KR100397791B1 - ＣＨＯ세포에서 ｂｃｌ-2 유전자 과발현 및 배지내 소디움부티레이트 첨가에 의한 인간화된 항체의 생산성을증가시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간화된 항체를 암호화하는 유전자로 형질전환된 CHO세포에 bcl-2 유전자를 과발현하는 벡터를 도입하여, 세포예정사(apoptosis)에 저항성을 갖는 세포주를 확립하고, 소디움 부티레이트를 첨가하여 항체생산성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 인간화된 항체 생산성을 증가시키는 방법은, 인간화된 항체를 암호화하는 유전자로 형질전환된 재조합 CHO세포로부터 항체를 대량생산하는 방법에 있어서, 전기 재조합 CHO세포에 인간의 bcl-2유전자를 과발현하는 벡터를 도입하는 단계; 및, 전기 벡터가 도입된 재조합 CHO세포를 배지에 접종하고, 소디움 부티레이트를 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 전기 방법은, 항체생산단계의 살아있는 세포의 농도, 및 전기 세포들의 비항체생산성을 동시에 향상시킴으로써, 재조합 CHO세포의 생존률 및 생존기간을 증가시켜, 최종 항체생산성을 2배이상 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 생산방법을 이용하면, 인간화된 항체 및 사이토카인과 같은 동물세포 산물의 단위 생산성을 향상시켜 관련분야의 시장개척에 커다란 도움을 줄 수 있을 것이다.

Description

ＣＨＯ세포에서 ｂｃｌ-2 유전자 과발현 및 배지내 소디움 부티레이트 첨가에 의한 인간화된 항체의 생산성을 증가시키는 방법{Method for Increasing Humanized Antibody Production in CHO Cells by Overexpression of bcl-2 Gene and Treatment of Sodium Butyrate}

본 발명은 인간화된 항체를 암호화하는 유전자로 형질전환된 CHO세포의 항체생산성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 인간화된 항체를 암호화하는 유전자로 형질전환된 CHO세포에 bcl-2 유전자를 과발현하는 벡터를 도입함으로써, 세포예정사(apoptosis)에 저항성을 갖는 세포주를 확립하고, 높은 농도의 소디움 부티레이트를 첨가하여 항체생산성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

암, 감염성 질환 또는 자가면역 질환의 진단 또는 예방 및 치료를 위한 단일클론항체의 대량생산은 1975년 영국의 밀스턴 박사(Dr. Milstein)와 콜러 박사(Dr. Kohler)에 의하여, 생쥐의 하이브리도마 기술이 개발됨으로써 가능해졌다. 그러나, 쥐의 단일클론 항체는 인체에 임상적으로 반복투여하였을 경우, 인체의 면역반응을 유발하여 부작용이 생기거나 그 효과가 감소하므로, 최근에는 생쥐 단일클론항체를 유전공학 기술과 단백질 공학기술을 이용하여 인간화시키는 기술이 개발되어, 선진 각국에서 경쟁적으로 여러가지 다양한 질환의 예방 및 치료제 개발에 이용되고 있다.

인간화된 항체의 경우, 항체내 가변영역의 CDR부위(complementarity determining region)만이 쥐 항체로 되어 있고, 나머지 부분은 모두 인간의 항체로 치환되어 있어, 인체내 안정성이 상당히 향상되어 있다. 이러한 인간화된 재조합 항체를 임상적으로 실험하고, 나아가 상품화하기 위해서는 경제적인 대량생산이 필수적이다. 현재, 당쇄화(glycosylation)와 같은 단백질의 번역 후 수정 및 수식과정(post-translational modification)을 거친 기능적인 전체 항체분자의 생산을 위해서는 동물세포를 발현숙주로 사용하는 것이 적합하다고 알려져 있으며, 특히 유전자 증폭된 CHO세포가 가장 널리 사용되고 있다.

한편, 재조합 CHO세포에 의하여 단일클론항체를 생산하는 경우, 항체의 최종농도는 항체를 생산하는 살아 있는 세포의 농도와 비항체생산속도의 영향을 받게 된다(최종 항체농도= 세포농도 X 비항체 생산속도). 기존의 배양 방법론에서는 비항체생산속도가 세포의 고유성질로 간주되어 변화시킬 수 없는 요소로 생각되었기 때문에, 최종 항체농도 증가를 위해서 주로 회분배양을 통하여 세포의 농도를 증가시키는 방향으로 연구가 진행되었다. 그러나, 한편으로는 비항체 생산속도를 증가시키기 위한 방법도 다양하게 시도되었는데, 디하이드로폴레이트 환원효소 (dihydrofolate reductase, DHFR)/메토트렉세이트(methotrexate, MTX)(DHFR/MTX), 글루타민 합성효소(glutamine synthetase, GS)/메티오닌 썰폭시민(methionine sulfoximine, MSX)(GS/MSX)과 같은 유전자 증폭 시스템 또는 고삼투압 배지를 이용한 세포의 단위생산속도 증가 등이 그것이다. 전술한 방법은, 최종 항체농도를 결정하는 세포농도나 비항체생산속도 중 어느 한쪽만을 최적화시킴으로써 최종 항체농도를 증가시키는 것이었다. 그러나, 유전자 증폭 시스템의 경우, 어느 수준 이상으로 재조합 유전자의 카피수가 증가하면, 선형적으로 재조합 항체생산성이 증가되지 않고 포화되며, 고삼투압 배지의 경우, 비항체생산속도는 증가하지만 상대적으로 세포의 성장 및 생존률은 감소한다. 따라서, 최종 항체농도를 결정하는 두 가지 요소, 즉 항체생산단계의 살아 있는 세포의 농도와 이 세포들의 비항체생산성을 동시에 향상시키는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 최종항체 농도를 증가시키는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 인간화된 항체를 암호화하는 유전자로 형질전환된 재조합 CHO세포로부터 항체를 대량생산하는 데 있어서, 전기 재조합 CHO세포에 인간의 bcl-2유전자를 과발현하는 벡터를 도입하고, 전기 벡터가 도입된 재조합 CHO 세포를 배지에 접종하고 소디움 부티레이트를 첨가함으로써, 인간화된 항체의 항체생산성이 증가됨을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 bcl-2 유전자의 과발현 및 배지내 소디움 부티레이트의 첨가에 의해 인간화된 항체를 암호화하는 유전자로 형질전환된 재조합 CHO세포의 항체생산성을 증가시키는 방법을 제공한다.

도 1a은 인간의 B형 간염 바이러스 S항원에 대한 인간화된 항체의 헤비 체인(heavy chain)을 발현시키는 벡터를 나타낸 그림이다.

도 1b는 인간의 B형 간염 바이러스 S항원에 대한 인간화된 항체의 라이트 체인(light chain)을 발현시키는 벡터를 나타낸 그림이다.

도 2는 인간의 B형 간염 바이러스 S항원에 대한 인간화된 항체의 헤비체인과 라이트체인을 동시에 발현시키는 벡터를 제조하는 과정을 나타낸 그림이다.

도 3은 본 발명의 인간의 bcl-2유전자를 클로닝하기 위하여 사용된 벡터를 나타낸 그림이다.

도 4는 도 3의 벡터로부터 인간의 bcl-2유전자를 제한효소로 잘라내에, 본 발명의 bcl-2유전자를 발현하는 벡터를 제조하는 과정을 나타낸 그림이다.

도 5는 B형 간염 바이러스의 S항원에 대한 인간화된 항체의 유전자로 형질전환된 재조합 CHO세포주에, 인간의 bcl-2 유전자가 도입되지 않는 세포주(SH2-0.32-△bcl-2)와 인간의 bcl-2 유전자가 도입되어 과발현되는 세포주(14C6-bcl-2)에 소디움 부티레이트를 처리하였을 때, 시간별로 나타나는 세포예정사(apoptosis)를 나타낸 그래프이다.

도 6는 SH2-0.32-△bcl-2 세포주와 14C6-bcl-2 세포주를 정상 회분 배양하였을 때, 배양기간에 따른 세포성장, 세포생존률 및 S항원에 대한 인간화된 항체의 발현정도를 나타낸 그래프이다.

도 7은 SH2-0.32-△bcl-2 세포주와 14C6-bcl-2 세포주를 정상 회분배양하는 과정에서, 대수증식기에 5mM의 소디움 부티레이트를 배지내에 첨가하였을 때, 배양기간에 따른 세포성장, 세포생존률 및 S항원에 대한 인간화된 항체의 발현정도를 나타낸 그래프이다.

본 발명자들은 인간화된 항체의 유전자로 형질전환된 재조합 CHO세포에, 다양한 스트레스 환경에서 세포예정사의 한 단계를 방해하여 세포 생존률을 증가시킬 수 있는 것으로 알려진 인간의 bcl-2유전자를 과발현하는 벡터를 전기 재조합 CHO 세포에 도입하고, 또한 재조합 세포의 염색체 구조에 변화를 유도함으로써 외래 유전자의 발현단계 중 전사단계를 증가시키고 이로 인하여 전체적인 단백질의 발현수준을 증가시키는 것으로 알려진 소디움 부티레이트를 배지에 첨가함으로써, 소디움 부티레이트의 세포독성에 의하여 야기되는 세포예정사를 bcl-2유전자의 과발현에 의하여 억제함으로써, 인간화된 항체 생산성이 증가됨을 확인하였다.

이하, 본 발명의 인간화된 항체를 암호화하는 유전자로 형질전환된 재조합 CHO세포의 항체 생산성을 증가시키는 방법을 상세히 설명하고자 한다.

본 발명의 인간화된 항체를 암호화하는 유전자로 형질전환된 재조합 CHO세포의 항체 생산성을 증가시키는 방법은, 인간화된 항체를 암호화하는 유전자로 형질전환된 재조합 CHO세포로부터 항체를 대량생산하는 방법에 있어서, 전기 재조합 CHO세포에 인간의 bcl-2유전자를 과발현하는 벡터를 도입하는 단계; 및, 전기 벡터가 도입된 재조합 CHO세포를 배지에 접종하고, 소디움 부티레이트를 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이때, CHO세포는 벡터에 클로닝되어 있는 인간화된 항체 유전자를 DHFR/MTX 시스템으로 유전자 증폭반응을 하기 위하여 DHFR유전자가 결실된 CHO 세포주를 사용하고, 소디움 부티레이트는 배지에 대하여 최종농도가 4 내지 6 mM, 가장 바람직하게는 5mM로, 재조합 CHO세포를 배지에 접종하고 50 내지 70시간, 가장 바람직하게는 60시간이 지난 후에 처리된다. 전술한 방법에 의하여 제조되는 인간화된 항체를 암호화하는 유전자 및 인간의 bcl-2유전자가 동시에 발현되는 세포주는 인간화된 항체 생산성을 크게 증가시킨다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 지닌 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 인간의 B형 간염 바이러스의 S항원에 대한 인간화된 항체 유전자로 형질전환된 재조합 CHO세포의 제조

인간의 B형 간염 바이러스의 S항원에 대한 인간화된 항체를 발현하는 벡터를전기 항체의 라이트체인(light chain)과 헤비체인(heavy chain)을 발현하는 벡터, 즉 pKC-dhfr-huS 및 pRc/CMV-HC-huS(참조: 대한민국 특허등록 제 162021호, 도 1a 및 1b)를 기초로 제작하였다: 즉, pRc/CMV-HC-huS에서 우선 BglII제한효소로 부분적으로 절단하고, 다시 XhoI제한효소로 자른 후, 전기영동하여 Pcmv와 헤비체인 유전자를 포함하는 2.8kb절편을 얻고, 이 절편에 Klenow효소를 처리하여 블런트 말단으로 만든 다음, 이를 DraIII로 절단된 pKC-dhfr-huS에 삽입함으로써 라이트체인과 헤비체인을 단일벡터로부터 발현될 수 있는 벡터를 조합하여, 이를 pKC-dhfr-HC-huS라 하였다(참조: 도 2).

전기에서 수득한 벡터, pKC-dhfr-HC-huS를 CHO세포에 도입하기 위하여, 라이포펙타민(lipofectamine, GIBCO, USA)을 이용한 트랜스펙션(transfection)을 수행하였다: 즉, 1 x 하이포크산틴(hypoxanthine)/티미딘(thymidine), 10%의 우태아 혈청, 1 x 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media)/Ham F12배지 5ml이 담겨진 60mm 배양접시에 5 x 10⁵세포/웰의 농도로 dhfr-인 CHO세포(DUKX-B11, ATCC CRL-9096, USA)를 접종하여 24시간이 경과한 후, 배지를 3ug의 pKC-dhfr-HC-huS벡터/ 18ug의 라이포펙타민 복합체를 내포한 무혈청 배지(Opti-MEM I, GIBCO, USA)로 교환하여 줌으로써 트랜스펙션을 시도하였다. 48시간이 경과한 후에, 550ug/ml 농도의 G418(GIBCO, USA) 및 10%의 투석된 우태아 혈청(GIBCO, USA)이 들어 있는 MEM-α(Minimum Essential Medium-alpha, GIBCO, USA) 배지에서 2 내지 3주간 선별하였다. 선별된 세포는 20, 80, 320nM로 MTX의농도를 단계적으로 올려주면서 항체 유전자의 카피수를 증폭시켜, 최종적으로 320nM MTX에 저항성을 갖는 고생산성 세포주를 확보하고, 이를 SH2-0.32라 하였다.

실시예 2: SH2-0.32세포주에 인간의 bcl-2유전자로 형질전환된 CHO세포의 제조

전기의 실시예 1에서 수득한 SH2-0.32세포주에 인간의 Bcl-2 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 도입하기 위하여, 인간의 bcl-2유전자가 클로닝되어 있는 pKC-bcl-2벡터(참조: 도 3)로부터 EcoRI 제한효소를 사용하여, 0.95kb의 bcl-2 cDNA 절편을 잘라내었다. 전기의 bcl-2 cDNA를 pcDNA 3.1/Zeo(+) 발현벡터(Invitrogen, USA)의 멀티클로닝 부위의 EcoRI 부위에 삽입하여 pBcl-2/Zeo를 벡터를 제조하고(참조: 도 4), 이를 전기의 실시예 1에서와 마찬가지로 라이포펙틴을 이용하여 트랜스펙션한 다음, 500ug/ml의 지오신(zeocin)이 들어있는 배지에서 2주간 선별하여 35개의 지오신 저항클론들을 얻었다. 전기 클론들로부터 전체 단백질을 분리한 다음, 클론당 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE를 통하여 단백질 종류에 따라 분리하고, 니트로셀로로스 막으로 옮겼다. 인간 Bcl-2 단백질에 대한 쥐 항체 (Boehringer Mannheim, Germany)를 1차 항체로 하고, HRP로 표지된 쥐 항체에 대한 염소 항체를 2차 항체(Upstate Biotechnology, USA)를 사용하여 항원-항체 반응을 야기시키고, 이 때 수득되는 밴드의 강도를 측정하여 Bcl-2 단백질을 고발현하는 재조합 세포를 확보하고, 이를 14C6-bcl-2라 하였다. 이 때, bcl-2유전자가 삽입되어 있지 않은 벡터(pcDNA 3.1/Zeo(+))를 동일한 SH2-0.32세포주에 도입하여, 지오신이 첨가된 배양배지에서 선별하여 대조군 세포주를 얻어, 이를 SH2-0.32-△bcl-2라 하였다.

실시예 3: 소디움 부티레이트 처리에 의한 14C6-bcl-2세포주의 세포예정사 (apoptosis) 억제효과

bcl-2 단백질의 과발현이 소디움 부티레이트에 의한 세포예정사를 억제하는지를 알아보기 위하여, 대조군인 SH2-0.32-△bcl-2 세포와 실험군인 14C6-bcl-2세포 10⁶을 320nM MTX 및 5% 우태아 혈청이 첨가된 MEM-α배지가 10ml 들어 있는 100mm 배양접시에 접종한 다음, 단백질 생산에 필요한 충분한 농도의 세포를 확보하기 위하여 60시간동안 배양하고, 최종 농도가 5mM이 되도록 배양배지에 소디움 부티레이트를 첨가하여, 일정한 시간 간격을 두고 세포를 수확한 다음, 제노믹 DNA (genomic DNA)를 분리하여 2%의 아가로스 젤에서 전기영동을 하였다. 그 결과, 대조군 세포로부터 분리한 제노믹 DNA는 소디움 부티레이트를 첨가하고, 36시간이 지난 이후부터 세포예정사의 특징인 200염기쌍의 배수로 DNA밴드가 나타나는 것을 볼 수 있으나, Bcl-2 단백질을 과발현하는 14C6-bcl-2세포는 84시간 이후에 DNA밴드가 약한 정도로 나타나는 것을 확인할 수 있었다(참조: 도 5). 즉, Bcl-2의 과발현이 소디움 부티레이트의 세포독성에 의한 세포예정사를 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 4: 14C6-bcl-2세포에 의한 항체 생산성의 변화

Bcl-2의 과발현에 의한 세포예정사 억제가 14C6-bcl-2세포로부터 생산되는 항체의 최종생산성 증가로 연결되는가를 알아보기 위해서 회분배양을 실시하였다: 즉, SH2-0.32-△bcl-2와 14C6-bcl-2세포를 회분배양하기 위하여, 320nM MTX, 5%의 투석한 우태아 혈청, 1g/L의 글루코스가 추가로 첨가된 MEM-α배지 3ml을 6웰의 배양접시에 넣고 37℃에서 배양하면서, 소디움 부티레이트를 첨가하지 않은 경우와 첨가한 경우에 시간별로 시료를 채취하여 세포의 세포성장, 세포생존률 및 항체 생산성의 변화를 측정하였다(참조: 도 6 및 도 7). 세포성장과 세포생존률은 트립판 블루 배제법(tryphan blue exclusion)으로 측정하고, 생산되는 항체의 농도는 샌드위치 ELISA 방법(sandwich ELISA, Kim et al., Biotechnol. Bioeng., 51:479-487, 1996)으로 측정하였다. 도 6 및 도 7에서, (--)는 대조군인 SH2-0.32-bcl-2세포주를 나타내고, (--)는 실험군인 14C6-bcl-2세포주를 각각 나타낸다.

도 6에서 보듯이, 소디움 부티레이트를 첨가하지 않은 상태에서 회분 배양을 하였을 때, 14C6-bcl-2세포의 최종 세포농도는 대조군의 약 70%임을 알 수 있었는 바, 이는 bcl-2 세포의 과발현으로 인한 세포크기의 증가에 의하여 이차원적 평면에서 세포간의 접촉 억제가(contact inhibition)가 대조군보다 크기 때문인 것으로 추측되었다. 그러나, 세포생존률과 최종 항체생산성(대조군과 14C6-bcl-2 모두 약5ug/ml)의 경우에는 대조군과 비교하여 커다란 차이점을 확인할 수 없었다. 반면, 도 7에서 보듯이, 회분배양 과정 중 중간대수증식기에 최종 농도가 5mM이 되도록 소디움 부티레이트를 첨가하였을 때는 대조군의 경우, 소디움 부티레이트를 첨가한 이후 약 12시간 정도의 성장억제를 보이다가, 곧바로 세포 사멸기로 넘어갔으나, 14C6-bcl-2세포는 소디움 부티레이트를 첨가한 후 12시간 동안은 약간의 세포농도가 증가하다가 이후에 세포 사멸기로 들어갔는데, 대조군에 비하여 그 속도가 느림을 확인할 수 있었다. 세포생존률의 경우, 50%의 생존률 감소를 보이는 시간이 대조군과 비교하였을 때, 약 72시간 정도가 더 연장되었으며, 항체 생산성의 경우는 대조군(7ug/ml)과 비교하여 14C6-bcl-2세포의 경우(14.6ug/ml) 약 2배 정도 증가하였고, 소디움 부티레이트를 첨가하지 않았을 경우(5ug/ml)에 비해서는 약 3배 정도 증가하였다. 하기 표 1은 소디움 부티레이트의 첨가여부에 따른 세포의 비항체생산성을 보여주고 있다.

표 1. 소디움 부티레이트 첨가여부에 따른 세포의 비항체생산성

	5mM 소디움 부티레이트 첨가없음	5mM 소디움 부티레이트 첨가
		첨가 전	첨가 후
대조군(SH2-0.32-△bcl-2)	4.0	4.0	10.0
14C6-bcl-2	4.0	5.0	10.0

(단위: ug/10⁶세포/일)

표 1에서 보듯이, bcl-2유전자의 과발현과 배지내 소디움 부티레이트 첨가에 의한 항체 생산성의 증가는 결국, 소디움 부티레이트에 의한 비항체생산성의 증가에 의한 것임을 알 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 인간화된 항체를 암호화하는 유전자로 형질전환된 재조합 CHO세포의 항체 생산성을 증가시킬 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 재조합 CHO세포에 인간의 bcl-2 유전자를 과발현하는 벡터를 도입하고, 전기 벡터가 도입된 재조합 CHO세포를 배지에 접종하여, 소디움 부티레이트를 배지에 첨가함으로써 항체생산성을 증가시킬 수 있다. 전기 방법은, 항체생산단계의 살아있는 세포의 농도, 및 전기 세포들의 비항체생산성을 동시에 향상시킴으로써, 재조합 CHO세포의 생존률 및 생존기간을 증가시키고, 그 결과 최종 항체생산성을 2배이상 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 생산방법을 이용하면, 인간화된 항체 및 사이토카인과 같은 동물세포 산물의 단위 생산성을 향상시켜 관련분야의 시장개척에 커다란 도움을 줄 수 있을 것이다.

Claims (6)

1. 인간화된 항체를 암호화하는 유전자로 형질전환된 재조합 CHO세포로부터 항체를 대량생산하는 방법에 있어서, 전기 재조합 CHO세포에 인간의 bcl-2 유전자를 과발현하는 벡터를 도입하는 단계; 및, 전기 벡터가 도입된 재조합 CHO세포를 배지에 접종하고, 소디움 부티레이트를 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 생산성을 증가시키는 방법.
2. 제 1항에 있어서,

   인간화된 항체 유전자를 DHFR/MTX 시스템으로 유전자 증폭시키기 위하

   여, CHO세포는 게놈에 DHFR(dihydrofolate reductase) 유전자가 결실된

   것을 특징으로 하는 세포주를 사용하는

   방법.
3. 제 1항에 있어서,

   소디움 부티레이트는 배지에 대하여 최종농도 4 내지 6mM로 처리되는

   것을 특징으로 하는

   방법.
4. 제 1항에 있어서,

   소디움 부티레이트는 재조합 CHO세포를 배지에 접종하고 50 내지 70시

   간이 지난 후에 처리되는 것을 특징으로 하는

   방법.
5. 삭제
6. 인간의 B형 간염 바이러스의 S항원에 대한 인간화된 항체를 암호화하는 유전자 및 인간의 bcl-2유전자를 동시에 발현시킴으로써, 인간화된 항체의 생산성이 증가되는 재조합 CHO세포주.