctctgctcca ttgacttttg 1320
gtcaaggtac aaaggtcgaa atcaagagag aattcggtaa gcctatccct aaccctctcc 1380
tcggtctcga ttctacgggt ggtggtggat ctggtggtgg tggttctggt ggtggtggtt 1440
ctcaggaact gacaactata tgcgagcaaa tcccctcacc aactttagaa tcgacgccgt 1500
actctttgtc aacgactact attttggcca acgggaaggc aatgcaagga gtttttgaat 1560
attacaaatc agtaacgttt gtcagtaatt gcggttctca cccctcaaca actagcaaag 1620
gcagccccat aaacacacag tatgtttttt gagtttaaac ccgctgatct gataacaaca 1680
gtgtagatgt aacaaaatcg actttgttcc cactgtactt ttagctcgta caaaatacaa 1740
tatacttttc atttctccgt aaacaacatg ttttcccatg taatatcctt ttctattttt 1800
cgttccgtta ccaactttac acatacttta tatagctatt cacttctata cactaaaaaa 1860
ctaagacaat tttaattttg ctgcctgcca tatttcaatt tgttataaat tcctataatt 1920
tatcctatta gtagctaaaa aaagatgaat gtgaatcgaa tcctaagaga attgggcaag 1980
tgcacaaaca atacttaaat aaatactact cagtaataac ctatttctta gcatttttga 2040
cgaaatttgc tattttgtta gagtctttta caccatttgt ctccacacct ccgcttacat 2100
caacaccaat aacgccattt aatctaagcg catcaccaac attttctggc gtcagtccac 2160
cagctaacat aaaatgtaag ctctcggggc tctcttgcct tccaacccag tcagaaatcg 2220
agttccaatc caaaagttca cctgtcccac ctgcttctga atcaaacaag ggaataaacg 2280
aatgaggttt ctgtgaagct gcactgagta gtatgttgca gtcttttgga aatacgagtc 2340
ttttaataac tggcaaaccg aggaactctt ggtattcttg ccacgactca tctccgtgca 2400
gttggacgat atcaatgccg taatcattga ccagagccaa aacatcctcc ttaggttgat 2460
tacgaaacac gccaaccaag tatttcggag tgcctgaact atttttatat gcttttacaa 2520
gacttgaaat tttccttgca ataaccgggt caattgttct ctttctattg ggcacacata 2580
taatacccag caagtcagca tcggaatcta gagcacattc tgcggcctct gtgctctgca 2640
agccgcaaac tttcaccaat ggaccagaac tacctgtgaa attaataaca gacatactcc 2700
aagctgcctt tgtgtgctta atcacgtata ctcacgtgct caatagtcac caatgccctc 2760
cctcttggcc ctctcctttt cttttttcga ccgaatttct tgaagacgaa agggcctcgt 2820
gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttagg acggatcgct 2880
tgcctgtaac ttacacgcgc ctcgtatctt ttaatgatgg aataatttgg gaatttactc 2940
tgtgtttatt tatttttatg ttttgtattt ggattttaga aagtaaataa agaaggtaga 3000
agagttacgg aatgaagaaa aaaaaataaa caaaggttta aaaaatttca acaaaaagcg 3060
tactttacat atatatttat tagacaagaa aagcagatta aatagatata cattcgatta 3120
acgataagta aaatgtaaaa tcacaggatt ttcgtgtgtg gtcttctaca cagacaagat 3180
gaaacaattc ggcattaata cctgagagca ggaagagcaa gataaaaggt agtatttgtt 3240
ggcgatcccc ctagagtctt ttacatcttc ggaaaacaaa aactattttt tctttaattt 3300
ctttttttac tttctatttt taatttatat atttatatta aaaaatttaa attataatta 3360
tttttatagc acgtgatgaa aaggacccag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 3420
cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 3480
cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 3540
tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 3600
tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 3660
atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 3720
gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc 3780
aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag 3840
aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga 3900
gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg 3960
cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga 4020
atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt 4080
tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact 4140
ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt 4200
ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg 4260
ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacgggcagt caggcaacta 4320
tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac 4380
tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta 4440
aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt 4500
tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt 4560
tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt 4620
gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc 4680
agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 4740
tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 4800
ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 4860
cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 4920
tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 4980
acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 5040
ggaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 5100
ttttgtgatg ctcgtcaggg gggccgagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 5160
tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 5220
attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 5280
cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc 5340
ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga 5400
aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttacct cactcattag gcaccccagg 5460
ctttacactt tatgcttccg gctcctatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 5520
acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagctcgg aattaaccct cactaaaggg 5580
aacaaaagct ggctagt 5597
<210> 57
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> U6-HC7 hinge
<400> 57
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Cys His Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 58
<211> 435
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-1 clone
<400> 58
gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60
ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120
ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180
gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240
aaaatgctga ttatttgggc atccactagg gtatctggag tcccttctcg cttctctgga 300
tccgggtctg ggacggattt cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360
acttattact gtcagcagtc ctacagccgc ccgtacacgt tcggacaggg taccaaggtg 420
gagatcaaac gtacg 435
<210> 59
<211> 435
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-2 clone
<400> 59
gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60
ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120
ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180
gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240
aaaatgctga ttatttgggc atccactagg gtatctggag tcccttctcg cttctctgga 300
tccgggtctg ggacggattt cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360
acttattact gtgggcagtc ctacagccgt ccgctcacgt tcggacaggg taccaaggtg 420
gagatcaaac gtacg 435
<210> 60
<211> 435
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-3 clone
<400> 60
gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60
ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120
ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180
gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240
aaaatgctga ttatttgggc atccactagg gtatctggag tcccttctcg cttctctgga 300
tccgggtctg ggacggattt cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360
acttattact gtgcacagtc ctacagccat ccgttctctt tcggacaggg taccaaggtg 420
gagatcaaac gtacg 435
<210> 61
<211> 435
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-5 clone
<400> 61
gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60
ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120
ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180
gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240
aaaatgctga ttatttgggc atccactagg gtatctggag tcccttctcg cttctctgga 300
tccgggtctg ggacggattt cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360
acttattact gtcagcagtc ctacagccgc ccgtttacgt tcggacaggg taccaaggtg 420
gagatcaaac gtacg 435
<210> 62
<211> 462
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, U6-HC7
hinge and constant region of human IgG1
<400> 62
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln
1 5 10 15
Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
20 25 30
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp
35 40 45
Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
50 55 60
Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser
65 70 75 80
Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
130 135 140
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
145 150 155 160
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
165 170 175
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
180 185 190
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
210 215 220
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Cys His
225 230 235 240
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
245 250 255
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
260 265 270
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
275 280 285
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
290 295 300
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
305 310 315 320
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
325 330 335
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
340 345 350
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
355 360 365
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
370 375 380
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
385 390 395 400
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
405 410 415
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
420 425 430
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
435 440 445
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 63
<211> 1410
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide encoding polypeptide consisting of heavy chain of
huAbF46-H4-A1, U6-HC7 hinge and constant region of human IgG1
<400> 63
gaattcgccg ccaccatgga atggagctgg gtttttctcg taacactttt aaatggtatc 60
cagtgtgagg ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc 120
cgtttgtcct gtgcagcttc tggcttcacc ttcactgatt actacatgag ctgggtgcgt 180
caggccccgg gtaagggcct ggaatggttg ggttttatta gaaacaaagc taatggttac 240
acaacagagt acagtgcatc tgtgaagggt cgtttcacta taagcagaga taattccaaa 300
aacacactgt acctgcagat gaacagcctg cgtgctgagg acactgccgt ctattattgt 360
gctagagata actggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcaccgt ctcctcggct 420
agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720
agctgcgatt gccactgtcc tccatgtcca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380
ctctccctgt ctccgggtaa atgactcgag 1410
<210> 64
<211> 461
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, human
IgG2 hinge and constant region of human IgG1
<400> 64
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln
1 5 10 15
Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
20 25 30
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp
35 40 45
Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
50 55 60
Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser
65 70 75 80
Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
130 135 140
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
145 150 155 160
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
165 170 175
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
180 185 190
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
210 215 220
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys
225 230 235 240
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
245 250 255
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
260 265 270
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
275 280 285
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
290 295 300
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
305 310 315 320
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
325 330 335
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
340 345 350
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
355 360 365
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
370 375 380
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
385 390 395 400
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
405 410 415
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
420 425 430
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
435 440 445
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 65
<211> 1407
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide encoding polypeptide consisting of heavy chain of
huAbF46-H4-A1, human IgG2 hinge and constant region of human IgG1
<400> 65
gaattcgccg ccaccatgga atggagctgg gtttttctcg taacactttt aaatggtatc 60
cagtgtgagg ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc 120
cgtttgtcct gtgcagcttc tggcttcacc ttcactgatt actacatgag ctgggtgcgt 180
caggccccgg gtaagggcct ggaatggttg ggttttatta gaaacaaagc taatggttac 240
acaacagagt acagtgcatc tgtgaagggt cgtttcacta taagcagaga taattccaaa 300
aacacactgt acctgcagat gaacagcctg cgtgctgagg acactgccgt ctattattgt 360
gctagagata actggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcaccgt ctcctcggct 420
agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagaggaag 720
tgctgtgtgg agtgcccccc ctgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 780
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 960
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1080
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380
tccctgtctc cgggtaaatg actcgag 1407
<210> 66
<211> 460
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, human
IgG2 hinge and constant region of human IgG2
<400> 66
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln
1 5 10 15
Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
20 25 30
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp
35 40 45
Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
50 55 60
Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser
65 70 75 80
Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
130 135 140
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
145 150 155 160
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
165 170 175
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
180 185 190
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
195 200 205
Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
210 215 220
Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys
225 230 235 240
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
245 250 255
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
260 265 270
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
275 280 285
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
290 295 300
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr
305 310 315 320
Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
325 330 335
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
340 345 350
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
355 360 365
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
370 375 380
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
385 390 395 400
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser
405 410 415
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
420 425 430
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
435 440 445
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 67
<211> 1404
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide encoding polypeptide consisting of heavy chain of
huAbF46-H4-A1, human IgG2 hinge and constant region of human IgG2
<400> 67
gaattcgccg ccaccatgga atggagctgg gtttttctcg taacactttt aaatggtatc 60
cagtgtgagg ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc 120
cgtttgtcct gtgcagcttc tggcttcacc ttcactgatt actacatgag ctgggtgcgt 180
caggccccgg gtaagggcct ggaatggttg ggttttatta gaaacaaagc taatggttac 240
acaacagagt acagtgcatc tgtgaagggt cgtttcacta taagcagaga taattccaaa 300
aacacactgt acctgcagat gaacagcctg cgtgctgagg acactgccgt ctattattgt 360
gctagagata actggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcaccgt ctcctcggct 420
agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 480
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540
aactcaggcg ctctgaccag cggcgtgcac accttcccag ctgtcctaca gtcctcagga 600
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca acttcggcac ccagacctac 660
acctgcaacg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagacagt tgagcgcaaa 720
tgttgtgtcg agtgcccacc gtgcccagca ccacctgtgg caggaccgtc agtcttcctc 780
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 840
gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggacggcgtg 900
gaggtgcata atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt tcaacagcac gttccgtgtg 960
gtcagcgtcc tcaccgttgt gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 1020
gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaagggcag 1080
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1140
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccatgctgga ctccgacggc 1260
tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380
ctgtctccgg gtaaatgact cgag 1404
<210> 68
<211> 240
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polypeptide consisting of light chain of huAbF46-H4-A1(H36Y) and
human kappa constant region
<400> 68
Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Ser Val Ser
1 5 10 15
Gly Thr Cys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Ala Ser Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg
65 70 75 80
Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
100 105 110
Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
130 135 140
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
145 150 155 160
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
165 170 175
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
180 185 190
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
195 200 205
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
210 215 220
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235 240
<210> 69
<211> 758
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide encoding polypeptide consisting of light chain of
huAbF46-H4-A1(H36Y) and human kappa constant region
<400> 69
aattcactag tgattaattc gccgccacca tggattcaca ggcccaggtc ctcatgttgc 60
tgctgctatc ggtatctggt acctgtggag atatccagat gacccagtcc ccgagctccc 120
tgtccgcctc tgtgggcgat agggtcacca tcacctgcaa gtccagtcag agtcttttag 180
ctagtggcaa ccaaaataac tacttggcct ggtaccaaca gaaaccagga aaagctccga 240
aaatgctgat tatttgggca tccactaggg tatctggagt cccttctcgc ttctctggat 300
ccgggtctgg gacggatttc actctgacca tcagcagtct gcagccggaa gacttcgcaa 360
cttattactg tcagcagtcc tacagccgcc cgtacacgtt cggacagggt accaaggtgg 420
agatcaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt 480
tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca 540
aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag 600
agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag 660
actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg 720
tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt gactcgag 758
<210> 70
<211> 240
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polypeptide consisting of light chain of huAbF46-H4-A1 and human
kappa constant region
<400> 70
Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Ser Val Ser
1 5 10 15
Gly Thr Cys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Ala Ser Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg
65 70 75 80
Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
100 105 110
Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
130 135 140
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
145 150 155 160
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
165 170 175
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
180 185 190
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
195 200 205
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
210 215 220
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235 240
<210> 71
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> epitope in SEMA domain of c-Met
<400> 71
Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val Val
1 5 10 15
Ser Ala Leu
<210> 72
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> epitope in SEMA domain of c-Met
<400> 72
Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro
1 5 10
<210> 73
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> epitope in SEMA domain of c-Met
<400> 73
Glu Glu Pro Ser Gln
1 5
<210> 74
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain variable region of anti-c-Met antibody (AbF46 or
huAbF46-H1)
<400> 74
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 75
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain variable region of anti-c-Met antibody (AbF46 or
huAbF46-H1)
<400> 75
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 76
<211> 1416
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of heavy chain of nti-c-Met antibody (AbF46
or huAbF46-H1)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> EcoRI restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(66)
<223> signal sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (67)..(417)
<223> VH - heavy chain variable region
<220>
<221> misc_feature
<222> (418)..(423)
<223> NdeI restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (418)..(1407)
<223> CH - heavy chain constant region
<220>
<221> misc_feature
<222> (1408)..(1410)
<223> TGA - stop codon
<220>
<221> misc_feature
<222> (1411)..(1416)
<223> XhoI restriction site
<400> 76
gaattcgccg ccaccatgga atggagctgg gtttttctcg taacactttt aaatggtatc 60
cagtgtgagg tgaagctggt ggagtctgga ggaggcttgg tacagcctgg gggttctctg 120
agactctcct gtgcaacttc tgggttcacc ttcactgatt actacatgag ctgggtccgc 180
cagcctccag gaaaggcact tgagtggttg ggttttatta gaaacaaagc taatggttac 240
acaacagagt acagtgcatc tgtgaagggt cggttcacca tctccagaga taattcccaa 300
agcatcctct atcttcaaat ggacaccctg agagctgagg acagtgccac ttattactgt 360
gcaagagata actggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagct 420
agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 780
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 960
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1140
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga ctcgag 1416
<210> 77
<211> 759
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of light chain of anti-c-Met antibody (AbF46
or huAbF46-H1)
<220>
<221> misc_difference
<222> (1)..(6)
<223> EcoRI restriction site
<220>
<221> misc_difference
<222> (7)..(90)
<223> signal sequence
<220>
<221> misc_difference
<222> (91)..(432)
<223> VL - light chain variable region
<220>
<221> misc_difference
<222> (430)..(435)
<223> BsiWI restriction site
<220>
<221> misc_difference
<222> (433)..(750)
<223> CL - light chain constant region
<220>
<221> misc_difference
<222> (751)..(753)
<223> stop codon
<220>
<221> misc_difference
<222> (754)..(759)
<223> XhoI restriction site
<400> 77
gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60
ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gacattttga tgacccagtc tccatcctcc 120
ctgactgtgt cagcaggaga gaaggtcact atgagctgca agtccagtca gagtctttta 180
gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccagc agaaaccagg acgatctcct 240
aaaatgctga taatttgggc atccactagg gtatctggag tccctgatcg cttcataggc 300
agtggatctg ggacggattt cactctgacc atcaacagtg tgcaggctga agatctggct 360
gtttattact gtcagcagtc ctacagcgct ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg 420
gagctgaaac gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 480
ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 540
aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca 600
gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca 660
gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc 720
gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt tgactcgag 759
<210> 78
<211> 4170
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide encoding c-Met protein
<400> 78
atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60
aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag 120
tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat 180
cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag 240
gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac 300
tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta 360
gttgtcgaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc 420
tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc 480
atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg 540
ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc 600
ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag 660
gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag 720
ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac 780
ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg 840
ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc 900
acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg 960
tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac 1020
attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct 1080
gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa 1140
aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg 1200
acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt 1260
accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca 1320
tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt 1380
cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc 1440
ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc 1500
tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc 1560
agacatttcc agtcctgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg 1620
tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc 1680
tgtctgcctg caatctacaa ggttttccca aatagtgcac cccttgaagg agggacaagg 1740
ctgaccatat gtggctggga ctttggattt cggaggaata ataaatttga tttaaagaaa 1800
actagagttc tccttggaaa tgagagctgc accttgactt taagtgagag cacgatgaat 1860
acattgaaat gcacagttgg tcctgccatg aataagcatt tcaatatgtc cataattatt 1920
tcaaatggcc acgggacaac acaatacagt acattctcct atgtggatcc tgtaataaca 1980
agtatttcgc cgaaatacgg tcctatggct ggtggcactt tacttacttt aactggaaat 2040
tacctaaaca gtgggaattc tagacacatt tcaattggtg gaaaaacatg tactttaaaa 2100
agtgtgtcaa acagtattct tgaatgttat accccagccc aaaccatttc aactgagttt 2160
gctgttaaat tgaaaattga cttagccaac cgagagacaa gcatcttcag ttaccgtgaa 2220
gatcccattg tctatgaaat tcatccaacc aaatctttta ttagtggtgg gagcacaata 2280
acaggtgttg ggaaaaacct gaattcagtt agtgtcccga gaatggtcat aaatgtgcat 2340
gaagcaggaa ggaactttac agtggcatgt caacatcgct ctaattcaga gataatctgt 2400
tgtaccactc cttccctgca acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt 2460
ttcatgttag atgggatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg 2520
tttaagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt 2580
aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag 2640
agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg 2700
ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt 2760
ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacaggat tgattgctgg tgttgtctca 2820
atatcaacag cactgttatt actacttggg tttttcctgt ggctgaaaaa gagaaagcaa 2880
attaaagatc tgggcagtga attagttcgc tacgatgcaa gagtacacac tcctcatttg 2940
gataggcttg taagtgcccg aagtgtaagc ccaactacag aaatggtttc aaatgaatct 3000
gtagactacc gagctacttt tccagaagat cagtttccta attcatctca gaacggttca 3060
tgccgacaag tgcagtatcc tctgacagac atgtccccca tcctaactag tggggactct 3120
gatatatcca gtccattact gcaaaatact gtccacattg acctcagtgc tctaaatcca 3180
gagctggtcc aggcagtgca gcatgtagtg attgggccca gtagcctgat tgtgcatttc 3240
aatgaagtca taggaagagg gcattttggt tgtgtatatc atgggacttt gttggacaat 3300
gatggcaaga aaattcactg tgctgtgaaa tccttgaaca gaatcactga cataggagaa 3360
gtttcccaat ttctgaccga gggaatcatc atgaaagatt ttagtcatcc caatgtcctc 3420
tcgctcctgg gaatctgcct gcgaagtgaa gggtctccgc tggtggtcct accatacatg 3480
aaacatggag atcttcgaaa tttcattcga aatgagactc ataatccaac tgtaaaagat 3540
cttattggct ttggtcttca agtagccaaa ggcatgaaat atcttgcaag caaaaagttt 3600
gtccacagag acttggctgc aagaaactgt atgctggatg aaaaattcac agtcaaggtt 3660
gctgattttg gtcttgccag agacatgtat gataaagaat actatagtgt acacaacaaa 3720
acaggtgcaa agctgccagt gaagtggatg gctttggaaa gtctgcaaac tcaaaagttt 3780
accaccaagt cagatgtgtg gtcctttggc gtgctcctct gggagctgat gacaagagga 3840
gccccacctt atcctgacgt aaacaccttt gatataactg tttacttgtt gcaagggaga 3900
agactcctac aacccgaata ctgcccagac cccttatatg aagtaatgct aaaatgctgg 3960
caccctaaag ccgaaatgcg cccatccttt tctgaactgg tgtcccggat atcagcgatc 4020
ttctctactt tcattgggga gcactatgtc catgtgaacg ctacttatgt gaacgtaaaa 4080
tgtgtcgctc cgtatccttc tctgttgtca tcagaagata acgctgatga tgaggtggac 4140
acacgaccag cctccttctg ggagacatca 4170
<210> 79
<211> 444
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEMA domain of c-Met
<400> 79
Leu His Glu His His Ile Phe Leu Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val
1 5 10 15
Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro
20 25 30
Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys
35 40 45
Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu
50 55 60
Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val
65 70 75 80
Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His Val Phe Pro His Asn His Thr Ala
85 90 95
Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu
100 105 110
Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val
115 120 125
Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr
130 135 140
Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp His Pro Leu His Ser Ile Ser Val
145 150 155 160
Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln
165 170 175
Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys
180 185 190
Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val
195 200 205
Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg
210 215 220
Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu
225 230 235 240
Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu
245 250 255
Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln
260 265 270
Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly
275 280 285
Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser
290 295 300
Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys
305 310 315 320
Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro
325 330 335
Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly
340 345 350
Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu
355 360 365
Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr
370 375 380
Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly
385 390 395 400
Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro
405 410 415
Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro
420 425 430
Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu Asn Gln Asn Gly
435 440
<210> 80
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PSI-IPT domain of c-Met
<400> 80
Tyr Thr Leu Val Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys Ile Pro Leu Asn
1 5 10 15
Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln Cys Leu Ser Ala
20 25 30
Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys Cys Val Arg Ser
35 40 45
Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile Cys Leu Pro Ala
50 55 60
Ile Tyr Lys Val Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu Glu Gly Gly Thr Arg
65 70 75 80
Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg Asn Asn Lys Phe
85 90 95
Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu Ser Cys Thr Leu
100 105 110
Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys Thr Val Gly Pro
115 120 125
Ala Met Asn Lys His Phe Asn Met Ser Ile Ile Ile Ser Asn Gly His
130 135 140
Gly Thr Thr Gln Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp Pro Val Ile Thr
145 150 155 160
Ser Ile Ser Pro Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly Thr Leu Leu Thr
165 170 175
Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg His Ile Ser Ile
180 185 190
Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn Ser Ile Leu Glu
195 200 205
Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe Ala Val Lys Leu
210 215 220
Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe Ser Tyr Arg Glu
225 230 235 240
Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser Phe Ile Ser Thr
245 250 255
Trp Trp Lys Glu Pro Leu Asn Ile Val Ser Phe Leu Phe Cys Phe Ala
260 265 270
Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu Asn Ser Val
275 280 285
Ser Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His Glu Ala Gly Arg Asn Phe
290 295 300
Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys Cys Thr
305 310 315 320
Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu Lys Thr Lys
325 330 335
Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Tyr Phe Asp Leu Ile
340 345 350
Tyr Val His Asn Pro Val Phe Lys Pro Phe Glu Lys Pro Val Met Ile
355 360 365
Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile Lys Gly Asn Asp Ile Asp
370 375 380
Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn Lys Ser Cys
385 390 395 400
Glu Asn Ile His Leu His Ser Glu Ala Val Leu Cys Thr Val Pro Asn
405 410 415
Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys Gln Ala
420 425 430
Ile Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln Pro Asp Gln Asn
435 440 445
Phe Thr Gly
450
<210> 81
<211> 313
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TyrKc domain of c-Met
<400> 81
Val His Phe Asn Glu Val Ile Gly Arg Gly His Phe Gly Cys Val Tyr
1 5 10 15
His Gly Thr Leu Leu Asp Asn Asp Gly Lys Lys Ile His Cys Ala Val
20 25 30
Lys Ser Leu Asn Arg Ile Thr Asp Ile Gly Glu Val Ser Gln Phe Leu
35 40 45
Thr Glu Gly Ile Ile Met Lys Asp Phe Ser His Pro Asn Val Leu Ser
50 55 60
Leu Leu Gly Ile Cys Leu Arg Ser Glu Gly Ser Pro Leu Val Val Leu
65 70 75 80
Pro Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Arg Asn Phe Ile Arg Asn Glu Thr
85 90 95
His Asn Pro Thr Val Lys Asp Leu Ile Gly Phe Gly Leu Gln Val Ala
100 105 110
Lys Gly Met Lys Tyr Leu Ala Ser Lys Lys Phe Val His Arg Asp Leu
115 120 125
Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asp Glu Lys Phe Thr Val Lys Val Ala
130 135 140
Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Met Tyr Asp Lys Glu Tyr Tyr Ser Val
145 150 155 160
His Asn Lys Thr Gly Ala Lys Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Leu Glu
165 170 175
Ser Leu Gln Thr Gln Lys Phe Thr Thr Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe
180 185 190
Gly Val Leu Leu Trp Glu Leu Met Thr Arg Gly Ala Pro Pro Tyr Pro
195 200 205
Asp Val Asn Thr Phe Asp Ile Thr Val Tyr Leu Leu Gln Gly Arg Arg
210 215 220
Leu Leu Gln Pro Glu Tyr Cys Pro Asp Pro Leu Tyr Glu Val Met Leu
225 230 235 240
Lys Cys Trp His Pro Lys Ala Glu Met Arg Pro Ser Phe Ser Glu Leu
245 250 255
Val Ser Arg Ile Ser Ala Ile Phe Ser Thr Phe Ile Gly Glu His Tyr
260 265 270
Val His Val Asn Ala Thr Tyr Val Asn Val Lys Cys Val Ala Pro Tyr
275 280 285
Pro Ser Leu Leu Ser Ser Glu Asp Asn Ala Asp Asp Glu Val Asp Thr
290 295 300
Arg Pro Ala Ser Phe Trp Glu Thr Ser
305 310
<210> 82
<211> 1332
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide encoding SEMA domain of c-Met
<400> 82
ctacatgagc atcacatttt ccttggtgcc actaactaca tttatgtttt aaatgaggaa 60
gaccttcaga aggttgctga gtacaagact gggcctgtgc tggaacaccc agattgtttc 120
ccatgtcagg actgcagcag caaagccaat ttatcaggag gtgtttggaa agataacatc 180
aacatggctc tagttgtcga cacctactat gatgatcaac tcattagctg tggcagcgtc 240
aacagaggga cctgccagcg acatgtcttt ccccacaatc atactgctga catacagtcg 300
gaggttcact gcatattctc cccacagata gaagagccca gccagtgtcc tgactgtgtg 360
gtgagcgccc tgggagccaa agtcctttca tctgtaaagg accggttcat caacttcttt 420
gtaggcaata ccataaattc ttcttatttc ccagatcatc cattgcattc gatatcagtg 480
agaaggctaa aggaaacgaa agatggtttt atgtttttga cggaccagtc ctacattgat 540
gttttacctg agttcagaga ttcttacccc attaagtatg tccatgcctt tgaaagcaac 600
aattttattt acttcttgac ggtccaaagg gaaactctag atgctcagac ttttcacaca 660
agaataatca ggttctgttc cataaactct ggattgcatt cctacatgga aatgcctctg 720
gagtgtattc tcacagaaaa gagaaaaaag agatccacaa agaaggaagt gtttaatata 780
cttcaggctg cgtatgtcag caagcctggg gcccagcttg ctagacaaat aggagccagc 840
ctgaatgatg acattctttt cggggtgttc gcacaaagca agccagattc tgccgaacca 900
atggatcgat ctgccatgtg tgcattccct atcaaatatg tcaacgactt cttcaacaag 960
atcgtcaaca aaaacaatgt gagatgtctc cagcattttt acggacccaa tcatgagcac 1020
tgctttaata ggacacttct gagaaattca tcaggctgtg aagcgcgccg tgatgaatat 1080
cgaacagagt ttaccacagc tttgcagcgc gttgacttat tcatgggtca attcagcgaa 1140
gtcctcttaa catctatatc caccttcatt aaaggagacc tcaccatagc taatcttggg 1200
acatcagagg gtcgcttcat gcaggttgtg gtttctcgat caggaccatc aacccctcat 1260
gtgaattttc tcctggactc ccatccagtg tctccagaag tgattgtgga gcatacatta 1320
aaccaaaatg gc 1332
<210> 83
<211> 1299
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide encoding PSI-IPT domain of c-Met
<400> 83
tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc 60
agacatttcc agtcctgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg 120
tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc 180
tgtctgcctg caatctacaa ggttttccca aatagtgcac cccttgaagg agggacaagg 240
ctgaccatat gtggctggga ctttggattt cggaggaata ataaatttga tttaaagaaa 300
actagagttc tccttggaaa tgagagctgc accttgactt taagtgagag cacgatgaat 360
acattgaaat gcacagttgg tcctgccatg aataagcatt tcaatatgtc cataattatt 420
tcaaatggcc acgggacaac acaatacagt acattctcct atgtggatcc tgtaataaca 480
agtatttcgc cgaaatacgg tcctatggct ggtggcactt tacttacttt aactggaaat 540
tacctaaaca gtgggaattc tagacacatt tcaattggtg gaaaaacatg tactttaaaa 600
agtgtgtcaa acagtattct tgaatgttat accccagccc aaaccatttc aactgagttt 660
gctgttaaat tgaaaattga cttagccaac cgagagacaa gcatcttcag ttaccgtgaa 720
gatcccattg tctatgaaat tcatccaacc aaatctttta ttagtggtgg gagcacaata 780
acaggtgttg ggaaaaacct gaattcagtt agtgtcccga gaatggtcat aaatgtgcat 840
gaagcaggaa ggaactttac agtggcatgt caacatcgct ctaattcaga gataatctgt 900
tgtaccactc cttccctgca acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt 960
ttcatgttag atgggatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg 1020
tttaagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt 1080
aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag 1140
agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg 1200
ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt 1260
ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacagga 1299
<210> 84
<211> 939
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide encoding TyrKc domain of c-Met
<400> 84
gtgcatttca atgaagtcat aggaagaggg cattttggtt gtgtatatca tgggactttg 60
ttggacaatg atggcaagaa aattcactgt gctgtgaaat ccttgaacag aatcactgac 120
ataggagaag tttcccaatt tctgaccgag ggaatcatca tgaaagattt tagtcatccc 180
aatgtcctct cgctcctggg aatctgcctg cgaagtgaag ggtctccgct ggtggtccta 240
ccatacatga aacatggaga tcttcgaaat ttcattcgaa atgagactca taatccaact 300
gtaaaagatc ttattggctt tggtcttcaa gtagccaaag gcatgaaata tcttgcaagc 360
aaaaagtttg tccacagaga cttggctgca agaaactgta tgctggatga aaaattcaca 420
gtcaaggttg ctgattttgg tcttgccaga gacatgtatg ataaagaata ctatagtgta 480
cacaacaaaa caggtgcaaa gctgccagtg aagtggatgg ctttggaaag tctgcaaact 540
caaaagttta ccaccaagtc agatgtgtgg tcctttggcg tgctcctctg ggagctgatg 600
acaagaggag ccccacctta tcctgacgta aacacctttg atataactgt ttacttgttg 660
caagggagaa gactcctaca acccgaatac tgcccagacc ccttatatga agtaatgcta 720
aaatgctggc accctaaagc cgaaatgcgc ccatcctttt ctgaactggt gtcccggata 780
tcagcgatct tctctacttt cattggggag cactatgtcc atgtgaacgc tacttatgtg 840
aacgtaaaat gtgtcgctcc gtatccttct ctgttgtcat cagaagataa cgctgatgat 900
gaggtggaca cacgaccagc ctccttctgg gagacatca 939
<210> 85
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain CDR3 of anti-c-Met antibody
<400> 85
Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
1 5 10
<210> 86
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain CDR3 of anti-c-Met antibody
<400> 86
Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu
1 5 10
<210> 87
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain variable region of monoclonal antibody AbF46
<400> 87
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asp Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 88
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain variable region of anti-c-Met antibody
<400> 88
Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Arg
35 40 45
Ser Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys Arg
<210> 89
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain CDR3 of anti-c-Met antibody
<400> 89
Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
1 5 10 15
Glu
<210> 90
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain variable region of AT-VH1
<400> 90
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 91
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain variable region of AT-VH2
<400> 91
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 92
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain variable region of AT-VH3
<400> 92
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 93
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain variable region of AT-VH4
<400> 93
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 94
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain variable region of AT-VH5
<400> 94
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 95
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain variable region of anti c-Met humanized
antibody(huAbF46-H4)
<400> 95
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 96
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain variable region of AT-Vk1
<400> 96
Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 97
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain variable region of AT-Vk2
<400> 97
Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 98
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain variable region of AT-Vk3
<400> 98
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 99
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain variable region of AT-Vk4
<400> 99
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 100
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> modified hinge region(U7-HC6)
<400> 100
Glu Pro Ser Cys Asp Lys His Cys Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 101
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> modified hinge region(U6-HC7)
<400> 101
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Cys His Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 102
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> modified hinge region(U3-HC9)
<400> 102
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 103
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> modified hinge region(U6-HC8)
<400> 103
Glu Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 104
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> modified hinge region(U8-HC5)
<400> 104
Glu Lys Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 105
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human hinge region
<400> 105
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 106
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-L1 of antibody L3-11Y
<400> 106
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Trp Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 107
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of light chain variable region of antibody
L3-11Y
<400> 107
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Trp
20 25 30
Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 108
<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of light chain of antibody L3-11Y
<400> 108
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Trp
20 25 30
Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 109
<211> 1077
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDK1 gene
<400> 109
atgtttcttc gacaagagtt gcctgttaga ttggcaaata taatgaaaga aataagcctt 60
cttccagaca atcttctcag gacgccatca gtacagttgg tacaaagttg gtatatacag 120
agtcttcagg agctgcttga ttttaaggac aaaagtgctg aagatgctaa aactatttat 180
gaattcacag acacagtgat aaggatcaga aaccggcaca atgatgtcat tccaaccatg 240
gcccagggtg tgaccgaata caaggagagc ttcggggtgg atcctgtcac cagccaaaat 300
gtccagtact ttttggatcg attctacatg agtcgcattt caattagaat gttactcaac 360
cagcactctt tattgtttgg tggaaaagga agcccatctc atcgaaaaca cattggaagc 420
ataaatccaa actgcgatgt agtcgaagtc attaaagatg gctatgaaaa tgctaggcgg 480
ctttgtgatt tgtattatgt taactctcct gaactagaac ttgaagaact aaatgcgatt 540
tcaccaggac agacaataca agtggtttat gtaccatccc atctctatca catggtgttt 600
gaactgttca agaatgcaat gagggctacc atggagcacc atgctgacaa aggtgtctat 660
cccccgattc aagttcatgt cacactgggt gaggaggatt tgactgtgaa gatgagtgac 720
cggggaggtg gtgttccact gagaaagatt gacagactct tcaactacat gtactcaact 780
gcaccccggc ctcgttttga gacatcccgt gcagtgcccc tggctggttt tggttatgga 840
ttgcccatat cacgcctcta tgcacagtac ttccaggggg acctaaagct gtactccttg 900
gagggctacg ggactgacgc tgttatctat attaaggctc tgtcaacaga atccatcgag 960
agactccccg tgtataataa agctgcctgg aagcattaca aaaccaacca tgaagctgac 1020
gactggtgtg tccccagcag agagccgaaa gacatgacca cattccgaag ctcttag 1077
<210> 110
<211> 358
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDK1 protein
<400> 110
Met Phe Leu Arg Gln Glu Leu Pro Val Arg Leu Ala Asn Ile Met Lys
1 5 10 15
Glu Ile Ser Leu Leu Pro Asp Asn Leu Leu Arg Thr Pro Ser Val Gln
20 25 30
Leu Val Gln Ser Trp Tyr Ile Gln Ser Leu Gln Glu Leu Leu Asp Phe
35 40 45
Lys Asp Lys Ser Ala Glu Asp Ala Lys Thr Ile Tyr Glu Phe Thr Asp
50 55 60
Thr Val Ile Arg Ile Arg Asn Arg His Asn Asp Val Ile Pro Thr Met
65 70 75 80
Ala Gln Gly Val Thr Glu Tyr Lys Glu Ser Phe Gly Val Asp Pro Val
85 90 95
Thr Ser Gln Asn Val Gln Tyr Phe Leu Asp Arg Phe Tyr Met Ser Arg
100 105 110
Ile Ser Ile Arg Met Leu Leu Asn Gln His Ser Leu Leu Phe Gly Gly
115 120 125
Lys Gly Ser Pro Ser His Arg Lys His Ile Gly Ser Ile Asn Pro Asn
130 135 140
Cys Asp Val Val Glu Val Ile Lys Asp Gly Tyr Glu Asn Ala Arg Arg
145 150 155 160
Leu Cys Asp Leu Tyr Tyr Val Asn Ser Pro Glu Leu Glu Leu Glu Glu
165 170 175
Leu Asn Ala Ile Ser Pro Gly Gln Thr Ile Gln Val Val Tyr Val Pro
180 185 190
Ser His Leu Tyr His Met Val Phe Glu Leu Phe Lys Asn Ala Met Arg
195 200 205
Ala Thr Met Glu His His Ala Asp Lys Gly Val Tyr Pro Pro Ile Gln
210 215 220
Val His Val Thr Leu Gly Glu Glu Asp Leu Thr Val Lys Met Ser Asp
225 230 235 240
Arg Gly Gly Gly Val Pro Leu Arg Lys Ile Asp Arg Leu Phe Asn Tyr
245 250 255
Met Tyr Ser Thr Ala Pro Arg Pro Arg Phe Glu Thr Ser Arg Ala Val
260 265 270
Pro Leu Ala Gly Phe Gly Tyr Gly Leu Pro Ile Ser Arg Leu Tyr Ala
275 280 285
Gln Tyr Phe Gln Gly Asp Leu Lys Leu Tyr Ser Leu Glu Gly Tyr Gly
290 295 300
Thr Asp Ala Val Ile Tyr Ile Lys Ala Leu Ser Thr Glu Ser Ile Glu
305 310 315 320
Arg Leu Pro Val Tyr Asn Lys Ala Ala Trp Lys His Tyr Lys Thr Asn
325 330 335
His Glu Ala Asp Asp Trp Cys Val Pro Ser Arg Glu Pro Lys Asp Met
340 345 350
Thr Thr Phe Arg Ser Ser
355
<210> 111
<211> 1224
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDK2 gene
<400> 111
atgcgctgga tccgggcact gttgaagaat gcgtccctag caggggcgcc caagtacatc 60
gagcacttca gcaagttctc cccgtccccg ctgtccatga agcagtttct agacttcgga 120
tccagcaatg cctgcgagaa aacttccttc accttcctta ggcaggagct gcctgtgcgc 180
ctggccaaca tcatgaaaga gattaacttg cttcccgaca gagtgctggg caccccctca 240
gtgcagctgg tgcagagctg gtatgtccag agtctgctgg acatcatgga attcctggac 300
aaggatccag aggatcaccg gacactaagc cagttcaccg atgccctggt caccatccgg 360
aaccggcaca atgacgtagt gcccaccatg gcacagggag tgctggagta caaggacacc 420
tatggcgatg acccggtgtc caaccagaac attcagtact tcttggaccg cttctacctc 480
agccggatct ccatccgcat gctcatcaac cagcacaccc tcatctttga tggaagtacc 540
aacccagctc accccaaaca cattggcagc attgacccta actgcagcgt gtctgatgtg 600
gtaaaagatg cctatgacat ggccaagctc ctgtgtgaca aatactacat ggcttcacct 660
gatctagaga tccaggaagt taatgccacc aatgccaacc agcccattca catggtctac 720
gtcccctccc acctctacca catgctcttt gagctcttca agaatgccat gcgggccacg 780
gtggagagcc acgagtccag cctcaccctc cctcctatca agattatggt agccttgggt 840
gaagaagatc tgtccatcaa aatgagtgac cgaggtgggg gtgtcccctt gaggaagatt 900
gagaggctct tcagctacat gtactccaca gcccccacac cccagcctgg cactgggggt 960
accccactgg ctggctttgg gtatggactc cccatttccc gcctctacgc caagtacttc 1020
caaggagact tgcagctctt ctctatggag ggctttggga cagatgctgt catatatctc 1080
aaggccctgt ccacggactc agtggagcgt ctgcctgtct acaacaagtc tgcctggcgc 1140
cactaccaga ccatccagga ggccggtgac tggtgtgtgc ccagcacgga gcccaagaac 1200
acatccacgt atcgggtcag ctag 1224
<210> 112
<211> 407
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDK2 protein
<400> 112
Met Arg Trp Ile Arg Ala Leu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Ala Gly Ala
1 5 10 15
Pro Lys Tyr Ile Glu His Phe Ser Lys Phe Ser Pro Ser Pro Leu Ser
20 25 30
Met Lys Gln Phe Leu Asp Phe Gly Ser Ser Asn Ala Cys Glu Lys Thr
35 40 45
Ser Phe Thr Phe Leu Arg Gln Glu Leu Pro Val Arg Leu Ala Asn Ile
50 55 60
Met Lys Glu Ile Asn Leu Leu Pro Asp Arg Val Leu Gly Thr Pro Ser
65 70 75 80
Val Gln Leu Val Gln Ser Trp Tyr Val Gln Ser Leu Leu Asp Ile Met
85 90 95
Glu Phe Leu Asp Lys Asp Pro Glu Asp His Arg Thr Leu Ser Gln Phe
100 105 110
Thr Asp Ala Leu Val Thr Ile Arg Asn Arg His Asn Asp Val Val Pro
115 120 125
Thr Met Ala Gln Gly Val Leu Glu Tyr Lys Asp Thr Tyr Gly Asp Asp
130 135 140
Pro Val Ser Asn Gln Asn Ile Gln Tyr Phe Leu Asp Arg Phe Tyr Leu
145 150 155 160
Ser Arg Ile Ser Ile Arg Met Leu Ile Asn Gln His Thr Leu Ile Phe
165 170 175
Asp Gly Ser Thr Asn Pro Ala His Pro Lys His Ile Gly Ser Ile Asp
180 185 190
Pro Asn Cys Ser Val Ser Asp Val Val Lys Asp Ala Tyr Asp Met Ala
195 200 205
Lys Leu Leu Cys Asp Lys Tyr Tyr Met Ala Ser Pro Asp Leu Glu Ile
210 215 220
Gln Glu Val Asn Ala Thr Asn Ala Asn Gln Pro Ile His Met Val Tyr
225 230 235 240
Val Pro Ser His Leu Tyr His Met Leu Phe Glu Leu Phe Lys Asn Ala
245 250 255
Met Arg Ala Thr Val Glu Ser His Glu Ser Ser Leu Thr Leu Pro Pro
260 265 270
Ile Lys Ile Met Val Ala Leu Gly Glu Glu Asp Leu Ser Ile Lys Met
275 280 285
Ser Asp Arg Gly Gly Gly Val Pro Leu Arg Lys Ile Glu Arg Leu Phe
290 295 300
Ser Tyr Met Tyr Ser Thr Ala Pro Thr Pro Gln Pro Gly Thr Gly Gly
305 310 315 320
Thr Pro Leu Ala Gly Phe Gly Tyr Gly Leu Pro Ile Ser Arg Leu Tyr
325 330 335
Ala Lys Tyr Phe Gln Gly Asp Leu Gln Leu Phe Ser Met Glu Gly Phe
340 345 350
Gly Thr Asp Ala Val Ile Tyr Leu Lys Ala Leu Ser Thr Asp Ser Val
355 360 365
Glu Arg Leu Pro Val Tyr Asn Lys Ser Ala Trp Arg His Tyr Gln Thr
370 375 380
Ile Gln Glu Ala Gly Asp Trp Cys Val Pro Ser Thr Glu Pro Lys Asn
385 390 395 400
Thr Ser Thr Tyr Arg Val Ser
405
<210> 113
<211> 1248
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDK3 gene
<400> 113
atgcggctct tctttaggct gctcaagcag ccggtgccca aacagatcga gcgctactcc 60
cgcttctctc cgtctccgct ctctatcaaa cagttcttgg acttcggaag agataatgca 120
tgtgaaaaaa cttcatatat gtttctgcgc aaggagcttc ctgtacgact ggcgaacaca 180
atgagagaag ttaatctttt gccggataac ttgttgaacc gcccttcagt gggattagtt 240
cagagttggt acatgcagag ctttcttgaa cttttagaat atgaaaacaa gagcccagaa 300
gacccacggg ttttagataa ctttctccat gttttgatta atatcagaaa cagacacaac 360
gatgttgttc ccacaatggc ccaaggcgtg attgagtaca aagaaaagtt cggatttgat 420
ccatttatta gcagtaacat ccagtatttc ctggatcgtt tttataccaa ccgcatctct 480
ttccgaatgc ttattaacca acacacactt ctgtttggtg gtgacactaa tcctgctcat 540
cctaagcaca tagggagtat cgatcccacc tgtaatgtag ctgatgtcgt gaaagatgca 600
tatgaaacag ctaagctact ctgtgaacag tattacctgg tagctccaga gctggaagtg 660
gaagaattca atgccaaagc accaaacaaa cctattcagg tggtttatgt gccgtctcat 720
ctgtttcaca tgctatttga gctgttcaag aactcgatga gagcaacagt tgaactacat 780
gaaaatagaa aagagggcta cccagctgtt aaaactctcg ttactcttgg taaagaagac 840
ttgtccatta agataagtga cttaggtggt ggagtcccac ttcgaaaaat agaccgtctt 900
tttaactaca tgtattccac tgctcctcga cccagcctgg agcctacaag agctgctccc 960
ttggctggat ttggttatgg cttgccaatt tctcgactgt atgccagata ttttcaggga 1020
gatctaaaac tgtattccat ggaaggagtg ggtaccgatg ctgttattta tctgaaggcc 1080
ctttcaagtg aatcatttga gaggctgccc gttttcaata agtctgcatg gcgccattac 1140
aagacaactc ctgaagctga tgactggagc aatcccagta gcgaaccaag ggatgcatca 1200
aaatacaagg ctaaacagga caagatcaag actaatagaa ctttgtag 1248
<210> 114
<211> 415
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDK3 protein
<400> 114
Met Arg Leu Phe Phe Arg Leu Leu Lys Gln Pro Val Pro Lys Gln Ile
1 5 10 15
Glu Arg Tyr Ser Arg Phe Ser Pro Ser Pro Leu Ser Ile Lys Gln Phe
20 25 30
Leu Asp Phe Gly Arg Asp Asn Ala Cys Glu Lys Thr Ser Tyr Met Phe
35 40 45
Leu Arg Lys Glu Leu Pro Val Arg Leu Ala Asn Thr Met Arg Glu Val
50 55 60
Asn Leu Leu Pro Asp Asn Leu Leu Asn Arg Pro Ser Val Gly Leu Val
65 70 75 80
Gln Ser Trp Tyr Met Gln Ser Phe Leu Glu Leu Leu Glu Tyr Glu Asn
85 90 95
Lys Ser Pro Glu Asp Pro Arg Val Leu Asp Asn Phe Leu His Val Leu
100 105 110
Ile Asn Ile Arg Asn Arg His Asn Asp Val Val Pro Thr Met Ala Gln
115 120 125
Gly Val Ile Glu Tyr Lys Glu Lys Phe Gly Phe Asp Pro Phe Ile Ser
130 135 140
Ser Asn Ile Gln Tyr Phe Leu Asp Arg Phe Tyr Thr Asn Arg Ile Ser
145 150 155 160
Phe Arg Met Leu Ile Asn Gln His Thr Leu Leu Phe Gly Gly Asp Thr
165 170 175
Asn Pro Ala His Pro Lys His Ile Gly Ser Ile Asp Pro Thr Cys Asn
180 185 190
Val Ala Asp Val Val Lys Asp Ala Tyr Glu Thr Ala Lys Leu Leu Cys
195 200 205
Glu Gln Tyr Tyr Leu Val Ala Pro Glu Leu Glu Val Glu Glu Phe Asn
210 215 220
Ala Lys Ala Pro Asn Lys Pro Ile Gln Val Val Tyr Val Pro Ser His
225 230 235 240
Leu Phe His Met Leu Phe Glu Leu Phe Lys Asn Ser Met Arg Ala Thr
245 250 255
Val Glu Leu His Glu Asn Arg Lys Glu Gly Tyr Pro Ala Val Lys Thr
260 265 270
Leu Val Thr Leu Gly Lys Glu Asp Leu Ser Ile Lys Ile Ser Asp Leu
275 280 285
Gly Gly Gly Val Pro Leu Arg Lys Ile Asp Arg Leu Phe Asn Tyr Met
290 295 300
Tyr Ser Thr Ala Pro Arg Pro Ser Leu Glu Pro Thr Arg Ala Ala Pro
305 310 315 320
Leu Ala Gly Phe Gly Tyr Gly Leu Pro Ile Ser Arg Leu Tyr Ala Arg
325 330 335
Tyr Phe Gln Gly Asp Leu Lys Leu Tyr Ser Met Glu Gly Val Gly Thr
340 345 350
Asp Ala Val Ile Tyr Leu Lys Ala Leu Ser Ser Glu Ser Phe Glu Arg
355 360 365
Leu Pro Val Phe Asn Lys Ser Ala Trp Arg His Tyr Lys Thr Thr Pro
370 375 380
Glu Ala Asp Asp Trp Ser Asn Pro Ser Ser Glu Pro Arg Asp Ala Ser
385 390 395 400
Lys Tyr Lys Ala Lys Gln Asp Lys Ile Lys Thr Asn Arg Thr Leu
405 410 415
<210> 115
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target sequence for partial modification of PDK1 gene (219-241 of
SEQ ID NO: 109)
<400> 115
caatgatgtc attccaacca tgg 23
<210> 116
<211> 82
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Polypeptide (2-8mPDK1_M1)
<400> 116
Met Phe Leu Arg Gln Glu Leu Pro Val Arg Leu Ala Asn Ile Met Lys
1 5 10 15
Glu Ile Ser Leu Leu Pro Asp Asn Leu Leu Arg Thr Pro Ser Val Gln
20 25 30
Leu Val Gln Ser Trp Tyr Ile Gln Ser Leu Gln Glu Leu Leu Asp Phe
35 40 45
Lys Asp Lys Ser Ala Glu Asp Ala Lys Thr Ile Tyr Glu Phe Thr Asp
50 55 60
Thr Val Ile Arg Ile Arg Asn Arg His Asn Asp Val Ile Pro Thr Pro
65 70 75 80
Arg Val
<210> 117
<211> 82
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Polypeptide (2-8mPDK1_M2)
<400> 117
Met Phe Leu Arg Gln Glu Leu Pro Val Arg Leu Ala Asn Ile Met Lys
1 5 10 15
Glu Ile Ser Leu Leu Pro Asp Asn Leu Leu Arg Thr Pro Ser Val Gln
20 25 30
Leu Val Gln Ser Trp Tyr Ile Gln Ser Leu Gln Glu Leu Leu Asp Phe
35 40 45
Lys Asp Lys Ser Ala Glu Asp Ala Lys Thr Ile Tyr Glu Phe Thr Asp
50 55 60
Thr Val Ile Arg Ile Arg Asn Arg His Asn Asp Val Ile Pro Trp Pro
65 70 75 80
Arg Val
<210> 118
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target sequence for partial modification of PDK2 gene (172-194 of
SEQ ID NO: 111)
<400> 118
cctgtgcgcc tggccaacat cat 23
<210> 119
<211> 62
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Polypeptide (2-8mPDK2_m1)
<400> 119
Met Arg Trp Ile Arg Ala Leu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Ala Gly Ala
1 5 10 15
Pro Lys Tyr Ile Glu His Phe Ser Lys Phe Ser Pro Ser Pro Leu Ser
20 25 30
Met Lys Gln Phe Leu Asp Phe Gly Ser Ser Asn Ala Cys Glu Lys Thr
35 40 45
Ser Phe Thr Phe Leu Arg Gln Glu Leu Pro Val Pro Thr Ser
50 55 60
<210> 120
<211> 65
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Polypeptide (2-8mPDK2_m2)
<400> 120
Met Arg Trp Ile Arg Ala Leu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Ala Gly Ala
1 5 10 15
Pro Lys Tyr Ile Glu His Phe Ser Lys Phe Ser Pro Ser Pro Leu Ser
20 25 30
Met Lys Gln Phe Leu Asp Phe Gly Ser Ser Asn Ala Cys Glu Lys Thr
35 40 45
Ser Phe Thr Phe Leu Arg Gln Glu Leu Pro Gly Gln His His Glu Arg
50 55 60
Asp
65
<210> 121
<211> 65
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Polypeptide (2-33mPDK2)
<400> 121
Met Arg Trp Ile Arg Ala Leu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Ala Gly Ala
1 5 10 15
Pro Lys Tyr Ile Glu His Phe Ser Lys Phe Ser Pro Ser Pro Leu Ser
20 25 30
Met Lys Gln Phe Leu Asp Phe Gly Ser Ser Asn Ala Cys Glu Lys Thr
35 40 45
Ser Phe Thr Phe Leu Arg Gln Glu Leu Pro Val Pro Ala Trp Pro Thr
50 55 60
Ser
65
<210> 122
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target sequence for partial modification of PDK3 gene (38-60 of
SEQ ID NO: 113)
<400> 122
ccaaacagat cgagcgctac tcc 23
<210> 123
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Polypeptide (2-8mPDK3)
<400> 123
Met Arg Leu Phe Phe Arg Leu Leu Lys Gln Pro Val Pro Lys Gln Asp
1 5 10 15
Arg Ala Leu Leu Pro Leu Leu Ser Val Ser Ala Leu Tyr Gln Thr Val
20 25 30
Leu Gly Leu Arg Lys Arg
35
<210> 124
<211> 2490
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pRGEN_CHO-PDK1_U6_SG vector
<220>
<221> promoter
<222> (84)..(324)
<223> U6 promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (331)..(436)
<223> RGEN transcript
<400> 124
gacgaagact caattgtcga ttagtgaacg gatctcgacg gtatcgatca cgagactagc 60
ctcgagcggc cgcccccttc accgagggcc tatttcccat gattccttca tatttgcata 120
tacgatacaa ggctgttaga gagataattg gaattaattt gactgtaaac acaaagatat 180
tagtacaaaa tacgtgacgt agaaagtaat aatttcttgg gtagtttgca gttttaaaat 240
tatgttttaa aatggactat catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg 300
ctttatatat cttgtggaaa ggacgaaaca ccggcaatga tgtcattcca accagtttta 360
gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc 420
gagtcggtgc ttttttctag attcgcgatg tacgggccag atatacgcgt tgacattgat 480
tattgactag ttgtcttcct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg 540
cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 600
cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 660
aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 720
gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 780
tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 840
agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 900
ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcaa tgctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 960
taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 1020
gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 1080
gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 1140
ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg 1200
ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 1260
gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 1320
caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 1380
taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 1440
aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 1500
tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 1560
tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct 1620
gcaatgatac cgcgagatcc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 1680
gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt 1740
aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt 1800
gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc 1860
ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc 1920
tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt 1980
atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact 2040
ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc 2100
ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt 2160
ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg 2220
atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct 2280
gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa 2340
tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt 2400
ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc 2460
acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc 2490
<210> 125
<211> 2490
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pRGEN_CHO-PDK2_U6_SG vector
<220>
<221> promoter
<222> (84)..(324)
<223> U6 promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (331)..(436)
<223> RGEN transcript
<400> 125
gacgaagact caattgtcga ttagtgaacg gatctcgacg gtatcgatca cgagactagc 60
ctcgagcggc cgcccccttc accgagggcc tatttcccat gattccttca tatttgcata 120
tacgatacaa ggctgttaga gagataattg gaattaattt gactgtaaac acaaagatat 180
tagtacaaaa tacgtgacgt agaaagtaat aatttcttgg gtagtttgca gttttaaaat 240
tatgttttaa aatggactat catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg 300
ctttatatat cttgtggaaa ggacgaaaca ccggatgatg ttggccaggc gcacgtttta 360
gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc 420
gagtcggtgc ttttttctag attcgcgatg tacgggccag atatacgcgt tgacattgat 480
tattgactag ttgtcttcct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg 540
cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 600
cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 660
aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 720
gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 780
tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 840
agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 900
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taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 1020
gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 1080
gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 1140
ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg 1200
ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 1260
gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 1320
caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 1380
taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 1440
aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 1500
tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 1560
tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct 1620
gcaatgatac cgcgagatcc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 1680
gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt 1740
aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt 1800
gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc 1860
ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc 1920
tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt 1980
atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact 2040
ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc 2100
ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt 2160
ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg 2220
atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct 2280
gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa 2340
tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt 2400
ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc 2460
acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc 2490
<210> 126
<211> 2490
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pRGEN_CHO-PDK3_U6_SG vector
<220>
<221> promoter
<222> (84)..(324)
<223> U6 promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (331)..(436)
<223> RGEN transcript
<400> 126
gacgaagact caattgtcga ttagtgaacg gatctcgacg gtatcgatca cgagactagc 60
ctcgagcggc cgcccccttc accgagggcc tatttcccat gattccttca tatttgcata 120
tacgatacaa ggctgttaga gagataattg gaattaattt gactgtaaac acaaagatat 180
tagtacaaaa tacgtgacgt agaaagtaat aatttcttgg gtagtttgca gttttaaaat 240
tatgttttaa aatggactat catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg 300
ctttatatat cttgtggaaa ggacgaaaca ccggggagta gcgctcgatc tgttgtttta 360
gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc 420
gagtcggtgc ttttttctag attcgcgatg tacgggccag atatacgcgt tgacattgat 480
tattgactag ttgtcttcct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg 540
cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 600
cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 660
aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 720
gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 780
tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 840
agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 900
ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcaa tgctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 960
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gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 1080
gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 1140
ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg 1200
ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 1260
gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 1320
caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 1380
taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 1440
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tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 1560
tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct 1620
gcaatgatac cgcgagatcc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 1680
gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt 1740
aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt 1800
gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc 1860
ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc 1920
tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt 1980
atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact 2040
ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc 2100
ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt 2160
ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg 2220
atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct 2280
gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa 2340
tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt 2400
ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc 2460
acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc 2490
<210> 127
<211> 9893
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> expression vector of L3-1Y/IgG2
<400> 127
ggagaaaggc ctgaccgcca tgttgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa 60
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atggcccgcc tcgtgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 180
tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 240
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tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta cgggactttc 360
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ccctattggt gacgatactt tccattacta atccataaca tggctctttg ccacaactat 960
ctctattggc tatatgccaa tactctgtcc ttcagagact gacacggact ctgtattttt 1020
acaggatggg gtcccattta ttatttacaa attcacatat acaacaacgc cgtcccccgt 1080
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ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 2160
gaatccgtca ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 2220
ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 2280
ctgtccagcc ccgtgaccaa gtccttcaac cggggcgagt gctgactcga gaaactgtgc 2340
cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag 2400
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agaaaggcct gaccgccatg ttgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt 2640
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ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa 2820
ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tccggccccc tattgacgtc 2880
aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttacg ggactttcct 2940
acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag 3000
tacaccaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt 3060
gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaat 3120
aaccccgccc cgttgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc 3180
agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcgcc tggagacgcc atccacgctg ttttgacctc 3240
catagaagac accgggaccg atccagcctc cgcggccggg aacggtgcat tggaacgcgg 3300
attccccgtg ccaagagtga cgtaagtacc gcctatagac tctataggca cacccctttg 3360
gctcttatgc atgctatact gtttttggct tggggcctat acacccccgc tccttatgct 3420
ataggtgatg gtatagctta gcctataggt gtgggttatt gaccattatt gaccactccc 3480
ctattggtga cgatactttc cattactaat ccataacatg gctctttgcc acaactatct 3540
ctattggcta tatgccaata ctctgtcctt cagagactga cacggactct gtatttttac 3600
aggatggggt cccatttatt atttacaaat tcacatatac aacaacgccg tcccccgtgc 3660
ccgcagtttt tattaaacat agcgtgggat ctccacgcga atctcgggta cgtgttccgg 3720
acatgggctc ttctccggta gcggcggagc ttccacatcc gagccctggt cccatgcctc 3780
cagcggctca tggtcgctcg gcagctcctt gctcctaaca gtggaggcca gacttaggca 3840
cagcacaatg cccaccacca ccagtgtgcc gcacaaggcc gtggcggtag ggtatgtgtc 3900
tgaaaatgag ctcggagatt gggctcgcac cgtgacgcag atggaagact taaggcagcg 3960
gcagaagaag atgcaggcag ctgagttgtt gtattctgat aagagtcaga ggtaactccc 4020
gttgcggtgc tgttaacggt ggagggcagt gtagtctgag cagtactcgt tgctgccgcg 4080
cgcgccacca gacataatag ctgacagact aacagactgt tcctttccat gggtcttttc 4140
tgcagtcacc gaattcgccg ccaccatgga atggtcctgg gtgttcctgg tcaccctgct 4200
gaacggcatc cagtgcgagg tgcagctggt ggaatccggc ggaggactgg tgcagcctgg 4260
cggctccctg agactgtctt gcgccgcctc cggcttcacc ttcaccgact actacatgtc 4320
ctgggtccga caggcccctg gcaagggcct ggaatggctg ggcttcatcc ggaacaaggc 4380
caacggctac accaccgagt actccgcctc cgtgaagggc cggttcacca tctcccggga 4440
caactccaag aacacactgt acctgcagat gaactccctg cgggccgagg acaccgccgt 4500
gtactactgc gccagagaca attggttcgc ctactggggc cagggcaccc tggtcaccgt 4560
gtcctctgct agcaccaagg gcccctccgt gttccctctg gccccttgct cccggtccac 4620
ctccgagtct accgccgctc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg agcccgtgac 4680
cgtgtcctgg aactctggcg ccctgacctc cggcgtgcac accttccctg ccgtgctgca 4740
gtcctccggc ctgtactccc tgtcctccgt cgtgaccgtg ccctcctcca acttcggcac 4800
ccagacctac acctgtaacg tggaccacaa gccctccaac accaaggtgg acaagaccgt 4860
ggaacggaag tgctgcgtgg aatgcccccc ctgccctgct cctcctgtgg caggccctag 4920
cgtgttcctg ttccccccaa agcccaagga caccctgatg atctcccgga cccccgaagt 4980
gacctgcgtg gtggtggacg tgtcccacga ggaccccgag gtgcagttca attggtacgt 5040
ggacggcgtg gaagtgcaca acgccaagac caagcccaga gaggaacagt tcaactccac 5100
cttccgggtg gtgtccgtgc tgaccgtggt gcaccaggac tggctgaacg gcaaagagta 5160
caagtgcaag gtgtccaaca agggcctgcc tgcccccatc gaaaagacca tcagcaagac 5220
caagggccag ccccgcgagc cccaggtgta cacactgccc cctagccggg aagagatgac 5280
caagaaccag gtgtccctga cctgtctcgt caaaggcttc tacccctccg atatcgccgt 5340
ggaatgggag tccaacggcc agcccgagaa caactacaag accacccccc ccatgctgga 5400
ctccgacggc tcattcttcc tgtactccaa gctgacagtg gacaagtccc ggtggcagca 5460
gggcaacgtg ttctcctgct ccgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa 5520
gtccctgtcc ctgagccccg gcaagtgact cgagggagaa gcggccgcaa agccgcccct 5580
ctccctcccc cccccctaac gttactggcc gaagccgctt ggaataaggc cggtgtgcgt 5640
ttgtctatat gttattttcc accatattgc cgtcttttgg caatgtgagg gcccggaaac 5700
ctggccctgt cttcttgacg agcattccta ggggtctttc ccctctcgcc aaaggaatgc 5760
aaggtctgtt gaatgtcgtg aaggaagcag ttcctctgga agcttcttga agacaaacaa 5820
cgtctgtagc gaccctttgc aggcagcgga accccccacc tggcgacagg tgcctctgcg 5880
gccaaaagcc acgtgtataa gatacacctg caaaggcggc acaaccccag tgccacgttg 5940
tgagttggat agttgtggaa agagtcaaat ggctctcctc aagcgtattc aacaaggggc 6000
tgaaggatgc ccagaaggta ccccattgta tgggatctga tctggggcct cggtacacat 6060
gctttacatg tgtttagtcg aggttaaaaa aacgtctagg ccccccgaac cacggggacg 6120
tggttttcct ttgaaaaaca cgatgataat atggccacaa aaagatctgc caccatggcc 6180
acctcagcaa gttcccactt gaacaaaaac atcaagcaaa tgtacttgtg cctgccccag 6240
ggtgagaaag tccaagccat gtatatctgg gttgatggta ctggagaagg actgcgctgc 6300
aaaacccgca ccctggactg tgagcccaag tgtgtagaag agttacctga gtggaatttt 6360
gatggctcta gtacctttca gtctgagggc tccaacagtg acatgtatct cagccctgtt 6420
gccatgtttc gggacccctt ccgcagagat cccaacaagc tggtgttctg tgaagttttc 6480
aagtacaacc ggaagcctgc agagaccaat ttaaggcact cgtgtaaacg gataatggac 6540
atggtgagca accagcaccc ctggtttgga atggaacagg agtatactct gatgggaaca 6600
gatgggcacc cttttggttg gccttccaat ggctttcctg ggccccaagg tccgtattac 6660
tgtggtgtgg gcgcagacaa agcctatggc agggatatcg tggaggctca ctaccgcgcc 6720
tgcttgtatg ctggggtcaa gattacagga acaaatgctg aggtcatgcc tgcccagtgg 6780
gaattccaaa taggaccctg tgaaggaatc cgcatgggag atcatctctg ggtggcccgt 6840
ttcatcttgc atcgagtatg tgaagacttt ggggtaatag caacctttga ccccaagccc 6900
attcctggga actggaatgg tgcaggctgc cataccaact ttagcaccaa ggccatgcgg 6960
gaggagaatg gtctgaagca catcgaggag gccatcgaga aactaagcaa gcggcaccgg 7020
taccacattc gagcctacga tcccaagggg ggcctggaca atgcccgtcg tctgactggg 7080
ttccacgaaa cgtccaacat caacgacttt tctgctggtg tcgccaatcg cagtgccagc 7140
atccgcattc cccggactgt cggccaggag aagaaaggtt actttgaaga ccgccgcccc 7200
tctgccaatt gtgacccctt tgcagtgaca gaagccatcg tccgcacatg ccttctcaat 7260
gagactggcg accagccctt ccaatacaaa aactaaggcc ggccaaagtc gagaaactgt 7320
gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga 7380
aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag 7440
taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga 7500
agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg ggatatcgga gaaggcgcgc 7560
cgctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag 7620
acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca 7680
gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg 7740
tatactggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt 7800
gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct 7860
cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 7920
aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 7980
aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 8040
tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 8100
caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 8160
cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 8220
ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 8280
gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 8340
agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 8400
gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 8460
acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 8520
gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 8580
gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 8640
cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 8700
caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 8760
gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 8820
cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 8880
cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 8940
caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 9000
gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 9060
gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctgcaggc atcgtggtgt 9120
cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 9180
catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 9240
gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 9300
ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 9360
gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaacacgg gataataccg 9420
cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 9480
tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 9540
gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 9600
atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 9660
ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 9720
gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 9780
acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc 9840
cctttcgtct tcaagaaagt tacgctaggg ataacagggt aatatagacg cgt 9893
<210> 128
<211> 1073
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2-8mPDK1_M1 coding PDK 1 gene with partial deletion
<400> 128
atgtttcttc gacaagagtt gcctgttaga ttggcaaata taatgaaaga aataagcctt 60
cttccagaca atcttctcag gacgccatca gtacagttgg tacaaagttg gtatatacag 120
agtcttcagg agctgcttga ttttaaggac aaaagtgctg aagatgctaa aactatttat 180
gaattcacag acacagtgat aaggatcaga aaccggcaca atgatgtcat tccaaccccc 240
agggtgtgac cgaatacaag gagagcttcg gggtggatcc tgtcaccagc caaaatgtcc 300
agtacttttt ggatcgattc tacatgagtc gcatttcaat tagaatgtta ctcaaccagc 360
actctttatt gtttggtgga aaaggaagcc catctcatcg aaaacacatt ggaagcataa 420
atccaaactg cgatgtagtc gaagtcatta aagatggcta tgaaaatgct aggcggcttt 480
gtgatttgta ttatgttaac tctcctgaac tagaacttga agaactaaat gcgatttcac 540
caggacagac aatacaagtg gtttatgtac catcccatct ctatcacatg gtgtttgaac 600
tgttcaagaa tgcaatgagg gctaccatgg agcaccatgc tgacaaaggt gtctatcccc 660
cgattcaagt tcatgtcaca ctgggtgagg aggatttgac tgtgaagatg agtgaccggg 720
gaggtggtgt tccactgaga aagattgaca gactcttcaa ctacatgtac tcaactgcac 780
cccggcctcg ttttgagaca tcccgtgcag tgcccctggc tggttttggt tatggattgc 840
ccatatcacg cctctatgca cagtacttcc agggggacct aaagctgtac tccttggagg 900
gctacgggac tgacgctgtt atctatatta aggctctgtc aacagaatcc atcgagagac 960
tccccgtgta taataaagct gcctggaagc attacaaaac caaccatgaa gctgacgact 1020
ggtgtgtccc cagcagagag ccgaaagaca tgaccacatt ccgaagctct tag 1073
<210> 129
<211> 1073
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2-8mPDK1_M2 coding PDK 1 gene with partial deletion
<400> 129
atgtttcttc gacaagagtt gcctgttaga ttggcaaata taatgaaaga aataagcctt 60
cttccagaca atcttctcag gacgccatca gtacagttgg tacaaagttg gtatatacag 120
agtcttcagg agctgcttga ttttaaggac aaaagtgctg aagatgctaa aactatttat 180
gaattcacag acacagtgat aaggatcaga aaccggcaca atgatgtcat tccatggccc 240
agggtgtgac cgaatacaag gagagcttcg gggtggatcc tgtcaccagc caaaatgtcc 300
agtacttttt ggatcgattc tacatgagtc gcatttcaat tagaatgtta ctcaaccagc 360
actctttatt gtttggtgga aaaggaagcc catctcatcg aaaacacatt ggaagcataa 420
atccaaactg cgatgtagtc gaagtcatta aagatggcta tgaaaatgct aggcggcttt 480
gtgatttgta ttatgttaac tctcctgaac tagaacttga agaactaaat gcgatttcac 540
caggacagac aatacaagtg gtttatgtac catcccatct ctatcacatg gtgtttgaac 600
tgttcaagaa tgcaatgagg gctaccatgg agcaccatgc tgacaaaggt gtctatcccc 660
cgattcaagt tcatgtcaca ctgggtgagg aggatttgac tgtgaagatg agtgaccggg 720
gaggtggtgt tccactgaga aagattgaca gactcttcaa ctacatgtac tcaactgcac 780
cccggcctcg ttttgagaca tcccgtgcag tgcccctggc tggttttggt tatggattgc 840
ccatatcacg cctctatgca cagtacttcc agggggacct aaagctgtac tccttggagg 900
gctacgggac tgacgctgtt atctatatta aggctctgtc aacagaatcc atcgagagac 960
tccccgtgta taataaagct gcctggaagc attacaaaac caaccatgaa gctgacgact 1020
ggtgtgtccc cagcagagag ccgaaagaca tgaccacatt ccgaagctct tag 1073
<210> 130
<211> 1217
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2-8mPDK2_m1 coding PDK 2 gene with partial deletion
<400> 130
atgcgctgga tccgggcact gttgaagaat gcgtccctag caggggcgcc caagtacatc 60
gagcacttca gcaagttctc cccgtccccg ctgtccatga agcagtttct agacttcgga 120
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acatcatgaa agagattaac ttgcttcccg acagagtgct gggcaccccc tcagtgcagc 240
tggtgcagag ctggtatgtc cagagtctgc tggacatcat ggaattcctg gacaaggatc 300
cagaggatca ccggacacta agccagttca ccgatgccct ggtcaccatc cggaaccggc 360
acaatgacgt agtgcccacc atggcacagg gagtgctgga gtacaaggac acctatggcg 420
atgacccggt gtccaaccag aacattcagt acttcttgga ccgcttctac ctcagccgga 480
tctccatccg catgctcatc aaccagcaca ccctcatctt tgatggaagt accaacccag 540
ctcaccccaa acacattggc agcattgacc ctaactgcag cgtgtctgat gtggtaaaag 600
atgcctatga catggccaag ctcctgtgtg acaaatacta catggcttca cctgatctag 660
agatccagga agttaatgcc accaatgcca accagcccat tcacatggtc tacgtcccct 720
cccacctcta ccacatgctc tttgagctct tcaagaatgc catgcgggcc acggtggaga 780
gccacgagtc cagcctcacc ctccctccta tcaagattat ggtagccttg ggtgaagaag 840
atctgtccat caaaatgagt gaccgaggtg ggggtgtccc cttgaggaag attgagaggc 900
tcttcagcta catgtactcc acagccccca caccccagcc tggcactggg ggtaccccac 960
tggctggctt tgggtatgga ctccccattt cccgcctcta cgccaagtac ttccaaggag 1020
acttgcagct cttctctatg gagggctttg ggacagatgc tgtcatatat ctcaaggccc 1080
tgtccacgga ctcagtggag cgtctgcctg tctacaacaa gtctgcctgg cgccactacc 1140
agaccatcca ggaggccggt gactggtgtg tgcccagcac ggagcccaag aacacatcca 1200
cgtatcgggt cagctag 1217
<210> 131
<211> 1216
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2-8mPDK2_m2 coding PDK 2 gene with partial deletion
<400> 131
atgcgctgga tccgggcact gttgaagaat gcgtccctag caggggcgcc caagtacatc 60
gagcacttca gcaagttctc cccgtccccg ctgtccatga agcagtttct agacttcgga 120
tccagcaatg cctgcgagaa aacttccttc accttcctta ggcaggagct gcctggccaa 180
catcatgaaa gagattaact tgcttcccga cagagtgctg ggcaccccct cagtgcagct 240
ggtgcagagc tggtatgtcc agagtctgct ggacatcatg gaattcctgg acaaggatcc 300
agaggatcac cggacactaa gccagttcac cgatgccctg gtcaccatcc ggaaccggca 360
caatgacgta gtgcccacca tggcacaggg agtgctggag tacaaggaca cctatggcga 420
tgacccggtg tccaaccaga acattcagta cttcttggac cgcttctacc tcagccggat 480
ctccatccgc atgctcatca accagcacac cctcatcttt gatggaagta ccaacccagc 540
tcaccccaaa cacattggca gcattgaccc taactgcagc gtgtctgatg tggtaaaaga 600
tgcctatgac atggccaagc tcctgtgtga caaatactac atggcttcac ctgatctaga 660
gatccaggaa gttaatgcca ccaatgccaa ccagcccatt cacatggtct acgtcccctc 720
ccacctctac cacatgctct ttgagctctt caagaatgcc atgcgggcca cggtggagag 780
ccacgagtcc agcctcaccc tccctcctat caagattatg gtagccttgg gtgaagaaga 840
tctgtccatc aaaatgagtg accgaggtgg gggtgtcccc ttgaggaaga ttgagaggct 900
cttcagctac atgtactcca cagcccccac accccagcct ggcactgggg gtaccccact 960
ggctggcttt gggtatggac tccccatttc ccgcctctac gccaagtact tccaaggaga 1020
cttgcagctc ttctctatgg agggctttgg gacagatgct gtcatatatc tcaaggccct 1080
gtccacggac tcagtggagc gtctgcctgt ctacaacaag tctgcctggc gccactacca 1140
gaccatccag gaggccggtg actggtgtgt gcccagcacg gagcccaaga acacatccac 1200
gtatcgggtc agctag 1216
<210> 132
<211> 1226
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2-33mPDK2 coding PDK 2 gene with partial insertion
<400> 132
atgcgctgga tccgggcact gttgaagaat gcgtccctag caggggcgcc caagtacatc 60
gagcacttca gcaagttctc cccgtccccg ctgtccatga agcagtttct agacttcgga 120
tccagcaatg cctgcgagaa aacttccttc accttcctta ggcaggagct gcctgtgccc 180
gcctggccaa catcatgaaa gagattaact tgcttcccga cagagtgctg ggcaccccct 240
cagtgcagct ggtgcagagc tggtatgtcc agagtctgct ggacatcatg gaattcctgg 300
acaaggatcc agaggatcac cggacactaa gccagttcac cgatgccctg gtcaccatcc 360
ggaaccggca caatgacgta gtgcccacca tggcacaggg agtgctggag tacaaggaca 420
cctatggcga tgacccggtg tccaaccaga acattcagta cttcttggac cgcttctacc 480
tcagccggat ctccatccgc atgctcatca accagcacac cctcatcttt gatggaagta 540
ccaacccagc tcaccccaaa cacattggca gcattgaccc taactgcagc gtgtctgatg 600
tggtaaaaga tgcctatgac atggccaagc tcctgtgtga caaatactac atggcttcac 660
ctgatctaga gatccaggaa gttaatgcca ccaatgccaa ccagcccatt cacatggtct 720
acgtcccctc ccacctctac cacatgctct ttgagctctt caagaatgcc atgcgggcca 780
cggtggagag ccacgagtcc agcctcaccc tccctcctat caagattatg gtagccttgg 840
gtgaagaaga tctgtccatc aaaatgagtg accgaggtgg gggtgtcccc ttgaggaaga 900
ttgagaggct cttcagctac atgtactcca cagcccccac accccagcct ggcactgggg 960
gtaccccact ggctggcttt gggtatggac tccccatttc ccgcctctac gccaagtact 1020
tccaaggaga cttgcagctc ttctctatgg agggctttgg gacagatgct gtcatatatc 1080
tcaaggccct gtccacggac tcagtggagc gtctgcctgt ctacaacaag tctgcctggc 1140
gccactacca gaccatccag gaggccggtg actggtgtgt gcccagcacg gagcccaaga 1200
acacatccac gtatcgggtc agctag 1226
<210> 133
<211> 1249
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2-8mPDK3 coding PDK 3 gene with partial insertion
<400> 133
atgcggctct tctttaggct gctcaagcag ccggtgccca aacaagatcg agcgctactc 60
ccgcttctct ccgtctccgc tctctatcaa acagttcttg gacttcggaa gagataatgc 120
atgtgaaaaa acttcatata tgtttctgcg caaggagctt cctgtacgac tggcgaacac 180
aatgagagaa gttaatcttt tgccggataa cttgttgaac cgcccttcag tgggattagt 240
tcagagttgg tacatgcaga gctttcttga acttttagaa tatgaaaaca agagcccaga 300
agacccacgg gttttagata actttctcca tgttttgatt aatatcagaa acagacacaa 360
cgatgttgtt cccacaatgg cccaaggcgt gattgagtac aaagaaaagt tcggatttga 420
tccatttatt agcagtaaca tccagtattt cctggatcgt ttttatacca accgcatctc 480
tttccgaatg cttattaacc aacacacact tctgtttggt ggtgacacta atcctgctca 540
tcctaagcac atagggagta tcgatcccac ctgtaatgta gctgatgtcg tgaaagatgc 600
atatgaaaca gctaagctac tctgtgaaca gtattacctg gtagctccag agctggaagt 660
ggaagaattc aatgccaaag caccaaacaa acctattcag gtggtttatg tgccgtctca 720
tctgtttcac atgctatttg agctgttcaa gaactcgatg agagcaacag ttgaactaca 780
tgaaaataga aaagagggct acccagctgt taaaactctc gttactcttg gtaaagaaga 840
cttgtccatt aagataagtg acttaggtgg tggagtccca cttcgaaaaa tagaccgtct 900
ttttaactac atgtattcca ctgctcctcg acccagcctg gagcctacaa gagctgctcc 960
cttggctgga tttggttatg gcttgccaat ttctcgactg tatgccagat attttcaggg 1020
agatctaaaa ctgtattcca tggaaggagt gggtaccgat gctgttattt atctgaaggc 1080
cctttcaagt gaatcatttg agaggctgcc cgttttcaat aagtctgcat ggcgccatta 1140
caagacaact cctgaagctg atgactggag caatcccagt agcgaaccaa gggatgcatc 1200
aaaatacaag gctaaacagg acaagatcaa gactaataga actttgtag 1249
Claims (12)
- 불활성화된 피루베이트 디하이드로지네이즈 카이네이즈 (pyruvate dehydrogenase kinase; PDK) 유전자를 포함하고,
상기 불활성화된 PDK 유전자는,
1) PDK 유전자 전체가 결실된 PDK 유전자,
2) PDK 유전자 내의 연속하는 1개 내지 100개 염기가 결실 또는 다른 염기로 치환된 PDK 유전자, 및
3) PDK 유전자 내에 총 1개 내지 100개 염기가 삽입된 PDK 유전자
로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이고,
상기 PDK 유전자는 PDK1 유전자, PDK2 유전자, 및 PDK3 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인,
재조합 세포. - 제1항에 있어서, 다음 중 1종 이상을 포함하는, 재조합 세포:
PDK1 유전자 내의 연속하는 1 내지 100 bp의 염기가 결실 또는 다른 염기로 치환된 불활성화된 PDK1 유전자,
PDK2 유전자 내의 연속하는 1 내지 100 bp의 염기가 결실 또는 다른 염기로 치환된 불활성화된 PDK2 유전자, 및
PDK3 유전자 내에 1 내지 100개의 염기가 삽입된 불활성화된 PDK3 유전자. - 제1항에 있어서, 다음 중 1종 이상을 포함하는, 재조합 세포:
서열번호 109의 235번째부터 241번째까지의 연속하는 염기 서열을 포함하는 총 길이 23 내지 50bp의 염기 서열 중의 1 내지 20개의 염기가 결실 또는 다른 염기로 치환된 불활성화된 PDK1 유전자,
서열번호 111의 172번째부터 194번째까지의 연속하는 염기 서열을 포함하는 총 길이 23 내지 50bp의 염기 서열 중의 1 내지 20개의 염기가 결실 또는 다른 염기로 치환된 불활성화된 PDK2 유전자, 및
서열번호 113의 38번째부터 60번째까지의 연속하는 염기 서열을 포함하는 총 길이 23 내지 50bp의 염기 서열 내에 1 내지 20개의 염기가 삽입된 불활성화된 PDK3 유전자. - 제1항에 있어서, 다음 중 1종 이상을 포함하는, 재조합 세포:
서열번호 109의 235번째부터 241번째까지의 연속하는 염기 서열을 포함하는 총 길이 23 내지 50bp의 염기 서열 중의 1 내지 15개의 염기가 결실 또는 다른 염기로 치환된 불활성화된 PDK1 유전자,
서열번호 111의 172번째부터 194번째까지의 연속하는 염기 서열을 포함하는 총 길이 23 내지 50bp의 염기 서열 중의 1 내지 15개의 염기가 결실 또는 다른 염기로 치환된 불활성화된 PDK2 유전자, 및
서열번호 113의 38번째부터 60번째까지의 연속하는 염기 서열을 포함하는 총 길이 23 내지 50bp의 염기 서열 내에 1 내지 10개의 염기가 삽입된 불활성화된 PDK3 유전자. - 제1항에 있어서, 다음으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 재조합 세포:
서열번호 109의 235번째부터 241번째까지의 연속하는 염기 서열을 포함하는 총 길이 23 내지 50bp의 염기 서열 중의 1 내지 20개의 염기가 결실 또는 다른 염기로 치환된 불활성화된 PDK1 유전자,
서열번호 111의 172번째부터 194번째까지의 연속하는 염기 서열을 포함하는 총 길이 23 내지 50bp의 염기 서열 중의 1 내지 20개의 염기가 결실 또는 다른 염기로 치환, 또는 상기 23 내지 50bp의 염기 서열 내에 1 내지 20개의 염기가 삽입된 불활성화된 PDK2 유전자, 및
서열번호 113의 38번째부터 60번째까지의 연속하는 염기 서열을 포함하는 총 길이 23 내지 50bp의 염기 서열 내에 1 내지 20개의 염기가 삽입된 불활성화된 PDK3 유전자. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 목적 폴리펩타이드의 유전자를 추가로 포함하는, 재조합 세포.
- 제6항의 재조합 세포를 포함하는 목적 폴리펩타이드 생산용 조성물.
- 제6항의 재조합 세포에서 목적 폴리펩타이드를 발현시키는 단계를 포함하는, 목적 폴리펩타이드의 생산 방법.
- 세포에서 피루베이트 디하이드로지네이즈 카이네이즈 (pyruvate dehydrogenase kinase; PDK) 유전자를 불활성화시키는 단계를 포함하고,
상기 PDK 유전자를 불활성화시키는 단계는,
1) PDK 유전자 전체 결실,
2) PDK 유전자 내의 연속하는 1개 내지 100개 염기 결실 또는 다른 염기로 치환, 및
3) PDK 유전자 내에 총 1개 내지 100개 염기 삽입
으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하고,
상기 PDK 유전자는 PDK1 유전자, PDK2 유전자, 및 PDK3 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인,
목적 폴리펩타이드의 생산 증진 방법. - 제9항에 있어서, 상기 PDK 유전자를 불활성화시키는 단계는 다음 중 하나 이상을 포함하는 것인, 목적 폴리펩타이드의 생산 증진 방법:
PDK1 유전자 내의 연속하는 1 내지 100 bp의 염기의 결실 또는 다른 염기로 치환,
PDK2 유전자 내의 연속하는 1 내지 100 bp의 염기의 결실 또는 다른 염기로 치환, 및
PDK3 유전자 내에 1 내지 100개의 염기 삽입. - 제9항에 있어서, 상기 PDK 유전자를 불활성화시키는 단계는 다음 중 하나 이상을 포함하는 것인, 목적 폴리펩타이드의 생산 증진 방법:
서열번호 109의 235번째부터 241번째까지의 연속하는 염기 서열을 포함하는 총 길이 23 내지 50bp의 염기 서열 중의 1 내지 20개의 염기의 결실 또는 다른 염기로 치환,
서열번호 111의 172번째부터 194번째까지의 연속하는 염기 서열을 포함하는 총 길이 23 내지 50bp의 염기 서열 중의 1 내지 20개의 염기의 결실 또는 다른 염기로 치환, 및
서열번호 113의 38번째부터 60번째까지의 연속하는 염기 서열을 포함하는 총 길이 23 내지 50bp의 염기 서열 내에 1 내지 20개의 염기의 삽입. - 제7항에 있어서, 상기 목적 폴리펩타이드는 항 c-Met 항체인, 목적 폴리펩타이드 생산용 조성물.
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