KR20160085664A

KR20160085664A - Mpc1 과발현에 의한 재조합 폴리펩타이드의 생산 증대

Info

Publication number: KR20160085664A
Application number: KR1020150002967A
Authority: KR
Inventors: 서혜영; 박은영; 성희경; 김경은; 김선규
Original assignee: 삼성바이오에피스 주식회사
Priority date: 2015-01-08
Filing date: 2015-01-08
Publication date: 2016-07-18

Abstract

미토콘드리아 피루베이트 수송체 (mitochondrial pyruvate carrier; MPC) 유전자의 과발현이 유도된 재조합 세포, 상기 재조합 세포 및/또는 MPC 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 목적 폴리펩타이드 생산용 조성물, 및 상기 재조합 세포를 이용하여 목적 폴리펩타이드의 생산 방법이 제공된다.

Description

MPC1 과발현에 의한 재조합 폴리펩타이드의 생산 증대{Enhanced Production of a Recombinant Polypeptide by Overexpression of MPC1}

미토콘드리아 피루베이트 수송체 (mitochondrial pyruvate carrier; MPC) 유전자의 과발현이 유도된 재조합 세포, 상기 재조합 세포 및/또는 MPC 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 목적 폴리펩타이드 생산용 조성물, 및 상기 재조합 세포를 이용하는 목적 폴리펩타이드의 생산 방법이 제공된다.

항체와 같은 단백질 제품 개발에 있어서, 경제적 생산을 위한 생산 공정 개발이 중요하다. 생산 공정 개발로서 host system 및 세포주 개발, 세포배양공정 개발, 분리정제공정 개발 등을 들 수 있다.

항체의 경우, 현재 허가를 거쳐 시판되고 있는 모든 항체 제품은 동물세포를 host로 이용하여 생산된다. 상기 동물 세포는 안전성이 검증되고 항체 활성에 중요한 glycosylation이 정상적으로 이루어진다는 장점으로 인해, 항체 생산을 위한 가장 적합한 system으로 인정받고 있다. 그러나 동물세포는 성장속도가 느리고 생산성이 낮은 단점이 있다. 치료용 항체의 수요를 충족시키기 위한 방법 중의 하나로, 형질 전환을 이용한 연구가 진행되고 있으며, 이와 같은 전략은 낮은 생산성을 보완 할 수 있다고 평가된다.

항체와 같은 단백질의 의학적 및 경제적 중요성이 증가하면서, 이를 경제적이며 안정적으로 생산하기 위한 생산 공정 개발의 중요성 또한 증가하고 있다.

일 예는 미토콘드리아 피루베이트 수송체 (mitochondrial pyruvate carrier; MPC) 유전자의 과발현이 유도된 재조합 세포를 제공한다.

다른 예는 과발현이 유도된 MPC 유전자 및 목적 폴리펩타이드의 유전자를 포함하는 재조합 세포를 제공한다. 일 예에서, 상기 MPC 유전자의 과발현은 외래 MPC 유전자를 추가로 포함함으로써 유도되는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 MPC 유전자 및 목적 폴리펩타이드의 유전자는 하나의 벡터를 통하여 함께 도입되거나 별개의 벡터를 통하여 각각 도입된 것일 수 있으며, 동시 또는 순서와 상관없이 순차적으로 도입된 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 과발현이 유도된 MPC 유전자 및 목적 폴리펩타이드의 유전자를 포함하는 재조합 세포는 앞서 설명한 MPC 유전자의 과발현이 유도된 재조합 세포에 목적 폴리펩타이드의 유전자가 추가로 포함된 것일 수 있다. 다른 예에서, 상기 과발현이 유도된 MPC 유전자 및 목적 폴리펩타이드의 유전자를 포함하는 재조합 세포는 목적 폴리펩타이드의 유전자를 포함하는 재조합 세포에 외래의 MPC 유전자가 추가로 포함된 것일 수 있다. 상기 재조합 세포는 상기 목적 폴리펩타이드의 생산을 위한 재조합 세포일 수 있다.

다른 예는 상기 재조합 세포, MPC 유전자 재조합 벡터 또는 이들의 조합을 포함하는 목적 폴리펩타이드 생산용 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 상기 재조합 세포, MPC 유전자 재조합 벡터 또는 이들의 조합을 이용하여 목적 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 제공한다.

또 다른 예는 세포에서 MPC 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 상기 세포에서의 목적 폴리펩타이드의 생산 증진 방법을 제공한다.

본 발명에서는 미토콘드리아 피루베이트 수송체 (mitochondrial pyruvate carrier; MPC)를 과발현시킴으로써 세포 내 단백질 생산량을 증가시킬 수 있음을 제안한다.

이에, 본 발명의 일 예는 미토콘드리아 피루베이트 수송체 (mitochondrial pyruvate carrier; MPC) 유전자의 과발현이 유도된 재조합 세포를 제공한다.

다른 예는 과발현이 유도된 MPC 유전자 및 목적 폴리펩타이드의 유전자를 포함하는 재조합 세포 (또는 MPC 유전자의 과발현이 유도되고 목적 폴리펩타이드의 유전자가 도입된 재조합 세포)를 제공한다. 상기 MPC 유전자의 과발현은 외래 MPC 유전자를 추가로 포함함으로써 유도되는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 MPC 유전자 및 목적 폴리펩타이드의 유전자는 하나의 벡터를 통하여 함께 도입되거나 별개의 벡터를 통하여 각각 도입된 것일 수 있으며, 각각 도입되는 경우 동시 또는 순서와 상관없이 순차적으로 도입된 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 과발현이 유도된 MPC 유전자 및 목적 폴리펩타이드의 유전자를 포함하는 재조합 세포는 앞서 설명한 MPC 유전자의 과발현이 유도된 재조합 세포에 목적 폴리펩타이드의 유전자가 추가로 포함된 것일 수 있다. 다른 예에서, 상기 과발현이 유도된 MPC 유전자 및 목적 폴리펩타이드의 유전자를 포함하는 재조합 세포는 목적 폴리펩타이드의 유전자를 포함하는 재조합 세포에 외래의 MPC 유전자가 추가로 포함된 것일 수 있다. 상기 재조합 세포는 상기 목적 폴리펩타이드의 생산을 위한 재조합 세포일 수 있다.

미토콘드리아 피루베이트 수송체 (mitochondrial pyruvate carrier; MPC)는 글라이코라이시스 과정의 최종 산물인 피루베이트를 미토콘드리아로 수송하는 단백질로서, 피로베이트 흡수, 피루베이트 산화 등과 같이 에너지 생성의 필수적 역할을 한다. MPC 단백질류에 MPC1, MPC2, MPC3 등이 포함되며, 이 중에서 MPC1와 MPC2는 서로 결합하여 이합체 (분자량: ~약150 kDa)를 형성한다. MPC 단백질류는 효모로부터 포유류에 이르기까지 비교적 잘 보존되어 있다. 따라서, 상기 MPC 단백질, 예컨대, MPC1, MPC2, MPC3 등은 모든 진핵생물, 예컨대, 효모 또는 동물 (e.g., 척추동물)로부터 유래한 것일 수 있다. 예컨대, 상기 MPC1은 Cricetulus griseus (예컨대, XP_007609678.1, XP_003513444.1, XP_007648896.1, XP_007648894.1, XP_007607750.1, XP_007648895.1, Mus musculus (예컨대, NP_061289.1), Ailuropoda melanoleuca (예컨대, XP_002918743.1), Microtus ochrogaster (예컨대, XP_005363418.1), Loxodonta Africana (예컨대, XP_003419283.1, XP_003408932.1), Peromyscus maniculatus bairdii (예컨대, XP_006975969.1), Felis catus (예컨대, XP_006932203.1), Oryctolagus cuniculus (예컨대, XP_008250071.1), Callithrix jacchus (예컨대, XP_002747218.1), Equus caballus (예컨대, XP_005608187.1), Canis lupus familiaris (예컨대, XP_005642420.1, XP_005642395.1, XP_005615624.1), Mustela putorius furo (예컨대, XP_004769639.1), Bos Taurus (예컨대, NP_001070510.1, XP_005211168.1, XP_005211169.1), Saimiri boliviensis boliviensis (예컨대, XP_003933840.1), Microtus ochrogaster (예컨대, XP_005363417.1), Echinops telfairi (예컨대, XP_004702142.1), Pan troglodytes (예컨대, XP_001137474.1), Odobenus rosmarus divergens (예컨대, XP_004401601.1), Macaca mulatta (예컨대, NP_001247499.1), Cavia porcellus (예컨대, XP_003466422.1), Octodon degus (예컨대, XP_004646277.1), Jaculus jaculus (예컨대, XP_004651319.1), Ceratotherium simum simum (예컨대, XP_004440606.1), Ornithorhynchus anatinus (예컨대, XP_001507021.1), Papio Anubis (예컨대, XP_003898441.1), Trichechus manatus latirostris (예컨대, XP_004368839.1), Elephantulus edwardii (예컨대, XP_006882842.1), Homo sapiens (예컨대, NP_057182.1), Orycteropus afer afer (예컨대, XP_007948667.1), Heterocephalus glaber (예컨대, XP_004891744.1), Leptonychotes weddellii (예컨대, XP_006730674.1), nolis carolinensis (예컨대, XP_008123063.1), Meleagris gallopavo (예컨대, XP_003204118.1), Chrysochloris asiatica (예컨대, XP_006871239.1), Lipotes vexillifer (예컨대, XP_007445971.1), Orcinus orca (예컨대, XP_004278906.1), Erinaceus europaeus (예컨대, XP_007521659.1), Chrysemys picta bellii (예컨대, XP_005288016.1), Alligator sinensis (예컨대, XP_006034591.1), Pteropus alecto (예컨대, XP_006915105.1), Dasypus novemcinctus (예컨대, XP_004465981.1), Tursiops truncatus (예컨대, XP_004316227.1), Chelonia mydas (예컨대, XP_007071143.1), Tarsius syrichta (예컨대, XP_008056017.1), Dasypus novemcinctus (예컨대, XP_004465982.1), Python bivittatus (예컨대, XP_007420551.1), Sorex araneus (예컨대, XP_004601126.1), Myotis davidii (예컨대, XP_006755228.1), Monodelphis domestica (예컨대, XP_001371720.1), Gallus gallus (예컨대, NP_001026695.1), Anolis carolinensis (예컨대, XP_008123057.1), Sarcophilus harrisii (예컨대, XP_003769654.1), Ficedula albicollis (예컨대, XP_005043471.1), Taeniopygia guttata (예컨대, NP_001232284.1), Mesocricetus auratus (예컨대, XP_005139338.1), Anolis carolinensis (예컨대, XP_008123051.1), Xenopus laevis (예컨대, NP_001088849.1, NP_001165250.1), Zonotrichia albicollis (예컨대, XP_005486533.1), Columba livia (예컨대, XP_005508660.1), Xenopus (Silurana) tropicalis (예컨대, NP_001006893.1), Pseudopodoces humilis (예컨대, XP_005527000.1), Neolamprologus brichardi (예컨대, XP_006780036.1), Ictalurus punctatus (예컨대, NP_001187854.1), Pundamilia nyererei (예컨대, XP_005733302.1), Oreochromis niloticus (예컨대, XP_003442275.1), Melopsittacus undulatus (예컨대, XP_005150182.1), Danio rerio (예컨대, NP_001002398.2, XP_005156534.1), Lepisosteus oculatus (예컨대, XP_006638749.1), Latimeria chalumnae (예컨대, XP_005994014.1), Poecilia Formosa (예컨대, XP_007549865.1), Maylandia zebra (예컨대, XP_004539507.1, XP_004539508.1), Latimeria chalumnae (예컨대, XP_005994016.1), Panthera tigris altaica (예컨대, XP_007097337.1), Anas platyrhynchos (예컨대, XP_005019281.1), Astyanax mexicanus (예컨대, XP_007253244.1), Xiphophorus maculatus (예컨대, XP_005804256.1, XP_005804257.1), Pundamilia nyererei (예컨대, XP_005733303.1), Oreochromis niloticus (예컨대, XP_003442274.1), Callorhinchus milii (예컨대, NP_001279405.1), Oryzias latipes (예컨대, XP_004067288.1), Takifugu rubripes (예컨대, XP_003969507.1), Stegastes partitus (예컨대, XP_008290694.1), Felis catus (예컨대, XP_006932202.1), Cynoglossus semilaevis (예컨대, XP_008308799.1), Octodon degus (예컨대, XP_004645651.1), Ictidomys tridecemlineatus (예컨대, XP_005324107.1), Trichechus manatus latirostris (예컨대, XP_004377016.1) 등으로부터 유래한 것 및 이들 MPC1의 아미노산 서열과 65% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 것으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 MPC2는 Cricetulus griseus (예컨대, XP_003502331.1), Mesocricetus auratus (예컨대, XP_005071439.1), Microtus ochrogaster (예컨대, XP_005370159.1), Rattus norvegicus (예컨대, XP_006250188.1, NP_001071111.1), Mus musculus (예컨대, NP_081706.1), Ochotona princeps (예컨대, XP_004589195.1), Ictidomys tridecemlineatus (예컨대, XP_005319944.1), Mustela putorius furo (예컨대, XP_004779334.1, XP_004824551.1, XP_004824550.1, XP_004824549.1), Oryctolagus cuniculus (예컨대, XP_002715783.1), Macaca mulatta (예컨대, XP_001103255.1), Tupaia chinensis (예컨대, XP_006147102.1), Sus scrofa (예컨대, XP_003355117.1), Homo sapiens (예컨대, NP_056230.1), Saimiri boliviensis boliviensis (예컨대, XP_003928145.1), Orycteropus afer afer (예컨대, XP_007935920.1), Equus caballus (예컨대, XP_001493863.1), Bos Taurus (예컨대, NP_001180050.1), Ailuropoda melanoleuca (예컨대, XP_002928153.1), Chinchilla lanigera (예컨대, XP_005398277.1), Callithrix jacchus (예컨대, XP_002760466.1), Balaenoptera acutorostrata scammoni (예컨대, XP_007172526.1), Pongo abelii (예컨대, NP_001126868.1), Dasypus novemcinctus (예컨대, XP_004464757.1), Trichechus manatus latirostris (예컨대, XP_004384139.1), Chrysochloris asiatica (예컨대, XP_006872681.1), Ficedula albicollis (예컨대, XP_005038923.1), Leptonychotes weddellii (예컨대, XP_006735710.1), Cavia porcellus (예컨대, XP_003468727.1), Canis lupus familiaris (예컨대, XP_537209.1), Heterocephalus glaber (예컨대, XP_004878630.1), Physeter catodon (예컨대, XP_007121700.1), Capra hircus (예컨대, XP_005677137.1), Pantholops hodgsonii (예컨대, XP_005968496.1), Ornithorhynchus anatinus (예컨대, XP_001513814.2), Sarcophilus harrisii (예컨대, XP_003767449.1), Felis catus (예컨대, XP_003999202.2), Elephantulus edwardii (예컨대, XP_006887465.1), Macaca fascicularis (예컨대, XP_005540944.1), Vicugna pacos (예컨대, XP_006211148.1), Octodon degus (예컨대, XP_004646099.1), Lipotes vexillifer (예컨대, XP_007469996.1), Felis catus (예컨대, XP_006942724.1), Falco peregrinus (예컨대, XP_005236094.1), Sorex araneus (예컨대, XP_004613893.1), Ceratotherium simum simum (예컨대, XP_004425242.1), Echinops telfairi (예컨대, XP_004706806.1), Jaculus jaculus (예컨대, XP_004658872.1), Eptesicus fuscus (예컨대, XP_008151338.1), Condylura cristata (예컨대, XP_004688508.1), Orcinus orca (예컨대, XP_004269771.1), Loxodonta Africana (예컨대, XP_003414942.1), Erinaceus europaeus (예컨대, XP_007531862.1), Otolemur garnettii (예컨대, XP_003785781.1), Myotis brandtii (예컨대, XP_005880568.1), Pteropus alecto (예컨대, XP_006907889.1), Columba livia (예컨대, XP_005502666.1), Geospiza fortis (예컨대, XP_005422437.1) Tursiops truncates (예컨대, XP_004319963.1), Pelodiscus sinensis (예컨대, XP_006124278.1), Tarsius syrichta (예컨대, XP_008065781.1), Odobenus rosmarus divergens (예컨대, XP_004391948.1), Anas platyrhynchos (예컨대, XP_005017717.1), Zonotrichia albicollis (예컨대, XP_005491042.1), Monodelphis domestica (예컨대, XP_001371657.1), Gallus gallus (예컨대, NP_001265053.1), Balaenoptera acutorostrata scammoni (예컨대, XP_007164507.1), Peromyscus maniculatus bairdii (예컨대, XP_006988179.1), Pseudopodoces humilis (예컨대, XP_005524158.1), Pseudopodoces humilis (예컨대, XP_005524158.1), Melopsittacus undulates (예컨대, XP_005144526.1), Taeniopygia guttata (예컨대, XP_002192887.1), Alligator mississippiensis (예컨대, XP_006262326.1), Chrysemys picta bellii (예컨대, XP_005283737.1), Xenopus (Silurana) tropicalis (예컨대, NP_001016695.1), Alligator sinensis (예컨대, XP_006018957.1), Chelonia mydas (예컨대, XP_007057644.1), Callorhinchus milii (예컨대, NP_001279567.1), Poecilia Formosa (예컨대, XP_007555465.1), Takifugu rubripes (예컨대, XP_003961772.1), Stegastes partitus (예컨대, XP_008273787.1), Astyanax mexicanus (예컨대, XP_007227874.1), Lepisosteus oculatus (예컨대, XP_006639306.1), Anolis carolinensis (예컨대, XP_003219154.1), Latimeria chalumnae (예컨대, XP_005993459.1, XP_005993460.1), Danio rerio (예컨대, NP_997757.1, NP_001004662.1), Xiphophorus maculatus (예컨대, XP_005798124.1), Cynoglossus semilaevis (예컨대, XP_008326255.1), Python bivittatus (예컨대, XP_007434303.1), Xenopus laevis (예컨대, NP_001079531.1), Ictalurus punctatus (예컨대, NP_001187152.1), Oreochromis niloticus (예컨대, XP_003453011.1), Maylandia zebra (예컨대, XP_004551373.1), Oryzias latipes (예컨대, XP_004081547.1), Camelus ferus (예컨대, XP_006194047.1), Astyanax mexicanus (예컨대, XP_007242758.1)) 등으로부터 유래한 것 및 이들 MPC2의 아미노산 서열과 65% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 것으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 MPC3는 Saccharomyces cerevisiae (P53311.1) 등으로부터 유래한 것 및 이와 65% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다

일 구체예에서, 상기 MPC 단백질은 앞서 설명한 MPC1일 수 있다.

본 명세서에서 MPC 유전자는 MPC를 암호화하는 전장 DNA, cDNA, 또는 mRNA를 의미하는 것일 수 있다. 구체적인 MPC 유전자(전장 DNA, cDNA, 또는 mRNA)는 앞서 설명한 MPC1, MPC2, 또는 MPC3의 등재 번호를 참조하여 정의될 수 있으며, 본 발명에서 사용 가능한 MPC 유전자는 상기한 MPC1, MPC2, 또는 MPC3의 유전자 및 이들 MPC 유전자의 염기 서열과 65% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 것으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 명세서에서, "MPC 유전자의 과발현"은 형질전환이 일어나지 않은 야생형 세포에서의 MPC 유전자 발현과 비교하여 발현량이 많은 것 (예컨대, 단백질 또는 mRNA 중량 또는 통상적 표지의 신호 강도 기준으로, 1.2배 이상, 1.5배 이상, 1.7배 이상, 2배 이상, 2.2배 이상, 2.5배 이상, 2.7배 이상 또는 3배 이상)을 의미할 수 있다.

상기 MPC 유전자의 과발현의 유도는 a) 숙주 세포 게놈 내의 MPC 유전자(내재 유전자)의 복제수를 증가시키거나, b) 숙주 세포 게놈 유전자에 외래의 MPC 유전자를 추가로 도입(삽입)하여 전사체의 수를 증가시키거나, c) 숙주 세포 게놈의 MPC 유전자와 작동 가능하게 연결된 발현 시스템에 상기 숙주세포에서의 발현 효율이 높은 프로모터(strong promoter) 및/또는 인핸서 (enhancer) 등을 도입시킴으로써 상기 발현 시스템에 작동 가능하게 연결된 MPC 유전자의 발현 효율을 높이는 등의 방법으로 수행될 수 있다.

일 예에서, 상기 MPC 유전자의 과발현은 i) 외래 MPC 유전자 또는 외래 MPC 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 추가로 포함하거나, 및/또는 ii) 숙주 세포에서 발현 효율이 높은 프로모터 및/또는 인핸서를 MPC 유전자 (숙주 세포의 내재 유전자 또는 외래 유전자)와 작동 가능하도록 추가로 포함함으로써 유도되는 것일 수 있다.

상기 숙주 세포에 도입되는 외래의 MPC 유전자는 숙주 세포와 동일한 종 또는 상이한 종에서 유래하는 것일 수 있다.

상기 외래의 MPC 유전자의 도입은 통상적인 모든 유전자 도입 방법에 의할 수 있으며, 예컨대, 외래의 MPC 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 숙주 세포에 도입시킴으로써 수행되는 것일 수 있다. 상기 MPC 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 통상의 발현 시스템 내에 MPC 유전자를 포함하는 것이거나, MPC 유전자 발현을 보다 증가시키기 위하여, 숙주 세포에서의 발현 효율이 높은 프로모터 및/또는 인핸서를 포함하고, 여기에 작동 가능하게 연결된 MPC 유전자를 포함하는 것일 수 있다.

또한, 상기 재조합 세포는 MPC 유전자 이외에 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드의 유전자를 추가로 포함하여 상기 목적 폴리펩타이드를 생산하기 위한 세포로 사용될 수 있다. 이 때, 상기 목적 폴리펩타이드의 유전자는 숙주 세포 게놈에 존재하는 유전자이거나, 별도의 재조합 벡터를 통하여 도입된 외래 유전자일 수 있다. 상기 목적 폴리펩타이드의 유전자가 외래 유전자인 경우 (숙주 세포와 동종 또는 이종 유래), 상기 MPC 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 함께 포함되어 도입되거나, 별도의 재조합 벡터를 통하여 동시 또는 순서에 무관하게 순차적으로 숙주 세포에 도입될 수 있다.

상기 목적 폴리펩타이드의 유전자가 MPC 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 포함되어 도입되는 경우, 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서의 MPC 유전자 copy수를 증가시켜 숙주 세포에서의 MPC 과발현을 유도하여, 함께 포함된 목적 폴리펩타이드의 생산을 증진시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 예는 목적 폴리펩타이드의 유전자 및 MPC 유전자를 포함하는, 목적 폴리펩타이드의 발현을 위한 발현 벡터를 제공한다.

상기 재조합 벡터에 있어서, MPC 유전자 및/또는 목적 폴리펩타이드 유전자는 프로모터, 전사 종결 서열 등의 통상적인 유전자 발현 조절 서열과 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 유전자 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 유전자 발현 조절 서열은 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다. 상기 재조합 벡터에 있어서, 유전자 발현 조절 인자가 상기 MPC 유전자 및/또는 목적 폴리펩타이드의 유전자 (목적 유전자)에 작동 가능하게 연결되기 위해서, 상기 유전자 발현 조절 서열은 상기 MPC 유전자 및/또는 목적 폴리펩타이드의 유전자의 5' 말단 쪽에 연결된 것일 수 있다.

하기하는 프로모터에 대한 기재는 상기 재조합 벡터에 포함된 프로모터뿐 아니라 숙주세포에서의 발현 효율이 높은 프로모터에도 적용된다.

상기 프로모터(또는 숙주세포에서의 발현 효율이 높은 프로모터)는 특정 유전자의 전사 개시를 조절하는 전사 조절 서열 중 하나로, 통상적으로 약 100 내지 약 2000 bp 길이의 폴리뉴클레오타이드 단편이다. 일 구체예에서, 상기 프로모터는 세포, 예컨대, 바이러스 세포, 박테리아 세포, 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 또는 동물 세포에서 전사 개시를 조절할 수 있으면, 제한 없이 사용 가능하다. 예컨대, 상기 프로모터는 CMV 프로모터 (cytomegalovirus promoter; 예컨대, CMV immediate-early 프로모터), SV40 프로모터, 아데노바이러스 프로모터(major late promoter), pL^λ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, HSV의 tk 프로모터 메탈로티오닌 프로모터(metallothionin promoter), 베타-액틴 프로모터, 마우스 유방암 바이러스 프로모터(mouse mammary tumor virus promoter), 마우스 백혈병 바이러스 긴 말단반복(murine leukemia virus (MuLV) long terminal repeat (LTR)), 로우스 육종 바이러스 프로모터 (Rous sarcoma virus (rsv) promoter), 알파-태아단백질 프로모터(a-fetoprotein promoter), 감마-글로빈/베타-글로빈 프로모터(g-globin/b-globin promoter), 베타-인터페론 프로모터(b-interferon promoter) 등의 원핵 세포, 포유류 바이러스의 프로모터, 및/또는 동물 세포 프로모터 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 예에서, 상기 프로모터(또는 발현 효율이 높은 프로모터)는 인간 CMV immediate-early 프로모터, 마우스 CMV immediate-early 프로모터, 인간 유비퀴틴 C 프로모터, 상기 프로모터의 단편 (프로모터의 기능을 유지하는 프로모터의 일부 영역) 또는 이들 프로모터 또는 프로모터 단편 중 어느 하나와 인트론 (예컨대, 인트론 A, 면역글로불린 인트론, 키메라 인트론 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상)이 융합된 융합 프로모터일 수 있다.

상기 융합 프로모터에 있어서, 상기 인간 CMV immediate-early 프로모터는 서열번호 112 (GenBank Accession No. X03922.1; 1848bp)의 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 113 내지 120의 뉴클레오타이드 서열, 또는 상기 뉴클레오타이드 서열 내의 연속하는 100개 이상, 200개 이상, 300개 이상 또는 400개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있다:

마우스 CMV immediate-early 프로모터는 서열번호 121의 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 뉴클레오타이드 서열 내의 연속하는 100개 이상, 200개 이상, 300개 이상, 또는 400개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있다.

상기 인간 유비퀴틴 C 프로모터는 서열번호 122의 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 뉴클레오타이드 서열 내의 연속하는 100개 이상, 200개 이상, 300개 이상, 400개 이상 또는 500개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있다.

상기 인트론은 면역글로불린 인트론, 키메라 인트론 (서열번호 123), 인트론 A (서열번호 124) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 면역 글로불린 인트론은 IGLV 인트론 (예컨대, Accession No. X59707의 71~185 부위; 115 bP; 서열번호 125), IGKV 인트론 (예컨대, Accession No. X12688의 269~474 부위; 206 bp; 서열번호 126), 및 IGH 인트론 (예컨대, Accession No. M29811의 197~278 부위; 82 bp; 서열번호 127)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 모든 수단을 의미한다. 상기 벡터는 목적 유전자 발현을 위한 요소 (elements)를 포함하는 것으로, 복제원점 (replication origin), 프로모터, 작동 유전자 (operator), 전사 종결 서열 (terminator) 등을 포함할 수 있고, 숙주 세포의 게놈 내로의 도입을 위한 적절한 효소 부위 (예컨대, 제한 효소 부위) 및/또는 숙주 세포 내로의 성공적인 도입을 확인하기 위한 선별 마커 및/또는 단백질로의 번역을 위한 리보좀 결합 부위 (ribosome binding site; RBS) 등을 추가로 포함할 수 있다 (도 1 참조). 상기 재조합 벡터는 프로모터 이외의 전사 조절 서열을 추가로 포함할 수 있다.

상기 전사 종결 서열은 폴리아데닐화 서열(pA) 등일 수 있고, 상기 복제 원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, BBV 복제원점 등일 수 있다.

또한, 상기 재조합 벡터는 선별 마커를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 재조합 벡터가 숙주 세포 내에 성공적으로 도입되었는지 여부를 확인하거나, 안정적인 세포주 구축을 위한 유전자로서, 예컨대 항생제와 같은 약물 저항 유전자, 대사 관련 유전자, 유전자 증폭 유전자 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 선별 마커는 본 발명의 핵심적 기술인 벡터의 최적의 조합에 따른 발현 효율에 크게 영향을 미치는 요소가 아니므로, 선별 마커로서 일반적으로 사용되는 모든 유전자 (예컨대, 항생제 저항 유전자, 및/또는 대사관련 효소 유전자 등)를 제한 없이 사용할 수 있다. 예컨대, 상기 선별 마커는 암피실린(ampicilin) 저항 유전자, 테트라사이클린(tetracyclin) 저항 유전자, 카나마이신(kanamycin) 저항 유전자, 클로람페니콜(chloroamphenicol) 저항 유전자, 스트렙토마이신 (streptomycin) 저항 유전자, 네오마이신(neomycin) 저항 유전자, 블라스티시딘(Blasticidin) 저항 유전자, 제오신(Zeocin) 저항 유전자, 하이그로마이신(Hygromycin) 저항 유전자, 퓨로마이신 (Puromycin) 저항 유전자, 티미딘 키나아제 (TK) 유전자, 디하이드로폴레이트 환원효소 (Dihydrofolate reductase, DHFR) 유전자, 글루타민 합성효소 (Glutamine synthetase, GS) 유전자 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예컨대, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pcDNA 시리즈, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1, M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 기본으로 하여 제작될 수 있다.

또한, MPC 유전자의 발현을 증진시키기 위하여, 상기 재조합 세포 또는 재조합 벡터는 인핸서(enhancer)를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 인핸서는 유전자의 전사를 활성화시키는 단백질 (예컨대, 전사조절인자)과 결합 가능한 약 50 내지 150bp 정도의 DNA 단편으로, 일반적으로 cis-작용성이다. 예컨대, 상기 인핸서는 CMV 인핸서 (예컨대, cytomegalovirus early enhancer element), SV40 인핸서, hTERT (human telomerase reverse transcriptase) 인핸서 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 재조합 세포는 MPC 유전자를 및/또는 목적 폴리펩타이드 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 숙주 세포 내로 도입된 것을 의미할 수 있다. 이 때, MPC 유전자와 목적 폴리펩타이드 유전자는 하나의 재조합 벡터에 포함되거나 별개의 벡터에 포함되어 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.

상기 숙주 세포로는 재조합 벡터에 포함된 프로모터가 작동 가능하고(즉, 전사 개시 기능을 나타낼 수 있고), MPC 유전자의 염색체 내 통합 (삽입) 및/또는 목적 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 모든 종류의 원핵 또는 진핵 동물 (예컨대, 포유류) 세포가 사용될 수 있다. 예컨대, 본 발명을 위해 적합한 숙주 세포는 대장균 (E. coli), 마우스 세포 (예컨대, COP, L, C127, Sp2/0, NS-0, NS-1, At20 또는 NIH3T3), 래트 세포 (PC12, PC12h, GH3, 또는 MtT), 햄스터 세포 (예컨대, BHK, CHO, GS 유전자 결함 CHO, 또는 DHFR 유전자 결함 CHO), 원숭이 세포 (예컨대, COS1, COS3, COS7, CV1 또는 Vero), 인간 세포 (예컨대, Hela, HEK-293, 망막-유래 PER-C6, 이배체 섬유모세포로부터 유래된 세포, 골수종 세포 또는 HepG2), 곤충세포 (예컨대, Sf9 세포, Sf21 세포, Tn-368 세포, BTI-TN-5B1-4 세포 등), 하이브리도마 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으니, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 숙주 세포는 생체에서 분리된 것일 수 있다.

상기 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예컨대, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 발현 벡터가 도입된 재조합 세포(형질전환체)를 선별하는 방법은 통상적인 선별 마커를 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예컨대, 상기 선별 마커가 앞서 설명한 바와 같은 특정 항생제 저항 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 상기 세포를 배양함으로써 재조합 벡터가 도입된 재조합 세포를 용이하게 선별할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 MPC 유전자의 과발현이 유도된 재조합 세포는 GSKO-MPC1 (수탁번호 KCLRF-BP-00327) 세포일 수 있다.

다른 예에서, 상기 MPC 유전자의 과발현이 유도(도입)된 재조합 세포 및/또는 MPC 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 목적 폴리펩타이드 생산 증진 용도가 제공된다. 구체적으로, MPC 유전자의 과발현이 유도된 재조합 세포, MPC 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 또는 이들의 조합을 포함하는 목적 폴리펩타이드 생산용 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 목적 폴리펩타이드를 이를 포함하는 MPC 유전자의 과발현이 유도된 재조합 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는 목적 폴리펩타이드의 생산 방법을 제공한다. 상기 발현시키는 단계는 생체 외(ex vivo)에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 발현시키는 단계는 상기 재조합 세포를 상기 목적 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 조건 및 세포 배양 배지 내에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 생산 방법은 상기 발현시키는 단계 또는 배양하는 단계 이후에, 상기 목적 폴리펩타이드를 수득(분리)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 폴리펩타이드의 수득(분리) 단계는 상기 재조합 세포의 파쇄물 및/또는 상기 배양 배지(폴리펩타이드가 배지로 분비되는 경우)로부터 폴리펩타이드를 분리하는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 상기 생산 방법은 수득된 폴리펩타이드가 목적하는 품질 및/또는 순도를 갖도록 하기 위한 추가의 처리 단계, 예컨대, 정제 및/또는 변형 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 목적 폴리펩타이드가 질병 또는 병적 증상의 예방, 치료 및/또는 경감과 관련된 기능을 갖는 것(예컨대, 항체, 치료용 단백질 등)인 경우, 본 발명의 다른 예는 상기 MPC 유전자 및 목적 폴리펩타이드 유전자를 포함하는 발현 벡터, 상기 MPC 유전자 및 목적 폴리펩타이드 유전자를 포함하는 재조합 세포 및 상기 재조합 세포의 배양물 (세포 포함 또는 무세포)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 사용된 용어 "목적 폴리펩타이드"는 숙주 세포에서 발현(생산)시키고자 하는 폴리펩타이드를 의미하는 것으로, 이 때 폴리펩타이드는 펩타이드 결합(들)에 의해 함께 연결된 아미노산의 중합체를 포함하는 분자를 의미한다. 폴리펩타이드는 펩타이드 (예컨대, 2 내지 49개의 아미노산 포함) 또는 임의의 길이의 단백질 일 수 있다. 상기 목적 폴리펩타이드의 유전자는 숙주 세포 이외의 소스에서 유래하는 외래 유전자일 수 있다.

본 발명에서의 "목적 폴리펩타이드"는 생체에서 목적하는 활성 (예컨대 특정 질병 또는 증상의 예방, 경감, 및/또는 치료 활성 또는 생체 필요 물질을 대체하는 활성)을 갖는 단백질 및/또는 펩타이드일 수 있으며, 예컨대, 효소 활성의 단백질 또는 펩타이드 (예컨대, 프로테아제, 키나제, 포스파타제 등), 수용체 단백질 또는 펩타이드, 수송체 단백질 또는 펩타이드, 살균 및/또는 내독소-결합 폴리펩타이드, 구조 단백질 또는 펩타이드, 면역 폴리펩타이드, 독소, 항생제, 호르몬, 성장 인자, 백신 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 예에서, 상기 목적 폴리펩타이드는 호르몬, 사이토카인, 조직 플라스미노겐 활성인자, 면역글로불린 (예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 변이체) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 면역글로불린은 임의의 이소타입 (예컨대, IgA, IgD, IgG, IgM 또는 IgE)의 것일 수 있으며, 예컨대, IgG (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4) 분자일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 본래 항체의 항원 결합 능력을 보유하는 단편으로, 약 20개 이상의 아미노산, 예컨대, 약 100개 이상의 아미노산을 포함하는 항체의 임의의 단편일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 항체의 항원 결합 부위, 예컨대, CDS, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)2 단편, Fv, scFv, (scFv)2, scFvFc, 다수의 결합 도메인을 포함하는 멀티바디 (multibody) (예컨대, 디아바디 (diabody), 트리아바디 (triabody), 테트라바디 (tetrabody) 등), 단일 도메인 항체, 애피바디 (affibody) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이 상일 수 있다. 상기 항체 변이체는 항체와 동일한 결합 기능을 갖지만 본래 항체와 변경된 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편의 유도체이다. 상기 항체 및/또는 항원 결합 단편은 예컨대, 마우스 항체, 인간 항체, 키메라 (chimera) 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체일 수 있다. 상기 항체는 단일클론항체일 수 있다. 상기 항체의 중쇄 (또는 중쇄가변부위)와 경쇄 (또는 경쇄가변부위)는 하나의 벡터를 통하여 함께 또는 각각 별개의 벡터를 통하여 독립적으로 재조합 세포 내에 도입될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 목적 폴리펩타이드는 인슐린, 사람 성장 호르몬(hGH), 인슐린-유사 성장 인자, EGF, VERF 등의 각종 성장 인자, 각종 수용체, 조직 플라스미노겐 활성인자(tPA), 에리트로포이에틴(EPO), 사이토카인 (예컨대, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18과 같은 인터루킨), 인터페론(IFN)-알파, -베타, -감마, -오메가 또는 -타우, TNF-알파, 베타 또는 감마와 같은 종양 괴사 인자(TNF), TRAIL, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 목적 폴리펩타이드는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.

상기 항 c-Met 항체는 c-Met의 특정 부위, 예컨대 SEMA 도메인 내의 특정 부위를 에피토프로 인식하는 것일 수 있으며, c-Met에 작용하여 세포내이동(internalization) 및 분해(degradation)를 유도하는 모든 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다.

HGF(Hepatocyte growth factor)의 수용체인 c-Met은 세포외 부위, 막투과 부위, 세포내 부위의 세 부분으로 구분되며, 세포외 부위의 경우, 이황화 결합에 의해 α-소단위체와 β-소단위체가 연결된 형태로 HGF 결합 도메인인 SEMA 도메인, PSI 도메인(plexin-semaphorins-integrin homology domain) 및 IPT 도메인(immunoglobulin-like fold shared by plexins and transcriptional factors domain)으로 이루어진다. c-Met 단백질의 SEMA 도메인은 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, c-Met의 세포외 부위에 존재하는 도메인으로서, HGF가 결합하는 부위에 해당한다. SEMA 도메인 중에서 특정 부위, 예컨대, 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 영역은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프 중 2번과 3번 프로펠러 도메인 사이의 루프(loop) 부위에 해당하며, 본 발명에서 제안되는 항 c-Met 항체의 에피토프로 작용할 수 있다.

용어, "에피토프(epitope)"는 항원 결정 부위(antigenic determinant)로서, 항체에 의해 인지되는 항원의 일부분을 의미하는 것으로 해석된다. 일 구체예에 따르면, 상기 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 연속하는 5개 이상의 아미노산을 포함하는 부위, 예컨대, c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71 내에 위치하는 연속하는 5개 내지 19개의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 에피토프는 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하여 연속하는 5 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다.

상기 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 2번과 3번 프로펠러 구조의 도메인 사이의 루프 부위 중 가장 바깥으로 위치한 부위에 해당하며, 상기 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 일 구체예에 따른 항체 또는 항원 결합 단편이 가장 특이적으로 결합하는 부위이다.

따라서, 항 c-Met 항체는 서열번호 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하는 연속하는 5 내지 19개의 아미노산을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72, 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는,

서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR), 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;

서열번호 7의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 15의 아미노산 서열, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;

상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는

상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합

을 포함하고,

상기 서열번호 4 내지 서열번호 9는 각각 하기 일반식 Ⅰ 내지 일반식 Ⅵ으로 표시되는 아미노산 서열인 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다:

일반식 Ⅰ

Xaa₁-Xaa₂-Tyr-Tyr-Met-Ser (서열번호 4),

일반식 Ⅱ

Arg-Asn-Xaa₃-Xaa₄-Asn-Gly-Xaa₅-Thr (서열번호 5),

일반식 Ⅲ

Asp-Asn-Trp-Leu-Xaa₆-Tyr (서열번호 6),

일반식 Ⅳ

Lys-Ser-Ser-Xaa₇-Ser-Leu-Leu-Ala-Xaa₈-Gly-Asn-Xaa₉-Xaa₁₀-Asn-Tyr-Leu-Ala (서열번호 7)

일반식 Ⅴ

Trp-Xaa₁₁-Ser-Xaa₁₂-Arg-Val-Xaa₁₃ (서열번호 8)

일반식 Ⅵ

Xaa₁₄-Gln-Ser-Tyr-Ser-Xaa₁₅-Pro-Xaa₁₆-Thr (서열번호 9)

상기 일반식 Ⅰ에서, Xaa₁은 존재하지 않거나 Pro 또는 Ser이고, Xaa₂는 Glu 또는 Asp이며,

상기 일반식 Ⅱ에서, Xaa₃은 Asn 또는 Lys이며, Xaa₄는 Ala 또는 Val이고, Xaa₅는 Asn 또는 Thr이며,

상기 일반식 Ⅲ에서, Xaa₆은 Ser 또는 Thr이고,

상기 일반식 Ⅳ에서, Xaa₇은 His, Arg, Gln 또는 Lys이고, Xaa₈은 Ser 또는 Trp이고, Xaa₉은 His 또는 Gln이며, Xaa₁₀는 Lys 또는 Asn이고,

상기 일반식 Ⅴ에서, Xaa₁₁은 Ala 또는 Gly이며, Xaa₁₂은 Thr 또는 Lys이고, Xaa₁₃는 Ser 또는 Pro이며,

상기 일반식 Ⅵ에서, Xaa₁₄은 Gly, Ala 또는 Gln이고, Xaa₁₅는 Arg, His, Ser, Ala, Gly 또는 Lys이며, Xaa₁₆는 Leu, Tyr, Phe 또는 Met이다.

일 구체예에서, 상기 CDR-H1은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-H2는 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-H3는 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 CDR-L1은 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-L2는 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-L3은 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은

서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H3)를 포함하는 중쇄 가변 영역;

서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는

상기 중쇄 가변 영역과 상기 경쇄 가변 영역의 조합

을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 17, 서열번호 74, 서열번호 87, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 또는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 상기 중쇄 가변 영역, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 75, 서열번호 88, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99 또는 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 상기 경쇄 가변 영역, 또는 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 항 c-Met 항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00220인 하이브리도마 세포에서 생산되는, c-Met 단백질의 세포외 부위(extracellular region)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체일 수 있다 (대한민국 공개특허 제2011-0047698호 참조; 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함됨).

상기의 항 c-Met 항체는 대한민국 공개특허 제2011-0047698호에 정의된 항체를 모두 포함할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는,

서열번호 62의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 64의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 66의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 및 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및

서열번호 68의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 70의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 및 서열번호 108의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄

를 포함하는 것일 수 있다.

예컨대, 상기 항-c-Met 항체는,

서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 또는

서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체

서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 및

서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체

로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항 c-Met 항체는 서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체일 수 있다.

한편, 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드는 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄이며, 서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드는 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에서 36번 (kabat numbering에 따름, 서열번호 68 내의 62번째 아미노산 위치) 히스티딘 (histidine)이 티로신 (tyrosine)으로 치환된 형태의 폴리펩타이드다. 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 생산량이 증가될 수 있다. 또한 상기 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드는 상기 서열번호 68의 아미노산 서열 중 1번째부터 20번째까지의 시그널 펩타이드를 제외한 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에서 kabat numbering에 의한 27e 위치(kabat numbering에 따름, 서열번호 108 내 32번째 위치; CDR-L1 내부)의 세린(Ser)이 트립토판(Trp)으로 치환된 것으로, 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 활성(예컨대, c-Met에 대한 결합친화도, c-Met 분해 활성 및 Akt 인산화 억제 활성 등)이 보다 증진될 수 있다.

상기 항 c-Met 항체 또는 항 EGFR 항체의 앞서 정의된 CDR 부위 또는 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역을 제외한 부위, 예컨대, 경쇄 불변 영역과 중쇄 불변 영역은 모든 서브타입의 면역글로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, 등)에서 유래한 것일 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예컨대, scFv, (scFv)₂, scFv-Fc, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 본 발명에서의 항체의 항원 결합 단편은 상기한 상보성 결정 영역을 하나 이상 포함하는 항체 단편, 예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 목적 폴리펩타이드가 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 경우, 이를 암호화하는 목적 유전자는 상기 항 c-Met 항체의 앞서 설명한 중쇄 CDR 또는 경쇄 CDR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 앞서 설명한 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 앞서 설명한 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 목적 유전자는 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 63, 서열번호 65, 서열번호 67, 서열번호 69, 서열번호 76, 및 서열번호 77로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명은 MPC의 과발현이 유도된 재조합 세포를 제공함으로써, 항체를 비롯한 다양한 치료용 단백질의 대량 생산에 유용하게 적용될 수 있다.

도 1은 재조합 벡터를 모식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 항 c-Met 항체의 발현 벡터의 개열 지도이다.
도 3은 항체 유전자를 포함하는 재조합 세포에 MPC1을 과발현하는 (외래 MPC 유전자가 도입된) GSKO 세포(GSKO301 MPC1로 표시)와 항체 유전자만을 포함하는 (즉, 외래 MPC1 유전자가 도입되지 않은) GSKO 세포 (GSKO301로 표시)를 이용한 7일간의 배양에서의 세포 생존률(cell viability; %)를 보여주는 그래프이다.
도 4는 항체 유전자를 포함하는 재조합 세포에 MPC1을 과발현하는 (외래 MPC 유전자가 도입된) GSKO 세포(GSKO301 MPC1로 표시)와 항체 유전자만을 포함하는 (즉, 외래 MPC1 유전자가 도입되지 않은) GSKO 세포 (GSKO301로 표시)를 이용한 7일간의 배양에서의 viable cell density (VCD)를 보여주는 그래프이다.
도 5는 항체 유전자를 포함하는 재조합 세포에 MPC1을 과발현하는 (외래 MPC 유전자가 도입된) GSKO 세포(GSKO301 MPC1로 표시)와 항체 유전자만을 포함하는 (즉, 외래 MPC1 유전자가 도입되지 않은) GSKO 세포 (GSKO301로 표시)를 이용한 7일간의 배양에서의 항체 생산량을 보여주는 그래프이다.
도 6은 MPC1을 과발현하는 (외래 MPC 유전자가 도입된) 재조합 세포에 항체 유전자가 도입된 GSKO 세포(GSKO MPC1 301 GS로 표시)와 항체 유전자만 도입된 (즉, 외래 MPC1 유전자가 도입되지 않은) GSKO 세포(GSKO 301 GS로 표시)를 이용한 7일간의 배양에서의 세포 생존률(cell viability; %)를 보여주는 그래프이다 (X축은 배양 기간 (day)를 나타냄).
도 7은 MPC1을 과발현하는 (외래 MPC 유전자가 도입된) 재조합 세포에 항체 유전자가 도입된 GSKO 세포(GSKO MPC1 301 GS로 표시)와 항체 유전자만 도입된 (즉, 외래 MPC1 유전자가 도입되지 않은) GSKO 세포(GSKO 301 GS로 표시)를 이용한 7일간의 배양에서의 viable cell density (VCD)를 보여주는 그래프이다 (X축은 배양 기간 (day)를 나타냄).
도 8은 MPC1을 과발현하는 (외래 MPC 유전자가 도입된) 재조합 세포에 항체 유전자가 도입된 GSKO 세포(GSKO MPC1 301 GS로 표시)와 항체 유전자만 도입된 (즉, 외래 MPC1 유전자가 도입되지 않은) GSKO 세포(GSKO 301 GS로 표시)를 이용한 7일간의 배양에서의 항체 생산량을 보여주는 그래프이다 (X축은 배양 기간 (day)를 나타냄).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 재조합 세포 제작

1.1: MPC1 과발현이 유도된 도입된 재조합 세포 제작

마우스 MPC1 유전자 (BC024365.1; mRNA: NM_018819.4; 단백질: NP_061289.1)를 CHOK1SV GS Knockout (KO) host cell line (Sigma, CHOZN

GS-/- ZFN-modified CHO cell line, #CHOGS, 글루타민 합성(GS) 유전자 넉아웃 시킴; 이하, 'GS-KO 세포')에 도입하여 MPC1 과발현 CHO 세포를 제작하였다.

MPC1 유전자의 도입을 위한 MPC1 발현 벡터는 Origene사에서 구입하였다 (catalog number MC201794).

상기 준비된 MPC1 발현 벡터 및 Amaxa nucleofector sf kit (catalog# V4XC-2024, Lonza)를 사용하여 GS-KO 세포 5*10⁶ cells에 5ug DNA (MPC1 유전자)를 세포 내로 전달(transfection) 시켰다. 세포내 전달 후, 100ug/ml Geneticin (Life technologies, 10131027)을 사용하여 MPC1 발현 벡터가 도입된 세포 (MPC1 과발현 세포)를 선별하였다. 이와 같이 선별된 세포는 MPC1가 과발현된 재조합 세포이다. 상기 재조합 세포를 2014년 9월 3일자로 대한민국 서울시 종로구 연건동에 소재하는 한국세포주연구재단에 기탁하여, 수탁번호 KCLRF-BP-00327을 부여 받았다.

1.2: 항체 유전자가 도입된 재조합 세포에 MPC1 유전자가 도입된 재조합 세포의 제작

MPC1 유전자의 도입을 위한 MPC1 발현 벡터는 Origene사에서 구입하였다 (catalog number MC201794). 목적 폴리펩타이드로서 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2 (중쇄: 서열번호 66; 경쇄: 서열번호 68)의 유전자 (중쇄 유전자: 서열번호 67; 경쇄 유전자: 서열번호 69) 도입을 위한 발현 벡터를 제작하였다 (기본벡터: pCNV6-Kan/neo, 도 2 참조; 발현 벡터 염기서열: 서열번호 109).　　

상기 제작된 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2의 발현 벡터를 이용하여 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2를 도입하였다. 구체적으로, 상기 준비된 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2의 발현 벡터 및 Amaxa nucleofector sf kit (catalog# V4XC-2024, Lonza)를 사용하여 GS-KO 세포 5*10⁶ cells에 5ug DNA (항체 유전자)를 세포 내로 전달(transfection) 시켰다. 세포 내 전달 후, 상기 세포를 EX-CELL CD CHO Fusion media (sigma, 14365C)에 1X GSEM supplement (sigma G9785)와 100ug/ml Geneticin (Life technologies, 10131027)를 첨가한 배지에 세포 생존률(viability)이 90% 이상 회복될 때까지 glutamine-negative selection을 진행하여, L3-1Y/IgG2 유전자를 포함하는 재조합 세포를 선별하였다.

상기 선별된 재조합 세포 중 일부에 MPC1 유전자를 도입하였다. 구체적으로, 상기 준비된 MPC1 발현 벡터 및 Amaxa nucleofector sf kit (catalog# V4XC-2024, Lonza)를 사용하여 GS-KO 세포 5*10⁶ cells에 5ug DNA (MPC1 유전자)를 세포 내로 전달(transfection) 시켰다. 세포내 전달 후, 100ug/ml Geneticin (Life technologies, 10131027)을 사용하여 MPC1 발현 벡터가 도입된 세포 (MPC1 과발현 세포)를 선별하였다. 이와 같이 선별된 세포는 MPC1가 과발현되고 L3-1Y/IgG2 유전자를 포함하는 재조합 세포이다.

상기 도입된 마우스 MPC1과 숙주 세포인 CHO 세포에 원래 존재하는 MPC1의 서열이 유사하기 때문에, 상기 제작된 재조합 세포에서 마우스 MPC1이 과발현되는지 여부를 보다 명확하게 확인하기 위하여 SRM (Selected reaction monitoring)을 수행하였다. 우선, 상기 제작된 MPC1가 과발현되고 L3-1Y/IgG2 유전자를 포함하는 재조합 세포를 harvest 한 후, MKN buffer (1mM Tris.Cl, pH 7.4, 0.13 M NaCl, 5mM KCl, 7.5 mM MgCl₂)을 이용하여 3회 세척하였다. Homogenizer를 통하여 homogenizate를 확보한 후, 2M Sucrose를 이용하여 pellet으로 분리된 미토콘드리아 단백질(mitochondrial proteins)을 확보하였다. 상기 확보된 미토콘드리아 단백질은 농도를 측정한 후, 약 300~500 ug(microgram)의 단백질에 DTT (dithiothreitol) 및 Urea를 사용하여 환원시켰다. 0.2 M Iodoacetamide 20 uL를 사용하여 알킬화시킨 후, 트립신으로 분해(trypsin digestion)시켰다.

상기 trypsin 분해로 얻어진 펩타이드를 Sep-Pak C18 SPE (solid phase extract) column (Waters, Cat No. 036820)를 통하여 세척하고, vaccum 조건 하에서 건조시킨 후, 정제수로 녹여, SRM(Selected reaction monitoring) 분석에 이용하였다.

UPLC 분석 조건은 Mobile phase A의 경우 10%(v/v) acetonotrile이고 mobile phase B는 0.1%(v/v) formic acid/97:3-water:Acetonitrile로 하였다. 상기의 방법을 통하여 아래의 표 1의 Peptide를 확보하였고, 굵은 글씨로 표기된 부분이 CHO genome에서 자체적으로 보유하고 있는 MPC1과 상이한 마우스 MPC1 중의 펩타이드이다.

	GSKO-MPC1
High	NWLLFAcHVTNEVAQLIQGGR
High	LINYEMSK
High	MAGALVRK
High	KSPEIISGR
High	KAADYVR
High	KAADYVRSK

참고로 Mouse MPC1 유전자로부터 코딩된 MPC1과 CHO genome에서 자체적으로 보유하고 있는 MPC1의 아미노산 서열은 아래와 같다:

Mouse MPC1: NP_061289.1 [Mus musculus] (서열번호 110)

MAGALVRKAADYVRSKDFRDYLMSTHFWGPVANWGLPIAAINDMKKSPEIISGRMTFALCCYSLTFMRFAYKVQPRNWLLFACHVTNEVAQLIQGGRLINYEMSKRPSA

CHO MPC1: XP_007609678.1 [Cricetulus griseus] (서열번호 111)

MAGVLVRKVMDYVLSKDFQDYLMSTHFWGPVANWGLPIAAINDKKKSPEIISGRMTFALCCYSLTFMRFAYKVQPQNWLLFACHGTNEVVQLIQGGWLINYEMSKKASA

이와 같이, 상기 확보된 데이터에서 CHO MPC1와 차이를 나타내는 마우스 MPC1의 펩타이드가 검출되었고, 이를 통하여 마우스 MPC1이 CHO 세포에서 과발현되었음을 확인할 수 있다.

1.3: MPC1 이 과발현된 재조합 세포에 항체 유전자가 도입된 재조합 세포의 제작

MPC1가 과발현된 재조합 세포에 목적 폴리펩타이드인 항 c-Met 항체의 유전자를 도입시켰다.

이를 위하여, 목적 폴리펩타이드로서 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2 (중쇄: 서열번호 66; 경쇄: 서열번호 68)의 유전자 (중쇄 유전자: 서열번호 67; 경쇄 유전자: 서열번호 69) 도입을 위한 발현 벡터를 제작하였다 (기본벡터: pCNV6-Kan/neo, 도 2 참조; 발현 벡터 염기서열: 서열번호 109).　 상기 제작된 L3-1Y/IgG2 발현 벡터를 상기 실시예 1.1에서 제작된 MPC1가 과발현된 재조합 세포에 도입하였다. 구체적으로, 상기 준비된 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2의 발현 벡터 및 Amaxa nucleofector sf kit (catalog# V4XC-2024, Lonza)를 사용하여 상기 실시예 1.1에서 제작된 MPC1가 과발현된 재조합 세포 5*10⁶ cells에 5ug DNA (항체 유전자)를 세포 내로 전달(transfection) 시켰다. 세포 내 전달 후, 상기 세포를 EX-CELL CD CHO Fusion media (sigma, 14365C)에 1X GSEM supplement (sigma G9785)와 100ug/ml Geneticin (Life technologies, 10131027)를 첨가한 배지에 세포 생존률(viability)이 90% 이상 회복될 때까지 glutamine-negative selection을 진행하여, L3-1Y/IgG2 유전자를 포함하는 재조합 세포를 선별하였다. 이와 같이 선별된 세포는 MPC1가 과발현되고 L3-1Y/IgG2 유전자를 포함하는 재조합 세포이다.

실시예 2: 재조합 세포의 세포 생존률 , 생존세포 농도, 및 항체 생산량 측정

상기 실시예 1.1, 1.2 및 1.3의 과정을 통해 선별된 세포, 즉, 항체 유전자가 도입된 GS-KO pool ('GSKO301' 또는 'GSKO 301 GS'로 표시과 항체 유전자 및 마우스 MPC1이 도입된 GS-KO pool (항체 유전자 도입 후 MPC1 유전자 도입된 GS-KO pool(실시예 1.2): 'GSKO301 MPC1'로 표시; MPC1 유전자 도입 후 항체 유전자 도입된 GS-KO pool(실시예 1.3): 'GSKO MPC1 301 GS'로 표시)에 대한 batch culture test를 실행하였다. 5x10⁵ cells/ml 농도로 30ml culture로 시작하여 7일간 배양을 지속하였다 (배지: EX-CELL CD CHO Fusion media (sigma, 14365C)). 배양 시작 후, 0, 1, 2, 3, 4, 7번째 날에 세포의 세포 생존률(viability), viable cell density (VCD), 그리고 배지에 존재하는 목적 폴리펩타이드인 항 c-Met 항체의 농도를 측정하였다. Cell viability와 VCD는 Cedex automated cell counter (Roche)를 이용하여 측정하였고, 배지 내에 존재하는 항체의 농도는 Octet systems (Fortebio)를 이용하여 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 도 3 내지 도 8에 나타내었다.

도 3 내지 도 5는 항체 유전자 도입 후 MPC1 유전자 도입된 GS-KO pool(실시예 1.2; GSKO301 MPC1)에서의 세포 생존률, 생존 세포 밀도 (VCD), 및 항체 농도 결과를 보여준다. 도 3은 세포 생존률을 보여주는 그래프로서, GSKO301과 GSKO301 MPC1 모두 90% 이상의 높은 세포 생존률을 나타냄을 알 수 있다. 이는, MPC1이 도입되어도 세포 생존률에 영향이 없음을 보여준다. 도 4는 VCD를 보여주는 그래프로서, GSKO301 MPC1의 경우, GSKO301에 비해 높은 cell growth를 나타냄을 알 수 있다. 또한, 도 5는 배지에 존재하는 항체의 농도를 보여주는 그래프로서, 마우스 MPC1와 항체를 발현하는 세포 pool에서 마우스 MPC1를 발현하지 않고 항체만을 발현하는 세포 pool에 비해 항체 농도가 약 2배 이상 또는 약 3배 이상 높게 나타남을 알 수 있다.

도 6 내지 도 8는 MPC1 유전자 도입 후 항체 유전자 도입된 GS-KO pool(실시예 1.3; GSKO MPC1 301 GS)에서의 세포 생존률, 생존 세포 밀도 (VCD), 및 항체 농도 결과를 보여준다. 도 6은 세포 생존률을 보여주는 그래프로서, GSKO 301 GS와 GSKO MPC1 301 GS 모두 90% 이상의 높은 세포 생존률을 나타냄을 알 수 있다. 이는, MPC1이 도입되어도 세포 생존률에 영향이 없음을 보여준다. 도 7는 VCD를 보여주는 그래프로서, GSKO MPC1 301 GS의 경우, GSKO 301 GS에 비해 약 2배 가까이 높은 cell growth를 나타냄을 알 수 있다. 또한, 도 8는 배지에 존재하는 항체의 농도를 보여주는 그래프로서, 마우스 MPC1와 항체를 발현하는 세포 pool(GSKO MPC1 301 GS)에서 마우스 MPC1를 발현하지 않고 항체만을 발현하는 세포 pool(GSKO 301 GS)에 비해 항체 농도가 약 2배 이상 또는 약 3배 이상 높게 나타남을 알 수 있다.

한국세포주연구재단

KCLRF-BP-00327

20140903

<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Enhanced Production of a Recombinant Polypeptide by Overexpression of MPC1 <130> DPP20142514KR <160> 127 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of AbF46 <400> 1 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of AbF46 <400> 2 Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 of AbF46 <400> 3 Asp Asn Trp Phe Ala Tyr 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> X is Pro or Ser or absent <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> X is Glu or Asp <400> 4 Xaa Xaa Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> X is Asn or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (4) 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720 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320 ctctccctgt ctccgggtaa atgactcgag 1350 <210> 49 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of H4-heavy <400> 49 gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60 tcctgtgcag cttctggctt caccttcact gattactaca tgagctgggt gcgtcaggcc 120 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aacaatctta ctctgctcca ttgacttttg 1320 gtcaaggtac aaaggtcgaa atcaagagag aattcggtaa gcctatccct aaccctctcc 1380 tcggtctcga ttctacgggt ggtggtggat ctggtggtgg tggttctggt ggtggtggtt 1440 ctcaggaact gacaactata tgcgagcaaa tcccctcacc aactttagaa tcgacgccgt 1500 actctttgtc aacgactact attttggcca acgggaaggc aatgcaagga gtttttgaat 1560 attacaaatc agtaacgttt gtcagtaatt gcggttctca cccctcaaca actagcaaag 1620 gcagccccat aaacacacag tatgtttttt gagtttaaac ccgctgatct gataacaaca 1680 gtgtagatgt aacaaaatcg actttgttcc cactgtactt ttagctcgta caaaatacaa 1740 tatacttttc atttctccgt aaacaacatg ttttcccatg taatatcctt ttctattttt 1800 cgttccgtta ccaactttac acatacttta tatagctatt cacttctata cactaaaaaa 1860 ctaagacaat tttaattttg ctgcctgcca tatttcaatt tgttataaat tcctataatt 1920 tatcctatta gtagctaaaa aaagatgaat gtgaatcgaa tcctaagaga attgggcaag 1980 tgcacaaaca atacttaaat aaatactact cagtaataac ctatttctta gcatttttga 2040 cgaaatttgc tattttgtta gagtctttta caccatttgt ctccacacct ccgcttacat 2100 caacaccaat aacgccattt aatctaagcg catcaccaac attttctggc gtcagtccac 2160 cagctaacat aaaatgtaag ctctcggggc tctcttgcct tccaacccag tcagaaatcg 2220 agttccaatc caaaagttca cctgtcccac ctgcttctga atcaaacaag ggaataaacg 2280 aatgaggttt ctgtgaagct gcactgagta gtatgttgca gtcttttgga aatacgagtc 2340 ttttaataac tggcaaaccg aggaactctt ggtattcttg ccacgactca tctccgtgca 2400 gttggacgat atcaatgccg taatcattga ccagagccaa aacatcctcc ttaggttgat 2460 tacgaaacac gccaaccaag tatttcggag tgcctgaact atttttatat gcttttacaa 2520 gacttgaaat tttccttgca ataaccgggt caattgttct ctttctattg ggcacacata 2580 taatacccag caagtcagca tcggaatcta gagcacattc tgcggcctct gtgctctgca 2640 agccgcaaac tttcaccaat ggaccagaac tacctgtgaa attaataaca gacatactcc 2700 aagctgcctt tgtgtgctta atcacgtata ctcacgtgct caatagtcac caatgccctc 2760 cctcttggcc ctctcctttt cttttttcga ccgaatttct tgaagacgaa agggcctcgt 2820 gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttagg acggatcgct 2880 tgcctgtaac ttacacgcgc ctcgtatctt ttaatgatgg aataatttgg gaatttactc 2940 tgtgtttatt tatttttatg ttttgtattt ggattttaga aagtaaataa agaaggtaga 3000 agagttacgg aatgaagaaa aaaaaataaa caaaggttta aaaaatttca acaaaaagcg 3060 tactttacat atatatttat tagacaagaa aagcagatta aatagatata cattcgatta 3120 acgataagta aaatgtaaaa tcacaggatt ttcgtgtgtg gtcttctaca cagacaagat 3180 gaaacaattc ggcattaata cctgagagca ggaagagcaa gataaaaggt agtatttgtt 3240 ggcgatcccc ctagagtctt ttacatcttc ggaaaacaaa aactattttt tctttaattt 3300 ctttttttac tttctatttt taatttatat atttatatta aaaaatttaa attataatta 3360 tttttatagc acgtgatgaa aaggacccag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 3420 cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 3480 cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 3540 tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 3600 tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 3660 atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 3720 gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc 3780 aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga 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ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc 4680 agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 4740 tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 4800 ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 4860 cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 4920 tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 4980 acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 5040 ggaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 5100 ttttgtgatg ctcgtcaggg gggccgagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 5160 tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 5220 attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 5280 cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc 5340 ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga 5400 aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttacct cactcattag gcaccccagg 5460 ctttacactt tatgcttccg gctcctatgt 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polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-2 clone <400> 59 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240 aaaatgctga ttatttgggc atccactagg gtatctggag tcccttctcg cttctctgga 300 tccgggtctg ggacggattt cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360 acttattact gtgggcagtc ctacagccgt ccgctcacgt tcggacaggg taccaaggtg 420 gagatcaaac gtacg 435 <210> 60 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-3 clone <400> 60 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240 aaaatgctga 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constant region of human IgG1 <400> 62 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 145 150 155 160 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 165 170 175 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 180 185 190 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 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acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720 agctgcgatt gccactgtcc tccatgtcca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa atgactcgag 1410 <210> 64 <211> 461 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, human IgG2 hinge and constant region of human IgG1 <400> 64 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 145 150 155 160 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 165 170 175 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 180 185 190 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 195 200 205 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 210 215 220 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys 225 230 235 240 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 245 250 255 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 260 265 270 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 275 280 285 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 290 295 300 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 305 310 315 320 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 325 330 335 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 340 345 350 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 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cgtttcacta taagcagaga taattccaaa 300 aacacactgt acctgcagat gaacagcctg cgtgctgagg acactgccgt ctattattgt 360 gctagagata actggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcaccgt ctcctcggct 420 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagaggaag 720 tgctgtgtgg agtgcccccc ctgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 780 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 960 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1080 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380 tccctgtctc cgggtaaatg actcgag 1407 <210> 66 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, human IgG2 hinge and constant region of human IgG2 <400> 66 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn 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cagtgtgagg ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc 120 cgtttgtcct gtgcagcttc tggcttcacc ttcactgatt actacatgag ctgggtgcgt 180 caggccccgg gtaagggcct ggaatggttg ggttttatta gaaacaaagc taatggttac 240 acaacagagt acagtgcatc tgtgaagggt cgtttcacta taagcagaga taattccaaa 300 aacacactgt acctgcagat gaacagcctg cgtgctgagg acactgccgt ctattattgt 360 gctagagata actggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcaccgt ctcctcggct 420 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ctctgaccag cggcgtgcac accttcccag ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca acttcggcac ccagacctac 660 acctgcaacg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagacagt tgagcgcaaa 720 tgttgtgtcg agtgcccacc gtgcccagca ccacctgtgg caggaccgtc agtcttcctc 780 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 840 gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggacggcgtg 900 gaggtgcata atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt tcaacagcac gttccgtgtg 960 gtcagcgtcc tcaccgttgt gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 1020 gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaagggcag 1080 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1140 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccatgctgga ctccgacggc 1260 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380 ctgtctccgg gtaaatgact cgag 1404 <210> 68 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of light chain of huAbF46-H4-A1(H36Y) and human kappa constant region <400> 68 Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Ser Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Ala Ser Gly Asn 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consisting of light chain of huAbF46-H4-A1(H36Y) and human kappa constant region <400> 69 aattcactag tgattaattc gccgccacca tggattcaca ggcccaggtc ctcatgttgc 60 tgctgctatc ggtatctggt acctgtggag atatccagat gacccagtcc ccgagctccc 120 tgtccgcctc tgtgggcgat agggtcacca tcacctgcaa gtccagtcag agtcttttag 180 ctagtggcaa ccaaaataac tacttggcct ggtaccaaca gaaaccagga aaagctccga 240 aaatgctgat tatttgggca tccactaggg tatctggagt cccttctcgc ttctctggat 300 ccgggtctgg gacggatttc actctgacca tcagcagtct gcagccggaa gacttcgcaa 360 cttattactg tcagcagtcc tacagccgcc cgtacacgtt cggacagggt accaaggtgg 420 agatcaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt 480 tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca 540 aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag 600 agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag 660 actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg 720 tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt gactcgag 758 <210> 70 <211> 240 <212> 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aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1140 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga ctcgag 1416 <210> 77 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of light chain of anti-c-Met antibody (AbF46 or huAbF46-H1) <220> <221> misc_difference <222> (1)..(6) <223> EcoRI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (7)..(90) <223> signal sequence <220> <221> misc_difference <222> (91)..(432) <223> VL - light chain variable region <220> <221> misc_difference <222> (430)..(435) <223> BsiWI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (433)..(750) <223> CL - light chain constant region <220> <221> misc_difference <222> (751)..(753) <223> stop codon <220> <221> misc_difference <222> (754)..(759) <223> XhoI restriction site <400> 77 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gacattttga tgacccagtc tccatcctcc 120 ctgactgtgt cagcaggaga gaaggtcact atgagctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccagc agaaaccagg acgatctcct 240 aaaatgctga taatttgggc atccactagg gtatctggag tccctgatcg cttcataggc 300 agtggatctg ggacggattt cactctgacc atcaacagtg tgcaggctga agatctggct 360 gtttattact gtcagcagtc ctacagcgct ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg 420 gagctgaaac gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 480 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 540 aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca 600 gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca 660 gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc 720 gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt tgactcgag 759 <210> 78 <211> 4170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding c-Met protein <400> 78 atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60 aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag 120 tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat 180 cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag 240 gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac 300 tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta 360 gttgtcgaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc 420 tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc 480 atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg 540 ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc 600 ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag 660 gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag 720 ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac 780 ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg 840 ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc 900 acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg 960 tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac 1020 attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct 1080 gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa 1140 aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg 1200 acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt 1260 accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca 1320 tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt 1380 cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc 1440 ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc 1500 tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc 1560 agacatttcc agtcctgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg 1620 tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc 1680 tgtctgcctg caatctacaa ggttttccca aatagtgcac cccttgaagg agggacaagg 1740 ctgaccatat gtggctggga ctttggattt cggaggaata ataaatttga tttaaagaaa 1800 actagagttc tccttggaaa tgagagctgc accttgactt taagtgagag cacgatgaat 1860 acattgaaat gcacagttgg tcctgccatg aataagcatt tcaatatgtc cataattatt 1920 tcaaatggcc acgggacaac acaatacagt acattctcct atgtggatcc tgtaataaca 1980 agtatttcgc cgaaatacgg tcctatggct ggtggcactt tacttacttt aactggaaat 2040 tacctaaaca gtgggaattc tagacacatt tcaattggtg gaaaaacatg tactttaaaa 2100 agtgtgtcaa acagtattct tgaatgttat accccagccc aaaccatttc aactgagttt 2160 gctgttaaat tgaaaattga cttagccaac cgagagacaa gcatcttcag ttaccgtgaa 2220 gatcccattg tctatgaaat tcatccaacc aaatctttta ttagtggtgg gagcacaata 2280 acaggtgttg ggaaaaacct gaattcagtt agtgtcccga gaatggtcat aaatgtgcat 2340 gaagcaggaa ggaactttac agtggcatgt caacatcgct ctaattcaga gataatctgt 2400 tgtaccactc cttccctgca acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt 2460 ttcatgttag atgggatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg 2520 tttaagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt 2580 aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag 2640 agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg 2700 ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt 2760 ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacaggat tgattgctgg tgttgtctca 2820 atatcaacag cactgttatt actacttggg tttttcctgt ggctgaaaaa gagaaagcaa 2880 attaaagatc tgggcagtga attagttcgc tacgatgcaa gagtacacac tcctcatttg 2940 gataggcttg taagtgcccg aagtgtaagc ccaactacag aaatggtttc aaatgaatct 3000 gtagactacc gagctacttt tccagaagat cagtttccta attcatctca gaacggttca 3060 tgccgacaag tgcagtatcc tctgacagac atgtccccca tcctaactag tggggactct 3120 gatatatcca gtccattact gcaaaatact gtccacattg acctcagtgc tctaaatcca 3180 gagctggtcc aggcagtgca gcatgtagtg attgggccca gtagcctgat tgtgcatttc 3240 aatgaagtca taggaagagg gcattttggt tgtgtatatc atgggacttt gttggacaat 3300 gatggcaaga aaattcactg tgctgtgaaa tccttgaaca gaatcactga cataggagaa 3360 gtttcccaat ttctgaccga gggaatcatc atgaaagatt ttagtcatcc caatgtcctc 3420 tcgctcctgg gaatctgcct gcgaagtgaa gggtctccgc tggtggtcct accatacatg 3480 aaacatggag atcttcgaaa tttcattcga aatgagactc ataatccaac tgtaaaagat 3540 cttattggct ttggtcttca agtagccaaa ggcatgaaat atcttgcaag caaaaagttt 3600 gtccacagag acttggctgc aagaaactgt atgctggatg aaaaattcac agtcaaggtt 3660 gctgattttg gtcttgccag agacatgtat gataaagaat actatagtgt acacaacaaa 3720 acaggtgcaa agctgccagt gaagtggatg gctttggaaa gtctgcaaac tcaaaagttt 3780 accaccaagt cagatgtgtg gtcctttggc gtgctcctct gggagctgat gacaagagga 3840 gccccacctt atcctgacgt aaacaccttt gatataactg tttacttgtt gcaagggaga 3900 agactcctac aacccgaata ctgcccagac cccttatatg aagtaatgct aaaatgctgg 3960 caccctaaag ccgaaatgcg cccatccttt tctgaactgg tgtcccggat atcagcgatc 4020 ttctctactt tcattgggga gcactatgtc catgtgaacg ctacttatgt gaacgtaaaa 4080 tgtgtcgctc cgtatccttc 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ttttcacaca 660 agaataatca ggttctgttc cataaactct ggattgcatt cctacatgga aatgcctctg 720 gagtgtattc tcacagaaaa gagaaaaaag agatccacaa agaaggaagt gtttaatata 780 cttcaggctg cgtatgtcag caagcctggg gcccagcttg ctagacaaat aggagccagc 840 ctgaatgatg acattctttt cggggtgttc gcacaaagca agccagattc tgccgaacca 900 atggatcgat ctgccatgtg tgcattccct atcaaatatg tcaacgactt cttcaacaag 960 atcgtcaaca aaaacaatgt gagatgtctc cagcattttt acggacccaa tcatgagcac 1020 tgctttaata ggacacttct gagaaattca tcaggctgtg aagcgcgccg tgatgaatat 1080 cgaacagagt ttaccacagc tttgcagcgc gttgacttat tcatgggtca attcagcgaa 1140 gtcctcttaa catctatatc caccttcatt aaaggagacc tcaccatagc taatcttggg 1200 acatcagagg gtcgcttcat gcaggttgtg gtttctcgat caggaccatc aacccctcat 1260 gtgaattttc tcctggactc ccatccagtg tctccagaag tgattgtgga gcatacatta 1320 aaccaaaatg gc 1332 <210> 83 <211> 1299 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding PSI-IPT domain of c-Met <400> 83 tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc 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cttccctgca acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt 960 ttcatgttag atgggatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg 1020 tttaagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt 1080 aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag 1140 agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg 1200 ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt 1260 ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacagga 1299 <210> 84 <211> 939 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding TyrKc domain of c-Met <400> 84 gtgcatttca atgaagtcat aggaagaggg cattttggtt gtgtatatca tgggactttg 60 ttggacaatg atggcaagaa aattcactgt gctgtgaaat ccttgaacag aatcactgac 120 ataggagaag tttcccaatt tctgaccgag ggaatcatca tgaaagattt tagtcatccc 180 aatgtcctct cgctcctggg aatctgcctg cgaagtgaag ggtctccgct ggtggtccta 240 ccatacatga aacatggaga tcttcgaaat ttcattcgaa atgagactca taatccaact 300 gtaaaagatc ttattggctt tggtcttcaa gtagccaaag gcatgaaata tcttgcaagc 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1560 tctgcagtca ccgaattcac tagtgattaa ttcgccgcca ccatggactc ccaggcccag 1620 gtgctgatgc tcctgctgct gtccgtgtcc ggcacctgtg gcgacatcca gatgacccag 1680 tccccatcca gcctgagcgc ttccgtgggc gacagagtga ccatcacatg caagtcctcc 1740 cagtccctgc tggcctccgg caaccagaac aactacctgg cctggtatca gcagaagccc 1800 ggcaaggccc ccaagatgct gatcatctgg gcctccacca gagtgtccgg cgtgccctcc 1860 agattctccg gctctggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagccc 1920 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tcctactccc ggccctacac cttcggccag 1980 ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gccgctccct ccgtgttcat cttcccaccc 2040 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 2100 ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 2160 gaatccgtca ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 2220 ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 2280 ctgtccagcc ccgtgaccaa gtccttcaac cggggcgagt gctgactcga gaaactgtgc 2340 cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag 2400 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gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240 aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300 ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360 tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 420 ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 480 ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 540 tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agct 584 <210> 118 <211> 588 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human CMV immediate-early promoter fragment <400> 118 gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60 gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120 ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180 ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240 atcaagtgta tcatatgcca agtccgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300 cctggcatta tgcccagtac atgaccttac gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360 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<210> 121 <211> 1391 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse CMV promoter <400> 121 aactccgccc gttttatgac tagaaccaat agtttttaat gccaaatgca ctgaaatccc 60 ctaatttgca aagccaaacg ccccctatgt gagtaatacg gggacttttt acccaatttc 120 ccacgcggaa agccccctaa tacactcata tggcatatga atcagcacgg tcatgcactc 180 taatggcggc ccatagggac tttccacata gggggcgttc accatttccc agcatagggg 240 tggtgactca atggccttta cccaagtaca ttgggtcaat gggaggtaag ccaatgggtt 300 tttcccatta ctggcaagca cactgagtca aatgggactt tccactgggt tttgcccaag 360 tacattgggt caatgggagg tgagccaatg ggaaaaaccc attgctgcca agtacactga 420 ctcaataggg actttccaat gggtttttcc attgttggca agcatataag gtcaatgtgg 480 gtgagtcaat agggactttc cattgtattc tgcccagtac ataaggtcaa tagggggtga 540 atcaacagga aagtcccatt ggagccaagt acactgcgtc aatagggact ttccattggg 600 ttttgcccag tacataaggt caatagggga tgagtcaatg ggaaaaaccc attggagcca 660 agtacactga ctcaataggg actttccatt gggttttgcc cagtacataa ggtcaatagg 720 gggtgagtca acaggaaagt tccattggag ccaagtacat tgagtcaata 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gacccgtcca tctcgcaggg tgggccaggg cgggtcagga gggaggggag 180 ggagaccccg actctgcaga aggcgctcgc tgcgtgcccc acgtccgccg aacgcggggt 240 tcgcgacccg aggggaccgc gggggctgag gggaggggcc gcggagccgc ggctaaggaa 300 cgcgggccgc ccacccgctc ccggtgcagc ggcctccgcg ccgggttttg gcgcctcccg 360 cgggcgcccc cctcctcacg gcgagcgctg ccacgtcaga cgaagggcgc agcgagcgtc 420 ctgatccttc cgcccggacg ctcaggacag cggcccgctg ctcataagac tcggccttag 480 aaccccagta tcagcagaag gacattttag gacgggactt gggtgactct agggcactgg 540 ttttctttcc agagagcgga acaggcgagg aaaagtagtc ccttctcggc gattctgcgg 600 agggatctcc gtggggcggt gaacgccgat gattatataa ggacgcgccg ggtgtggcac 660 agctagttcc gtcgcagccg ggatttgggt cgcagttctt gtttgtggat cgctgtgatc 720 gtcacttggt gagtagcggg ctgctgggct ggccggggct ttcgtggccg ccgggccgct 780 cggtgggacg gaggcgtgtg gagagaccgc caagggctgt agtctgggtc cgcgagcaag 840 gttgccctga actgggggtt ggggggagcg cagcaaaatg gcggctgttc ccgagtcttg 900 aatggaagac gcttgtgagg cgggctgtga ggtcgttgaa acaaggtggg gggcatggtg 960 ggcggcaaga acccaaggtc ttgaggcctt cgctaatgcg ggaaagctct tattcgggtg 1020 agatgggctg gggcaccatc tggggaccct gacgtgaagt ttgtcactga ctggagaact 1080 cggtttgtcg tctgttgcgg gggcggcagt tatggcggtg ccgttgggca gtgcacccgt 1140 acctttggga gcgcgcgccc tcgtcgtgtc gtgacgtcac ccgttctgtt ggcttataat 1200 gcagggtggg gccacctgcc ggtaggtgtg cggtaggctt ttctccgtcg caggacgcag 1260 ggttcgggcc tagggtaggc tctcctgaat cgacaggcgc cggacctctg gtgaggggag 1320 ggataagtga ggcgtcagtt tctctggtcg gttttatgta cctatcttct taagtagctg 1380 aagctccggt tttgaactat gcgctcgggg ttggcgagtg tgttttgtga agttttttag 1440 gcaccttttg aaatgtaatc atttgggtca atatgtaatt ttcagtgtta gactagtaaa 1500 ttgtccgcta aattctggcc gtttttggct tttttgttag ac 1542 <210> 123 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric intron <400> 123 gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga 60 cagagaagac tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc 120 tttctctcca cag 133 <210> 124 <211> 963 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Intron A <400> 124 gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa 60 gacaccggga ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg cggattcccc 120 gtgccaagag tgacgtaagt accgcctata gactctatag gcacacccct ttggctctta 180 tgcatgctat actgtttttg gcttggggcc tatacacccc cgctccttat gctataggtg 240 atggtatagc ttagcctata ggtgtgggtt attgaccatt attgaccact cccctattgg 300 tgacgatact ttccattact aatccataac atggctcttt gccacaacta tctctattgg 360 ctatatgcca atactctgtc cttcagagac tgacacggac tctgtatttt tacaggatgg 420 ggtcccattt attatttaca aattcacata tacaacaacg ccgtcccccg tgcccgcagt 480 ttttattaaa catagcgtgg gatctccacg cgaatctcgg gtacgtgttc cggacatggg 540 ctcttctccg gtagcggcgg agcttccaca tccgagccct ggtcccatgc ctccagcggc 600 tcatggtcgc tcggcagctc cttgctccta acagtggagg ccagacttag gcacagcaca 660 atgcccacca ccaccagtgt gccgcacaag gccgtggcgg tagggtatgt gtctgaaaat 720 gagctcggag attgggctcg caccgtgacg cagatggaag acttaaggca gcggcagaag 780 aagatgcagg cagctgagtt gttgtattct gataagagtc agaggtaact cccgttgcgg 840 tgctgttaac ggtggagggc agtgtagtct gagcagtact cgttgctgcc gcgcgcgcca 900 ccagacataa tagctgacag actaacagac tgttcctttc catgggtctt ttctgcagtc 960 acc 963 <210> 125 <211> 115 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGLV intron <400> 125 gtgacaggat ggggaccaag aaaggggccc tgggaagccc atggggccct gctttctcct 60 cttgtctcct tttgtctctt gtcaatcacc atgtctgtgt ctctctcact tccag 115 <210> 126 <211> 206 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGKV intron <400> 126 gtgagaatat ttagaaaaag ctaaaactaa ttctttgaac cattaatttt cttaattagg 60 aacctggcac catatggaac ttggcttgtt tttaaatgtg attttttttt aagtaatgcg 120 tattctttca tcttgtgcta ctagattagt ggtgatttca ttaagcagat gcttatattg 180 tgctaatgtt tgctgtatgt tttcag 206 <210> 127 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGH intron <400> 127 gtgagtgtct cagggatcca gacatggggg tatgggaggt gcctctgatc ccagggctca 60 ctgtgggtct ctctgttcac ag 82

Claims

MPC ((mitochondrial pyruvate carrier) 1 유전자의 과발현이 유도된 재조합 세포.
제1항에 있어서, 상기 MPC1 유전자의 과발현은 i) MPC1 유전자, 또는 ii) MPC1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 추가로 포함하여 유도되는 것인, 재조합 세포.
제2항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 발현 효율이 높은 프로모터, 인핸서, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것인, 재조합 세포.
제1항에 있어서, 상기 MPC1 유전자의 과발현은 발현 효율이 높은 프로모터, 인핸서, 또는 이들의 조합을 MPC1 유전자와 작동 가능하도록 도입함으로써 유도되는 것인, 재조합 세포.
제1항에 있어서, 수탁번호 KCLRF-BP-00327인, 재조합 세포.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 목적 폴리펩타이드 암호화 유전자를 추가로 포함하는, 재조합 세포.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 세포, MPC1 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 또는 이들의 조합을 포함하는, 폴리펩타이드 생산용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 재조합 벡터 또는 재조합 세포는 목적 폴리펩타이드 암호화 유전자를 추가로 포함하는 것인, 폴리펩타이드 생산용 조성물.
제6항의 재조합 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 목적 폴리펩타이드의 생산 방법.
MPC1 유전자 및 목적 폴리펩타이드 암호화 유전자를 포함하는 목적 폴리펩타이드 발현 벡터.