KR101000954B1 - 항상 활성화된 Ａｋｔ 단백질을 과발현하는 벡터를 도입한형질전환 세포주, 상기 벡터를 유효성분으로 포함하는세포예정사 저해제 및 상기 형질전환 세포주를 이용하여목적 단백질을 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항상 활성화된 Akt 단백질을 과발현하는 벡터를 도입한 형질전환 세포주, 상기 벡터를 유효성분으로 포함하는 세포예정사(Programmed cell death) 저해제 및 상기 형질전환 세포주를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 항상 활성화된 Akt 단백질을 과발현하는 벡터를 인간화된 항체를 암호화하는 유전자로 형질 전환된 CHO(chinese hamster ovary) 세포에 도입하여 항상 활성화된 Akt 단백질을 과발현시켜 세포자살(Apoptosis) 및 자기소모(Autophagy)의 두 가지 형태의 세포예정사에 저항성을 갖는 형질전환 세포주, 상기 벡터를 유효성분으로 포함하는 세포예정사 저해제 및 상기 형질전환 세포주를 이용하여 여러 가지 스트레스 환경에서의 세포예정사를 억제함으로써 상기 세포가 생산하는 목적 단백질의 생산을 향상시킬 수 있는 방법에 관한 것이다.

항상 활성화된 Akt유전자, 재조합 CHO 세포, 세포예정사

Description

항상 활성화된 Ａｋｔ 단백질을 과발현하는 벡터를 도입한 형질전환 세포주, 상기 벡터를 유효성분으로 포함하는 세포예정사 저해제 및 상기 형질전환 세포주를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법{A transformed cell line transfected by a vector which over―express constitutively active Akt protein, an inhibitor of programmed cell death containing above a vector, and a method of producing target proteins using above transformed cell line}

본 발명은 항상 활성화된 Akt 단백질을 과발현하는 벡터를 도입한 형질전환 세포주, 상기 벡터를 유효성분으로 포함하는 세포예정사(Programmed cell death) 저해제 및 상기 형질전환 세포주를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 항상 활성화된 Akt 단백질을 과발현하는 벡터를 인간화된 항체를 암호화하는 유전자로 형질 전환된 CHO(chinese hamster ovary) 세포에 도입하여 Akt 단백질을 발현시켜 세포자살(Apoptosis) 및 자기소모(Autophagy)의 두 가지 형태의 세포예정사에 저항성을 갖는 형질전환 세포주, 상기 벡터를 유효성분으로 포함하는 세포예정사 저해제 및 상기 형질전환 세포주를 이용하여 여러 가지 스트레스 환경에서의 세포예정사를 억제함으로써 상기 세포가 생산하는 목적 단 백질을 생산을 향상시킬 수 있는 방법에 관한 것이다.

암, 감염성 질환 혹은 자가 면역 질환의 진단, 예방 및 치료를 위한 단일클론항체의 대량생산은 1975년 영국의 밀스타인(Dr. Milstein) 박사와 콜러(Dr. Kohler) 박사에 의하여, 생쥐의 하이브리도마 기술이 개발됨으로써 가능해졌다. 그러나, 쥐의 단일클론 항체는 인체에 임상적으로 반복투여하였을 경우, 인체의 면역반응을 유발하여 부작용이 생기거나 그 효과가 감소하므로 최근에는 생쥐 단일클론항체를 유전공학 기술과 단백질 공학기술을 이용하여 인간화시키는 기술이 개발되어, 선진 각국에서 경쟁적으로 여러가지 다양한 질환의 예방 및 치료제 개발에 이용되고 있다. 인간화된 항체의 경우, 항체 내 가변영역의 CDR부위(complementarity determining region)만이 쥐 항체로 되어 있고, 나머지 부분은 모두 인간의 항체로 치환되어 있어, 인체 내 안정성이 상당히 향상되어 있다. 이러한 인간화된 재조합 항체를 임상적으로 실험하고, 나아가 상품화하기 위해서는 경제적인 대량생산이 필수적이다.

Akt는 아폽토시스(apoptosis)의 조절인자로써, 화학 치료제에 대한 내성을 유발하는 물질로 잘 알려져 있다. 생쥐 림프종 모델을 이용한 실험을 통해서 Akt의 종양관련 및 약물 내성 관련 특성이 아폽토시스를 분열시키는 특성과 관련되어 있다는 사실이 알려져 있다(nature , p.332, March 18, 2004). Akt는 다양한 스트 레스 환경에서 세포예정사의 윗 단계를 방해하여, 세포 생존률을 증가시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 항상 활성화된 Akt는 종양괴사인자 관련한 아폽토시스를 유발하는 리간드로 인한 아폽토시스를 억제하고(Chen X, et.al., Oncogene 20(42):6073-83, 2001), 섬유 아세포의 종양으로의 형질전환을 유도하며(Aoki M. et.al., Proc Natl Acad Sci USA 95(25):14950-5, 1998), 화학치료와 방사선 치료에의 내성을 증가시킨다는 보고가 있다(Brognard J. et.al., Cancer Res 61(10):3986-97, 2001).

최근에는 당쇄화(glycosylation) 등과 같은 단백질의 번역 후 수정 및 수식과정(post-translational modification)을 통한 기능적인 전체 항체분자의 생산을 위해서는 동물세포를 발현숙주로 사용하는 것이 적합하다고 알려져 있으며, 특히 유전자 증폭된 CHO 세포가 가장 널리 사용되고 있다.

CHO(chinese hamster ovary) 세포주는 현재 재조합 항체를 비롯한 인간 인터페론 감마(interferon-gamma, Goldman, et al., Cytotechnology, 23, 103-111, 1997), 제 8 인자(factor Ⅷ, Ganne and Mignot, Cytotechnology, 6, 233-40, 1991) 트롬보포이에틴(thrombopoietin, Kim, et al, Biotechnol Prog, 16, 775-781, 2000) 등의 목적 단백질을 생산하는데 가장 많이 이용되고 있다. 재조합 CHO 세포를 사용하여 목적 단백질을 생산할 때에는 단위시간당 살아있는 세포로부터 얼마나 많은 양의 단백질이 생산되는가를 표시하는 비생산 속도가 중요한데 이러한 비생산 속도를 증가시키기 위해서 외래유전자의 전사 속도를 증가시킴으로써 단백 질의 생산성을 증가시킬 수 있는 것으로 알려진 뷰티르산염을 사용하고 있다. 그러나 뷰티르산염은 세포의 전사속도를 증가시켜줌으로써 비생산 속도를 증가시킬 수는 있지만 동시에 그 자체의 세포독성에 의해 세포예정사를 유도하기 때문에 실제적으로 높은 농도의 뷰티르산염을 사용하기에는 문제가 있다. 따라서, 이러한 뷰티르산염에 의해 유도되는 세포예정사을 억제할 필요성이 대두되는데 기존의 방법은 세포예정사을 효과적으로 억제할 수 있는 것으로 알려져 있는 Bcl-2 단백질과 같은 생존단백질을 재조합 CHO 세포로부터 과발현시킴으로써 세포사멸을 억제하는 실험이 시도된 바 있으며(Tey, et al., Biotechnol . Bioeng ., 68, 31-43, 2000), 실제로 본 발명자들은 Bcl-2를 인간화된 항체를 생산하는 재조합 CHO 세포에서 과발현시켜 세포사멸을 효과적으로 억제시킴으로써 최종 항체 농도를 증가시키는데 성공한 바 있다(Kim and Lee, Biotechnol . bioeng., 71, 184-193, 2001).

재조합 CHO 세포에 의하여 단일클론항체를 생산하는 경우, 항체의 최종농도는 항체를 생산하는 살아 있는 세포의 농도와 비항체 생산속도의 영향을 받게 된다(최종 항체농도= 세포농도 X 비항체 생산속도). 기존의 배양 방법론에서는 비항체 생산속도가 세포의 고유 성질로 간주되어 변화시킬 수 없는 요소로 생각되었기 때문에, 최종 항체농도 증가를 위해서 주로 회분배양을 통하여 세포의 농도를 증가시키는 방향으로 연구가 진행되었다.

항체의 생산량을 증가시키기 위한 방법도 다양하게 시도되었는데, 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase, DHFR)/메토트렉세이 트(methotrexate, MTX)(DHFR/MTX), 글루타민 합성효소(glutamine synthetase, GS)/메티오닌 썰폭시민(methionine sulfoximine, MSX)(GS/MSX)과 같은 유전자 증폭 시스템, 뷰티르산염(Chang KH. et.al., Free Radic Res 30(2):85-91, 1999; Palermo DP. et.al., J Biotechnol 19(1):35-47, 1991; Kim NS. et.al., Biotechnol Bioeng 71(3):184-93, 2000; Mimura Y. et.al., J Immunol Methods 247(1-2):205-16, 2001; Sung YH. et.al., Biotechnol Prog 21(1):50-7, 2005) 또는 고삼투압 환경(Kim NS, et.al., J Biotechnol 95(3):237-48, 2001; Oh SKW. et.al., Biotechnol Bioeng 42:601-10, 1993; Takagi M. et.al., J Biosci Bioeng 91(5):509-14, 2001; Cherlet M. et.al., Cytotechnology 29:71-84, 1999)를 이용한 세포의 단위생산속도 증가 등이 그것이다. 상기 방법들은, 최종 항체농도를 결정하는 세포농도나 비항체 생산속도 중 어느 한쪽만을 최적화시킴으로써 최종 항체농도를 증가시키는 것이었다. 그러나, 유전자 증폭 시스템의 경우, 어느 수준 이상으로 재조합 유전자의 카피수가 증가하면, 선형적으로 재조합 항체생산성이 증가되지 않고 포화되며, 고삼투압 배지의 경우, 비항체생산속도는 증가하지만 상대적으로 세포의 성장 및 생존률은 감소한다. 따라서, 최종 항체농도를 결정하는 두 가지 요소, 즉 항체생산단계의 살아 있는 세포의 농도와 이 세포들의 비항체 생산성을 동시에 향상시키는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두 되었다.

이전의 보고에는, 특허번호 US 09/668,924 및 US 10/227,154에서 세포의 목적 단백질의 생산성 증가를 위해 세포예정사 억제제 또는 영양분을 직접 세포 배양 액에 첨가하는 방법이 기재되어 있고, 특허번호 US 6,413,744에서는 재조합 세포주를 이용하여 목적 단백질의 생산성 향상 방법이 기재되어 있다. 또한, Akt 단백질 키나아제를 생산하여 인터루킨-2의 항 세포사멸 및 생장 신호의 전달(Ahmed et.al., vol. 94pp. 3627-3632, 1997)과 BcI-2 단백질의 과발현을 통한 뷰티르산 염 첨가에 의한 세포사멸의 억제 및 인간화된 항체의 생산성 증가(Kim et.al., vol. 71pp. 184-193, 2000)에 대한 보고가 있다.

그러나 형질전환 세포가 직접 Akt 단백질 및 GFP도 함께 발현하여 Akt 과발현 세포주 선별을 용이하게 할 수 있으며, 여러 가지 스트레스 환경에서 세포사멸뿐 아니라 세포소모도 함께 억제하여 목적 단백질을 생산성을 향상시킬 수 있는 방법에 대해서는 보고된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 최종항체 농도를 증가시키는 방법을 개발하고자, 인간화된 항체를 암호화하는 유전자로 형질 전환된 재조합 CHO 세포로부터 항체를 생산하는데 있어서, 상기 CHO 세포에 항상 활성화된 인간의 Akt 단백질 및 GFP를 동시에 발현하는 벡터를 도입함으로써, 상기 벡터가 도입된 재조합 CHO 세포는 배지 내 양분이 고갈되거나, 뷰티르산 염 또는 고삼투 환경 등 여러가지 스트레스 환경하에서 세포사멸 및 세포소모의 2가지 형태의 세포예정사 모두에 저항성을 가지고, GFP를 함께 발현함으로써 Akt의 과발현 세포주를 선별하기 용이한 형질전환 세포주를 제조하여 항체생산성을 증가시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 항상 활성화된 Akt 단백질을 발현하는 벡터를 도입한 형질전환 세포주, 상기 벡터를 유효성분으로 포함하는 세포예정사 저해제 및 상기 형질전환 세포주를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항상 활성화된 Akt 단백질을 발현하는 벡터를 도입한 형질전환 세포주를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 세포주를 제공한다.

또한, 본 발명은 인간의 항상 활성화된 Akt 단백질을 발현하는 벡터를 유효성분으로 포함하는 세포예정사 저해제를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 형질전환된 세포주를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 항상 활성화된 Akt 단백질을 과발현하는 벡터를 인간화된 항체를 암호화하는 유전자로 형질 전환된 CHO 세포에 도입하여 Akt 단백질을 과발현시켜 세포사멸 및 세포소모의 두 가지 형태의 세포예정사에 저항성을 갖는 세포를 제조함으로써 양분이 고갈되거나 항체 생산성을 향상시키기 위한 뷰티르산염 또는 고삼 투 환경에서 증가되는 세포예정사를 억제함으로써 재조합 CHO 세포의 생존률 및 생존기간을 증가시켜 최종 항체 생산성을 증가시킬 수 있었다. 따라서, 본 발명의 항체 생산방법을 이용하면, 인간화된 항체 및 사이토카인과 같은 동물세포의 산물의 단위 생산성을 향상시켜 관련분야의 시장개척에 커다란 도움을 줄 수 있을 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 있어서, '항상 활성화된(constitutively active)'이란 야생형 Akt의 아미노 터미널 말단에 세포막으로 향하는 아미노기 신호가 첨가되어있고, 카르복실 터미널 말단의 일부가 제거되어, 인산화되는 부분이 노출되어있어서 만들어지자마자 세포막으로 이동되어 활성화되는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, '과발현'이란 통상적으로 원래 세포가 발현하는 양의 적어도 2 배 이상을 발현하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, '세포소모(autophagy)'란 세포 내 물질이 라이소좀(lysosome)을 통해 분해되는 과정으로, 세포 내 양분이 고갈된 경우, 반드시 필요한 부분에 아미노산을 공급하기 위하여 불필요한 세포의 기관을 분해하는 방법이다. 또한, 외부 바이러스나 세균의 침투된 경우, 세포질에서 두 겹 혹은 그 이상의 막 구조를 스스로 형성하여 세포 내부의 물질을 감싸서 오토파고좀(autophagosome)을 형성한 후 라이소좀과 결합하여 라이소좀의 분해 효소로 내부 물질을 분해하는 방법이다. 세포소모는 세포 내 물질을 재사용함으로써 세포의 성장을 유발하는 반면, 그 정도에 따라 더 이상 손을 쓸 수 없는 세포예정사로 이끌 수 있다.

본 발명은

1) 항상 활성화된 Akt 단백질을 발현하는 벡터를 제조하는 단계; 및

2) 숙주 세포에 단계 1)의 벡터를 도입한 후, 항상 활성화된 Akt 단백질을 과발현하는 숙주세포를 선별하는 단계를 포함하는 세포예정사가 억제되는 형질 전환 세포주의 제조 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 항상 활성화된 Akt 단백질은 서열번호 1로 기재되는 것을 특징으로 한다. 상기 항상 활성화된 Akt 단백질은 N 터미널에 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA)이 첨가되어 있다(Kohn AD, et.al., J Biol Chem 271(36): 21920-6, 1996 ; Franke TF, et.al., Cell 81(5): 727-36, 1995 ; Cross FR, et.al., Mol Cell Biol 4(9): 1834-42, 1984).

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 벡터는 이. 콜라이(E. coli), 박테리오파아지(예를 들면, 람다유도체), 플라스미드(예를 들면, pBR322 유도체) 또는 pUC 플라스미드 유도체(예를 들면, pGEX 벡터, pmal-c, pFLAG)등이 모두 사용 가능하며, 이에 한정되지 않고 숙주 세포와 적합한 벡터는 모두 사용 가능하다. 상기 벡터에 당업계에 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 항상 활성화된 Akt 유전자를 도입하여 제조한다. 벡터는 선별마커를 도입하여 형질전환된 세포주를 용이하게 선별 할 수 있으며, 본원 발명의 벡터는 GFP 유전자를 도입하여 GFP의 발현양을 통해 Atk 과발현 형질전환 세포주를 손쉽게 선별할 수 있으며, 바람직하게는 도 2의 개열지도로 표시되는 벡터를 사용한다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 숙주세포에 벡터의 도입은 형질전환(transfection), 전기천공(electroporation), 형질도입(transduction), 미세주입(microinjection) 또는 총알식 도입(ballistic introduction) 방법이 모두 이용가능하며 본 발명에서는 형질전환을 이용하였다. 상기 형질전환을 위해 벡터에 혼합하는 리포좀은 리포펙틴(lipofectin), 리포펙타민(lipofectamine), 올리고펙틴(oligofectin), 도탑(dotap), 수퍼펙트(superfect)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있으며 본 발명에서는 리포펙타민을 이용하였다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 숙주 세포는 CHO, VERO, BHK, HeLa, Cv1, MDCK, 293, 3T3, 미엘로마(myeloma), PC12 또는 WI38가 모두 이용가능하며, 본 발명에서는 CHO 세포를 이용하였다. 상기 CHO 세포는 벡터에 클로닝 되어있는 인간화된 항체 유전자를 DHFR/MTX 시스템으로 유전자 증폭반응을 하기 위하여 DHFR유전자가 결실된 CHO 세포주를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 선별과정은 항상 활성화된 Akt 단백질을 안정되게 생산하는 세포주를 선별하기 위한 것으로서, 도입된 세포주를 배양하여 배지 내 항상 활성화된 단백질의 항체를 첨가한 후 저항성이 있는 세포들을 세포주를 집합풀(pool)로 모아 선별하거나 각각의 클론으로 선별하는 방법 모두를 이용할 수 있다. 상기 선별 방법은 형광현미경, 면역블로팅(Immunoblotting) 또는 형광 활성 세포 분리(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS)가 모두 이용가능하며 본 발명에서는 Akt 단백질 발현량을 형광현미경 및 면역블로팅으로 측정하였다. 본 발명의 형질 전환 세포주는 항상 활성화된 Akt 단백질뿐 아니라 GFP를 동시에 발현하는 것을 특징으로 한다. 따라서 본 발명의 형질전환된 세포주는 항상 활성화된 Akt 단백질의 발현량이 GFP의 발현량과 상관관계가 있음을 확인함으로써 GFP의 발현량을 상기와 같은 방법으로 측정하여, Akt 단백질의 발현량을 가늠함으로써 과발현 세포주를 용이하게 선별할 수 있다.

본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 세포주를 제공한다.

상기 형질전환 세포주는 세포자살 및 세포소모 면에서 억제되어 세포예정사가 억제되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서는 상기 항상 활성화된 Akt 단백질을 과발현하는 형질전환 세포주가 세포자살 및 세포소모 두 가지 형태의 세포예정사를 억제하는지 조사하였다. 세포자살은 지노믹 DNA 절편현상(genomic DNA fragmentation)을 이용하여 측정하였고 세포소모는 전자현미경을 이용하여 측정한 결과, 항상 활성화된 Akt 단백질을 발현하는 세포집합에서는 두 가지 측정 모두에서 세포사멸이 저하되어 세포의 성장, 생존율 및 항체의 생산량이 증가하는 것을 알 수 있었다.

본 발명에서는 항상 활성화된 Akt 단백질을 과발현하는 형질전환된 재조합 CHO 세포가 양분의 고갈에 따른 세포예정사를 억제하는지 알아보기 위해, Akt 단백질을 발현하지 않는 대조군, 야생 Akt 단백질을 발현하는 세포집합 및 항상 활성 화된 Akt 단백질을 과발현하는 세포집합을 각각 무혈청 배지에서 부유 배양한 후 세포의 성장, 생존률 및 항체의 총 생산량을 측정하였다. 그 결과, 항상 활성화된 Akt 단백질을 과발현하는 세포집합이 Akt 단백질을 발현하지 않는 대조군 및 야생 Akt 단백질을 발현하는 세포집합에 비해 세포의 성장 및 생존율이 향상되었으며 항체의 총 생산량이 증가한 것을 확인하였다.

또한, 본 발명은 인간의 항상 활성화된 Akt 단백질을 발현하는 벡터를 유효성분으로 포함하는 세포예정사 저해제를 제공한다.

본 발명의 항상 활성화된 Akt 단백질을 과발현하는 벡터 또는 항상 활성화된 Akt 단백질과 GFP를 동시에 발현하는 벡터는 세포자살과 세포소모 면에서 모두 세포사멸을 저해하였으므로, 세포예정사 저해제로서 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은

1) 상기 형질전환된 세포주에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 도입하는 단계;

2) 상기 단계 1)에 의해 제조된 형질전환된 세포주를 배양하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)에 의해 생산된 목적 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 목적 단백질은 가용성 TNF 수용체, 가용성 IL-4 수용체, 가용성 IL-1 유형 II 수용체, 가용성 Flt3 리간드, 가용성 CD40 리간 드, CD39, CD30, CD27, TEK/Ork, IL-15, 가용성 IL-15 수용체, Ox 40, GM-CSF, RANKL, RANK, TRAIL, 가용성 TRAIL 수용체, 조직 플라스미노겐 활성제(tissue plasminogen activator), 인자(Factor) VIII, 인자(Factor) IX, 아포지방단백질(apolipoprotein) E, 아포지방단백질(apolipoprotein) A-I, IL-2 수용체, IL-2 길항제(antagonist), 알파-1 안티트립신(alpha-1 antitrypsin), 칼시토닌(calcitonin), 성장 호르몬(growth hormone), 인슐린(insulin), 인슐리노트로핀(insulinotropin), 인슐린-유사 성장 인자(insulin-like growth factors), 파라티로이드 호르몬(parathyroid hormone), 인터페론(interferons), 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase), 글루칸(glucagon), 에리스로포이틴(erythropoeitin), 항체(antibody), 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), Fc-융합 단백질(Fc-fusion protein), 글로빈(globins), 신경 성장 인자(nerve growth factors), 인터루킨(interleukins), 집락자극인자(colony stimulating factor)로 이루어진 군으로부터 선택된 것 모두가 생산 가능하며, 본 발명에서는 항체를 생산하였다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 형질전환된 세포주는 정상 환경뿐만 아니라 인간화된 항체의 생산성을 증가하기 위해 뷰티르산 염 또는 고삼투 환경의 스트레스 환경에서 발생되는 세포예정사를 억제함으로써 목적 단백질의 생산수율을 증대시킬 수 있다.

본 발명에서는 항상 활성화된 Akt 단백질이 인간화된 항체를 생산하는 재조합 CHO 세포에서 인간화된 항체의 생산성을 증가하기 위해 형성하는 뷰티르산 염 또는 고삼투 환경에서 세포예정사를 억제하는지 알아보았다. Akt 단백질을 발현하지 않는 대조군, 야생 Akt 단백질을 발현하는 세포집합 및 항상 활성화된 Akt 단백질을 과발현하는 세포집합을 각각 무혈청 배지에 배양한 후 뷰티르산 염 및 고삼투환경을 위한 염을 첨가한 후의 세포 성장, 생존률 및 항체 생산성을 측정하였다. 상기 스트레스 환경은 뷰티르산염의 경우, 첨가하는 시기는 접종 후 60 ~ 80시간 사이인 것이 바람직하며, 배지에 대한 농도는 1 ~ 5 mM인 것이 바람직하고, 3 mM인 것이 더욱 바람직하다. 고삼투 환경을 위한 염의 경우, 첨가하는 시기는 접종 후 60 ~ 80시간 사이인 것이 바람직하며, 배지에 대한 농도는 0.05 ~ 0.2 M인 것이 바람직하고, 0.1 M인 것이 더욱 바람직하다. 그 결과, 항상 활성화된 Akt 단백질을 과발현하는 세포집합이 Akt 단백질을 발현하지 않는 대조군 및 야생 Akt 단백질을 발현하는 세포집합에 비해 세포 성장 및 생존율이 향상되었으며 항체의 총 생산량이 증가한 것을 확인하였다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기의 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 인간의 항상 활성화된 Akt 단백질을 GFP 와 동시에 발현하는 유전자와 대조 유전자의 제조

본 발명자들은 인간의 항상 활성화된 Akt 단백질을 발현하는 유전자와 그와 동시에 GFP를 발현하는 유전자를 코딩하는 벡터인 pcDNA3.1/Zeo(+)-IRES2-EGFP(도 1 참조) 및 pcDNA3.1/Zeo(+)-CA-Akt_IRES2_EGFP(도 2 참조)를 제작하였다. 구체적으로 pIRES2-EGFP(Clontech, USA) 벡터로부터 IRES2-EGFP 절편을 EcoRI과 XbaI으로 절단한 후, 상기와 같은 제한효소로 절단된 pcDNA3.1/Zeo(+)(Invitrogen, USA) 벡터에 삽입하여 GFP를 발현하는 벡터 pcDNA3.1-EGFP-IRES(pcIE)를 제작하였다. 인간의 항상 활성화된 Akt(CA-Akt)를 발현하는 벡터 pECE_CA-Akt를 EcoRI과 SacII로 절단하여 CA-Akt 절편을 얻은 후, 상기와 같은 제한 효소로 잘라진 pIRES2-EGFP 벡터에 삽입하였다. 이때 제작된 pIRES2-EGFP-CA_Akt 벡터를 EcoRI과 NotI으로 동시에 절단하여 같은 제한효소로 절단한 pcDNA3.1/Zeo(+)벡터에 삽입하여, 최종적으로 pcDNA3.1/Zeo(+)-CA-Akt_IRES2_EGFP(pcCAAIE)를 제작하였다. 항상 활성화된 Akt의 발현벡터와 같은 방법으로 야생형 Akt의 발현벡터 pcDNA3.1/Zeo(+)-Akt_IRES2_EGFP (pcAIE)를 제작하였다(도 3 참조).

< 실시예 2> 인간화된 항체를 생산하는 재조합 CHO 세포주에 인간의 항상 활성화된 Akt 유전자의 도입, 및 안정적인 세포주 제조와 선별

본 발명자들은 상기에서 수득한 벡터(pcDNA3.1/Zeo(+)-CA-Akt_IRES2_EGFP)와 대조 벡터(pcDNA3.1/Zeo(+)-IRES2-EGFP)를 인간화된 항체를 MTX의 농도를 단계적으로 올려주면서 항체 유전자의 카피 수를 DHFR의 유전자 카피수와 함께 증폭시켜 만든 인간화된 항체를 안정적으로 생산하는 재조합 CHO 세포주에 리포펙타민(lipofectamine2000, Invitrogen, USA)을 이용하여 도입(transfection)하였다(도 4 참조). 6 웰-배양 플레이트에 2x10⁵개의 세포를 3 mL의 10% 우태아혈청이 첨가된 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, Invitrogen, USA) 배지에 접종하여 24시간이 지난 후, 2 ug의 DNA와 3 uL의 리포펙타민을 복합체를 OptiMEM(Invitrogen, USA)배지에 첨가하여 도입 후 48시간 뒤에 500 ug/mL 농도의 지오신(Zeocin, Invitrogen, USA)을 첨가하여 도입된 세포주를 2주간 배양하여 저항성이 있는 세포들을 선별하였다. 이때, 두 가지 방법으로 선별하였는데, 그 중 하나는 세포주를 집합풀(pool)로 모아 선별하는 방법이고, 다른 한가지 방법은 각각의 클론으로 선별하는 방법이었다.

안정되게 Akt 단백질을 과발현하는 세포주의 집합의 항상 활성화된 Akt 단백질의 발현량과 야생형 Akt 단백질의 발현량, 그리고 대조군 세포주의 Akt 단백질의 발현량을 면역블로팅(Immunoblotting)으로 나타내었다(도 5 참조). 이때, Akt 단백질을 발현하지 않는 세포집합을 대조군, 항상 활성화된 Akt 단백질을 과발현하는 세포 집합을 CA-Akt, 그리고 야생형 Akt 단백질을 과발현하는 세포 집합을 WT-Akt라고 명명하였다. 이때 항상 활성화된 Akt 단백질 혹은 야생형 Akt 단백질의 발현량은 GFP의 발현량과 각각 상관관계가 있었다. 따라서 GFP의 발현량을 형광현미경 및 면역블로팅을 이용해 측정하여, Akt 단백질의 발현량을 가늠함으로써 과발현 세포주를 용이하게 선별하였다.

< 실험예 1> Akt 단백질의 과발현을 통한 배양 배지 내의 양분의 고갈에 따른 세포 자살(apoptosis ) 및 세포소모( autophagy ) 두 가지 형태의 세포 예정사( programmed cell death ) 억제

본 발명자들은 회분배양 후반부로 갈수록 배양 배지 내의 양분 고갈에 따른 세포예정사를 Akt 단백질의 과발현을 통해 억제할 수 있는지 알아보았다. 대조군 세포 혹은 야생형 Akt 단백질을 안정적으로 과발현하는 세포집합과 실험군인 항상 활성화된 Akt 단백질을 안정적으로 과발현하는 세포집합을 각각 무혈청 배지에서 부유 배양하였다. 무혈청 부유배양은 110rpm의 속도로, 95% CO₂를 포함하는 37℃ 온도의 인큐베이터에서 50 mL 엘렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크에서 실시하였다.

Akt 단백질을 발현하지 않는 대조군, 야생 Akt 단백질을 발현하는 세포집합 및 항상 활성화된 Akt 단백질을 과발현하는 세포집합을 각각 무혈청 배지에서 부유 배양한 후 세포의 성장, 생존률 및 항체의 총 생산량을 측정하였다. 세포의 성장 및 생존률의 측정은 날짜별로 수집하여 Trypan blue(sigma) 염색약을 이용하여 생존세포와 죽은 세포를 구별하였으며, 그 퍼센티지로 생존률을 계산하였다. 또한, 항체 생산량은 샘플링한 세포 배양액을 ELISA(효소 결합 면역 흡수법)를 이용하여 측정하였다.

상기 측정결과, 항상 활성화된 Akt 단백질을 과발현하는 세포집합이 Akt 단백질을 발현하지 않는 대조군 및 야생 Akt 단백질을 발현하는 세포집합에 비해 세포의 성장 및 생존율이 향상되었으며 항체의 총 생산량이 증가한 것을 확인하였다(도 7 및 도 8 참조).

상기 항상 활성화된 Akt 단백질을 과발현하는 CHO 세포집합이 세포자살 및 세포소모 두 가지 형태의 세포예정사를 억제하는지 조사하기 위해, 세포자살은 지노믹 DNA 절편현상(genomic DNA fragmentation) 및 세포자살 관련 단백질들의 면역블로팅을 이용하여 측정하였고, 세포소모는 전자현미경을 이용하여 측정하였다. 세포가 세포 자살로 인해 사멸하는 경우, 세포자살의 진행에 따라 핵의 DNA는 세포질 내의 DNA 절단 효소에 의해 뉴클레오좀 사이에서 절단되고 180부터 200bp 배수의 다양한 길이를 지닌 DNA 조각이 발생한다. 또한, 세포가 세포 소모현상을 나타내는 경우, 세포 소모현상에서 두드러지게 나타나는 두 겹의 막으로 형성되어 세포 내부 물질을 함유하는 오토파고좀(autophagosome)을 쉽게 관찰할 수 있다.

상기 측정결과, 도 9에서 보는 바와 같이, 대조군의 세포가 세포 배양기간이 지날수록 DNA 절단 현상이 나타나기 시작하는데, 배양 13일째에서 그 정도가 항상 활성화된 Akt 과발현 세포주에서 훨씬 적게 나타난다. 이는 항상 활성화된 Akt 과발현 세포주에서 DNA 절단현상을 억제하는 것으로서 세포자살의 정도가 더 줄어든 것을 알 수 있다. 도 10에 보는 바와 같이, 세포 배양 7일째의 사진은 대조군과 야생형에 비해 항상 활성화된 Akt 단백질을 과발현하는 세포에서 오토파고좀의 숫자가 현저히 줄어든 것을 알 수 있다.

따라서 두 측정 모두에서 세포사멸이 저하됨을 알 수 있었다(도 9 및 도 10 참조).

< 실험예 2> 항상 활성화된 Akt 단백질의 과발현을 통한 뷰티르산염 혹은 염으로 인한 세포예정사의 억제

본 발명자들은 인간의 항상 활성화된 Akt 단백질이 인간화된 항체를 생산하는 재조합 CHO 세포주에서 각종 스트레스 환경에서의 세포예정사를 억제하는지 알아보았다.

Akt 단백질을 발현하지 않는 대조군, 야생 Akt 단백질을 발현하는 세포집합 및 항상 활성화된 Akt 단백질을 과발현하는 세포집합을 각각 무혈청 배지에 회분배양을 실시한 후 배양 3일째 뷰티르산 염(3 mM)(도 11참조) 및 고삼투환경을 위한 염(0.1M)(도 12 참조)을 각각 첨가한 후 세포 성장, 생존률 및 비항체 생산성을 측정하였다. 세포의 성장 및 생존률의 측정은 날짜별로 수집하여 Trypan blue(sigma) 염색약을 이용하여 생존세포와 죽은 세포를 구별하였으며, 그 퍼센티지로 생존률을 계산하였다. 또한, 항체 생산량은 샘플링한 세포 배양액을 ELISA(효소 결합 면역 흡수법)를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 항상 활성화된 Akt 단백질을 과발현하는 세포집합이 Akt 단백질을 발현하지 않는 대조군 및 야생 Akt 단백질을 발현하는 세포집합에 비해 세포 성장 및 생존율이 향상되었으며 비항체 생산성이 증가한 것을 확인하였다.

뷰티르산염 또는 염을 첨가하였을 때, 세포는 세포사멸기로 들어갔는데, 대조군에 비하여 실험군은 그 속도가 느림을 확인할 수 있었으며, 뷰티르산염 혹은 염의 첨가에서 CA-Akt의 비항체 생산성을 비교한 표는 하기 표 1과 같다.

스트레스 환경에서의 세포의 성장성과 비항체 생산성

스트레스	벡터	μ(일 -1 )	qab (μg/ 10 6 세포 /일)
처리전	대조군	0.55±0.09	5.47±0.41
	WT-Akt	0.51±0.02	6.77±0.45
	CA-Akt	0.59±0.04	7.70±0.14
뷰티르산염(3 mM)	대조군	0.66±0.01	13.80±1.74
	WT-Akt	0.57±0.00	13.84±0.53
	CA-Akt	0.58±0.06	14.90±0.87
염(0.1 M)	대조군	0.43±0.01	14.82±2.23
	WT-Akt	0.41±0.01	11.48±0.30
	CA-Akt	0.53±0.03	15.30±2.56

따라서 CA-Akt의 과발현을 통해 정상 환경과 스트레스 환경 모두에서 비항체 생산성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

도 1은 GFP를 발현하는 벡터를 제조하는 과정을 나타내는 모식도이고,

도 2는 항상 활성화된 Akt 단백질 및 GFP를 동시에 발현하는 벡터를 제조하는 과정을 나타내는 모식도이고,

도 3은 야생형 Akt 단백질 및 GFP를 동시에 발현하는 벡터를 제조하는 과정을 나타내는 모식도이고,

도 4는 상기 도 1 내지 도 3의 벡터들을 각각 인간화된 항체를 생산하는 재조합 CHO 세포에 도입하여 6개의 웰 플레이트에 배양하는 것을 나타내는 그림이고,

도 5는 GFP만 발현하는 세포 집합, 야생형 Akt 단백질을 과발현하는 세포 집합 및 항상 활성화된 Akt 단백질을 과발현하는 세포 집합을 면역블로팅하여 각각의 단백질 발현량을 나타낸 그림이고:

대조군: GFP만 발현하는 세포 집합;

WT-Akt: 야생형 Akt 단백질을 과발현하는 세포 집합; 및

CA-Akt: 항상 활성화된 Akt 단백질을 과발현하는 세포 집합,

도 6은 상기 도 5의 단백질 발현량을 각각의 세포 집합으로 분리하여 나타낸 그림이고,

도 7은 상기 도 5의 세포 집합들을 무혈청 배지에서 각각 배양하였을 때, 세포 성장 및 생존율을 나타낸 그래프이고,

도 8은 상기 도 5의 세포 집합들을 무혈청 배지에서 각각 배양하였을 때, 항체 생산량을 나타낸 그래프이고,

도 9는 상기 도 5의 세포 집합들을 무혈청 배지에서 각각 배양하였을 때, 면역블로팅하여 지노믹 DNA 절편현상의 정도를 나타낸 그림이고,

도 10은 상기 도 5의 세포 집합들을 무혈청 배지에서 각각 배양하였을 때, 세포 배양 7일째 때 세포예정사를 전자현미경으로 관찰한 그림이고,

도 11은 상기 도 5의 세포 집합들을 뷰티르산염(3 mM)을 첨가한 배지에 각각 배양하였을 때, 세포의 성장 및 생존율을 나타낸 그래프이고,

도 12는 상기 도 5의 세포 집합들을 염(0.1 mM)을 첨가한 배지에 각각 배양하였을 때, 항체 생산량을 나타낸 그래프이다.

<110> KOREA ADVANCED INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> A transformed cell line transfected by a vector which over-express constitutively active Akt protein, an inhibitor of programmed cell death containing above a vector, and a method of producing target proteins using above transformed cell line <130> 7p-07-100 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 480 <212> PRT <213> constitutively active Akt(CA-Akt) protein <400> 1 Met Ser Asp Val Ala Ile Val Lys Glu Gly Trp Leu His Lys Arg Gly 1 5 10 15 Glu Tyr Ile Lys Thr Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Asn Asp 20 25 30 Gly Thr Phe Ile Gly Tyr Lys Glu Arg Pro Gln Asp Val Asp Gln Arg 35 40 45 Glu Ala Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Gln Cys Gln Leu Met Lys 50 55 60 Thr Glu Arg Pro Arg Pro Asn Thr Phe Ile Ile Arg Cys Leu Gln Trp 65 70 75 80 Thr Thr Val Ile Glu Arg Thr Phe His Val Glu Thr Pro Glu Glu Arg 85 90 95 Glu Glu Trp Thr Thr Ala Ile Gln Thr Val Ala Asp Gly Leu Lys Lys 100 105 110 Gln Glu Glu Glu Glu Met Asp Phe Arg Ser Gly Ser Pro Ser Asp Asn 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Glu Met Glu Val Ser Leu Ala Lys Pro Lys His Arg 130 135 140 Val Thr Met Asn Glu Phe Glu Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr 145 150 155 160 Phe Gly Lys Val Ile Leu Val Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Tyr Tyr 165 170 175 Ala Met Lys Ile Leu Lys Lys Glu Val Ile Val Ala Lys Asp Glu Val 180 185 190 Ala His Thr Leu Thr Glu Asn Arg Val Leu Gln Asn Ser Arg His Pro 195 200 205 Phe Leu Thr Ala Leu Lys Tyr Ser Phe Gln Thr His Asp Arg Leu Cys 210 215 220 Phe Val Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Ser 225 230 235 240 Arg Glu Arg Val Phe Ser Glu Asp Arg Ala Arg Phe Tyr Gly Ala Glu 245 250 255 Ile Val Ser Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser Glu Lys Asn Val Val Tyr 260 265 270 Arg Asp Leu Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile 275 280 285 Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Lys Asp Gly Ala 290 295 300 Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val 305 310 315 320 Leu Glu Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu Gly 325 330 335 Val Val Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gln 340 345 350 Asp His Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Glu Ile Arg Phe 355 360 365 Pro Arg Thr Leu Gly Pro Glu Ala Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu 370 375 380 Lys Lys Asp Pro Lys Gln Arg Leu Gly Gly Gly Ser Glu Asp Ala Lys 385 390 395 400 Glu Ile Met Gln His Arg Phe Phe Ala Gly Ile Val Trp Gln His Val 405 410 415 Tyr Glu Lys Lys Leu Ser Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu 420 425 430 Thr Asp Thr Arg Tyr Phe Asp Glu Glu Phe Thr Ala Gln Met Ile Thr 435 440 445 Ile Thr Pro Pro Asp Gln Asp Asp Ser Met Glu Cys Val Asp Ser Glu 450 455 460 Arg Arg Pro His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Gly Thr Ala 465 470 475 480

Claims (13)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
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7. 삭제
8. 삭제
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10. 1) 인간의 항상 활성화된 Akt 단백질을 발현하는 벡터를 도입한 형질전환된 세포주에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 도입하는 단계;

    2) 상기 단계 1)에 의해 제조된 형질전환된 세포주를 염의 농도가 0.05 ~ 0.2 M인 고삼투 배지에서 배양하는 단계; 및,

    3) 상기 단계 2)에 의해 생산된 목적 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 생산방법
11. 제 10항에 있어서, 단계 1)의 목적 단백질은 가용성 TNF 수용체, 가용성 IL-4 수용체, 가용성 IL-1 유형 II 수용체, 가용성 Flt3 리간드, 가용성 CD40 리간드, CD39, CD30, CD27, TEK/Ork, IL-15, 가용성 IL-15 수용체, Ox 40, GM-CSF, RANKL, RANK, TRAIL, 가용성 TRAIL 수용체, 조직 플라스미노겐 활성제(tissue plasminogen activator), 인자(Factor) VIII, 인자(Factor) IX, 아포지방단백질(apolipoprotein) E, 아포지방단백질(apolipoprotein) A-I, IL-2 수용체, IL-2 길항제(antagonist), 알파-1 안티트립신(alpha-1 antitrypsin), 칼시토닌(calcitonin), 성장 호르몬(growth hormone), 인슐린(insulin), 인슐리노트로핀(insulinotropin), 인슐린-유사 성장 인자(insulin-like growth factors), 파라티로이드 호르몬(parathyroid hormone), 인터페론(interferons), 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase), 글루칸(glucagon), 에리스로포이틴(erythropoeitin), 항체(antibody), 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), Fc-융합 단백질(Fc-fusion protein), 글로빈(globins), 신경 성장 인자(nerve growth factors), 인터루킨(interleukins), 집락자극인자(colony stimulating factor)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 생산방법.
12. 제 10항에 있어서, 단계 2)의 염은 접종 후 60~80시간 사이에 배지에 첨가하는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 생산 방법.
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