KR102287725B1 - 지방산 결합 단백질 과발현에 의한 재조합 폴리펩타이드의 생산 - Google Patents

지방산 결합 단백질 과발현에 의한 재조합 폴리펩타이드의 생산 Download PDF

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Abstract

지방산 결합 단백질 (fatty acid binding protein) 유전자의 과발현이 유도된 재조합 세포, 상기 재조합 세포 및/또는 지방산 결합 단백질 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 목적 폴리펩타이드 생산용 조성물, 및 상기 재조합 세포를 이용하여 목적 폴리펩타이드의 생산 방법이 제공된다.

Description

지방산 결합 단백질 과발현에 의한 재조합 폴리펩타이드의 생산{Production of a Recombinant Polypeptide by Overexpression of fatty acid binding protein}
지방산 결합 단백질 (fatty acid binding protein)을 암호화하는 유전자의 과발현이 유도된 재조합 세포, 상기 재조합 세포 및/또는 FABP5 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 목적 폴리펩타이드 생산용 조성물, 및 상기 재조합 세포를 이용하는 목적 폴리펩타이드의 생산 방법이 제공된다.
항체와 같은 단백질 제품 개발에 있어서, 경제적 생산을 위한 생산 공정 개발이 중요하다. 생산 공정 개발로서 host system 및 세포주 개발, 세포배양공정 개발, 분리정제공정 개발 등을 들 수 있다.
항체의 경우, 현재 허가를 거쳐 시판되고 있는 모든 항체 제품은 동물세포를 host로 이용하여 생산된다. 상기 동물 세포는 안전성이 검증되고 항체 활성에 중요한 glycosylation이 정상적으로 이루어진다는 장점으로 인해, 항체 생산을 위한 가장 적합한 system으로 인정받고 있다. 그러나 동물세포는 성장속도가 느리고 생산성이 낮은 단점이 있다. 치료용 항체의 수요를 충족시키기 위한 방법 중의 하나로, 형질 전환을 이용한 연구가 진행되고 있으며, 이와 같은 전략은 낮은 생산성을 보완 할 수 있다고 평가된다.
항체와 같은 단백질의 의학적 및 경제적 중요성이 증가하면서, 이를 경제적이며 안정적으로 생산하기 위한 생산 공정 개발의 중요성 또한 증가하고 있다.
일 예는 지방산 결합 단백질 유전자의 과발현이 유도된 재조합 세포를 제공한다.
다른 예는 과발현이 유도된 지방산 결합 단백질 유전자 및 목적 폴리펩타이드의 유전자를 포함하는 재조합 세포를 제공한다. 상기 재조합 세포는 상기 목적 폴리펩타이드의 생산을 위한 재조합 세포일 수 있다.
다른 예는 상기 재조합 세포, 지방산 결합 단백질 유전자를 포함하는 재조합 벡터 또는 이들의 조합을 포함하는 목적 폴리펩타이드 생산용 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 재조합 세포, 지방산 결합 단백질 유전자를 포함하는 재조합 벡터 또는 이들의 조합을 이용하여 목적 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 제공한다.
또 다른 예는 세포에서 지방산 결합 단백질 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 상기 세포에서의 목적 폴리펩타이드의 생산 증진 방법을 제공한다.
본 발명에서는 지방산 결합 단백질 (fatty acid binding protein)을 과발현시킴으로써 세포 내 단백질 생산량을 증가시킬 수 있음을 제안한다.
이에, 본 발명의 일 예는 지방산 결합 단백질 (fatty acid binding protein) 유전자의 과발현이 유도된 재조합 세포를 제공한다.
다른 예는 과발현이 유도된 지방산 결합 단백질 유전자 및 목적 폴리펩타이드의 유전자를 포함하는 재조합 세포를 제공한다. 상기 재조합 세포는 상기 목적 폴리펩타이드의 생산을 위한 재조합 세포일 수 있다.
다른 예는 상기 재조합 세포, 지방산 결합 단백질 유전자 재조합 벡터 또는 이들의 조합을 포함하는 목적 폴리펩타이드 생산용 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 재조합 세포, 지방산 결합 단백질 유전자 재조합 벡터 또는 이들의 조합을 이용하여 목적 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 제공한다.
또 다른 예는 세포에서 지방산 결합 단백질 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 상기 세포에서의 목적 폴리펩타이드의 생산 증진 방법을 제공한다.
지방산 결합 단백질 (fatty acid binding proteins; FABPs)은 지방산 및 에이코사노이드 및 레티노이드와 같은 다른 친지성 물질의 운반 단백질로서, 세포내막(intracellular membrane)과 세포외막(extracellular membrane) 간의 지방산 운반에 관여한다. 상기 지방산 결합 단백질은 FABP1, FABP2, FABP3, FABP4, FABP5, FABP6 및 FABP7로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 지방산 결합 단백질은 모든 원핵세포 또는 진핵생물, 예컨대, 효모 또는 동물 (e.g., 포유류 등의 척추동물)로부터 유래한 것 또는 합성된 것일 수 있다.
예컨대, 상기 지방산 결합 단백질 영장목, 소목, 바다소목, 땅돼지과, 설치목, 고래목 (Cetacea), 박쥐목 (Chiroptera), 토끼목 (Lagomorpha), 곰과 (Ursidae), 두더지과 (Talpidae), 황금두더지과(Chrysochloridae), 족제비과(Mustelidae), 나무뒤쥐과(Tupaiidae), 개과, 고양이과, 코끼리과, 말과, 바다코끼리과 (Odobenidae), 코끼리땃쥐과 (Macroscelididae), 고슴도치과 (Erinaceidae), 물범과 (Phocidae), 아르마딜로과 (Dasypodidae), Ceratorium속 등으로 이루어진 군에서 선택된 포유류 유래의 FABP1, FABP2, FABP3, FABP4, FABP5, FABP6 및 FABP7, 및 이들과 80% 이상 (예컨대, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%)의 서열 상동성을 갖도록 합성된 합성 FABP1, FABP2, FABP3, FABP4, FABP5, FABP6 및 FABP7로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
한 구체예에서, 상기 지방산 결합 단백질은 인간(Homo sapiens), 침팬지 (Pan속), 고릴라 (Gorilla속), 원숭이 (예컨대, 긴팔원숭이속(Nomascus), Macaca속, 개코원숭이속(Papio), 다람쥐원숭이속(Saimiri), 긴꼬리원숭이과, 가죽날개원숭이과 (예컨대, Galeopterus속 등), 안경원숭이과(예컨대, Tarsius속 등) 등), 오랑우탄 (예컨대, Pongo속 등) 등의 영장목; 멧돼지과(Suidae; 예컨대, Sus속, Babyrousa속 등), 소과 (예컨대, Bos속, Pantholops속, Ovis속 등), 낙타과(예컨대, Camelus속 등) 등의 소목; 바다소목(예컨대, Trichechus속 등); 땅돼지과 (예컨대, Orycteropus속) 등); 쥐과 (Muridae; 예컨대, Mus속, Rattus속, Peromyscus속, Microtus속, Cricetulus속, Mesocricetus속, 등) 날쥐과(Dipodidae; 예컨대, Jaculus속 등), 기니피그과 (예컨대, Cavia속 등), 두더지쥐과(Bathyergidae; 예컨대, Heterocephalus속 등), 데구과 (Octodontidae; 예컨대, Octodon속 등), 친칠라과 (Chinchillidae; 예컨대, Chinchilla 속 등), 다람쥐과(Sciuridae; 예컨대, Ictidomys속 등) 등의 설치목; Balaenopteridae (예컨대, Balaenoptera속 등), Physeteridae (예컨대, Physeter속 등), Delphinidae (예컨대, Tursiops속, Orcinus속, 등), Lipotidae (예컨대, Lipotes속 등) 등의 고래목 (Cetacea); 곰과 (Ursidae; 예컨대, Ailuropoda속 등); 박쥐목 (Chiroptera; 예컨대, Eptesicus속 등); 두더지과 (Talpidae; 예컨대, Condylura속 등); 황금두더지과(Chrysochloridae; 예컨대, Chrysochloris속 동물); 족제비과(Mustelidae; 예컨대, Mustela속 등); 나무뒤쥐과(Tupaiidae; 예컨대, Tupaia속 등); 개과 (예컨대, Canis속 등); 고양이과 (예컨대, Felis속 등); 코끼리과 (예컨대, Loxodonta속 등); 말과 (예컨대, Equus속); 바다코끼리과 (Odobenidae; 예컨대, Odobenus속 등); 코끼리땃쥐과 (Macroscelididae; 예컨대, Elephantulus속 등); 고슴도치과 (Erinaceidae; 예컨대, Echinops속, Erinaceus속, 등); 물범과 (Phocidae; 예컨대, Leptonychotes속 등); 토끼목 (Lagomorpha; 예컨대, Oryctolagus속, Ochotona속, 등); 아르마딜로과 (Dasypodidae; 예컨대, Dasypus속 등); Ceratorium속 등으로 이루어진 군에서 선택된 포유류 유래의 FABP5 또는 이와 80% 이상 (예컨대, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%)의 서열 상동성을 갖도록 합성된 합성 FABP5일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 상기 지방산 결합 단백질은 인간(Homo sapiens), 침팬지 (Pan속), 고릴라 (Gorilla속), 원숭이 (예컨대, 긴팔원숭이속(Nomascus), Macaca속, 개코원숭이속(Papio), 다람쥐원숭이속(Saimiri), 긴꼬리원숭이과, 가죽날개원숭이과 (예컨대, Galeopterus속 등), 안경원숭이과(예컨대, Tarsius속 등) 등), 오랑우탄 (예컨대, Pongo속 등) 등의 영장목; 멧돼지과(Suidae; 예컨대, Sus속, Babyrousa속 등), 소과 (예컨대, Bos속, Pantholops속, Ovis속 등), 낙타과(예컨대, Camelus속 등) 등의 소목; 쥐과 (Muridae; 예컨대, Mus속, Rattus속, Peromyscus속, Microtus속, Cricetulus속, Mesocricetus속, 등) 날쥐과(Dipodidae; 예컨대, Jaculus속 등), 기니피그과 (예컨대, Cavia속 등), 두더지쥐과(Bathyergidae; 예컨대, Heterocephalus속 등), 데구과 (Octodontidae; 예컨대, Octodon속 등), 친칠라과 (Chinchillidae; 예컨대, Chinchilla 속 등), 다람쥐과(Sciuridae; 예컨대, Ictidomys속 등) 등의 설치목; 박쥐목 (Chiroptera; 예컨대, Eptesicus속 등); 개과 (예컨대, Canis속 등); 고양이과 (예컨대, Felis속 등); 코끼리과 (예컨대, Loxodonta속 등); 말과 (예컨대, Equus속); 아르마딜로과 (Dasypodidae; 예컨대, Dasypus속 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 포유류 유래의 FABP1, FABP2, FABP3, FABP4, FABP6 및 FABP7, 및 이들과 80% 이상 (예컨대, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%)의 서열 상동성을 갖도록 합성된 합성 FABP1, FABP2, FABP3, FABP4, FABP6 및 FABP7로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
지방산 결합 단백질 (FABPs)에 포함되는 단백질들을 아래의 표 1에 정리하였다:
FABP1
Description Accession No. (protein) Accession No. (gene; mRNA)
[Homo sapiens] 2F73_A
[Homo sapiens] 2PY1_A
[Homo sapiens] NP_001434.1 NM_001443.2
[synthetic construct] AAX37108.1 AY894071.1
[Gorilla gorilla gorilla] XP_004029642.1 XM_004029594.1
[Homo sapiens] AAA52418.1 M10050.1
[Homo sapiens] 2L67_A
[Homo sapiens] 3STK_A
[Homo sapiens] AAH22287.1 BC022287.1
[Nomascus leucogenys] XP_003268834.1 XM_003268786.2
[Pongo abelii] NP_001125017.1 NM_001131545.1
[Macaca fascicularis] XP_005575408.1 XM_005575351.1
[Macaca fascicularis] EHH55732.1 CM001288.1
[Papio anubis] XP_003908995.1 XM_003908946.1
[Sus scrofa] ACA48587.1 EU477533.1
[Sus scrofa] NP_001004046.1 NM_001004046.1
[Bos taurus] NP_787011.1 NM_175817.3
[Mus musculus] NP_059095.1 NM_017399.4
[Rattus norvegicus] NP_036688.1 NM_012556.2
[Cricetulus griseus] XP_003503959.1 XM_003503911.1
[Rattus norvegicus] 1LFO_A
FABP2
Description Accession No. (protein) Accession No. (gene; mRNA)
[Homo sapiens] NP_000125.2 NM_000134.3
[Homo sapiens] P12104.2
[Homo sapiens] 1KZX_A
[Gorilla gorilla gorilla] XP_004040374.1 XM_004040326.1
[Homo sapiens] 3IFB_A
[Pan troglodytes] XP_001149448.1 XM_001149448.2
[Homo sapiens] 1KZW_A
[Pongo abelii] XP_002815138.1 XM_002815092.1
[Macaca mulatta] XP_001099243.1 XM_001099243.2
[Chlorocebus sabaeus] XP_007997860.1 XM_007999669.1
[Nomascus leucogenys] XP_003271368.1 XM_003271320.2
[Papio anubis] XP_003899177.1 XM_003899128.1
[Sus scrofa] NP_001026950.1 NM_001031780.1
[Canis lupus familiaris] XP_545047.1 XM_545047.4
[Sus scrofa] AAZ38898.1 DQ126268.1
[Bos taurus] NP_001020503.1 NM_001025332.1
[Cricetulus griseus] XP_003511524.1 XM_003511476.2
[Rattus norvegicus] NP_037200.1 NM_013068.1
[Rattus norvegicus] 1AEL_A
[Rattus norvegicus] 1ICN_A
[Rattus norvegicus] 1T8V_A
[Rattus norvegicus] 1DC9_A
[Cricetulus griseus] XP_003511525.1 XM_003511477.2
[Rattus norvegicus] AAA41138.1 K01180.1
[Mus musculus] NP_032006.1 NM_007980.3
[Cricetulus griseus] ERE88589.1 KE665664.1
[Cricetulus griseus] ERE88587.1 KE665664.1
[Cricetulus griseus] ERE88588.1 KE665664.1
FABP3
Description Accession No. (protein) Accession No. (gene; mRNA)
[Homo sapiens] NP_004093.1 NM_004102.3
[synthetic construct] AAP36511.1 BT007839.1
[Homo sapiens] 3RSW_A
[Homo sapiens] 3WBG_A
[Nomascus leucogenys] XP_003276387.1 XM_003276339.1
[Homo sapiens] CAA71305.1 Y10255.1
[Homo sapiens] 1G5W_A
[Homo sapiens] 1714345A
[Papio anubis] XP_003891526.1 XM_003891477.1
[Felis catus] XP_003989843.1 XM_003989794.2
[Sus scrofa] ABR12603.1 EF619344.1
[Sus scrofa] NP_001093401.1 NM_001099931.1
[Bos taurus] ACN62389.1 FJ756345.1
[Bos taurus] NP_776738.1 NM_174313.2
[Sus scrofa] AEZ54788.1 JN646857.1
[Rattus norvegicus] NP_077076.1 NM_024162.1
[Mesocricetus auratus] XP_005079570.1 XM_005079513.1
[Bos taurus] 1BWY_A
[Cricetulus griseus] XP_007637557.1 XM_007639367.1
[Microtus ochrogaster] XP_005353215.1 XM_005353158.1
[Loxodonta africana] XP_003415499.1 XM_003415451.1
[Chinchilla lanigera] XP_005395077.1 XM_005395020.1
[Eptesicus fuscus] XP_008146180.1 XM_008147958.1
[Mus musculus] NP_034304.1 NM_010174.1
[Rattus norvegicus] AAF19003.1 AF144090.2
[Cricetulus griseus] XP_003498393.1 XM_003498345.2
[Mus musculus] CAA33084.1 X14961.1
[Homo sapiens] AAB29294.1 S67314.1
[Mus musculus] EDL21444.1
[Sus scrofa] XP_003127755.1 XM_003127707.3
[Sus scrofa] XP_003359943.1 XM_003359895.2
[Sus scrofa] AAT72764.1 AY569332.1
FABP4
Description Accession No. (protein) Accession No. (gene; mRNA)
[Homo sapiens] 3Q6L_A
[synthetic construct] AAP36447.1 BT007779.1
[Homo sapiens] NP_001433.1 NM_001442.2
[Homo sapiens] 3P6C_A
[Homo sapiens] 2HNX_A
[Homo sapiens] 1TOU_A
[Saimiri boliviensis boliviensis] XP_003940227.1 XM_003940178.1
[Nomascus leucogenys] XP_003269538.1 XM_003269490.2
[Macaca mulatta] NP_001252996.1 NM_001266067.1
[Chlorocebus sabaeus] XP_007999161.1 XM_008000970.1
[Pongo abelii] XP_002819258.1 XM_002819212.2
[Canis lupus familiaris] XP_850162.1 XM_845069.3
[Felis catus] XP_003999972.1 XM_003999923.2
[Cricetulus griseus] XP_003510122.1 XM_003510074.2
[Mus musculus] 2QM9_A
[Mus musculus] NP_077717.1 NM_024406.2
[Mus musculus] AAA39417.1 M13385.1
[Canis lupus familiaris] XP_003435639.1 XM_003435591.1
[Mus musculus] 2ANS_A
[Mus musculus] AAA39870.1 M13261.1, M13262.1, M13263.1, M13264.1
[Sus scrofa] NP_001002817.1 NM_001002817.1
[Rattus norvegicus] AAH84721.1 BC084721.1
[Equus przewalskii] XP_008533435.1 XM_008535213.1
[Rattus norvegicus] P70623.3
[Rattus norvegicus] AAB18344.1 U75581.1
[Mus musculus] 1A2D_A
[Rattus norvegicus] NP_445817.1 NM_053365.1
[Mus musculus] 1G74_A
[Mus musculus] 1AB0_A
[Bos mutus] XP_005897322.1 XM_005897260.1
[Bos grunniens] ACF24766.1 EU815937.1
[Mus musculus] 1ACD_A
[Bos taurus] NP_776739.1 NM_174314.2
[Bos taurus] DAA22709.1
[Mus musculus] AAA37112.1 M28726.1
[Sus scrofa] ABK58165.1 EF061482.1
FABP5
Description Accession No. (protein) Accession No. (gene; mRNA)
[Homo sapiens] 4LKP_A
[Homo sapiens] NP_001435.1 NM_001444.2
[Homo sapiens] 4AZM_A
[Homo sapiens] 4AZR_A
[syntic construct] AIC54370.1 KJ896796.1
[Pongo abelii] XP_002819257.1 XM_002819211.1
[Macaca mulatta] NP_001247718.1 NM_001260789.1
[Saimiri boliviensis boliviensis] XP_003940229.1 XM_003940180.1
[Pan troglodytes] XP_003310774.1 XM_003310726.2
[Pongo abelii] XP_002823444.1 XM_002823398.2
[Galeopterus variegatus] XP_008579846.1 XM_008581624.1
[Tarsius syrichta] XP_008051492.1 XM_008053301.1
[Equus caballus] XP_001489506.1 XM_001489456.3
[Orycteropus afer afer] XP_007942846.1 XM_007944655.1
[Macaca mulatta] XP_001087630.1 XM_001087630.2
[Nomascus leucogenys] XP_003270168.1 XM_003270120.1
[Tupaia chinensis] XP_006168992.1 XM_006168930.1
[Macaca fascicularis] XP_005548521.1 XM_005548464.1
[Bos taurus] NP_776740.1 NM_174315.3
[Jaculus jaculus] XP_004656951.1 XM_004656894.1
[Pan troglodytes] XP_527993.1 XM_527993.4
[Octodon degus] XP_004643132.1 XM_004643075.1
[Camelus ferus] XP_006193989.1 XM_006193927.1
[Otolemur garnettii] XP_003782576.1 XM_003782528.1
[Trichechus manatus latirostris] XP_004386056.1 XM_004385999.1
[Pantholops hodgsonii] XP_005957592.1 XM_005957530.1
[Ailuropoda melanoleuca] AFJ19860.1 JN008912.1
[Condylura cristata] XP_004679831.1 XM_004679774.1
[Ceratorium simum simum] XP_004427200.1 XM_004427143.1
[Nomascus leucogenys] XP_003268521.1 XM_003268473.1
[Physeter catodon] XP_007125410.1 XM_007125348.1
[Chrysochloris asiatica] XP_006830871.1 XM_006830808.1
[Ictidomys tridecemlineatus] XP_005336065.1 XM_005336008.1
[Mustela putorius furo] XP_004799229.1 XM_004799172.1
[Heterocephalus glaber] XP_004842062.1 XM_004842005.1
[Felis catus] XP_003999969.1 XM_003999920.2
[Cavia porcellus] NP_001166563.1 NM_001173092.1
[Macaca fascicularis] EHH65134.1
[Bos taurus] AAB41297.1 U55188.1
[Pan paniscus] XP_003815828.1 XM_003815780.1
[Odobenus rosmarus divergens] XP_004393791.1 XM_004393734.1
[Elephantulus edwardii] XP_006895825.1 XM_006895763.1
[Ovis aries] NP_001138652.1 NM_001145180.1
[Macaca fascicularis] XP_005560393.1 XM_005560336.1
[Ictidomys tridecemlineatus] XP_005319727.1 XM_005319670.1
[Echinops telfairi] XP_004697555.1 XM_004697498.1
[Peromyscus maniculatus bairdii] XP_006977941.1 XM_006977879.1
[Cavia porcellus] XP_005008261.1 XM_005008204.1
[Jaculus jaculus] XP_004656952.1 XM_004656895.1
[Balaenoptera acutorostrata scammoni] XP_007185162.1 XM_007185100.1
[Mustela putorius furo] XP_004786246.1 XM_004786189.1
[Octodon degus] XP_004643133.1 XM_004643076.1
[Ictidomys tridecemlineatus] XP_005334869.1 XM_005334812.1
[Ailuropoda melanoleuca] XP_002916782.1 XM_002916736.1
[Eptesicus fuscus] XP_008155028.1 XM_008156806.1
[Ictidomys tridecemlineatus] XP_005336066.1 XM_005336009.1
[Odobenus rosmarus divergens] XP_004411273.1 XM_004411216.1
[Heterocephalus glaber] XP_004842063.1 XM_004842006.1
[Babyrousa babyrussa] ABY84518.1 EU326154.1
[Leptonychotes weddellii] XP_006739934.1 XM_006739871.1
[Microtus ochrogaster] XP_005361864.1 XM_005361807.1
[Mustela putorius furo] XP_004770576.1 XM_004770519.1
[Mesocricetus auratus] XP_005066845.1 XM_005066788.1
[Chrysochloris asiatica] XP_006868522.1 XM_006868460.1
[Leptonychotes weddellii] XP_006727779.1 XM_006727716.1
[Sus scra] NP_001034835.1 NM_001039746.2
[Oryctolagus cuniculus] XP_008253914.1 XM_008255692.1
[Tursiops truncatus] XP_004328339.1 XM_004328291.1
[Odobenus rosmarus divergens] XP_004410341.1 XM_004410284.1
[Cricetulus griseus] ERE81730.1 KE670716.1
[Microtus ochrogaster] XP_005362651.1 XM_005362594.1
[Lipotes vexillifer] XP_007461751.1 XM_007461689.1
[Dasypus novemcinctus] XP_004479162.1 XM_004479105.1
[Orcinus orca] XP_004276220.1 XM_004276172.1
[Microtus ochrogaster] XP_005361865.1 XM_005361808.1
[Heterocephalus glaber] XP_004889917.1 XM_004889860.1
[Homo sapiens] EAW87089.1
[Mesocricetus auratus] XP_005066846.1 XM_005066789.1
[Erinaceus europaeus] XP_007520209.1 XM_007520147.1
[Ovis aries] ABB46354.1 DQ223551.1
[Leptonychotes weddellii] XP_006731991.1 XM_006731928.1
[Mus musculus] 4AZO_A
[Mus musculus] 4AZN_A
[Mus musculus] 4AZP_A
[Mus musculus] NP_034764.1 NM_010634.3
[Rattus norvegicus] P55053.3
[Heterocephalus glaber] EHB01883.1
[Leptonychotes weddellii] XP_006726940.1 XM_006726877.1
[Ochotona princeps] XP_004588173.1 XM_004588116.1
[Rattus sp.] AAB46848.1 S83247.1
[Rattus norvegicus] NP_665885.1 NM_145878.1
[Mus musculus] NP_001259026.1 NM_001272097.1
[Mustela putorius furo] XP_004779298.1 XM_004779241.1
[Mus musculus] EDL09529.1
[Sus scra] ABF71383.1 DQ523617.1
[Pan paniscus] XP_003831320.1 XM_003831272.1
[Ailuropoda melanoleuca] EFB15275.1
[Mustela putorius furo] XP_004810031.1 XM_004809974.1
[Octodon degus] XP_004627642.1 XM_004627585.1
[Canis lupus familiaris] XP_005642139.1 XM_005642082.1
FABP6
Description Accession No. (protein) Accession No. (gene; mRNA)
[Homo sapiens] NP_001035532.1
[Homo sapiens] EAW61564.1
[Pan troglodytes] XP_009448348.1
[Nomascus leucogenys] XP_003268649.1
[Homo sapiens] EAW61566.1
[Macaca mulatta] EHH26995.1
[Homo sapiens] XP_006714892.1
[Macaca mulatta] XP_001083965.2
[Homo sapiens] NP_001436.1
[Homo sapiens] 2MM3_A
[Homo sapiens] EAW61565.1
[Pongo abelii] XP_002816192.1
[Homo sapiens] 1O1U_A
[Homo sapiens] AAH22489.1
[Macaca mulatta] XP_001083748.1
[Chlorocebus sabaeus] XP_008013379.1
[Saimiri boliviensis boliviensis] XP_003934804.1
[Papio anubis] XP_009207781.1
[Mesocricetus auratus] XP_005071980.1
[Cricetulus griseus] XP_007612523.1
[Canis lupus familiaris] XP_536447.1
[Mus musculus] NP_032401.1
[Rattus norvegicus] NP_058794.1
[Rattus norvegicus] EDM04137.1
[Rattus norvegicus] P80020.3
[Mesocricetus auratus] XP_005071979.1
[Sus scrofa] P10289.3
[Sus scrofa] XP_005672631.1
[Sus scrofa] NP_999380.2
[Sus scrofa] 1EIO_A
[Sus scrofa] 1EAL_A
[Bos mutus] ELR55136.1
[Bos taurus] NP_001069143.1
[Cricetulus griseus] EGW03057.1
[Cricetulus griseus] XP_007641020.1
FABP7
Description Accession No. (protein) Accession No. (gene; mRNA)
[Homo sapiens] NP _001437.1 NM_001446.3
[Homo sapiens] CAG33338.1 CR457057.1
[Pan troglodytes] XP_527495.1 XM_527495.5
[Pan troglodytes] XP_009450199.1 XM_009451924.1
[Homo sapiens] BAA23324.1 D50373.1
[Homo sapiens] 1FDQ_A, 1FDQ_B
[Nomascus leucogenys] XP_003255695.1 XM_003255647.1
[Macaca mulatta] NP_001244643.1 NM_001257714.1
[Pongo abelii] XP_002817362.1 XM_002817316.3
[Sus scrofa] NP_001020400.1 NM_001025229.1
[Felis catus] XP_003986566.1 XM_003986517.2
[Bos taurus] NP_001071630.1 NM_001078162.2
[Bos taurus] DAA26338.1 GJ061656.1
[Bos taurus] AAI18370.1 BC118369.1
[Canis lupus familiaris] XP_533484.2 XM_533484.4
[Rattus norvegicus] NP_110459.1 NM_030832.2
[Cricetulus griseus] XP_003504260.1 XM_003504212.1
[Homo sapiens] XP_005266915.1 XM_005266858.2
[Homo sapiens] EAW48165.1
[Mus musculus] NP_067247.1 NM_021272.3
[Mus musculus] EDL05123.1
[Mesocricetus auratus] XP_0050331.1
[Mus musculus] CAI35910.1
예컨대, 상기 지방산 결합 단백질은 상기 표 1에 기재된 단백질, 이들 단백질의 아미노산 서열과 65% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 것으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 예에서, 상기 지방산 결합 단백질은 FABP5 또는 이들의 아미노산 서열과 65% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 것으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 명세서에서 지방산 결합 단백질 유전자는 지방산 결합 단백질을 암호화하는 전장 DNA, cDNA, 또는 mRNA를 의미하는 것일 수 있다. 구체적인 지방산 결합 단백질 유전자(전장 DNA, cDNA, 또는 mRNA)는 앞서 설명한 지방산 결합 단백질 또는 유전자의 등재 번호를 참조하여 정의될 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 지방산 결합 단백질 유전자는 상기한 지방산 결합 단백질의 유전자 및 이들 지방산 결합 단백질 유전자의 염기 서열과 65% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 것으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 지방산 결합 단백질 유전자의 과발현의 유도는 i) 숙주 세포 게놈 내의 지방산 결합 단백질 유전자(내재 유전자)의 복제수를 증가시키거나, ii) 숙주 세포 게놈 유전자에 외래의 지방산 결합 단백질 유전자를 추가로 도입(삽입)하여 전사체의 수를 증가시키거나, iii) 숙주 세포 게놈의 지방산 결합 단백질 유전자와 작동 가능하게 연결된 발현 시스템에 상기 숙주세포에서의 발현 효율이 높은 프로모터(strong promoter) 및/또는 인핸서 (enhancer) 등을 도입시킴으로써 상기 발현 시스템에 작동 가능하게 연결된 지방산 결합 단백질 유전자의 발현 효율을 높이는 등의 방법으로 수행될 수 있다.
상기 숙주 세포에 도입되는 외래의 지방산 결합 단백질 유전자는 숙주 세포와 동일한 종 또는 상이한 종에서 유래하는 것일 수 있다.
상기 외래의 지방산 결합 단백질 유전자의 도입은 통상적인 모든 유전자 도입 방법에 의할 수 있으며, 예컨대, 외래의 지방산 결합 단백질 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 숙주 세포에 도입시킴으로써 수행되는 것일 수 있다. 상기 지방산 결합 단백질 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 통상의 발현 시스템 내에 지방산 결합 단백질 유전자를 포함하는 것이거나, 지방산 결합 단백질 유전자 발현을 보다 증가시키기 위하여, 숙주 세포에서의 발현 효율이 높은 프로모터 및/또는 인핸서를 포함하고, 여기에 작동 가능하게 연결된 지방산 결합 단백질 유전자를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 재조합 세포는 지방산 결합 단백질 유전자 이외에 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드의 유전자를 추가로 포함하여 상기 목적 폴리펩타이드를 생산하기 위한 세포로 사용될 수 있다. 이 때, 상기 목적 폴리펩타이드의 유전자는 숙주 세포 게놈에 존재하는 유전자이거나, 별도의 재조합 벡터를 통하여 도입된 외래 유전자일 수 있다. 상기 목적 폴리펩타이드의 유전자가 외래 유전자인 경우 (숙주세포와 동종 또는 이종 유래), 상기 지방산 결합 단백질 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 함께 포함되어 도입되거나, 별도의 재조합 벡터를 통하여 숙주 세포에 도입될 수 있다.
상기 목적 폴리펩타이드의 유전자가 지방산 결합 단백질 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 포함되어 도입되는 경우, 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서의 지방산 결합 단백질 유전자 copy수를 증가시켜 숙주 세포에서의 지방산 결합 단백질 과발현을 유도하여, 함께 포함된 목적 폴리펩타이드의 생산을 증진시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 예는 목적 폴리펩타이드의 유전자 및 지방산 결합 단백질 유전자를 포함하는, 목적 폴리펩타이드의 발현을 위한 발현 벡터를 제공한다.
상기 재조합 벡터에 있어서, 지방산 결합 단백질 유전자 및/또는 목적 폴리펩타이드 유전자는 프로모터, 전사 종결 서열 등의 통상적인 유전자 발현 조절 서열과 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 유전자 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합(cis)을 의미한다. 상기 유전자 발현 조절 서열은 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다. 상기 재조합 벡터에 있어서, 유전자 발현 조절 인자가 상기 지방산 결합 단백질 유전자 및/또는 목적 폴리펩타이드의 유전자 (목적 유전자)에 작동 가능하게 연결되기 위해서, 상기 유전자 발현 조절 서열은 상기 지방산 결합 단백질 유전자 및/또는 목적 폴리펩타이드의 유전자의 5' 말단 쪽에 연결된 것일 수 있다.
상기 프로모터는 특정 유전자의 전사 개시를 조절하는 전사 조절 서열 중 하나로, 통상적으로 약 100 내지 약 2500 bp 길이의 폴리뉴클레오타이드 단편이다. 일 구체예에서, 상기 프로모터는 세포, 예컨대, 바이러스 세포, 박테리아 세포, 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 또는 동물 세포 (e.g., 포유류 세포)에서 전사 개시를 조절할 수 있으면, 제한 없이 사용 가능하다. 예컨대, 상기 프로모터는 CMV 프로모터 (cytomegalovirus promoter; (예컨대, CMV immediate-early 프로모터), SV40 프로모터, 아데노바이러스 프로모터(major late promoter), pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, HSV의 tk 프로모터, SV40E1 프로모터, 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory syncytial virus; RSV) 프로모터, 등의 원핵 세포 또는 포유류 바이러스의 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터(metallothionin promoter), 베타-액틴 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, EF1-알파 (elongation factor 1-alpha) 프로모터, 인간 IL-2 (human interleukin-2) 유전자 프로모터, 인간 림포톡신(human lymphotoxin) 유전자 프로모터, 인간 GM-CSF (human granulocyte-macrophage colony stimulating factor) 유전자 프로모터 등의 동물 세포 프로모터 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예에서, 상기 프로모터는 인간 CMV immediate-early 프로모터, 마우스 CMV immediate-early 프로모터, 인간 유비퀴틴 C 프로모터, 또는 이들 프로모터 중 어느 하나와 인트론이 융합된 융합 프로모터일 수 있다.
용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 모든 수단을 의미한다. 상기 벡터는 목적 유전자 발현을 위한 요소 (elements)를 포함하는 것으로, 복제원점 (replication origin), 프로모터, 작동 유전자 (operator), 전사 종결 서열 (terminator) 등을 포함할 수 있고, 숙주 세포의 게놈 내로의 도입을 위한 적절한 효소 부위 (예컨대, 제한 효소 부위) 및/또는 숙주 세포 내로의 성공적인 도입을 확인하기 위한 선별 마커 및/또는 단백질로의 번역을 위한 리보좀 결합 부위 (ribosome binding site; RBS) 등을 추가로 포함할 수 있다 (도 1 참조). 상기 재조합 벡터는 프로모터 이외의 전사 조절 서열을 추가로 포함할 수 있다.
상기 전사 종결 서열은 폴리아데닐화 서열(pA) 등일 수 있고, 상기 복제 원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, BBV 복제원점 등일 수 있다.
또한, 상기 재조합 벡터는 선별 마커를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 재조합 벡터가 숙주 세포 내에 성공적으로 도입되었는지 여부를 확인하거나, 안정적인 세포주 구축을 위한 유전자로서, 예컨대 항생제와 같은 약물 저항 유전자, 대사 관련 유전자, 유전자 증폭 유전자 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 선별 마커는 본 발명의 핵심적 기술인 벡터의 최적의 조합에 따른 발현 효율에 크게 영향을 미치는 요소가 아니므로, 선별 마커로서 일반적으로 사용되는 모든 유전자 (예컨대, 항생제 저항 유전자 및/또는 대사 관련 효소 유전자 등)를 제한 없이 사용할 수 있다. 예컨대, 상기 선별 마커는 암피실린(ampicilin) 저항 유전자, 테트라사이클린(tetracyclin) 저항 유전자, 카나마이신(kanamycin) 저항 유전자, 클로람페니콜(chloroamphenicol) 저항 유전자, 스트렙토마이신 (streptomycin) 저항 유전자, 네오마이신(neomycin) 저항 유전자, 블라스티시딘(Blasticidin) 저항 유전자, 제오신(Zeocin) 저항 유전자, 하이그로마이신(Hygromycin) 저항 유전자, 퓨로마이신 (Puromycin) 저항 유전자, 티미딘 키나아제 (TK) 유전자, 디하이드로폴레이트 환원효소 (Dihydrofolate reductase, DHFR) 유전자, 글루타민 합성효소 (Glutamine synthetase, GS) 유전자 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예컨대, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pcDNA 시리즈, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1, M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 기본으로 하여 제작될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 지방산 결합 단백질 유전자의 발현을 증진시키기 위하여, 상기 재조합 세포 또는 재조합 벡터는 인핸서(enhancer)를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 인핸서는 유전자의 전사를 활성화시키는 단백질 (예컨대, 전사조절인자)과 결합 가능한 약 50 내지 150bp 정도의 DNA 단편으로, 일반적으로 cis-작용성이다. 예컨대, 상기 인핸서는 CMV 인핸서 (예컨대, cytomegalovirus early enhancer element), SV40 인핸서, hTERT (human telomerase reverse transcriptase) 인핸서 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 재조합 세포는 지방산 결합 단백질 유전자 및/또는 목적 폴리펩타이드 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 숙주 세포 내로 도입된 것을 의미할 수 있다. 이 때, 지방산 결합 단백질 유전자와 목적 폴리펩타이드 유전자는 하나의 재조합 벡터에 포함되거나 별개의 벡터에 포함되어 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
상기 숙주 세포로는 재조합 벡터에 포함된 프로모터가 작동 가능하고(즉, 전사 개시 기능을 나타낼 수 있고), 지방산 결합 단백질 유전자의 염색체 내 통합 (삽입) 및/또는 목적 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 모든 종류의 원핵 또는 진핵 동물 (예컨대, 포유류) 세포가 사용될 수 있다. 예컨대, 본 발명을 위해 적합한 포유동물 숙주 세포는 마우스 (예컨대, COP, L, C127, Sp2/0, NS-0, NS-1, At20, 또는 NIH3T3), 래트 (예컨대, PC12, PC12h, GH3, 또는 MtT), 햄스터 (예컨대, BHK, CHO, GS 유전자 결함 CHO, 또는 DHFR 유전자 결함 CHO), 원숭이 (예컨대, COS1, COS3, COS7, CV1 또는 Vero), 인간 (예컨대, HeLa, HEK-293, 망막-유래 PER-C6, 이배체 섬유모세포로부터 유래된 세포, 골수종 세포 또는 HepG2) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으니, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 숙주 세포는 생체에서 분리된 것일 수 있다.
상기 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예컨대, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 발현 벡터가 도입된 재조합 세포(형질전환체)를 선별하는 방법은 통상적인 선별 마커를 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예컨대, 상기 선별 마커가 앞서 설명한 바와 같은 특정 항생제 저항 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 상기 세포를 배양함으로써 재조합 벡터가 도입된 재조합 세포를 용이하게 선별할 수 있다.
다른 예에서, 상기 지방산 결합 단백질 유전자의 과발현이 도입된 재조합 세포 및/또는 지방산 결합 단백질 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 목적 폴리펩타이드 생산 증진 용도가 제공된다. 구체적으로, 지방산 결합 단백질 유전자의 과발현이 도입된 재조합 세포, 지방산 결합 단백질 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 또는 이들의 조합을 포함하는 목적 폴리펩타이드 생산용 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 목적 폴리펩타이드를 상기 재조합 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는 목적 폴리펩타이드의 생산 방법을 제공한다. 상기 발현시키는 단계는 상기 재조합 세포를 상기 목적 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 조건 및 세포 배양 배지 내에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 생산 방법은 상기 발현시키는 단계 또는 배양하는 단계 이후에, 상기 목적 폴리펩타이드를 수득(분리)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 폴리펩타이드의 수득(분리) 단계는 상기 재조합 세포의 파쇄물 및/또는 상기 배양 배지(폴리펩타이드가 배지로 분비되는 경우)로부터 폴리펩타이드를 분리하는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 상기 생산 방법은 수득된 폴리펩타이드가 목적하는 품질 및/또는 순도를 갖도록 하기 위한 추가의 처리 단계, 예컨대, 정제 및/또는 변형 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 목적 폴리펩타이드가 질병 또는 병적 증상의 예방, 치료 및/또는 경감과 관련된 기능을 갖는 것(예컨대, 항체, 치료용 단백질 등)인 경우, 본 발명의 다른 예는 상기 지방산 결합 단백질 유전자 및 상기 목적 폴리펩타이드 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 지방산 결합 단백질 유전자 및 상기 목적 폴리펩타이드 유전자를 포함하는 재조합 세포, 및 상기 재조합 세포의 배양물 (세포 포함 또는 무세포)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 사용된 용어 "목적 폴리펩타이드"는 숙주 세포에서 발현(생산)시키고자 하는 폴리펩타이드를 의미하는 것으로, 이 때 폴리펩타이드는 펩타이드 결합(들)에 의해 함께 연결된 아미노산의 중합체를 포함하는 분자를 의미한다. 폴리펩타이드는 펩타이드 (예컨대, 2 내지 49개의 아미노산 포함) 또는 임의의 길이의 단백질 (예컨대, 50개의 아미노산 이상 포함) 일 수 있다. 상기 목적 폴리펩타이드의 유전자는 숙주 세포 이외의 소스에서 유래하는 외래 유전자일 수 있다.
본 발명에서의 "목적 폴리펩타이드"는 생체에서 목적하는 활성 (예컨대 특정 질병 또는 증상의 예방, 경감, 및/또는 치료 활성 또는 생체 필요 물질을 대체하는 활성)을 갖는 단백질 및/또는 펩타이드일 수 있으며, 예컨대, 효소 활성의 단백질 또는 펩타이드 (예컨대, 프로테아제, 키나제, 포스파타제 등), 수용체 단백질 또는 펩타이드, 수송체 단백질 또는 펩타이드, 살균 및/또는 내독소-결합 폴리펩타이드, 구조 단백질 또는 펩타이드, 면역 폴리펩타이드, 독소, 항생제, 호르몬, 성장 인자, 백신 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 예에서, 상기 목적 폴리펩타이드는 호르몬, 사이토카인, 조직 플라스미노겐 활성인자, 면역글로불린 (예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 변이체) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 면역글로불린은 임의의 이소타입 (예컨대, IgA, IgD, IgG, IgM 또는 IgE)의 것일 수 있으며, 예컨대, IgG (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4) 분자일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 본래 항체의 항원 결합 능력을 보유하는 단편으로, 약 20개 이상의 아미노산, 예컨대, 약 100개 이상의 아미노산을 포함하는 항체의 임의의 단편일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 항체의 항원 결합 부위, 예컨대, CDS, Fab 단편, F(ab)2 단편, Fv, scFv, 다수의 결합 도메인을 포함하는 멀티바디 (multibody) (예컨대, 디아바디 (diabody), 트리아바디 (triabody), 테트라바디 (tetrabody) 등), 단일 도메인 항체, 애피바디 (affibody) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이 상일 수 있다. 상기 항체 변이체는 항체와 동일한 결합 기능을 갖지만 본래 항체와 변경된 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편의 유도체이다. 상기 항체 및/또는 항원 결합 단편은 예컨대, 마우스 항체, 인간 항체, 키메라 (chimera) 항체, 또는 인간화 항체일 수 있다. 상기 항체의 중쇄 (또는 중쇄가변부위)와 경쇄 (또는 경쇄가변부위)는 하나의 벡터를 통하여 함께 또는 각각 별개의 벡터를 통하여 독립적으로 재조합 세포 내에 도입될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 목적 폴리펩타이드는 인슐린, 사람 성장 호르몬(hGH), 인슐린-유사 성장 인자, EGF, VERF 등의 각종 성장 인자, 각종 수용체, 조직 플라스미노겐 활성인자(tPA), 에리트로포이에틴(EPO), 사이토카인 (예컨대, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18과 같은 인터루킨), 인터페론(IFN)-알파, -베타, -감마, -오메가 또는 -타우, TNF-알파, 베타 또는 감마와 같은 종양 괴사 인자(TNF), TNF-관련 세포자멸사 유도 리간드 (TNF-related apoptosis-inducing ligand; TRAIL), G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 상기 목적 폴리펩타이드는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
상기 항 c-Met 항체는 c-Met의 특정 부위, 예컨대 SEMA 도메인 내의 특정 부위를 에피토프로 인식하는 것일 수 있으며, c-Met에 작용하여 세포내이동(internalization) 및 분해(degradation)를 유도하는 모든 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다.
HGF(Hepatocyte growth factor)의 수용체인 c-Met은 세포외 부위, 막투과 부위, 세포내 부위의 세 부분으로 구분되며, 세포외 부위의 경우, 이황화 결합에 의해 α-소단위체와 β-소단위체가 연결된 형태로 HGF 결합 도메인인 SEMA 도메인, PSI 도메인(plexin-semaphorins-integrin homology domain) 및 IPT 도메인(immunoglobulin-like fold shared by plexins and transcriptional factors domain)으로 이루어진다. c-Met 단백질의 SEMA 도메인은 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, c-Met의 세포외 부위에 존재하는 도메인으로서, HGF가 결합하는 부위에 해당한다. SEMA 도메인 중에서 특정 부위, 예컨대, 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 영역은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프 중 2번과 3번 프로펠러 도메인 사이의 루프(loop) 부위에 해당하며, 본 발명에서 제안되는 항 c-Met 항체의 에피토프로 작용할 수 있다.
용어, "에피토프(epitope)"는 항원 결정 부위(antigenic determinant)로서, 항체에 의해 인지되는 항원의 일부분을 의미하는 것으로 해석된다. 일 구체예에 따르면, 상기 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 연속하는 5개 이상의 아미노산을 포함하는 부위, 예컨대, c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71 내에 위치하는 연속하는 5개 내지 19개의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 에피토프는 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하여 연속하는 5 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다.
상기 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 2번과 3번 프로펠러 구조의 도메인 사이의 루프 부위 중 가장 바깥으로 위치한 부위에 해당하며, 상기 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 일 구체예에 따른 항체 또는 항원 결합 단편이 가장 특이적으로 결합하는 부위이다.
따라서, 항 c-Met 항체는 서열번호 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하는 연속하는 5 내지 19개의 아미노산을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72, 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는,
서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR), 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;
서열번호 7의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 15의 아미노산 서열, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;
상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는
상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합
을 포함하고,
상기 서열번호 4 내지 서열번호 9는 각각 하기 일반식 Ⅰ 내지 일반식 Ⅵ으로 표시되는 아미노산 서열인 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다:
일반식 Ⅰ
Xaa1-Xaa2-Tyr-Tyr-Met-Ser (서열번호 4),
일반식 Ⅱ
Arg-Asn-Xaa3-Xaa4-Asn-Gly-Xaa5-Thr (서열번호 5),
일반식 Ⅲ
Asp-Asn-Trp-Leu-Xaa6-Tyr (서열번호 6),
일반식 Ⅳ
Lys-Ser-Ser-Xaa7-Ser-Leu-Leu-Ala-Xaa8-Gly-Asn-Xaa9-Xaa10-Asn-Tyr-Leu-Ala (서열번호 7)
일반식 Ⅴ
Trp-Xaa11-Ser-Xaa12-Arg-Val-Xaa13 (서열번호 8)
일반식 Ⅵ
Xaa14-Gln-Ser-Tyr-Ser-Xaa15-Pro-Xaa16-Thr (서열번호 9)
상기 일반식 Ⅰ에서, Xaa1은 존재하지 않거나 Pro 또는 Ser이고, Xaa2는 Glu 또는 Asp이며,
상기 일반식 Ⅱ에서, Xaa3은 Asn 또는 Lys이며, Xaa4는 Ala 또는 Val이고, Xaa5는 Asn 또는 Thr이며,
상기 일반식 Ⅲ에서, Xaa6은 Ser 또는 Thr이고,
상기 일반식 Ⅳ에서, Xaa7은 His, Arg, Gln 또는 Lys이고, Xaa8은 Ser 또는 Trp이고, Xaa9은 His 또는 Gln이며, Xaa10는 Lys 또는 Asn이고,
상기 일반식 Ⅴ에서, Xaa11은 Ala 또는 Gly이며, Xaa12은 Thr 또는 Lys이고, Xaa13는 Ser 또는 Pro이며,
상기 일반식 Ⅵ에서, Xaa14은 Gly, Ala 또는 Gln이고, Xaa15는 Arg, His, Ser, Ala, Gly 또는 Lys이며, Xaa16는 Leu, Tyr, Phe 또는 Met이다.
일 구체예에서, 상기 CDR-H1은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-H2는 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-H3는 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 CDR-L1은 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-L2는 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-L3은 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은
서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H3)를 포함하는 중쇄 가변 영역;
서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
상기 중쇄 가변 영역과 상기 경쇄 가변 영역의 조합
을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 17, 서열번호 74, 서열번호 87, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 또는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 상기 중쇄 가변 영역, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 75, 서열번호 88, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99 또는 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 상기 경쇄 가변 영역, 또는 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 항 c-Met 항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00220인 하이브리도마 세포에서 생산되는, c-Met 단백질의 세포외 부위(extracellular region)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체일 수 있다 (대한민국 공개특허 제2011-0047698호 참조; 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함됨).
상기의 항 c-Met 항체는 대한민국 공개특허 제2011-0047698호에 정의된 항체를 모두 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는,
서열번호 62의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 64의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 66의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 및 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
서열번호 68의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 70의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 및 서열번호 108의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는 것일 수 있다.
예컨대, 상기 항-c-Met 항체는,
서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 또는
서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체
서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 및
서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체
로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항 c-Met 항체는 서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체일 수 있다.
한편, 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드는 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄이며, 서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드는 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에서 36번 (kabat numbering에 따름, 서열번호 68 내의 62번째 아미노산 위치) 히스티딘 (histidine)이 티로신 (tyrosine)으로 치환된 형태의 폴리펩타이드다. 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 생산량이 증가될 수 있다. 또한 상기 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드는 상기 서열번호 68의 아미노산 서열 중 1번째부터 20번째까지의 시그널 펩타이드를 제외한 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에서 kabat numbering에 의한 27e 위치(kabat numbering에 따름, 서열번호 108 내 32번째 위치; CDR-L1 내부)의 세린(Ser)이 트립토판(Trp)으로 치환된 것으로, 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 활성(예컨대, c-Met에 대한 결합친화도, c-Met 분해 활성 및 Akt 인산화 억제 활성 등)이 보다 증진될 수 있다.
상기 항 c-Met 항체의 앞서 정의된 CDR 부위 또는 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역을 제외한 부분, 예컨대 경쇄 불변 영역과 중쇄 불변 영역은 모든 서브타입의 면역글로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, 등)에서 유래한 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 본 발명에서의 항체의 항원 결합 단편은 상기한 상보성 결정 영역을 하나 이상 포함하는 항체 단편, 예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 목적 폴리펩타이드가 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 경우, 이를 암호화하는 목적 유전자는 상기 항 c-Met 항체의 앞서 설명한 중쇄 CDR 또는 경쇄 CDR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 앞서 설명한 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 앞서 설명한 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 목적 유전자는 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 63, 서열번호 65, 서열번호 67, 서열번호 69, 서열번호 76, 및 서열번호 77로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명은 지방산 결합 단백질의 과발현이 유도된 재조합 세포를 제공함으로써, 항체를 비롯한 다양한 치료용 단백질의 대량 생산에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 재조합 벡터를 모식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 FABP5 유전자 도입을 위한 재조합 벡터의 개열 지도이다.
도 3는 항 c-Met 항체 유전자 도입을 위한 재조합 벡터의 개열 지도이다.
도 4은 FABP5 유전자가 도입된 세포와 FABP5 유전자가 도입되지 않은 세포에서의 FABP5 mRNA 수준 차이를 보여주는 면역블라팅 결과이다.
도 5는 FABP5 유전자가 도입된 세포와 FABP5 유전자가 도입되지 않은 세포의 세포생존률(viability; %)를 보여주는 그래프이다.
도 6는 FABP5 유전자가 도입된 세포와 FABP5 유전자가 도입되지 않은 세포의 VCD(viable cell density)를 보여주는 그래프이다.
도 7은 FABP5 유전자가 도입된 세포와 FABP5 유전자가 도입되지 않은 세포에서의 항체 생산 정도를 보여주는 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재조합 세포 제작
지방산 결합 단백질 5 (FABP5) 유전자 (Human cDNA clone, NM_001444.2, Origene) 를 CHOK1SV GS Knockout (KO) host cell line (Sigma, CHOZN
Figure 112014105336816-pat00001
GS-/- ZFN-modified CHO cell line, #CHOGS, 글루타민 합성(GS) 유전자 넉아웃 시킴; 이하, 'GS-KO 세포')에 도입하여 FABP5 과발현 CHO 세포를 제작하였다.
FABP5 유전자(NM_001444.2)를 포함하는 FABP5 벡터(Origene; FABP5 유전자 양 말단에 EcoRI 및 NotI 자리를 가짐)를 EcoRI 및 NotI로 처리하여 얻어진 FABP5 유전자 단편을 EcoRI 및 NotI로 처리한 CMV-IRES PURO 벡터 (Clonetech)에 삽입하여, FABP5 발현 벡터 pIRESpuro3-FABP5 Hu (VC68-4)(도 2 참조)를 준비하였다. 목적 폴리펩타이드로서 항 c-Met 항체 (L3-1Y/IgG2) (중쇄: 서열번호 66; 경쇄: 서열번호 68)의 유전자 (중쇄 유전자: 서열번호 67; 경쇄 유전자: 서열번호 69) 도입을 위한 발현 벡터를 제작하였다 (pCA-L3-1Y/IgG2-GS, 도 3 참조; 발현 벡터 염기서열: 서열번호 109;).　　
상기 준비된 FABP5 발현 벡터 및 Amaxa nucleofector sf kit (catalog# V4XC-2024, Lonza)를 사용하여 GS-KO 세포 5*106 cells에 5ug DNA (FABP5 유전자)를 세포 내로 전달(transfection) 시켰다. 세포내 전달 후, 10ug/ml puromycin (Life technologies, A11138-02)을 사용하여 FABP5 발현 벡터가 도입된 세포 (FABP5 과발현 세포)를 선별하였다. 이와 같이 선별된 세포는 FABP5 유전자를 포함하는 FABP5 과발현 재조합 세포(GSKO FABP5)이다. 상기 세포를 2014년 9월 3일자로 대한민국 서울시 종로구 연건동에 소재하는 한국세포주연구재단에 기탁하여, 수탁번호 KCLRF-BP-00330를 부여 받았다.
상기 준비된 FABP5 과발현 세포에 항 c-Met 항체의 발현 벡터(서열번호 109)를 이용하여 항 c-Met 항체 유전자(중쇄 코딩 폴리뉴클레오티드: 서열번호 67; 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드: 서열번호 69)를 도입시켰다. 구체적으로, 상기 준비된 항 c-Met 항체 발현 벡터 및 Amaxa nucleofector sf kit (catalog# V4XC-2024, Lonza)를 사용하여 GS-KO-FABP5 발현 세포 5*106 cells에 5ug DNA (항체 유전자)를 세포 내로 전달(transfection) 시켰다. 세포 내 전달 후, 상기 세포를 EX-CELL CD CHO Fusion media (sigma, 14365C)에 1X GSEM supplement (sigma G9785)를 첨가한 배지에 세포 생존률(viability)이 90% 이상 회복될 때까지 glutamine-negative selection을 진행하여, 항 c-Met 항체 유전자를 포함하는 재조합 세포를 선별하였다. 아래 표의 primer를 사용하여 FABP5 과발현을 확인하였다. puromycin으로 선별된 세포에서 QIAGEN RNease mini kit (74104) 를 사용하여 RNA를 추출하였고 Qiagen Omniscript RT Kit (205111)을 사용하여 발현 유무를 확인하였다. 이 때 사용된 프라이머를 아래의 표 8에 나타내었다:
hFABP5 For primer tcagcagctggaaggaagat (서열번호 110)
hFABP5 Rev primer tgtaaagttgcagacagtctgagtttt (서열번호 111)
상기 얻어진 항체 생산량 시험 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 보여지는 바와 같이, FABP5 발현 벡터 도입 없이 항체 발현 벡터(서열번호 109)만을 발현시킨 GS-KO 세포(GSKO)와 비교하여, FABP5 발현 벡터가 도입된 GS-KO 세포(GSKO FABP5)에서의 FABP5의 mRNA 수준이 현저하게 높게 나타났으며, 이는 GSKO FABP5 세포에서 FABP5가 과발현됨을 확인시켜 주는 것이다.
실시예 2: Batch culture 를 통한 재조합 세포의 세포 생존률 , 생존세포 농도, 및 항체 생산량 측정
위 과정을 통해 선별된 세포, 즉, 301 GS (항 c-Met 항체를 발현하는 GS-KO pool)과 FABP5 301 GS (항 c-Met 항체와 FABP5을 발현하는 GS-KO pool)에 대한 batch culture test를 실행하였다. 3x105 cells/ml 농도로 30ml culture로 시작하여 7일간 배양을 지속하였다. 상기 세포를 EX-CELL CD CHO Fusion media 에 1X GSEM supplement와 10ug/ml의 puromycin을 첨가한 배지에 배양하였다 배양 시작 후, 0, 1, 2, 3, 4, 7, 번째 날에 세포의 세포 생존률(viability), viable cell density (VCD), 그리고 배지에 존재하는 목적 폴리펩타이드인 항 c-Met 항체의 농도를 측정하였다. Cell viability와 VCD는 Cedex automated cell counter (Roche)를 이용하여 측정하였고, 배지 내에 존재하는 항체의 농도는 Octet systems (Fortebio)를 이용하여 측정하였다
상기 얻어진 결과를 도 5 내지 도 7에 나타내었다. 도 5 내지 도 7에서 "-■-"는 항체만 발현하는 세포에서의 결과를 보여주고, "-◆-""는 항체와 FABP5을 함께 발현하는 세포에서의 결과를 보여준다. 도 5는 세포 생존률을 보여주는 그래프로서, 301 GS와 FABP5 301 GS 모두 높은 세포 생존률을 나타냄을 알 수 있다. 이는, FABP5이 도입되어도 세포 생존률에 영향이 없음을 보여준다. 도 6은 VCD를 보여주는 그래프로서, FABP5 301 GS의 경우, 301 GS 에 비해 유사하거나 다소 증가된 cell growth를 나타냄을 알 수 있다. 또한, 도 7은 배지에 존재하는 항체의 농도를 보여주는 그래프로서, FABP5과 함께 항체를 발현하는 세포 pool에서 FABP5을 발현하지 않고 항체만을 발현하는 세포 pool에 비해 항체 농도가 약 1.6배 정도 증가함을 알 수 있다.
한국세포주연구재단 KCLRF-BP-00330 20140903
<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Production of a Recombinant Polypeptide by Overexpression of fatty acid binding protein <130> DPP20143120KR <160> 111 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of AbF46 <400> 1 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of AbF46 <400> 2 Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 of AbF46 <400> 3 Asp Asn Trp Phe Ala Tyr 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> X is Pro or Ser or absent <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> X is Glu or Asp <400> 4 Xaa Xaa Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> X is Asn or Lys <220> <221> 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Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of anti c-Met humanized antibody(huAbF46-H4) <400> 18 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 19 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of anti c-Met humanized antibody(huAbF46-H4) <400> 19 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg 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Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser His Pro Phe Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 21 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of anti c-Met humanized antibody(huAbF46-H4) <400> 21 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Arg Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 derived from H11-4 clone <400> 22 Pro Glu Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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<223> CL - light chain constant region <220> <221> misc_difference <222> (751)..(753) <223> stop codon <220> <221> misc_difference <222> (754)..(759) <223> XhoI restriction site <400> 39 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gacattttga tgacccagtc tccatcctcc 120 ctgactgtgt cagcaggaga gaaggtcact atgagctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccagc agaaaccagg acgatctcct 240 aaaatgctga taatttgggc atccactagg gtatctggag tccctgatcg cttcataggc 300 agtggatctg ggacggattt cactctgacc atcaacagtg tgcaggctga agatctggct 360 gtttattact gtcagcagtc ctacagcgct ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg 420 gagctgaaac gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 480 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 540 aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca 600 gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca 660 gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc 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cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320 ctctccctgt ctccgggtaa atgactcgag 1350 <210> 48 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of H3-heavy <400> 48 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcact gactactaca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg gttgggcttt attagaaaca aagctaacgg ttacaccaca 180 gaatacagtg cgtctgtgaa aggcagattc accatctcaa gagataattc aaagaactca 240 ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgct gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgctaga 300 gataactggt ttgcttactg gggtcaagga accctggtca ccgtctcctc ggctagcacc 360 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg 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tatttttatg ttttgtattt ggattttaga aagtaaataa agaaggtaga 3000 agagttacgg aatgaagaaa aaaaaataaa caaaggttta aaaaatttca acaaaaagcg 3060 tactttacat atatatttat tagacaagaa aagcagatta aatagatata cattcgatta 3120 acgataagta aaatgtaaaa tcacaggatt ttcgtgtgtg gtcttctaca cagacaagat 3180 gaaacaattc ggcattaata cctgagagca ggaagagcaa gataaaaggt agtatttgtt 3240 ggcgatcccc ctagagtctt ttacatcttc ggaaaacaaa aactattttt tctttaattt 3300 ctttttttac tttctatttt taatttatat atttatatta aaaaatttaa attataatta 3360 tttttatagc acgtgatgaa aaggacccag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 3420 cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 3480 cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 3540 tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 3600 tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 3660 atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 3720 gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc 3780 aactcggtcg 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tatgcttccg gctcctatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 5520 acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagctcgg aattaaccct cactaaaggg 5580 aacaaaagct ggctagt 5597 <210> 57 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> U6-HC7 hinge <400> 57 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Cys His Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 58 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-1 clone <400> 58 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240 aaaatgctga ttatttgggc atccactagg gtatctggag tcccttctcg cttctctgga 300 tccgggtctg ggacggattt cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360 acttattact gtcagcagtc ctacagccgc ccgtacacgt tcggacaggg taccaaggtg 420 gagatcaaac gtacg 435 <210> 59 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-2 clone <400> 59 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240 aaaatgctga ttatttgggc atccactagg gtatctggag tcccttctcg cttctctgga 300 tccgggtctg ggacggattt cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360 acttattact gtgggcagtc ctacagccgt ccgctcacgt tcggacaggg taccaaggtg 420 gagatcaaac gtacg 435 <210> 60 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-3 clone <400> 60 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240 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acaacagagt acagtgcatc tgtgaagggt cgtttcacta taagcagaga taattccaaa 300 aacacactgt acctgcagat gaacagcctg cgtgctgagg acactgccgt ctattattgt 360 gctagagata actggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcaccgt ctcctcggct 420 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagaggaag 720 tgctgtgtgg agtgcccccc ctgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 780 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 960 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1080 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380 tccctgtctc cgggtaaatg actcgag 1407 <210> 66 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, human IgG2 hinge and constant region of human IgG2 <400> 66 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 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of light chain of antibody L3-11Y <400> 108 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Trp 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 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tccgcggccg ggaacggtgc attggaacgc 720 ggattccccg tgccaagagt gacgtaagta ccgcctatag actctatagg cacacccctt 780 tggctcttat gcatgctata ctgtttttgg cttggggcct atacaccccc gctccttatg 840 ctataggtga tggtatagct tagcctatag gtgtgggtta ttgaccatta ttgaccactc 900 ccctattggt gacgatactt tccattacta atccataaca tggctctttg ccacaactat 960 ctctattggc tatatgccaa tactctgtcc ttcagagact gacacggact ctgtattttt 1020 acaggatggg gtcccattta ttatttacaa attcacatat acaacaacgc cgtcccccgt 1080 gcccgcagtt tttattaaac atagcgtggg atctccacgc gaatctcggg tacgtgttcc 1140 ggacatgggc tcttctccgg tagcggcgga gcttccacat ccgagccctg gtcccatgcc 1200 tccagcggct catggtcgct cggcagctcc ttgctcctaa cagtggaggc cagacttagg 1260 cacagcacaa tgcccaccac caccagtgtg ccgcacaagg ccgtggcggt agggtatgtg 1320 tctgaaaatg agctcggaga ttgggctcgc accgtgacgc agatggaaga cttaaggcag 1380 cggcagaaga agatgcaggc agctgagttg ttgtattctg ataagagtca gaggtaactc 1440 ccgttgcggt gctgttaacg gtggagggca gtgtagtctg agcagtactc gttgctgccg 1500 cgcgcgccac cagacataat agctgacaga ctaacagact gttcctttcc atgggtcttt 1560 tctgcagtca ccgaattcac tagtgattaa ttcgccgcca ccatggactc ccaggcccag 1620 gtgctgatgc tcctgctgct gtccgtgtcc ggcacctgtg gcgacatcca gatgacccag 1680 tccccatcca gcctgagcgc ttccgtgggc gacagagtga ccatcacatg caagtcctcc 1740 cagtccctgc tggcctccgg caaccagaac aactacctgg cctggtatca gcagaagccc 1800 ggcaaggccc ccaagatgct gatcatctgg gcctccacca gagtgtccgg cgtgccctcc 1860 agattctccg gctctggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagccc 1920 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tcctactccc ggccctacac cttcggccag 1980 ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gccgctccct ccgtgttcat cttcccaccc 2040 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 2100 ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 2160 gaatccgtca ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 2220 ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 2280 ctgtccagcc ccgtgaccaa gtccttcaac cggggcgagt gctgactcga gaaactgtgc 2340 cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag 2400 gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta 2460 ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag 2520 acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggg atatcggaga aggcgcgtgg 2580 agaaaggcct gaccgccatg ttgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt 2640 acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat 2700 ggcccgcctc gtgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc 2760 ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa 2820 ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tccggccccc tattgacgtc 2880 aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttacg ggactttcct 2940 acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag 3000 tacaccaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt 3060 gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaat 3120 aaccccgccc cgttgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc 3180 agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcgcc tggagacgcc atccacgctg ttttgacctc 3240 catagaagac accgggaccg atccagcctc cgcggccggg aacggtgcat tggaacgcgg 3300 attccccgtg ccaagagtga cgtaagtacc gcctatagac tctataggca cacccctttg 3360 gctcttatgc atgctatact gtttttggct tggggcctat acacccccgc tccttatgct 3420 ataggtgatg gtatagctta gcctataggt gtgggttatt gaccattatt gaccactccc 3480 ctattggtga cgatactttc cattactaat ccataacatg gctctttgcc acaactatct 3540 ctattggcta tatgccaata ctctgtcctt cagagactga cacggactct gtatttttac 3600 aggatggggt cccatttatt atttacaaat tcacatatac aacaacgccg tcccccgtgc 3660 ccgcagtttt tattaaacat agcgtgggat ctccacgcga atctcgggta cgtgttccgg 3720 acatgggctc ttctccggta gcggcggagc ttccacatcc gagccctggt cccatgcctc 3780 cagcggctca tggtcgctcg gcagctcctt gctcctaaca gtggaggcca gacttaggca 3840 cagcacaatg cccaccacca ccagtgtgcc gcacaaggcc gtggcggtag ggtatgtgtc 3900 tgaaaatgag ctcggagatt gggctcgcac cgtgacgcag atggaagact taaggcagcg 3960 gcagaagaag atgcaggcag ctgagttgtt gtattctgat aagagtcaga ggtaactccc 4020 gttgcggtgc tgttaacggt ggagggcagt gtagtctgag cagtactcgt tgctgccgcg 4080 cgcgccacca gacataatag ctgacagact aacagactgt tcctttccat gggtcttttc 4140 tgcagtcacc gaattcgccg ccaccatgga atggtcctgg gtgttcctgg tcaccctgct 4200 gaacggcatc cagtgcgagg tgcagctggt ggaatccggc ggaggactgg tgcagcctgg 4260 cggctccctg agactgtctt gcgccgcctc cggcttcacc ttcaccgact actacatgtc 4320 ctgggtccga caggcccctg gcaagggcct ggaatggctg ggcttcatcc ggaacaaggc 4380 caacggctac accaccgagt actccgcctc cgtgaagggc cggttcacca tctcccggga 4440 caactccaag aacacactgt acctgcagat gaactccctg cgggccgagg acaccgccgt 4500 gtactactgc gccagagaca attggttcgc ctactggggc cagggcaccc tggtcaccgt 4560 gtcctctgct agcaccaagg gcccctccgt gttccctctg gccccttgct cccggtccac 4620 ctccgagtct accgccgctc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg agcccgtgac 4680 cgtgtcctgg aactctggcg ccctgacctc cggcgtgcac accttccctg ccgtgctgca 4740 gtcctccggc ctgtactccc tgtcctccgt cgtgaccgtg ccctcctcca acttcggcac 4800 ccagacctac acctgtaacg tggaccacaa gccctccaac accaaggtgg acaagaccgt 4860 ggaacggaag tgctgcgtgg aatgcccccc ctgccctgct cctcctgtgg caggccctag 4920 cgtgttcctg ttccccccaa agcccaagga caccctgatg atctcccgga cccccgaagt 4980 gacctgcgtg gtggtggacg tgtcccacga ggaccccgag gtgcagttca attggtacgt 5040 ggacggcgtg gaagtgcaca acgccaagac caagcccaga gaggaacagt tcaactccac 5100 cttccgggtg gtgtccgtgc tgaccgtggt gcaccaggac tggctgaacg gcaaagagta 5160 caagtgcaag gtgtccaaca agggcctgcc tgcccccatc gaaaagacca tcagcaagac 5220 caagggccag ccccgcgagc cccaggtgta cacactgccc cctagccggg aagagatgac 5280 caagaaccag gtgtccctga cctgtctcgt caaaggcttc tacccctccg atatcgccgt 5340 ggaatgggag tccaacggcc agcccgagaa caactacaag accacccccc ccatgctgga 5400 ctccgacggc tcattcttcc tgtactccaa gctgacagtg gacaagtccc ggtggcagca 5460 gggcaacgtg ttctcctgct ccgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa 5520 gtccctgtcc ctgagccccg gcaagtgact cgagggagaa gcggccgcaa agccgcccct 5580 ctccctcccc cccccctaac gttactggcc gaagccgctt ggaataaggc cggtgtgcgt 5640 ttgtctatat gttattttcc accatattgc cgtcttttgg caatgtgagg gcccggaaac 5700 ctggccctgt cttcttgacg agcattccta ggggtctttc ccctctcgcc aaaggaatgc 5760 aaggtctgtt gaatgtcgtg aaggaagcag ttcctctgga agcttcttga agacaaacaa 5820 cgtctgtagc gaccctttgc aggcagcgga accccccacc tggcgacagg tgcctctgcg 5880 gccaaaagcc acgtgtataa gatacacctg caaaggcggc acaaccccag tgccacgttg 5940 tgagttggat agttgtggaa agagtcaaat ggctctcctc aagcgtattc aacaaggggc 6000 tgaaggatgc ccagaaggta ccccattgta tgggatctga tctggggcct cggtacacat 6060 gctttacatg tgtttagtcg aggttaaaaa aacgtctagg ccccccgaac cacggggacg 6120 tggttttcct ttgaaaaaca cgatgataat atggccacaa aaagatctgc caccatggcc 6180 acctcagcaa gttcccactt gaacaaaaac atcaagcaaa tgtacttgtg cctgccccag 6240 ggtgagaaag tccaagccat gtatatctgg gttgatggta ctggagaagg actgcgctgc 6300 aaaacccgca ccctggactg tgagcccaag tgtgtagaag agttacctga gtggaatttt 6360 gatggctcta gtacctttca gtctgagggc tccaacagtg acatgtatct cagccctgtt 6420 gccatgtttc gggacccctt ccgcagagat cccaacaagc tggtgttctg tgaagttttc 6480 aagtacaacc ggaagcctgc agagaccaat ttaaggcact cgtgtaaacg gataatggac 6540 atggtgagca accagcaccc ctggtttgga atggaacagg agtatactct gatgggaaca 6600 gatgggcacc cttttggttg gccttccaat ggctttcctg ggccccaagg tccgtattac 6660 tgtggtgtgg gcgcagacaa agcctatggc agggatatcg tggaggctca ctaccgcgcc 6720 tgcttgtatg ctggggtcaa gattacagga acaaatgctg aggtcatgcc tgcccagtgg 6780 gaattccaaa taggaccctg tgaaggaatc cgcatgggag atcatctctg ggtggcccgt 6840 ttcatcttgc atcgagtatg tgaagacttt ggggtaatag caacctttga ccccaagccc 6900 attcctggga actggaatgg tgcaggctgc cataccaact ttagcaccaa ggccatgcgg 6960 gaggagaatg gtctgaagca catcgaggag gccatcgaga aactaagcaa gcggcaccgg 7020 taccacattc gagcctacga tcccaagggg ggcctggaca atgcccgtcg tctgactggg 7080 ttccacgaaa cgtccaacat caacgacttt tctgctggtg tcgccaatcg cagtgccagc 7140 atccgcattc cccggactgt cggccaggag aagaaaggtt actttgaaga ccgccgcccc 7200 tctgccaatt gtgacccctt tgcagtgaca gaagccatcg tccgcacatg ccttctcaat 7260 gagactggcg accagccctt ccaatacaaa aactaaggcc ggccaaagtc gagaaactgt 7320 gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga 7380 aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag 7440 taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga 7500 agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg ggatatcgga gaaggcgcgc 7560 cgctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag 7620 acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca 7680 gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg 7740 tatactggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt 7800 gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct 7860 cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 7920 aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 7980 aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 8040 tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 8100 caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 8160 cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 8220 ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 8280 gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 8340 agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 8400 gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 8460 acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 8520 gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 8580 gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 8640 cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 8700 caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 8760 gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 8820 cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 8880 cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 8940 caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 9000 gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 9060 gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctgcaggc atcgtggtgt 9120 cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 9180 catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 9240 gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 9300 ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 9360 gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaacacgg gataataccg 9420 cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 9480 tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 9540 gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 9600 atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 9660 ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 9720 gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 9780 acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc 9840 cctttcgtct tcaagaaagt tacgctaggg ataacagggt aatatagacg cgt 9893 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFABP5 For primer <400> 110 tcagcagctg gaaggaagat 20 <210> 111 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFABP5 Rev primer <400> 111 tgtaaagttg cagacagtct gagtttt 27

Claims (15)

  1. 지방산결합단백질 유전자의 과발현이 유도된 재조합 세포로서,
    목적 폴리펩타이드 암호화 유전자를 추가로 포함하고,
    상기 목적 폴리펩타이드는 항체, 호르몬, 사이토카인, 조직 플라스미노겐 활성인자, 성장인자, 수용체, 및 에리트로포이에틴로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이며,
    상기 지방산 결합 단백질은 포유류 FABP5이고,
    상기 세포는 포유류 세포인, 재조합 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 지방산결합단백질은 인간 FABP5인, 재조합 세포.
  3. 제1항에 있어서, 상기 포유류 세포는 마우스, 래트, 햄스터, 원숭이, 및 인간으로 이루어진 군에서 선택된 포유류의 세포인, 재조합 세포.
  4. 제1항에 있어서, 상기 포유류 세포는,
    마우스의 COP, L, C127, Sp2/0, NS-0, NS-1, At20, 또는 NIH3T3 세포;
    래트의 PC12, PC12h, GH3, 또는 MtT 세포;
    햄스터의 BHK, CHO, GS 유전자 결함 CHO, 또는 DHFR 유전자 결함 CHO 세포;
    원숭이의 COS1, COS3, COS7, CV1 또는 Vero 세포; 또는
    인간의 HeLa, HEK-293, 망막-유래 PER-C6, 이배체 섬유모세포로부터 유래된 세포, 골수종 세포, 또는 HepG2 세포
    인, 재조합 세포.
  5. 제1항에 있어서, 상기 지방산결합단백질의 과발현은 지방산결합단백질 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 추가로 포함하여 유도되는 것인, 재조합 세포.
  6. 제5항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 발현 효율이 높은 프로모터, 인핸서, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것인, 재조합 세포.
  7. 제1항에 있어서, 상기 지방산결합단백질 유전자의 과발현은 발현 효율이 높은 프로모터, 인핸서, 또는 이들의 조합의 도입에 의하여 유도되는 것인, 재조합 세포.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 목적 폴리펩타이드는 항 c-Met 항체인, 재조합 세포.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 재조합 세포를 포함하는, 목적 폴리펩타이드 생산용 조성물로서,
    상기 목적 폴리펩타이드는 상기 재조합 세포에 포함된 목적 폴리펩타이드 암호화 유전자에 의하여 암호화되는 항체, 호르몬, 사이토카인, 조직 플라스미노겐 활성인자, 성장인자, 수용체, 및 에리트로포이에틴로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 목적 폴리펩타이드 생산용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 목적 폴리펩타이드는 항 c-Met 항체인, 목적 폴리펩타이드 생산용 조성물.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 재조합 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 목적 폴리펩타이드의 생산 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 목적 폴리펩타이드는 항 c-Met 항체인, 목적 폴리펩타이드의 생산 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
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