KR20160086217A

KR20160086217A - Glud 과발현에 의한 재조합 폴리펩타이드의 생산 증대

Info

Publication number: KR20160086217A
Application number: KR1020150003671A
Authority: KR
Inventors: 박은영; 김경은; 성희경; 김선규; 서혜영
Original assignee: 삼성바이오에피스 주식회사
Priority date: 2015-01-09
Filing date: 2015-01-09
Publication date: 2016-07-19

Abstract

글루타메이트 탈수소효소 (glutamate dehydrogenase; GLUD) 유전자의 과발현이 유도된 재조합 세포, 상기 재조합 세포 및/또는 GLUD 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 목적 폴리펩타이드 생산용 조성물, 및 상기 재조합 세포를 이용하여 목적 폴리펩타이드의 생산 방법이 제공된다.

Description

GLUD 과발현에 의한 재조합 폴리펩타이드의 생산 증대{Enhanced Production of a Recombinant Polypeptide by Overexpression of GLUD}

글루타메이트 탈수소효소 (glutamate dehydrogenase; GLUD) 유전자의 과발현이 유도된 재조합 세포, 상기 재조합 세포 및/또는 GLUD 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 목적 폴리펩타이드 생산용 조성물, 및 상기 재조합 세포를 이용하는 목적 폴리펩타이드의 생산 방법이 제공된다.

항체와 같은 단백질 제품 개발에 있어서, 경제적 생산을 위한 생산 공정 개발이 중요하다. 생산 공정 개발로서 host system 및 세포주 개발, 세포배양공정 개발, 분리정제공정 개발 등을 들 수 있다.

항체의 경우, 현재 허가를 거쳐 시판되고 있는 모든 항체 제품은 동물세포를 host로 이용하여 생산된다. 상기 동물 세포는 안전성이 검증되고 항체 활성에 중요한 glycosylation이 정상적으로 이루어진다는 장점으로 인해, 항체 생산을 위한 가장 적합한 system으로 인정받고 있다. 그러나 동물세포는 성장속도가 느리고 생산성이 낮은 단점이 있다. 치료용 항체의 수요를 충족시키기 위한 방법 중의 하나로, 형질 전환을 이용한 연구가 진행되고 있으며, 이와 같은 전략은 낮은 생산성을 보완 할 수 있다고 평가된다.

항체와 같은 단백질의 의학적 및 경제적 중요성이 증가하면서, 이를 경제적이며 안정적으로 생산하기 위한 생산 공정 개발의 중요성 또한 증가하고 있다.

일 예는 글루타메이트 탈수소효소 (glutamate dehydrogenase; GLUD) 유전자의 과발현이 유도된 재조합 세포를 제공한다.

다른 예는 과발현이 유도된 GLUD 유전자 및 목적 폴리펩타이드의 유전자를 포함하는 재조합 세포 (또는 GLUD 유전자의 과발현이 도입되고 목적 폴리펩타이드 유전자가 도입된 재조합 세포)를 제공한다. 이 때 상기 과발현이 유도된 GLUD 유전자와 목적 폴리펩타이드는 숙주세포에 하나의 벡터를 통하여 동시에 도입되거나, 각각 별개의 벡터를 통하여 개별적으로 도입될 수 있다. 또한, 상기 목적 폴리펩타이드 유전자의 도입 시기는 제한이 없으며, 예컨대, 상기 목적 폴리펩타이드 유전자는 GLUD 유전자의 과발현 유도 또는 과발현이 유도된 GLUD 유전자 도입 전, 후, 또는 동시에 도입될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예에서, 상기 과발현이 유도된 GLUD 유전자 및 목적 폴리펩타이드의 유전자를 포함하는 재조합 세포(또는 GLUD 유전자의 과발현이 도입되고 목적 폴리펩타이드 유전자가 도입된 재조합 세포)는 앞서 설명한 GLUD 유전자의 과발현이 유도된 재조합 세포에 목적 폴리펩타이드의 유전자를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 재조합 세포는 상기 목적 폴리펩타이드의 생산을 위한 재조합 세포일 수 있다.

다른 예는 상기 재조합 세포, GLUD 유전자를 포함하는 재조합 벡터 또는 이들의 조합을 포함하는 목적 폴리펩타이드 생산용 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 재조합 세포, GLUD 유전자를 포함하는 재조합 벡터 또는 이들의 조합을 이용하여 목적 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 제공한다.

또 다른 예는 세포에서 GLUD 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 상기 세포에서의 목적 폴리펩타이드의 생산 증진 방법을 제공한다.

본 발명에서는 글루타메이트 탈수소효소 (glutamate dehydrogenase; GLUD)를 과발현시킴으로써 세포 내 단백질 생산량을 증가시킬 수 있음을 제안한다.

이에, 본 발명의 일 예는 글루타메이트 탈수소효소 (glutamate dehydrogenase; GLUD) 유전자의 과발현이 유도된 재조합 세포를 제공한다.

다른 예는 과발현이 유도된 GLUD 유전자 및 목적 폴리펩타이드의 유전자를 포함하는 재조합 세포 (또는 GLUD 유전자의 과발현이 도입되고 목적 폴리펩타이드 유전자가 도입된 재조합 세포)를 제공한다. 이 때 상기 과발현이 유도된 GLUD 유전자와 목적 폴리펩타이드는 숙주세포에 하나의 벡터를 통하여 동시에 도입되거나, 각각 별개의 벡터를 통하여 개별적으로 도입될 수 있다. 또한, 상기 목적 폴리펩타이드 유전자의 도입 시기는 제한이 없으며, 예컨대, 상기 목적 폴리펩타이드 유전자는 GLUD 유전자의 과발현 유도 또는 과발현이 유도된 GLUD 유전자의 도입 전, 후, 또는 동시에 도입될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예에서, 상기 과발현이 유도된 GLUD 유전자 및 목적 폴리펩타이드의 유전자를 포함하는 재조합 세포 (또는 GLUD 유전자의 과발현이 도입되고 목적 폴리펩타이드 유전자가 도입된 재조합 세포)는 앞서 설명한 GLUD 유전자의 과발현이 유도된 재조합 세포에 목적 폴리펩타이드의 유전자를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 재조합 세포는 상기 목적 폴리펩타이드의 생산을 위한 재조합 세포일 수 있다.

다른 예는 상기 재조합 세포, GLUD 유전자 재조합 벡터 또는 이들의 조합을 포함하는 목적 폴리펩타이드 생산용 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 재조합 세포, GLUD 유전자 재조합 벡터 또는 이들의 조합을 이용하여 목적 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 제공한다.

글루타메이트 탈수소효소 (glutamate dehydrogenase; GLUD; EC 1.4.1.3)는 글루타메이트를 알파-케토글루타레이트로 변환시키는 효소로서, 대부분의 원핵 세포와 진핵 생물의 미토콘드리아에 존재한다. GLUD에 GLUD1, GLUD2 등이 포함된다. 상기 GLUD 단백질, 예컨대, GLUD1, GLUD2 등은 모든 원핵세포 또는 진핵생물, 예컨대, 효모 또는 동물 (e.g., 척추동물 (e.g., 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유류 등))로부터 유래한 것일 수 있다.

예컨대, 상기 GLUD1은 인간, 원숭이, 침팬지 등의 영장목, 소, 돼지, 양 등의 우제목(Artiodactyla), 마우스, 래트 등의 설치목 등을 포함하는 포유류, 개구리 등의 양서류 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로부터 유래한(분리된) 것 및 이들의 아미노산 서열과 65% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 것(천연 또는 합성 단백질)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 GLUD2는 인간, 원숭이, 침팬지 등의 영장목, 마우스, 래트 등의 설치목 등을 포함하는 포유류 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로부터 유래한(분리된) 것 및 이들의 아미노산 서열과 65% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 것(천연 또는 합성 단백질)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

GLUD1 단백질 및 유전자 예시

Species	단백질 Accession No.	유전자 (mRNA) Accession No.
[Homo sapiens]	NP_005262.1	NM_005271.3
[Mus musculus]	NP_032159.1	NM_008133.4
[Bos taurus]	NP_872593.1	NM_182652.1
[Sus scrofa]	NP_001231430.1	NM_001244501.1
[Rattus norvegicus]	NP_036702.1	NM_012570.2
[Ovis aries]	NP_001265496.1	NM_001278567.1
[Pan troglodytes]	NP_001009004.1	NM_001009004.1
[Xenopus laevis]	NP_001087023.1	NM_001093554.1
[Xenopus (Silurana) tropicalis]	NP_001011138.1	NM_001011138.1

GLUD2 단백질 및 유전자 예시

Species	단백질 Accession No.	유전자 (mRNA) Accession No.
[Homo sapiens]	NP_036216.2	NM_012084.3
[Pan troglodytes]	NP_001009004.1	NM_001009004.1

일 구체예에서, 상기 GLUD 단백질은 GLUD1일 수 있다.

본 발명에서는 GLUD를 과발현시킴으로써 세포 내 단백질 생산량을 증가시킬 수 있음을 제안한다. 상기 GLUD 유전자의 과발현은 숙주 세포 게놈 유전자에 외래 GLUD 유전자를 추가로 삽입하거나, 외래 GLUD 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 숙주 세포에 도입시킴으로써 수행되는 것일 수 있다. 상기 재조합 벡터 또는 숙주 세포에 도입되는 외래 GLUD 유전자는 숙주 세포와 동일한 종 또는 상이한 종에서 유래하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 GLUD 유전자는 GLUD를 암호화하는 전장 DNA, cDNA, 또는 mRNA를 의미하는 것일 수 있다. 구체적인 GLUD 유전자(전장 DNA, cDNA, 또는 mRNA)는 앞서 설명한 GLUD1 또는 GLUD2의 등재 번호를 참조하여 정의될 수 있으며, 본 발명에서 사용 가능한 GLUD 유전자는 상기한 GLUD1 또는 GLUD2의 유전자 (mRNA), 상기 유전자의 CDS (coding sequence) 영역, 및 이들 GLUD 유전자의 염기 서열과 65% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 것(합성 또는 천연 유전자)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 명세서에서, "GLUD 유전자의 과발현"은 형질전환이 일어나지 않은 야생형 세포에서의 GLUD 유전자 발현과 비교하여 발현량이 많은 것 (예컨대, 단백질 또는 mRNA 중량 또는 통상적 표지의 신호 강도 기준으로, 1.2배 이상, 1.5배 이상, 1.7배 이상, 2배 이상, 2.2배 이상, 2.5배 이상, 2.7배 이상 또는 3배 이상)을 의미할 수 있다.

상기 GLUD 유전자의 과발현의 유도는 a) 숙주 세포 게놈 내의 GLUD 유전자(내재 유전자)의 복제수의 증가, b) 숙주 세포 게놈 유전자에 외래 GLUD 유전자의 추가 도입(삽입)에 의한 전사체의 수의 증가, c) 숙주 세포 게놈의 GLUD 유전자와 작동 가능하게 연결된 발현 시스템에 상기 숙주세포에서 작동 가능한 (예컨대, 발현 효율이 높은) 프로모터(strong promoter) 및/또는 인핸서 (enhancer) 등의 도입에 의한 상기 발현 시스템에 작동 가능하게 연결된 GLUD 유전자의 발현 효율의 증가 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 수행될 수 있다.

일 예에서, 상기 GLUD 유전자의 과발현은 i) 외래 GLUD 유전자 또는 외래 GLUD 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 추가로 포함하거나, ii) 숙주 세포에서 작동 가능한 (예컨대, 발현 효율이 높은) 프로모터 및/또는 인핸서를 GLUD 유전자 (숙주 세포의 내재 유전자 또는 추가 도입된 외래 유전자)와 작동 가능하도록 추가로 포함하거나, iii) i)과 ii)를 모두 포함함으로써 유도되는 것일 수 있다.

또한, 상기 과발현이 유도된 GLUD 유전자는 상기한 바와 같은 과발현 유도에 의하여 야생형 세포에 비하여 숙주세포 또는 재조합 세포 내에서 과발현 가능한 상태가 된 GLUD 유전자를 의미할 수 있다.

상기 숙주 세포에 도입되는 외래의 GLUD 유전자는 숙주 세포와 동일한 종 또는 상이한 종에서 유래하는 것일 수 있다.

상기 외래의 GLUD 유전자의 도입은 통상적인 모든 유전자 도입 방법에 의할 수 있으며, 예컨대, 외래의 GLUD 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 숙주 세포에 도입시킴으로써 수행되는 것일 수 있다. 상기 GLUD 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 통상의 발현 시스템 내에 GLUD 유전자를 포함하는 것이거나, GLUD 유전자 발현을 보다 증가시키기 위하여, 숙주 세포에서의 발현 효율이 높은 프로모터 및/또는 인핸서를 포함하고, 여기에 작동 가능하게 연결된 GLUD 유전자를 포함하는 것일 수 있다.

또한, 상기 재조합 세포는 GLUD 유전자 이외에 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드의 유전자를 추가로 포함하여 상기 목적 폴리펩타이드를 생산하기 위한 세포로 사용될 수 있다. 이 때, 상기 목적 폴리펩타이드의 유전자는 숙주 세포 게놈에 존재하는 유전자이거나, 별도의 재조합 벡터를 통하여 도입된 외래 유전자일 수 있다. 상기 목적 폴리펩타이드의 유전자가 외래 유전자인 경우 숙주세포와 동종 또는 이종 유래의 것일 수 있다. 상기 목적 폴리펩타이드의 유전자가 외래 유전자인 경우, 상기 외래 GLUD 유전자와 목적 폴리펩타이드의 유전자는 하나의 재조합 벡터에 포함되어 함께 도입되거나, 각각 별개의 재조합 벡터를 통하여 동시 또는 순서에 상관없이 순차적으로 숙주 세포에 도입될 수 있다.

상기 목적 폴리펩타이드의 유전자가 GLUD 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 포함되어 도입되는 경우, 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서의 GLUD 유전자 copy수를 증가시켜 숙주 세포에서의 GLUD 과발현을 유도하여, 함께 포함된 목적 폴리펩타이드의 생산을 증진시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 예는 목적 폴리펩타이드의 유전자 및 GLUD 유전자를 포함하는, 목적 폴리펩타이드의 발현을 위한 발현 벡터를 제공한다.

상기 재조합 벡터에 있어서, GLUD 유전자 및/또는 목적 폴리펩타이드 유전자는 프로모터, 전사 종결 서열 등의 통상적인 유전자 발현 조절 서열과 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 유전자 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 유전자 발현 조절 서열은 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다. 상기 재조합 벡터에 있어서, 유전자 발현 조절 인자가 상기 GLUD 유전자 및/또는 목적 폴리펩타이드의 유전자 (목적 유전자)에 작동 가능하게 연결되기 위해서, 상기 유전자 발현 조절 서열은 상기 GLUD 유전자 및/또는 목적 폴리펩타이드의 유전자의 5' 말단 쪽에 연결된 것일 수 있다.

하기 기재되는 프로모터는 재조합 벡터에 포함된 프로모터뿐 아니라 상기 기재된 숙주세포에서 작동 가능한 (예컨대, 숙주 세포에서 발현 효율이 높은) 프로모터)에도 적용 가능하다.

상기 프로모터는 특정 유전자의 전사 개시를 조절하는 전사 조절 서열 중 하나로, 통상적으로 약 100 내지 약 1000 bp 또는 약 100 내지 약 2000 bp 길이의 폴리뉴클레오타이드 단편이다. 일 구체예에서, 상기 프로모터는 세포, 예컨대, 바이러스 세포, 박테리아 세포, 진핵 세포 (예컨대, 곤충 세포, 식물 세포, 또는 동물 세포)에서 전사 개시를 조절할 수 있으면, 제한 없이 사용 가능하다. 예컨대, 상기 프로모터는 CMV 프로모터 (cytomegalovirus promoter; 예컨대, CMV immediate-early 프로모터), SV40 프로모터, 아데노바이러스 프로모터(major late promoter), pL^λ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터(metallothionin promoter), 베타-액틴 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, 마우스 유방암 바이러스 프로모터(mouse mammary tumor virus promoter), 마우스 백혈병 바이러스 긴 말단반복(murine leukemia virus (MuLV) long terminal repeat (LTR)), 로우스 육종 바이러스 프로모터 (Rous sarcoma virus (rsv) promoter), 알파-태아단백질 프로모터(a-fetoprotein promoter), 감마-글로빈/베타-글로빈 프로모터(g-globin/b-globin promoter), 베타-인터페론 프로모터(b-interferon promoter) 등의 원핵 세포 프로모터, 포유류 바이러스 프로모터, 및/또는 동물 세포 프로모터 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 예에서, 상기 프로모터는 인간 CMV immediate-early 프로모터, 마우스 CMV immediate-early 프로모터, 인간 유비퀴틴 C 프로모터, 상기 프로모터의 단편 (프로모터의 기능을 유지하는 일부 영역), 또는 이들 프로모터 중 어느 하나와 인트론 (예컨대, 인트론 A, 면역글로불린 인트론, 키메라 인트론 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상)이 융합된 융합 프로모터일 수 있다.

상기 융합 프로모터에 있어서, 상기 인간 CMV immediate-early 프로모터는 서열번호 111 (GenBank Accession No. X03922.1; 1848bp)의 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 112 내지 119의 뉴클레오타이드 서열, 또는 상기 뉴클레오타이드 서열 내의 연속하는 100개 이상, 200개 이상, 300개 이상 또는 400개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있다:

마우스 CMV immediate-early 프로모터는 서열번호 120의 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 뉴클레오타이드 서열 내의 연속하는 100개 이상, 200개 이상, 300개 이상, 또는 400개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있다.

상기 인간 유비퀴틴 C 프로모터는 서열번호 121의 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 뉴클레오타이드 서열 내의 연속하는 100개 이상, 200개 이상, 300개 이상, 400개 이상 또는 500개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있다.

상기 인트론은 면역글로불린 인트론, 키메라 인트론 (서열번호 122), 인트론 A (서열번호 123) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 면역 글로불린 인트론은 IGLV 인트론 (예컨대, Accession No. X59707의 71~185 부위; 115 bP; 서열번호 124), IGKV 인트론 (예컨대, Accession No. X12688의 269~474 부위; 206 bp; 서열번호 125), 및 IGH 인트론 (예컨대, Accession No. M29811의 197~278 부위; 82 bp; 서열번호 126)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 모든 수단을 의미한다. 상기 벡터는 목적 유전자 발현을 위한 요소 (elements)를 포함하는 것으로, 복제원점 (replication origin), 프로모터, 작동 유전자 (operator), 전사 종결 서열 (terminator) 등을 포함할 수 있고, 숙주 세포의 게놈 내로의 도입을 위한 적절한 효소 부위 (예컨대, 제한 효소 부위) 및/또는 숙주 세포 내로의 성공적인 도입을 확인하기 위한 선별 마커 및/또는 단백질로의 번역을 위한 리보좀 결합 부위 (ribosome binding site; RBS) 등을 추가로 포함할 수 있다 (도 1 참조). 상기 재조합 벡터는 프로모터 이외의 전사 조절 서열을 추가로 포함할 수 있다.

상기 전사 종결 서열은 폴리아데닐화 서열(pA) 등일 수 있고, 상기 복제 원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, BBV 복제원점 등일 수 있다.

또한, 상기 재조합 벡터는 선별 마커를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 재조합 벡터가 숙주 세포 내에 성공적으로 도입되었는지 여부를 확인하거나, 안정적인 세포주 구축을 위한 유전자로서, 예컨대 항생제와 같은 약물 저항 유전자, 대사 관련 유전자, 유전자 증폭 유전자 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 선별 마커는 본 발명의 핵심적 기술인 벡터의 최적의 조합에 따른 발현 효율에 크게 영향을 미치는 요소가 아니므로, 선별 마커로서 일반적으로 사용되는 모든 유전자 (예컨대, 항생제 저항 유전자 및/또는 대사 관련 효소 유전자 등)를 제한 없이 사용할 수 있다. 예컨대, 상기 선별 마커는 암피실린(ampicilin) 저항 유전자, 테트라사이클린(tetracyclin) 저항 유전자, 카나마이신(kanamycin) 저항 유전자, 클로람페니콜(chloroamphenicol) 저항 유전자, 스트렙토마이신 (streptomycin) 저항 유전자, 네오마이신(neomycin) 저항 유전자, 블라스티시딘(Blasticidin) 저항 유전자, 제오신(Zeocin) 저항 유전자, 하이그로마이신(Hygromycin) 저항 유전자, 퓨로마이신 (Puromycin) 저항 유전자, 티미딘 키나아제 (TK) 유전자, 디하이드로폴레이트 환원효소 (Dihydrofolate reductase, DHFR) 유전자, 글루타민 합성효소 (Glutamine synthetase, GS) 유전자 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예컨대, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pcDNA 시리즈, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1, M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 기본으로 하여 제작될 수 있다

또한, GLUD 유전자의 발현을 증진시키기 위하여, 상기 재조합 세포 또는 재조합 벡터는 인핸서(enhancer)를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 인핸서는 유전자의 전사를 활성화시키는 단백질 (예컨대, 전사조절인자)과 결합 가능한 약 50 내지 150bp 정도의 DNA 단편으로, 일반적으로 cis-작용성이다. 예컨대, 상기 인핸서는 CMV 인핸서 (예컨대, cytomegalovirus early enhancer element), SV40 인핸서, hTERT (human telomerase reverse transcriptase) 인핸서 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 재조합 세포는 GLUD 유전자를 및/또는 목적 폴리펩타이드 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 숙주 세포 내로 도입된 것을 의미할 수 있다. 이 때, GLUD 유전자와 목적 폴리펩타이드 유전자는 하나의 재조합 벡터에 포함되거나 별개의 벡터에 포함되어 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.

상기 숙주 세포로는 재조합 벡터에 포함된 프로모터가 작동 가능하고(즉, 전사 개시 기능을 나타낼 수 있고), GLUD 유전자의 염색체 내 통합 (삽입) 및/또는 목적 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 모든 종류의 원핵 또는 진핵 동물 (예컨대, 곤충, 포유류 등) 세포가 사용될 수 있다. 예컨대, 본 발명을 위해 적합한 숙주 세포는 대장균 (E. coli), 마우스 세포 (예컨대, COP, L, C127, Sp2/0, NS-0, NS-1, At20, NIH3T3 등), 래트 세포 (PC12, PC12h, GH3, MtT 등), 햄스터 세포 (예컨대, BHK, CHO, GS 유전자 결함 CHO, DHFR 유전자 결함 CHO 등), 원숭이 세포 (예컨대, COS1, COS3, COS7, CV1, Vero 등), 인간 세포 (예컨대, Hela, HEK-293, HEK-293유래 생산세포, 망막-유래 PER-C6, 이배체 섬유모세포로부터 유래된 세포, 골수종 세포, HepG2 등), 곤충세포 (예컨대, Sf9 세포, Sf21 세포, Tn-368 세포, BTI-TN-5B1-4 세포 등), 하이브리도마 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으니, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 숙주 세포는 생체에서 분리된 것일 수 있다.

상기 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예컨대, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, 유전자 밤바드먼트 (gene bombardment) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 발현 벡터가 도입된 재조합 세포(형질전환체)를 선별하는 방법은 통상적인 선별 마커를 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예컨대, 상기 선별 마커가 앞서 설명한 바와 같은 특정 항생제 저항 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 상기 세포를 배양함으로써 재조합 벡터가 도입된 재조합 세포를 용이하게 선별할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 GLUD 유전자의 과발현이 유도된 재조합 세포는 GSKO-GLUD1 (수탁번호 KCLRF-BP-00329) 세포일 수 있다.

다른 예에서, 상기 GLUD 유전자의 과발현이 도입(유도)된 재조합 세포 및/또는 GLUD 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 목적 폴리펩타이드 생산 증진 용도가 제공된다. 구체적으로, GLUD 유전자의 과발현이 도입(유도)된 재조합 세포, GLUD 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 또는 이들의 조합을 포함하는 목적 폴리펩타이드 생산용 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 목적 폴리펩타이드를 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 GLUD 유전자의 과발현이 유도된 재조합 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는 목적 폴리펩타이드의 생산 방법을 제공한다. 상기 발현시키는 단계는 생체 외(ex vivo)에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 발현시키는 단계는 상기 재조합 세포를 상기 목적 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 조건 및 세포 배양 배지 내에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 생산 방법은 상기 배양하는 단계 이후에, 상기 배양물로부터 상기 목적 폴리펩타이드를 수득(분리)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 폴리펩타이드의 수득(분리) 단계는 상기 재조합 세포의 파쇄물 및/또는 상기 배양 배지(폴리펩타이드가 배지로 분비되는 경우)로부터 폴리펩타이드를 분리하는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 상기 생산 방법은 수득된 폴리펩타이드가 목적하는 품질 및/또는 순도를 갖도록 하기 위한 추가의 처리 단계, 예컨대, 정제 및/또는 변형 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일 예에서, 상기 목적 폴리펩타이드의 생산 방법은, 상기 발현시키는 단계 또는 배양하는 단계 이전에, GLUD 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 목적 폴리펩타이드의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 숙주 세포에 도입시키거나, 또는 GLUD 유전자 및 목적 폴리펩타이드의 유전자를 함께 포함하는 재조합 벡터를 숙주 세포에 도입시켜 재조합 세포를 제작하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. GLUD 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 목적 폴리펩타이드의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 도입하는 경우, 상기 GLUD 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 목적 폴리펩타이드의 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내 도입은 동시 또는 순서에 무관하게 순차적으로 진행될 수 있다.

상기 목적 폴리펩타이드가 질병 또는 병적 증상의 예방, 치료 및/또는 경감과 관련된 기능을 갖는 것(예컨대, 항체, 치료용 단백질 등)인 경우, 본 발명의 다른 예는 상기 목적 폴리펩타이드 유전자의 발현 벡터, 상기 목적 폴리펩타이드 유전자를 포함하는 재조합 세포 및 상기 재조합 세포의 배양물 (세포 포함 또는 무세포)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 사용된 용어 "목적 폴리펩타이드"는 숙주 세포에서 발현(생산)시키고자 하는 폴리펩타이드를 의미하는 것으로, 이 때 폴리펩타이드는 펩타이드 결합(들)에 의해 함께 연결된 아미노산의 중합체를 포함하는 분자를 의미한다. 폴리펩타이드는 2개 이상의 아미노산을 포함하는 모든 펩타이드 또는 단백질일 수 있다. 상기 목적 폴리펩타이드의 유전자는 숙주 세포 이외의 동종 또는 이종 세포에서 유래하는 외래 유전자일 수 있다.

본 발명에서의 "목적 폴리펩타이드"는 생체에서 목적하는 활성 (예컨대 특정 질병 또는 증상의 예방, 경감, 및/또는 치료 활성 또는 생체 필요 물질을 대체하는 활성)을 갖는 단백질 및/또는 펩타이드일 수 있으며, 예컨대, 효소 활성의 단백질 또는 펩타이드 (예컨대, 프로테아제, 키나제, 포스파타제 등), 수용체 단백질 또는 펩타이드, 수송체 단백질 또는 펩타이드, 살균 및/또는 내독소-결합 폴리펩타이드, 구조 단백질 또는 펩타이드, 면역 폴리펩타이드, 독소, 항생제, 호르몬, 성장 인자, 백신 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예에서, 상기 목적 폴리펩타이드는 호르몬, 사이토카인, 조직 플라스미노겐 활성인자, 면역글로불린 (예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 변이체) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 면역글로불린은 임의의 이소타입 (예컨대, IgA, IgD, IgG, IgM 또는 IgE)의 것일 수 있으며, 예컨대, IgG (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4) 분자일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 본래 항체의 항원 결합 능력을 보유하는 단편으로, 약 20개 이상의 아미노산, 예컨대, 약 100개 이상의 아미노산을 포함하는 항체의 임의의 단편일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 항체의 항원 결합 부위, 예컨대, CDS, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)2 단편, Fv, scFv, (scFv)2, scFvFc, 다수의 결합 도메인을 포함하는 멀티바디 (multibody) (예컨대, 디아바디 (diabody), 트리아바디 (triabody), 테트라바디 (tetrabody) 등), 단일 도메인 항체, 애피바디 (affibody) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이 상일 수 있다. 상기 항체 변이체는 항체와 동일한 결합 기능을 갖지만 본래 항체와 변경된 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편의 유도체이다. 상기 항체 및/또는 항원 결합 단편은 예컨대, 마우스 항체, 인간 항체, 키메라 (chimera) 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체일 수 있다. 상기 항체는 합성적 또는 재조합적으로 생산되는 것일 수 있다. 상기 항체는 단클론 항체일 수 있다. 상기 항체의 중쇄 (또는 중쇄가변부위)와 경쇄 (또는 경쇄가변부위)는 하나의 벡터를 통하여 함께 또는 각각 별개의 벡터를 통하여 각각 독립적으로 재조합 세포 내에 도입될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 목적 폴리펩타이드는 인슐린, 사람 성장 호르몬(hGH), 인슐린-유사 성장 인자, EGF, VERF 등의 각종 성장 인자, 각종 수용체, 조직 플라스미노겐 활성인자(tPA), 에리트로포이에틴(EPO), 사이토카인 (예컨대, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18과 같은 인터루킨), 인터페론(IFN)-알파, -베타, -감마, -오메가 또는 -타우, TNF-알파, 베타 또는 감마와 같은 종양 괴사 인자(TNF), TRAIL, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구체예에서, 상기 목적 폴리펩타이드는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.

상기 항 c-Met 항체는 c-Met의 특정 부위, 예컨대 SEMA 도메인 내의 특정 부위를 에피토프로 인식하는 것일 수 있으며, c-Met에 작용하여 세포내이동(internalization) 및 분해(degradation)를 유도하는 모든 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다.

HGF(Hepatocyte growth factor)의 수용체인 c-Met은 세포외 부위, 막투과 부위, 세포내 부위의 세 부분으로 구분되며, 세포외 부위의 경우, 이황화 결합에 의해 α-소단위체와 β-소단위체가 연결된 형태로 HGF 결합 도메인인 SEMA 도메인, PSI 도메인(plexin-semaphorins-integrin homology domain) 및 IPT 도메인(immunoglobulin-like fold shared by plexins and transcriptional factors domain)으로 이루어진다. c-Met 단백질의 SEMA 도메인은 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, c-Met의 세포외 부위에 존재하는 도메인으로서, HGF가 결합하는 부위에 해당한다. SEMA 도메인 중에서 특정 부위, 예컨대, 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 영역은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프 중 2번과 3번 프로펠러 도메인 사이의 루프(loop) 부위에 해당하며, 본 발명에서 제안되는 항 c-Met 항체의 에피토프로 작용할 수 있다.

용어, "에피토프(epitope)"는 항원 결정 부위(antigenic determinant)로서, 항체에 의해 인지되는 항원의 일부분을 의미하는 것으로 해석된다. 일 구체예에 따르면, 상기 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 연속하는 5개 이상의 아미노산을 포함하는 부위, 예컨대, c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71 내에 위치하는 연속하는 5개 내지 19개의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 에피토프는 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하여 연속하는 5 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다.

상기 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 2번과 3번 프로펠러 구조의 도메인 사이의 루프 부위 중 가장 바깥으로 위치한 부위에 해당하며, 상기 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 일 구체예에 따른 항체 또는 항원 결합 단편이 가장 특이적으로 결합하는 부위이다.

따라서, 항 c-Met 항체는 서열번호 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하는 연속하는 5 내지 19개의 아미노산을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72, 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는,

서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR), 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;

서열번호 7의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 15의 아미노산 서열, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;

상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는

상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합

을 포함하고,

상기 서열번호 4 내지 서열번호 9는 각각 하기 일반식 Ⅰ 내지 일반식 Ⅵ으로 표시되는 아미노산 서열인 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다:

일반식 Ⅰ

Xaa₁-Xaa₂-Tyr-Tyr-Met-Ser (서열번호 4),

일반식 Ⅱ

Arg-Asn-Xaa₃-Xaa₄-Asn-Gly-Xaa₅-Thr (서열번호 5),

일반식 Ⅲ

Asp-Asn-Trp-Leu-Xaa₆-Tyr (서열번호 6),

일반식 Ⅳ

Lys-Ser-Ser-Xaa₇-Ser-Leu-Leu-Ala-Xaa₈-Gly-Asn-Xaa₉-Xaa₁₀-Asn-Tyr-Leu-Ala (서열번호 7)

일반식 Ⅴ

Trp-Xaa₁₁-Ser-Xaa₁₂-Arg-Val-Xaa₁₃ (서열번호 8)

일반식 Ⅵ

Xaa₁₄-Gln-Ser-Tyr-Ser-Xaa₁₅-Pro-Xaa₁₆-Thr (서열번호 9)

상기 일반식 Ⅰ에서, Xaa₁은 존재하지 않거나 Pro 또는 Ser이고, Xaa₂는 Glu 또는 Asp이며,

상기 일반식 Ⅱ에서, Xaa₃은 Asn 또는 Lys이며, Xaa₄는 Ala 또는 Val이고, Xaa₅는 Asn 또는 Thr이며,

상기 일반식 Ⅲ에서, Xaa₆은 Ser 또는 Thr이고,

상기 일반식 Ⅳ에서, Xaa₇은 His, Arg, Gln 또는 Lys이고, Xaa₈은 Ser 또는 Trp이고, Xaa₉은 His 또는 Gln이며, Xaa₁₀는 Lys 또는 Asn이고,

상기 일반식 Ⅴ에서, Xaa₁₁은 Ala 또는 Gly이며, Xaa₁₂은 Thr 또는 Lys이고, Xaa₁₃는 Ser 또는 Pro이며,

상기 일반식 Ⅵ에서, Xaa₁₄은 Gly, Ala 또는 Gln이고, Xaa₁₅는 Arg, His, Ser, Ala, Gly 또는 Lys이며, Xaa₁₆는 Leu, Tyr, Phe 또는 Met이다.

일 구체예에서, 상기 CDR-H1은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-H2는 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-H3는 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 CDR-L1은 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-L2는 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-L3은 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은

서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H3)를 포함하는 중쇄 가변 영역;

서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는

상기 중쇄 가변 영역과 상기 경쇄 가변 영역의 조합

을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 17, 서열번호 74, 서열번호 87, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 또는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 상기 중쇄 가변 영역, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 75, 서열번호 88, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99 또는 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 상기 경쇄 가변 영역, 또는 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 항 c-Met 항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00220인 하이브리도마 세포에서 생산되는, c-Met 단백질의 세포외 부위(extracellular region)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체일 수 있다 (대한민국 공개특허 제2011-0047698호 참조; 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함됨).

상기의 항 c-Met 항체는 대한민국 공개특허 제2011-0047698호에 정의된 항체를 모두 포함할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는,

서열번호 62의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 64의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 66의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 및 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및

서열번호 68의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 70의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 및 서열번호 108의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄

를 포함하는 것일 수 있다.

예컨대, 상기 항-c-Met 항체는,

서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체

서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 및

서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체

로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항 c-Met 항체는 서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체일 수 있다.

한편, 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드는 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄이며, 서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드는 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에서 36번 (kabat numbering에 따름, 서열번호 68 내의 62번째 아미노산 위치) 히스티딘 (histidine)이 티로신 (tyrosine)으로 치환된 형태의 폴리펩타이드다. 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 생산량이 증가될 수 있다. 또한 상기 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드는 상기 서열번호 68의 아미노산 서열 중 1번째부터 20번째까지의 시그널 펩타이드를 제외한 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에서 kabat numbering에 의한 27e 위치(kabat numbering에 따름, 서열번호 108 내 32번째 위치; CDR-L1 내부)의 세린(Ser)이 트립토판(Trp)으로 치환된 것으로, 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 활성(예컨대, c-Met에 대한 결합친화도, c-Met 분해 활성 및 Akt 인산화 억제 활성 등)이 보다 증진될 수 있다.

상기 항 c-Met 항체 또는 항 EGFR 항체의 앞서 정의된 CDR 부위 또는 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역을 제외한 부분, 예컨대 경쇄 불변 영역과 중쇄 불변 영역은 모든 서브타입의 면역글로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, 등)에서 유래한 것일 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예컨대, scFv, (scFv)₂, scFv-Fc, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 본 발명에서의 항체의 항원 결합 단편은 상기한 상보성 결정 영역을 하나 이상 포함하는 항체 단편, 예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 목적 폴리펩타이드가 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 경우, 이를 암호화하는 목적 유전자는 상기 항 c-Met 항체의 앞서 설명한 중쇄 CDR 또는 경쇄 CDR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 앞서 설명한 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 앞서 설명한 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 목적 유전자는 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 63, 서열번호 65, 서열번호 67, 서열번호 69, 서열번호 76, 및 서열번호 77로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명은 GLUD의 과발현이 유도된 재조합 세포를 제공함으로써, 항체를 비롯한 다양한 치료용 단백질의 대량 생산에 유용하게 적용될 수 있다.

도 1은 재조합 벡터를 모식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 GLUD1 유전자의 도입을 위한 GLUD1 발현 벡터의 개열 지도이다.
도 3은 항 c-Met 항체 유전자의 도입을 위한 발현 벡터의 개열 지도이다.
도 4는 GLUD1 유전자가 도입되지 않은 항체 생산 재조합 세포(GSKO 301 GS로 표시)와 GLUD1 유전자가 도입된 항체 생산 재조합 세포(GSKO GLUD1 301 GS)에서의 GLUD1 발현 정도를 보여주는 사진이다.
도 5는 GLUD1 유전자가 도입되지 않은 항체 생산 재조합 세포(GSKO 301 GS로 표시)와 GLUD1 유전자가 도입된 항체 생산 재조합 세포(GSKO GLUD1 301 GS)의 세포 생존률을 보여주는 그래프이다.
도 6은 GLUD1 유전자가 도입되지 않은 항체 생산 재조합 세포(GSKO 301 GS로 표시)와 GLUD1 유전자가 도입된 항체 생산 재조합 세포(GSKO GLUD1 301 GS)의 생존 세포 밀도를 보여주는 그래프이다.
도 7은 GLUD1 유전자가 도입되지 않은 항체 생산 재조합 세포(GSKO 301 GS로 표시)와 GLUD1 유전자가 도입된 항체 생산 재조합 세포(GSKO GLUD1 301 GS)의 항체 생산량을 보여주는 그래프이다.
도 8은 GLUD1 유전자가 도입되지 않은 항체 생산 재조합 세포(GSKO 301 GS로 표시)와 GLUD1 유전자가 도입된 항체 생산 재조합 세포(GSKO GLUD1 301 GS)의 a-ketoglutarate 축적량을 보여주는 그래프이다.
도 9는 GLUD1 유전자가 도입되지 않은 항체 생산 재조합 세포('-'로 표시)와 GLUD1 유전자가 도입된 항체 생산 재조합 세포('GLUD'로 표시)의 ATP 수준을 보여주는 그래프이다.
도 10은 GLUD1 유전자가 도입된 항체 생산 재조합 세포(GSKO GLUD1 301 GS)에서 생산된 L3-1Y/IgG2 항체의 size exclusion chromatography 결과를 보여주는 그래프이다.
도 11은 GLUD1 유전자가 도입되지 않은 항체 생산 재조합 세포(GSKO 301 GS)에서 생산된 항체 ('12A37'로 표시)와 GLUD1 유전자가 도입된 항체 생산 재조합 세포에서 생산된 항체('GLUD'로 표시)의 SDS-PAGE 결과를 보여준다.
도 12는 GLUD1 유전자가 도입된 항체 생산 재조합 세포에서 생산된 L3-1Y/IgG2 항체의 정제 결과를 보여주는 그래프이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 재조합 세포 제작

실시예 1.1: GLUD1 유전자 과발현이 유도된 재조합 세포 제작

GLUD1 유전자 (human GLUD1 NM_005271.3 (유전자; 서열번호 153, CDS: 서열번호 153중 251부터 1927까지 (1925-1927: stop codon)의 염기서열); NP_005262.1 (단백질: 서열번호 154))를 CHOK1SV GS Knockout (KO) host cell line (Sigma, CHOZN

GS-/- ZFN-modified CHO cell line, #CHOGS, 글루타민 합성(GS) 유전자 넉아웃 시킴; 이하, 'GS-KO 세포')에 도입하여 GLUD1 과발현 CHO 세포를 제작하였다.

GLUD1의 도입을 위한 GLUD1 발현 벡터 pCMV6-XL5-GLUD1는 Origene사에서 구입하였다 (catalog number SC116830; 서열번호 110; 도 2 참조).

상기 준비된 GLUD 발현 벡터 및 Amaxa nucleofector sf kit (catalog# V4XC-2024, Lonza)를 사용하여 GS-KO 세포 5*106 cells에 5ug DNA (GLUD1 유전자)를 세포 내로 전달(transfection) 시켰다. 세포내 전달 후, 10ug/ml puromycin (Life technologies, A11138-02)을 사용하여 GLUD1 발현 벡터가 도입된 세포 (GLUD1 과발현 세포)를 선별하였다. 이와 같이 선별된 세포는 GLUD1가 과발현된 재조합 세포 ('GSKO-GLUD1')이다. 상기 재조합 세포를 2014년 9월 3일자로 대한민국 서울시 종로구 연건동에 소재하는 한국세포주연구재단에 기탁하여, 수탁번호 KCLRF-BP-00329를 부여 받았다.

실시예 1.2: GLUD1 이 과발현되고 항체 유전자가 도입된 재조합 세포 제작

GLUD1의 도입을 위한 GLUD1 발현 벡터 pCMV6-XL5-GLUD1는 Origene사에서 구입하였다 (catalog number SC116830; ORF 서열: 서열번호 110; 도 2 참조).세포주 제작에 사용된 GLDU1 과발현 벡터는 Empty vector (pIRES-PURO3, clonetech,#631619)와 pCMV6-XL5-GLUD1을 EcoRI과 NotI으로 처리한 후 pGLUD1-Puro 재조합를 제작하였다. 목적 폴리펩타이드로서 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2 (중쇄: 서열번호 66; 경쇄: 서열번호 68)의 유전자 (중쇄 유전자: 서열번호 67; 경쇄 유전자: 서열번호 69) 도입을 위한 발현 벡터를 제작하였다 (pCA301GS 벡터-, 도 3 참조; 발현 벡터 염기서열: 서열번호 109).　　

상기 제작된 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2의 발현 벡터(pCA301GS; 서열번호 109; 도 3 참조)를 이용하여 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2를 도입시켰다. 구체적으로, 상기 준비된 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2의 발현 벡터 및 Amaxa nucleofector sf kit (catalog# V4XC-2024, Lonza)를 사용하여 GS-KO 세포 5*10⁶ cells에 5ug DNA (항체 유전자)를 세포 내로 전달(transfection) 시켰다. 세포 내 전달 후, 상기 세포를 EX-CELL CD CHO Fusion media (sigma, 14365C)에 1X GSEM supplement (sigma G9785)를 첨가한 배지에 세포 생존률(viability)이 90% 이상 회복될 때까지 glutamine-negative selection을 진행하여, L3-1Y/IgG2 유전자를 포함하는 재조합 세포('GSKO 301 GS'로 표시)를 선별하였다.

상기 선별된 재조합 세포 에 GLUD1 유전자를 도입하였다. 구체적으로, 상기 준비된 GLUD1 발현 벡터(도 2 참조) 및 Amaxa nucleofector sf kit (catalog# V4XC-2024, Lonza)를 사용하여 항체 생산 재조합 세포 (GSKO 301 GS) 5*10⁶ cells에 5ug DNA (GLUD1 유전자)를 세포 내로 전달(transfection) 시켰다. 세포내 전달 후, 10ug/ml puromycin (Life technologies, A11138-02)을 사용하여 GLUD1 발현 벡터가 도입된 세포 (GLUD1 과발현 세포)를 선별하였다. 이와 같이 선별된 세포는 GLUD1가 과발현되고 L3-1Y/IgG2 유전자를 포함하는 재조합 세포('GSKO GLUD1 301 GS'로 표시)이다. -

아래의 표 3의 primer를 사용하여 GLUD1 과발현을 확인하였다. puromycin으로 선별된 세포에서 QIAGEN RNease mini kit (74104) 를 사용하여 RNA를 추출하였고 Qiagen Omniscript RT Kit (205111)을 사용하여 GLUD1의 발현 을 확인하였다.

프라이머

E70	hGLDU1 For primer	ggtcatcgaaggctaccg(서열번호 127)
E75	hGLUD1 Rev primer	aactctgccgtgggtacaat(서열번호 128)

상기 얻어진 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 보여지는 바와 같이, GLUD1 유전자 도입 없는 항체 생산 재조합 세포(GSKO 301 GS로 표시)와 비교하여, GLUD1 유전자가 도입된 항체 생산 재조합 세포(GSKO GLUD1 301 GS)에서 GLUD1 발현량이 현저히 높음을 알 수 있다.

상기 제작된 재조합 세포에서 인간 GLUD1의 단백질이 발현되는 것을 확인하기 위하여 SRM (Selected reaction monitoring)을 수행하였다. 우선, GLUD1이 과발현된 CHO cell을 harvest 한 후, MKN buffer (1mM Tris.Cl, pH 7.4, 0.13 M NaCl, 5mM KCl, 7.5 mM MgCl₂)을 이용하여 3회 세척하였다. Homogenizer를 통하여 homogenizate를 확보한 후, 2M Sucrose를 이용하여 pellet으로 분리된 미토콘드리아 단백질(mitochondrial proteins)을 확보하였다. 상기 확보된 미토콘드리아 단백질은 농도를 측정한 후, 약 300~500 ug(microgram)의 단백질에 DTT (dithiothreitol) 및 Urea를 사용하여 환원시켰다. 0.2 M Iodoacetamide 20 uL를 사용하여 알킬화시킨 후, 트립신으로 분해(trypsin digestion)시켰다.

상기 trypsin 분해로 얻어진된 펩타이드를 Sep-Pak C18 SPE (solid phase extract) column (Waters, Cat No. 036820)를 통하여 세척하고, vaccum 조건 하에서 건조시킨 후, 정제수로 녹여, SRM(Selected reaction monitoring) 분석에 이용하였다.

UPLC 분석 조건은 Mobile phase A의 경우 10%(v/v) acetonotrile이고 mobile phase B는 0.1%(v/v) formic acid/97:3-water:Acetonitrile로 하였다. 확보된 데이터에서 사람 GLUD1과 CHO GLUD1의 차이를 나타내는 펩타이드가 검출되었고 (아래 표 4 참조), 이를 통하여 사람 GLUD1이 CHO 세포에서 발현되었음을 확인하였다.

High	KGFIGPGIDVPAPDMSTGER(서열번호 129)
High	HGGTIPIVPTAEFQDR(서열번호 130)
High	GFIGPGIDVPAPDMSTGER(서열번호 131)
High	GFIGPGIDVPAPDmSTGER(서열번호 132)
High	DSNYHLLMSVQESLER(서열번호 133)
High	DIVHSGLAYTMER(서열번호 134)
High	DDGSWEVIEGYR(서열번호 135)
High	TFVVQGFGNVGLHSMR(서열번호 136)
High	DSNYHLLmSVQESLER(서열번호 137)
High	IIKPcNHVLSLSFPIR(서열번호 138)
High	IIAEGANGPTTPEADK(서열번호 139)
High	cIAVGESDGSIWNPDGIDPK(서열번호 140)
High	RDDGSWEVIEGYR(서열번호 141)
High	TFVVQGFGNVGLHSmR(서열번호 142)
High	cAVVDVPFGGAK(서열번호 143)
High	DIVHSGLAYTmER(서열번호 144)
High	YSTDVSVDEVK(서열번호 145)
High	ALASLMTYK(서열번호 146)
High	LQHGSILGFPK(서열번호 147)
High	MVEGFFDR(서열번호 148)
High	RFTMELAK(서열번호 149)
High	YNLGLDLR(서열번호 150)
High	ALASLmTYK(서열번호 151)
High	mVEGFFDR(서열번호 152)

실시예 2: Batch culture 를 통한 재조합 세포의 세포 생존률 , 생존세포 농도, 및 항체 생산량 측정

위 과정을 통해 선별된 재조합 세포, 즉, GSKO 301 GS (항체를 발현하는 GS-KO pool)과 GSKO GLUD1 301 GS (항체와 GLUD1을 발현하는 GS-KO pool)에 대한 batch culture test를 실행하였다. batch culture 는 2회 이상 반복 실험 하였다. 3x10⁵ cells/ml 농도로 30ml culture로 시작하여 7일간 배양을 지속하였다. 상기 세포를 EX-CELL CD CHO Fusion media(sigma, 14365C) 에 1X GSEM supplement와 10ug/ml의 puromycin을 첨가한 배지에 배양하였다. 배양 시작 후, 0,1,2,3,4,5, 및 7번째 날에 세포의 세포 생존률(viability), 생존세포밀도 (Integrated viable cell concentration (IVCC) or viable cell density (VCD)), 그리고 배지에 존재하는 목적 폴리펩타이드인 항 c-Met 항체의 농도를 측정하였다. Cell viability와 IVCC는 Cedex automated cell counter (Roche)를 이용하여 측정하였고, 배지 내에 존재하는 항체의 농도는 Octet systems (Fortebio)를 이용하여 측정하였다

상기 얻어진 결과를 도 5내지 도 7에 나타내었다. 도 5 내지 도 7에서 "-◆-"는 항체만 발현하는 세포에서의 결과를 보여주고, "-■-"는 항체와 GLUD1을 함께 발현하는 세포에서의 결과를 보여준다 도 5는 세포 생존률을 보여주는 그래프로서, 재조합 세포 GSKO 301 GS와 GSKO GLUD1 301 GS 모두 높은 세포 생존률을 나타냄을 알 수 있다. 이는, GLUD1이 도입되어도 세포 생존률에 영향이 없음을 보여준다. 도 6은 생존세포밀도 (IVCC또는 VCD)를 보여주는 그래프로서, GSKO GLUD1 301 GS 의 경우, GSKO 301 GS에 비해 약 1.53배 증가된 cell growth를 나타냄을 알 수 있다. 또한, 도 7은 배지에 존재하는 항체의 농도를 보여주는 그래프로서, GLUD1과 함께 항체를 발현하는 세포 pool에서 GLUD1를 발현하지 않고 항체만을 발현하는 세포 pool에 비해 항체 농도가 약 1.93배 정도 증가함을 알 수 있다.

실시예 3: a- kg 측정

상기 실시예 1.2에서 선별된 재조합 세포, 즉, GSKO 301 GS (항체를 발현하는 GS-KO pool)과 GSKO GLUD1 301 GS (항체와 GLUD1을 발현하는 GS-KO pool)을 각각 3x10⁵ cells/ml 농도로 30 ml culture로 시작하여 7일간 배양을 지속하였다. 상기 세포를 EX-CELL CD CHO Fusion media(sigma, 14365C)에 1X GSEM supplement와 10ug/ml의 puromycin을 첨가한 배지에 배양하였다. 이와 같이 얻어진 배양액을 사용하여 배양액내의 a-ketoglutarate (a-KG)의 양을 측정하였다. 10 mM Sulfuric acid를 mobile phase로 사용하여, column temperature 46.5℃, sample temperature 4℃, flow rate 0.6 mL/min의 isocratic 조건으로 running을 실시하였다. 시험에 사용한 column은 Aminex HPX-87H column, 300 mm*7.8 (Bio-rad, cat No. 125-0140) 이고, guard column도 함께 사용하였다. a-ketoglutarate (a-KG)는 20 uL(microliter)의 양으로 주입하고 210 nm의 파장에서 결과 standard와 동일한 위치의 peak을 관찰하였다. a-ketoglutarate (a-KG)의 농도 측정을 위해 standard를 20 nmol/mL~1,000nmol/mL 의 농도로 제조하였고 농도별 peak area를 이용하여 curve를 그린 후 a-ketoglutarate (a-KG)의 양을 추정하였다

상기 얻어진 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타난 바와 같이 GLUD1이 과발현 된 항체 생산 세포(GSKO GLUD1 301 GS)에서 더 많은 양의 a-KG가 축적되는 것을 확인 하였다.

실시예 4. ATP 측정

상기 실시 예 1.2에서 준비된 GSKO 301 GS 세포 및 GSKO GLUD1 301 GS 세포를 harvest 한 후, 각각 MKN buffer (10mM Tris.Cl pH 7.4, 0.13 M NaCl, 5mM KCl, 7.5 mM MgCl₂)을 이용하여 3회 세척하였다. 각각의 세포에 대하여 Homogenizer를 통하여 homogenization을 수행하여 homogenizate를 확보한 후, 2M Sucrose를 이용하여 pellet으로 분리된 mitochondrial protein을 확보하였다. Mitochondrial protein의 purity를 높이기 위해 mitochondrial lysis buffer (25 mM Tris.Cl, pH 7.4, 5 mM MgCl₂, 10% glycerol, 1 mM DTT)를 이용하여 녹인 후, 최종 농도가 0.5% tween 20 및 0.5 M KCl 이 되도록 첨가해주었다.5분간 ice에서 incubation 후 3회에 걸쳐 homogenization 해 주고 100,000g, 4℃에서 60 분 동안 centrifuge하였다. supernatant를 collect 한 후, -80℃에 보관하거나 ATP 측정에 바로 이용하였다. 분리된 mitochondria 내에 존재하는 ATP level은 ATP determination kit (Invitrogen, CAT. No. A22066)를 이용하여 측정하였다.

상기 수집된 시료(supernatant)를 단백질 농도 1 mg/ml이 되도록 mitochondrial lysis buffer 희석하여 측정에 사용하였으며, kit의 제조사 (Invitrogen)에서 제공하는 protocol에 따라 standard reaction solution (8.9 mL H₂O, 0.5 mL 20X Reaction Buffer (Provided), 0.1 mL 0.1 M DTT (Provided), 0.5 mL 10 mM D-luciferin (Provided), 2.5 uL firefly luciferase 5 mg/mL stock solution (Provided))을 만들었다. 96-well plate에 하나의 well 당 90 uL 의 standard reaction solution과 10 uL 의 시료를 넣고 5 분간 incubation한 후, 560 nm에서 emission light를 측정하였으며 각각의 반응은 triplicate로 진행되었다. Standard curve는 위와 같은 방법으로 시료 대신 0.001 ~ 100 nM 의 ATP를 이용하여 emission light를 측정하여 그려졌으며 이를 기준으로 사용 시료 (GSKO 301 GS 및 GSKO GLUD1 301 GS)의 ATP 농도를 계산하였다.

상기 얻어진 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9는 계산된 ATP 농도의 상대적 값을 나타낸 것으로 GSKO 301 GS 시료에서 관찰된 ATP 농도 ('-'로 표시)를 1로 환산하여 GSKO GLUD1 301 GS ('GLUD1'으로 표시)의 ATP level을 나타낸 것이다. 도 9에 나타난 바와 같이, GLUD1의 과발현이 유도된 GSKO GLUD1 301 GS에서의 ATP level이 현저히 높은 것을 확인할 수 있다.

실시예 5. 항 c- Met 항체 L3 -1Y/ IgG2 의 QC (정제, SDS - PAGE , SEC , Binding assay )

실시예 5.1: L3 -1Y/ IgG2 정제

Protein A column 인 Hitrap^TM 5 mL Mabselect^TM Sure를 priming 후 AKTA Prime Plus 에 연결하여 안정화시켰다. 상기 실시예 2와 같이 재조합 세포에서 항체를 발현시키고, 세포를 제거한 상청액 Sample을 5mL/min 의 속도로 injection 한 후 1x PBS (pH7.4)로 washing 하고 elution buffer인 IgG elution buffer (Thermo, Part No. 21009, Lot No. NC169691)로 elution하였다. 1.0 M Tris sterile solution, Ultrapure grade (pH 9.0) (Amresco, Code No. E694-250mL, Lot No. 3583C261)를 이용하여 pH를 중성화하였다.

이와 같이 얻어진 항체의 순도를 도 12 및 표 5에 나타내었다.

	S301-12A37 standard	GLUD
purity (%)	99.7	99.8

표 5에서, S301-12A37 standard는 GLUD1이 과발현이 유도되지 않고 항체 유전자를 포함하는 항체 생산 세포 (GSKO 301 GS)에서 생산된 항체를 의미하고, GLUD는 GLUD1이 과발현되고 항체 유전자를 포함하는 항체 생산 세포(GSKO GLUD1 301 GS)에서 생산된 항체를 나타낸다. 표 5에서 확인되는 바와 같이, GLUD1이 과발현된 (GSKO GLUD1 301 GS 세포에서 생산된 항체의 순도는 GLUD1이 과발현이 유도되지 않은 GSKO 301 GS에서 생산된 항체의 순도와 비교하여 동등 이상임을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 GLUD1이 과발현 유도가 생산되는 항체의 순도에 부정적인 영향이 없음을 보여주는 것이다.

이와 같이 얻어진 L3-1Y/IgG2 항체 시료를 아래의 실시예 5.2 내지 5.4에 사용하였다.

실시예 5.2: L3 -1Y/ IgG2 QC ( size exclusion chromatography )

Mobile phase는 50 mM Sodium Phosphate (pH6.6), 300 mM NaCl로 제조 하였다. 상기 실시예 5.1에서 얻은 L3-1Y/IgG2 항체 시료에 대하여 다음의 조건으로 size exclusion chromatography를 수행하였다: 사용 컬럼은 TSK G3000SWxL (Thosho, Cat No. 8-08541)이고, flow rate: 0.5 mL/min, injection volume: 20 uL. Rum time 40 min, column temperature 30℃, sample temperature 4℃ 조건으로 isocratic 분석하였다.

상기 얻어진 결과를 도 10에 나타내었다.

실시예 5-3 L3 -1Y/ IgG2 QC ( SDS - PAGE )

상기 실시예 5.1에서 얻은 L3-1Y/IgG2 항체 시료내의 L3-1Y/IgG2 항체의 농도를 측정하여 0.1~ 0.5 mg/mL의 농도로 희석하였다. 희석한 항체 시료 20 uL에 1M DTT 2 uL, NuPAGE

LDS Sample Buffer(4X) (Cat No: LC0007, Invitrogen) 7 uL를 혼합하여 90℃로 예열된 heat block에서 10 분간 환원시켰다. 다른 또 하나의 희석한 L3-1Y/IgG2 항체 시료에 대해서는 동일하게 희석하여 진행하되, DTT 첨가를 제외하고 90℃에서의 incubation step을 생략하였다. PAGE cartridge에 NuPAGE

4~12% Bis-Tris Gel, 1.0 mm, 10 well (Cat No: NP0321, Invitrogen)을 장착하고 NuPAGE

MES Running Buffer(20X)를 20배 희석하여 1x로 만든 후 상기 준비된 PAGE cartridge에 붓고, L3-1Y/IgG2 항체 시료와 standard인 S301-12A37 (GSKO 301 GS에서 발현된 항체)를 loading하였다. 200 V 로 설정하여 running 하고 dye가 바닥에 닿으면 중지하였다. SimplyBlue 염색약으로 약 1 시간 가량 염색 후 물을 이용하여 12~18시간 동안 destaning을 진행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 11에 나타내었다. GLUD1이 과발현 된 항체 생산 세포(GSKO GLUD1 301 GS; 'GLUD'로 표시)에서 생산된 항체는, non-reducing 및 reducing 조건 모두에서, standard인 S301-12A37 (GSKO 301 GS에서 발현된 항체)과 동일한 위치에서 band들이 확인되었으므로, 동일 size의 항체임을 확인하였다.

실시예 5-4 L3 -1Y/ IgG2 QC ( Binding affinity )

상기 실시예 5.1에서 얻은 L3-1Y/IgG2의 c-Met에 대한 결합 친화도를 Biacore T100(GE)을 사용하여 확인하였다. Chip CM-5 칩(GE Healthcare, Cat. No. BR-1005-30)의 표면을 Amine Coupling Kit (GE healthcare, Cat. No. BR-1000-50)을 이용하여 activation 시킨 후, Human Fab Capture Kit (GE Healthcare, Cat. No. 28-9583-25)를 이용하여 Human Fab binder(GE Healthcare)를 상기 칩 표면에 고정화시켰다. 고정화 Level은 9,000~ 13,000 RU 정도가 되도록 하였다. L3-1Y/IgG2 항체와 항원인 c-Met의 binding affinity를 측정하기 위하여, 항원인 c-Met은 25 nmol 부터 2 fold serial dultion 하여 0.78 nmol 가지 6 point를 준비하고, 항체인 L3-1Y/IgG2의 경우는 2 ug/mL의 농도가 되도록 희석시켜 사용하였켰다. Running이 시작되면 gradient signal 차이가 80~130 RU가 되는지 확인하고 signal이 맞게 형성되면 running을 진행하였다. 시험결과는 Kinetics, 1:1 bind를 선택하여 분석하여 Kd 값을 구하였다. 상기 실험에서 얻어진 데이터를 BIAevaluation software(GE Healthcare,Biacore T100 evaluation software)를 사용하여 fitting하였다.

상기 얻어진 결과를 아래의 표 6에 나타내었다.

	12A37	GLUD
KD (M)	5.73E-11	9.26E-11
KD (nM)	0.06	0.09

상기 표 5에서 확인되는 바와 같이, S301-12A37 standard (GSKO 301 GS에서 발현된 항체; 대조군)와 GLUD 과발현된 세포(GSKO GLUD1 301 GS)에서 생산된 항체는 모두 binding affinity의 기준인 '0.01nM ≤ KD ≤ 0.19 nM'을 만족하였다. 즉, GLUD 과발현된 세포는 대조군과 유사한 정도의 항원에 대한 친화력을 유지하는 항체를 대량 생산할 수 있음을 확인할 수 있다.

한국세포주연구재단

KCLRF-BP-00329

20140903

<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Enhanced Production of a Recombinant Polypeptide by Overexpression of GLUD1 <130> DPP20143076KR <160> 154 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of AbF46 <400> 1 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of AbF46 <400> 2 Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 of AbF46 <400> 3 Asp Asn Trp Phe Ala Tyr 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> X is Pro or Ser or absent <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> X is Glu or Asp <400> 4 Xaa Xaa Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> X is Asn or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (4) 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chain constant region <220> <221> misc_difference <222> (751)..(753) <223> stop codon <220> <221> misc_difference <222> (754)..(759) <223> XhoI restriction site <400> 39 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gacattttga tgacccagtc tccatcctcc 120 ctgactgtgt cagcaggaga gaaggtcact atgagctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccagc agaaaccagg acgatctcct 240 aaaatgctga taatttgggc atccactagg gtatctggag tccctgatcg cttcataggc 300 agtggatctg ggacggattt cactctgacc atcaacagtg tgcaggctga agatctggct 360 gtttattact gtcagcagtc ctacagcgct ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg 420 gagctgaaac gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 480 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 540 aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca 600 gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca 660 gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc 720 gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt tgactcgag 759 <210> 40 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of H1-heavy <400> 40 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser 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catcaccaac attttctggc gtcagtccac 2160 cagctaacat aaaatgtaag ctctcggggc tctcttgcct tccaacccag tcagaaatcg 2220 agttccaatc caaaagttca cctgtcccac ctgcttctga atcaaacaag ggaataaacg 2280 aatgaggttt ctgtgaagct gcactgagta gtatgttgca gtcttttgga aatacgagtc 2340 ttttaataac tggcaaaccg aggaactctt ggtattcttg ccacgactca tctccgtgca 2400 gttggacgat atcaatgccg taatcattga ccagagccaa aacatcctcc ttaggttgat 2460 tacgaaacac gccaaccaag tatttcggag tgcctgaact atttttatat gcttttacaa 2520 gacttgaaat tttccttgca ataaccgggt caattgttct ctttctattg ggcacacata 2580 taatacccag caagtcagca tcggaatcta gagcacattc tgcggcctct gtgctctgca 2640 agccgcaaac tttcaccaat ggaccagaac tacctgtgaa attaataaca gacatactcc 2700 aagctgcctt tgtgtgctta atcacgtata ctcacgtgct caatagtcac caatgccctc 2760 cctcttggcc ctctcctttt cttttttcga ccgaatttct tgaagacgaa agggcctcgt 2820 gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttagg acggatcgct 2880 tgcctgtaac ttacacgcgc ctcgtatctt ttaatgatgg aataatttgg gaatttactc 2940 tgtgtttatt tatttttatg ttttgtattt 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polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-2 clone <400> 59 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240 aaaatgctga ttatttgggc atccactagg gtatctggag tcccttctcg cttctctgga 300 tccgggtctg ggacggattt cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360 acttattact gtgggcagtc ctacagccgt ccgctcacgt tcggacaggg taccaaggtg 420 gagatcaaac gtacg 435 <210> 60 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-3 clone <400> 60 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240 aaaatgctga 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atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt tcaacagcac gttccgtgtg 960 gtcagcgtcc tcaccgttgt gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 1020 gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaagggcag 1080 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1140 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccatgctgga ctccgacggc 1260 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380 ctgtctccgg gtaaatgact cgag 1404 <210> 68 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of light chain of huAbF46-H4-A1(H36Y) and human kappa constant region <400> 68 Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Ser Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Ala Ser Gly Asn 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consisting of light chain of huAbF46-H4-A1(H36Y) and human kappa constant region <400> 69 aattcactag tgattaattc gccgccacca tggattcaca ggcccaggtc ctcatgttgc 60 tgctgctatc ggtatctggt acctgtggag atatccagat gacccagtcc ccgagctccc 120 tgtccgcctc tgtgggcgat agggtcacca tcacctgcaa gtccagtcag agtcttttag 180 ctagtggcaa ccaaaataac tacttggcct ggtaccaaca gaaaccagga aaagctccga 240 aaatgctgat tatttgggca tccactaggg tatctggagt cccttctcgc ttctctggat 300 ccgggtctgg gacggatttc actctgacca tcagcagtct gcagccggaa gacttcgcaa 360 cttattactg tcagcagtcc tacagccgcc cgtacacgtt cggacagggt accaaggtgg 420 agatcaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt 480 tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca 540 aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag 600 agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag 660 actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg 720 tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt gactcgag 758 <210> 70 <211> 240 <212> 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<221> misc_difference <222> (751)..(753) <223> stop codon <220> <221> misc_difference <222> (754)..(759) <223> XhoI restriction site <400> 77 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gacattttga tgacccagtc tccatcctcc 120 ctgactgtgt cagcaggaga gaaggtcact atgagctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccagc agaaaccagg acgatctcct 240 aaaatgctga taatttgggc atccactagg gtatctggag tccctgatcg cttcataggc 300 agtggatctg ggacggattt cactctgacc atcaacagtg tgcaggctga agatctggct 360 gtttattact gtcagcagtc ctacagcgct ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg 420 gagctgaaac gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 480 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 540 aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca 600 gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca 660 gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc 720 gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt tgactcgag 759 <210> 78 <211> 4170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding c-Met protein <400> 78 atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60 aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag 120 tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat 180 cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag 240 gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac 300 tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta 360 gttgtcgaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc 420 tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc 480 atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg 540 ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc 600 ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag 660 gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag 720 ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac 780 ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg 840 ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc 900 acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg 960 tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac 1020 attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct 1080 gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa 1140 aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg 1200 acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt 1260 accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca 1320 tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt 1380 cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc 1440 ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc 1500 tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc 1560 agacatttcc agtcctgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg 1620 tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc 1680 tgtctgcctg caatctacaa ggttttccca aatagtgcac cccttgaagg agggacaagg 1740 ctgaccatat gtggctggga ctttggattt cggaggaata ataaatttga tttaaagaaa 1800 actagagttc tccttggaaa tgagagctgc accttgactt taagtgagag cacgatgaat 1860 acattgaaat gcacagttgg tcctgccatg aataagcatt tcaatatgtc cataattatt 1920 tcaaatggcc acgggacaac acaatacagt acattctcct atgtggatcc tgtaataaca 1980 agtatttcgc cgaaatacgg tcctatggct ggtggcactt tacttacttt aactggaaat 2040 tacctaaaca gtgggaattc tagacacatt tcaattggtg gaaaaacatg tactttaaaa 2100 agtgtgtcaa acagtattct tgaatgttat accccagccc aaaccatttc aactgagttt 2160 gctgttaaat tgaaaattga cttagccaac cgagagacaa gcatcttcag ttaccgtgaa 2220 gatcccattg tctatgaaat tcatccaacc aaatctttta ttagtggtgg gagcacaata 2280 acaggtgttg ggaaaaacct gaattcagtt agtgtcccga gaatggtcat aaatgtgcat 2340 gaagcaggaa ggaactttac agtggcatgt caacatcgct ctaattcaga gataatctgt 2400 tgtaccactc cttccctgca acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt 2460 ttcatgttag atgggatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg 2520 tttaagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt 2580 aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag 2640 agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg 2700 ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt 2760 ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacaggat tgattgctgg tgttgtctca 2820 atatcaacag cactgttatt actacttggg tttttcctgt ggctgaaaaa gagaaagcaa 2880 attaaagatc tgggcagtga attagttcgc tacgatgcaa gagtacacac tcctcatttg 2940 gataggcttg taagtgcccg aagtgtaagc ccaactacag aaatggtttc aaatgaatct 3000 gtagactacc gagctacttt tccagaagat cagtttccta attcatctca gaacggttca 3060 tgccgacaag tgcagtatcc tctgacagac atgtccccca tcctaactag tggggactct 3120 gatatatcca gtccattact gcaaaatact gtccacattg acctcagtgc tctaaatcca 3180 gagctggtcc aggcagtgca gcatgtagtg attgggccca gtagcctgat tgtgcatttc 3240 aatgaagtca taggaagagg gcattttggt tgtgtatatc atgggacttt gttggacaat 3300 gatggcaaga aaattcactg tgctgtgaaa tccttgaaca gaatcactga cataggagaa 3360 gtttcccaat ttctgaccga gggaatcatc atgaaagatt ttagtcatcc caatgtcctc 3420 tcgctcctgg gaatctgcct gcgaagtgaa gggtctccgc tggtggtcct accatacatg 3480 aaacatggag atcttcgaaa tttcattcga aatgagactc ataatccaac tgtaaaagat 3540 cttattggct ttggtcttca agtagccaaa ggcatgaaat atcttgcaag caaaaagttt 3600 gtccacagag acttggctgc aagaaactgt atgctggatg aaaaattcac agtcaaggtt 3660 gctgattttg gtcttgccag agacatgtat gataaagaat actatagtgt acacaacaaa 3720 acaggtgcaa agctgccagt gaagtggatg gctttggaaa gtctgcaaac tcaaaagttt 3780 accaccaagt cagatgtgtg gtcctttggc gtgctcctct gggagctgat gacaagagga 3840 gccccacctt atcctgacgt aaacaccttt gatataactg tttacttgtt gcaagggaga 3900 agactcctac aacccgaata ctgcccagac cccttatatg aagtaatgct aaaatgctgg 3960 caccctaaag ccgaaatgcg cccatccttt tctgaactgg tgtcccggat atcagcgatc 4020 ttctctactt tcattgggga gcactatgtc catgtgaacg ctacttatgt gaacgtaaaa 4080 tgtgtcgctc cgtatccttc tctgttgtca tcagaagata acgctgatga tgaggtggac 4140 acacgaccag cctccttctg ggagacatca 4170 <210> 79 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEMA domain of c-Met <400> 79 Leu His Glu His His Ile Phe Leu Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val 1 5 10 15 Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro 20 25 30 Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys 35 40 45 Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu 50 55 60 Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val 65 70 75 80 Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His Val Phe Pro His Asn His Thr Ala 85 90 95 Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu 100 105 110 Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val 115 120 125 Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr 130 135 140 Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp His Pro Leu His Ser Ile Ser Val 145 150 155 160 Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln 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ttttcacaca 660 agaataatca ggttctgttc cataaactct ggattgcatt cctacatgga aatgcctctg 720 gagtgtattc tcacagaaaa gagaaaaaag agatccacaa agaaggaagt gtttaatata 780 cttcaggctg cgtatgtcag caagcctggg gcccagcttg ctagacaaat aggagccagc 840 ctgaatgatg acattctttt cggggtgttc gcacaaagca agccagattc tgccgaacca 900 atggatcgat ctgccatgtg tgcattccct atcaaatatg tcaacgactt cttcaacaag 960 atcgtcaaca aaaacaatgt gagatgtctc cagcattttt acggacccaa tcatgagcac 1020 tgctttaata ggacacttct gagaaattca tcaggctgtg aagcgcgccg tgatgaatat 1080 cgaacagagt ttaccacagc tttgcagcgc gttgacttat tcatgggtca attcagcgaa 1140 gtcctcttaa catctatatc caccttcatt aaaggagacc tcaccatagc taatcttggg 1200 acatcagagg gtcgcttcat gcaggttgtg gtttctcgat caggaccatc aacccctcat 1260 gtgaattttc tcctggactc ccatccagtg tctccagaag tgattgtgga gcatacatta 1320 aaccaaaatg gc 1332 <210> 83 <211> 1299 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding PSI-IPT domain of c-Met <400> 83 tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc 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360 aaaaagtttg tccacagaga cttggctgca agaaactgta tgctggatga aaaattcaca 420 gtcaaggttg ctgattttgg tcttgccaga gacatgtatg ataaagaata ctatagtgta 480 cacaacaaaa caggtgcaaa gctgccagtg aagtggatgg ctttggaaag tctgcaaact 540 caaaagttta ccaccaagtc agatgtgtgg tcctttggcg tgctcctctg ggagctgatg 600 acaagaggag ccccacctta tcctgacgta aacacctttg atataactgt ttacttgttg 660 caagggagaa gactcctaca acccgaatac tgcccagacc ccttatatga agtaatgcta 720 aaatgctggc accctaaagc cgaaatgcgc ccatcctttt ctgaactggt gtcccggata 780 tcagcgatct tctctacttt cattggggag cactatgtcc atgtgaacgc tacttatgtg 840 aacgtaaaat gtgtcgctcc gtatccttct ctgttgtcat cagaagataa cgctgatgat 900 gaggtggaca cacgaccagc ctccttctgg gagacatca 939 <210> 85 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 of anti-c-Met antibody <400> 85 Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 1 5 10 <210> 86 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR3 of anti-c-Met antibody <400> 86 Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr 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taaggtcaat gggaggtaag ccaatgggtt tttcccatta 840 ctggcacgta tactgagtca ttagggactt tccaatgggt tttgcccagt acataaggtc 900 aataggggtg aatcaacagg aaagtcccat tggagccaag tacactgagt caatagggac 960 tttccattgg gttttgccca gtacaaaagg tcaatagggg gtgagtcaat gggtttttcc 1020 cattattggc acgtacataa ggtcaatagg ggtgagtcat tgggtttttc cagccaattt 1080 aattaaaacg ccatgtactt tcccaccatt gacgtcaatg ggctattgaa actaatgcaa 1140 cgtgaccttt aaacggtact ttcccatagc tgattaatgg gaaagtaccg ttctcgagcc 1200 aatacacgtc aatgggaagt gaaagggcag ccaaaacgta acaccgcccc ggttttcccc 1260 tggaaattcc atattggcac gcattctatt ggctgagctg cgttctacgt gggtataaga 1320 ggcgcgacca gcgtcggtac cgtcgcagtc ttcggtctga ccaccgtaga acgcagagct 1380 cctcgctgca g 1391 <210> 121 <211> 1542 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human ubiquitin C promoter <400> 121 tctgccgagt cattgtcctt gtcccgcggc cccgggagcc ccccgcgacc ggcctgggag 60 gctcagggag gttgaagggg gctgagcaaa ggaagccccg tcattacctc aaatgtgacc 120 caaaaataaa gacccgtcca tctcgcaggg tgggccaggg 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tattcgggtg 1020 agatgggctg gggcaccatc tggggaccct gacgtgaagt ttgtcactga ctggagaact 1080 cggtttgtcg tctgttgcgg gggcggcagt tatggcggtg ccgttgggca gtgcacccgt 1140 acctttggga gcgcgcgccc tcgtcgtgtc gtgacgtcac ccgttctgtt ggcttataat 1200 gcagggtggg gccacctgcc ggtaggtgtg cggtaggctt ttctccgtcg caggacgcag 1260 ggttcgggcc tagggtaggc tctcctgaat cgacaggcgc cggacctctg gtgaggggag 1320 ggataagtga ggcgtcagtt tctctggtcg gttttatgta cctatcttct taagtagctg 1380 aagctccggt tttgaactat gcgctcgggg ttggcgagtg tgttttgtga agttttttag 1440 gcaccttttg aaatgtaatc atttgggtca atatgtaatt ttcagtgtta gactagtaaa 1500 ttgtccgcta aattctggcc gtttttggct tttttgttag ac 1542 <210> 122 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric intron <400> 122 gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga 60 cagagaagac tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc 120 tttctctcca cag 133 <210> 123 <211> 963 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Intron A <400> 123 gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa 60 gacaccggga ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg cggattcccc 120 gtgccaagag tgacgtaagt accgcctata gactctatag gcacacccct ttggctctta 180 tgcatgctat actgtttttg gcttggggcc tatacacccc cgctccttat gctataggtg 240 atggtatagc ttagcctata ggtgtgggtt attgaccatt attgaccact cccctattgg 300 tgacgatact ttccattact aatccataac atggctcttt gccacaacta tctctattgg 360 ctatatgcca atactctgtc cttcagagac tgacacggac tctgtatttt tacaggatgg 420 ggtcccattt attatttaca aattcacata tacaacaacg ccgtcccccg tgcccgcagt 480 ttttattaaa catagcgtgg gatctccacg cgaatctcgg gtacgtgttc cggacatggg 540 ctcttctccg gtagcggcgg agcttccaca tccgagccct ggtcccatgc ctccagcggc 600 tcatggtcgc tcggcagctc cttgctccta acagtggagg ccagacttag gcacagcaca 660 atgcccacca ccaccagtgt gccgcacaag gccgtggcgg tagggtatgt gtctgaaaat 720 gagctcggag attgggctcg caccgtgacg cagatggaag acttaaggca gcggcagaag 780 aagatgcagg cagctgagtt gttgtattct gataagagtc agaggtaact cccgttgcgg 840 tgctgttaac ggtggagggc agtgtagtct gagcagtact cgttgctgcc gcgcgcgcca 900 ccagacataa tagctgacag actaacagac tgttcctttc catgggtctt ttctgcagtc 960 acc 963 <210> 124 <211> 115 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGLV intron <400> 124 gtgacaggat ggggaccaag aaaggggccc tgggaagccc atggggccct gctttctcct 60 cttgtctcct tttgtctctt gtcaatcacc atgtctgtgt ctctctcact tccag 115 <210> 125 <211> 206 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGKV intron <400> 125 gtgagaatat ttagaaaaag ctaaaactaa ttctttgaac cattaatttt cttaattagg 60 aacctggcac catatggaac ttggcttgtt tttaaatgtg attttttttt aagtaatgcg 120 tattctttca tcttgtgcta ctagattagt ggtgatttca ttaagcagat gcttatattg 180 tgctaatgtt tgctgtatgt tttcag 206 <210> 126 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGH intron <400> 126 gtgagtgtct cagggatcca gacatggggg tatgggaggt gcctctgatc ccagggctca 60 ctgtgggtct ctctgttcac ag 82 <210> 127 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGLDU1 For primer <400> 127 ggtcatcgaa ggctaccg 18 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> 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gcg tcc gcc gac tcg gcc gcg ttg ctg 340 Gly Pro Ala Ala Leu Gly Ser Ala Ser Ala Asp Ser Ala Ala Leu Leu 15 20 25 30 ggc tgg gcc cgg gga cag ccc gcc gcc gcc ccg cag ccg ggg ctg gca 388 Gly Trp Ala Arg Gly Gln Pro Ala Ala Ala Pro Gln Pro Gly Leu Ala 35 40 45 ttg gcc gcc cgg cgc cac tac agc gag gcg gtg gcc gac cgc gag gac 436 Leu Ala Ala Arg Arg His Tyr Ser Glu Ala Val Ala Asp Arg Glu Asp 50 55 60 gac ccc aac ttc ttc aag atg gtg gag ggc ttc ttc gat cgc ggc gcc 484 Asp Pro Asn Phe Phe Lys Met Val Glu Gly Phe Phe Asp Arg Gly Ala 65 70 75 agc atc gtg gag gac aag ctg gtg gag gac ctg agg acc cgg gag agc 532 Ser Ile Val Glu Asp Lys Leu Val Glu Asp Leu Arg Thr Arg Glu Ser 80 85 90 gag gag cag aag cgg aac cgg gtg cgc ggc atc ctg cgg atc atc aag 580 Glu Glu Gln Lys Arg Asn Arg Val Arg Gly Ile Leu Arg Ile Ile Lys 95 100 105 110 ccc tgc aac cat gtg ctg agt ctc tcc ttc ccc atc cgg cgc gac gac 628 Pro Cys Asn His Val Leu Ser Leu Ser Phe Pro Ile Arg Arg Asp Asp 115 120 125 ggc tcc tgg gag gtc atc gaa ggc tac cgg gcc cag cac agc cag cac 676 Gly Ser Trp Glu Val Ile Glu Gly Tyr Arg Ala Gln His Ser Gln His 130 135 140 cgc acg ccc tgc aag gga ggt atc cgt tac agc act gat gtg agt gta 724 Arg Thr Pro Cys Lys Gly Gly Ile Arg Tyr Ser Thr Asp Val Ser Val 145 150 155 gat gaa gta aaa gct ttg gct tct ctg atg aca tac aag tgt gca gtg 772 Asp Glu Val Lys Ala Leu Ala Ser Leu Met Thr Tyr Lys Cys Ala Val 160 165 170 gtt gat gtg ccg ttt ggg ggt gct aaa gct ggt gtt aag atc aat ccc 820 Val Asp Val Pro Phe Gly Gly Ala Lys Ala Gly Val Lys Ile Asn Pro 175 180 185 190 aag aac tat act gat aat gaa ttg gaa aag atc aca agg agg ttc acc 868 Lys Asn Tyr Thr Asp Asn Glu Leu Glu Lys Ile Thr Arg Arg Phe Thr 195 200 205 atg gag cta gca aaa aag ggc ttt att ggt cct ggc att gat gtg cct 916 Met Glu Leu Ala Lys Lys Gly Phe Ile Gly Pro Gly Ile Asp Val Pro 210 215 220 gct cca gac atg agc aca ggt gag cgg gag atg tcc tgg atc gct gat 964 Ala Pro Asp Met Ser Thr Gly Glu Arg Glu Met Ser Trp Ile Ala Asp 225 230 235 acc tat gcc agc acc ata ggg cac tat gat att aat gca cac gcc tgt 1012 Thr Tyr Ala Ser Thr Ile Gly His Tyr Asp Ile Asn Ala His Ala Cys 240 245 250 gtt act ggt aaa ccc atc agc caa ggg gga atc cat gga cgc atc tct 1060 Val Thr Gly Lys Pro Ile Ser Gln Gly Gly Ile His Gly Arg Ile Ser 255 260 265 270 gct act ggc cgt ggt gtc ttc cat ggg att gaa aat ttc atc aat gaa 1108 Ala Thr Gly Arg Gly Val Phe His Gly Ile Glu Asn Phe Ile Asn Glu 275 280 285 gct tct tac atg agc att tta gga atg aca cca ggg ttt gga gat aaa 1156 Ala Ser Tyr Met Ser Ile Leu Gly Met Thr Pro Gly Phe Gly Asp Lys 290 295 300 aca ttt gtt gtt cag gga ttt ggt aat gtg ggc cta cac tct atg aga 1204 Thr Phe Val Val Gln Gly Phe Gly Asn Val Gly Leu His Ser Met Arg 305 310 315 tat tta cat cgt ttt ggt gct aaa tgt att gct gtt ggt gag tct gat 1252 Tyr Leu His Arg Phe Gly Ala Lys Cys Ile Ala Val Gly Glu Ser Asp 320 325 330 ggg agt ata tgg aat cca gat ggt att gac cca aag gaa ctg gaa gac 1300 Gly Ser Ile Trp Asn Pro Asp Gly Ile Asp Pro Lys Glu Leu Glu Asp 335 340 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Glu Arg Asp Ser 450 455 460 aac tac cac ttg ctc atg tct gtt caa gag agt tta gaa aga aaa ttt 1684 Asn Tyr His Leu Leu Met Ser Val Gln Glu Ser Leu Glu Arg Lys Phe 465 470 475 gga aag cat ggt gga act att ccc att gta ccc acg gca gag ttc caa 1732 Gly Lys His Gly Gly Thr Ile Pro Ile Val Pro Thr Ala Glu Phe Gln 480 485 490 gac agg ata tcg ggt gca tct gag aaa gac atc gtg cac tct ggc ttg 1780 Asp Arg Ile Ser Gly Ala Ser Glu Lys Asp Ile Val His Ser Gly Leu 495 500 505 510 gca tac aca atg gag cgt tct gcc agg caa att atg cgc aca gcc atg 1828 Ala Tyr Thr Met Glu Arg Ser Ala Arg Gln Ile Met Arg Thr Ala Met 515 520 525 aag tat aac ctg gga ttg gac ctg aga aca gct gcc tat gtt aat gcc 1876 Lys Tyr Asn Leu Gly Leu Asp Leu Arg Thr Ala Ala Tyr Val Asn Ala 530 535 540 att gag aaa gtc ttc aaa gtg tac aat gaa gct ggt gtg acc ttc aca 1924 Ile Glu Lys Val Phe Lys Val Tyr Asn Glu Ala Gly Val Thr Phe Thr 545 550 555 tagatg gatcatggct gacttcctca ctatcctctt cacatgtaac ttctgcagac 1980 ctatcacaag tttacatgta 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Pro Ala Ala Ala Pro Gln Pro Gly Leu Ala Leu Ala 35 40 45 Ala Arg Arg His Tyr Ser Glu Ala Val Ala Asp Arg Glu Asp Asp Pro 50 55 60 Asn Phe Phe Lys Met Val Glu Gly Phe Phe Asp Arg Gly Ala Ser Ile 65 70 75 80 Val Glu Asp Lys Leu Val Glu Asp Leu Arg Thr Arg Glu Ser Glu Glu 85 90 95 Gln Lys Arg Asn Arg Val Arg Gly Ile Leu Arg Ile Ile Lys Pro Cys 100 105 110 Asn His Val Leu Ser Leu Ser Phe Pro Ile Arg Arg Asp Asp Gly Ser 115 120 125 Trp Glu Val Ile Glu Gly Tyr Arg Ala Gln His Ser Gln His Arg Thr 130 135 140 Pro Cys Lys Gly Gly Ile Arg Tyr Ser Thr Asp Val Ser Val Asp Glu 145 150 155 160 Val Lys Ala Leu Ala Ser Leu Met Thr Tyr Lys Cys Ala Val Val Asp 165 170 175 Val Pro Phe Gly Gly Ala Lys Ala Gly Val Lys Ile Asn Pro Lys Asn 180 185 190 Tyr Thr Asp Asn Glu Leu Glu Lys Ile Thr Arg Arg Phe Thr Met Glu 195 200 205 Leu Ala Lys Lys Gly Phe Ile Gly Pro Gly Ile Asp Val Pro Ala Pro 210 215 220 Asp Met Ser Thr Gly Glu Arg Glu Met Ser Trp Ile Ala Asp Thr Tyr 225 230 235 240 Ala Ser Thr Ile Gly His Tyr Asp Ile Asn Ala His Ala Cys Val Thr 245 250 255 Gly Lys Pro Ile Ser Gln Gly Gly Ile His Gly Arg Ile Ser Ala Thr 260 265 270 Gly Arg Gly Val Phe His Gly Ile Glu Asn Phe Ile Asn Glu Ala Ser 275 280 285 Tyr Met Ser Ile Leu Gly Met Thr Pro Gly Phe Gly Asp Lys Thr Phe 290 295 300 Val Val Gln Gly Phe Gly Asn Val Gly Leu His Ser Met Arg Tyr Leu 305 310 315 320 His Arg Phe Gly Ala Lys Cys Ile Ala Val Gly Glu Ser Asp Gly Ser 325 330 335 Ile Trp Asn Pro Asp Gly Ile Asp Pro Lys Glu Leu Glu Asp Phe Lys 340 345 350 Leu Gln His Gly Ser Ile Leu Gly Phe Pro Lys Ala Lys Pro Tyr Glu 355 360 365 Gly Ser Ile Leu Glu Ala Asp Cys Asp Ile Leu Ile Pro Ala Ala Ser 370 375 380 Glu Lys Gln Leu Thr Lys Ser Asn Ala Pro Arg Val Lys Ala Lys Ile 385 390 395 400 Ile Ala Glu Gly Ala Asn Gly Pro Thr Thr Pro Glu Ala Asp Lys Ile 405 410 415 Phe Leu Glu Arg Asn Ile Met Val Ile Pro Asp Leu Tyr Leu Asn Ala 420 425 430 Gly Gly Val Thr Val Ser Tyr Phe Glu Trp Leu Lys Asn Leu Asn His 435 440 445 Val Ser Tyr Gly Arg Leu Thr Phe Lys Tyr Glu Arg Asp Ser Asn Tyr 450 455 460 His Leu Leu Met Ser Val Gln Glu Ser Leu Glu Arg Lys Phe Gly Lys 465 470 475 480 His Gly Gly Thr Ile Pro Ile Val Pro Thr Ala Glu Phe Gln Asp Arg 485 490 495 Ile Ser Gly Ala Ser Glu Lys Asp Ile Val His Ser Gly Leu Ala Tyr 500 505 510 Thr Met Glu Arg Ser Ala Arg Gln Ile Met Arg Thr Ala Met Lys Tyr 515 520 525 Asn Leu Gly Leu Asp Leu Arg Thr Ala Ala Tyr Val Asn Ala Ile Glu 530 535 540 Lys Val Phe Lys Val Tyr Asn Glu Ala Gly Val Thr Phe Thr 545 550 555

Claims

GLUD (Glutamate dehydrogenase 1) 1 유전자의 과발현이 유도된 재조합 세포.
제1항에 있어서, 상기 GLUD1 유전자의 과발현은 i) GLUD1 유전자, 또는 GLUD1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 추가로 포함하거나, ii) 작동 가능한 프로모터, 인핸서, 또는 이들의 조합을 포함하거나, iii) i) 및 ii)의 조합을 포함하여 유도되는 것인, 재조합 세포.
제2항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 발현 효율이 높은 프로모터, 인핸서, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것인, 재조합 세포.
제1항에 있어서, 상기 추가로 포함되는 GLUD1 유전자는 외래 GLUD1 유전자인, 재조합 세포.
제1항에 있어서, 수탁번호 KCLRF-BP-00329인, 재조합 세포.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 목적 폴리펩타이드 암호화 유전자를 추가로 포함하는, 재조합 세포.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 세포, GLUD1 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 또는 이들의 조합을 포함하는, 폴리펩타이드 생산용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 재조합 벡터 또는 재조합 세포는 목적 폴리펩타이드 암호화 유전자를 추가로 포함하는 것인, 폴리펩타이드 생산용 조성물.
제6항의 재조합 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 목적 폴리펩타이드의 생산 방법.
GLUD1 유전자 및 목적 폴리펩타이드 암호화 유전자를 포함하는 목적 폴리펩타이드 발현 벡터.