CN117247972B - 一种快速高成功率筛选Expi293稳转细胞株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种快速高成功率筛选Expi293稳转细胞株的方法，其特征在于，包含如下步骤：S1.质粒构建和大抽；S2.基于空白Expi293细胞的杀灭情况，筛选抗生素浓度；S3.将转染剂/DNA的复合物加入空白Expi293细胞中进行细胞培养后，向内加入S2筛选所得浓度的抗生素进行筛选，期间添加条件培养基进行培养直至其活率达到预设值，即获得种子细胞；S4.基于种子细胞的放大表达及纯化。该方案不仅筛选方便，更适合放大生产，同时，配合较为经济的转染试剂即可实现，大大降低成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物技术，具体地，涉及一种快速高成功率筛选Expi293稳转细胞株的方法。
背景技术
目前，对于稳转细胞株大多数公司会优先选择非常成熟的稳转筛选体系，如CHO-K1和HEK293T等，而悬浮的Expi293稳转细胞筛选体系几乎很少有人报道，目前经验和技术相对缺乏；转染方式上稳转一般常会选择用电转或者慢病毒转染方式。电转需要电转仪和对应的电转杯，而慢病毒转染会有病毒残留风险，特别对于IND申报或GMP生产影响很大；
Expi293 细胞一般用于瞬时表达。但对于表达低的重组蛋白难度较大。为了得到几百毫克级别的蛋白，往往需要反复抽提很多批次的质粒，会出现表达不稳定，不表达等情况。需求量增加至克级别，用Expi293 瞬转显然无法实现。
此外，为了减少批间差异及成本，也构建了CHO-K1稳转细胞株。但是，CHO-K1稳转方法存在 His 标签蛋白杂带太多，难以去除的问题；以及很多目的蛋白挂柱效果差，结合亲和柱后，用较高浓度的溶剂也难以洗脱，这样不仅得到的蛋白极少，反而影响镍柱寿命的问题；此外，在一些蛋白精纯的过程中，还发现在CHO-K1宿主中表达的蛋白极不稳定，出现了大量的聚体，导致得到的蛋白活性不达标等问题。
发明内容
本发明旨在克服上述缺陷，提供一种快速高成功率筛选Expi293稳转细胞株的方法。本发明在Expi293悬浮细胞上进行，不仅筛选方便，更适合放大生产，同时配合较为经济的转染试剂，如：PEI等，大大降低成本。本发明对筛选周期也进行优化，加用条件培养基，不仅可以提高筛选的成功率，还可以缩短筛选时间。
本发明提供了一种快速高成功率筛选Expi293稳转细胞株的方法，其特征在于，包含如下步骤：
S1.质粒构建和大抽；
S2.基于空白Expi293细胞的杀伤情况，筛选抗生素浓度；
S3.将转染剂/DNA的复合物加入空白Expi293细胞中进行细胞培养后，向内加入S2筛选所得浓度的抗生素进行筛选，期间添加条件培养基进行培养直至其活率达到预设值，即获得种子细胞；
S4.基于种子细胞的放大表达及纯化。
进一步地，本发明提供的一种快速高成功率筛选Expi293稳转细胞株的方法，其特征还在于：
在S1中，包含如下步骤：
S1-1.基于目标蛋白对应的氨基酸序列，按照蛋白表达序列要求在两端添加酶切位点，N端添加Kozak序列和信号肽序列，C端添加终止子后，进行密码子优化和合成，获得目标基因；
S1-2.拿到目的基因后，将其连接至空载体上，化转至感受态细胞中，将验证正确的单菌落接种至培养基中过夜培养，次日用大抽试剂盒抽提质粒；
S1-3.大抽完成的质粒进行线性化，将线性化后产物进行醇沉回收，去除酶切引入的成分，此时即得到待用线性化的质粒。
进一步地，本发明提供的一种快速高成功率筛选Expi293稳转细胞株的方法，其特征还在于：
在S1-2中，要求质粒大抽后用灭菌超纯水溶解，质粒浓度要求大于1μg/μL且不含TE、EDTA等螯合剂；纯度要求琼脂糖胶上无其他杂带，且260/280在1.8-2.0范围内。
进一步地，本发明提供的一种快速高成功率筛选Expi293稳转细胞株的方法，其特征还在于：
在S2中，包含如下步骤：
S2-1.复苏Expi293空白细胞，细胞操作代次必须为复苏操作三代稳定以后，且传代生长时间在一个月以内；
S2-2.空白Expi293细胞按照转染对应的活细胞密度2.5*10^6 cells/mL进行接种；
S2-3.先进行抗生素大梯度筛选后，根据大梯度筛选结果再进行最终浓度的筛选获得最终抗生素浓度。
进一步地，本发明提供的一种快速高成功率筛选Expi293稳转细胞株的方法，其特征还在于：
当抗生素为G418时，其浓度为工作浓度范围在50 ug/mL到1000ug/mL。
进一步地，本发明提供的一种快速高成功率筛选Expi293稳转细胞株的方法，其特征还在于：
在步骤S3中，包含如下步骤：
S3-1.将S1中的质粒和转染剂用培养基稀释；
S3-2.将转染剂加入到质粒中，混匀后室温孵育5-30min；
S3-3.将S3-2的复合物加入至空白Expi293细胞中，恒温摇床内培养24-48小时；
S3-4.离心换液后，向松散的细胞中加入抗生素，混匀；
S3-5.固定频次换液直至活率上升至95%。
进一步地，本发明提供的一种快速高成功率筛选Expi293稳转细胞株的方法，其特征还在于：
在步骤S3-1中，转染剂和质粒的质量比为5-10。
进一步地，本发明提供的一种快速高成功率筛选Expi293稳转细胞株的方法，其特征还在于：
在步骤S3-5中，当密度低于1*10^6 cells/mL，或者活率低于30%时，加入条件培养基。
进一步地，本发明提供的一种快速高成功率筛选Expi293稳转细胞株的方法，其特征还在于：
在步骤S3-5中，加入50%条件培养基。
本发明的作用和效果：
本发明自主开发了Expi293稳转表达体系；一方面解决了一些特殊蛋白在CHO-K1上表达不理想的情况；另外一方面弥补了Expi293稳转技术的不足，实现在Expi293上进行稳定表达；最重要是产品在产量和质量上也得到了进一步的提升；
本次实验探索在Expi293悬浮细胞上进行，不仅筛选方便，更适合放大生产，同时，配合较为经济的转染试剂即可实现，大大降低成本。本次实验对筛选周期也进行优化，加用条件培养基，不仅可以提高筛选的成功率，还可以缩短筛选时间。
附图说明
图1.不同梯度G418浓度对空白Expi293的杀死曲线（大筛）
图2.不同梯度G418浓度对空白Expi293的杀死曲线（缩小条件后的筛选）
图3.对比第一批未加条件培养基与添加条件培养基的筛选时间对比
图4.DLL3蛋白表达情况
图5.FcRH5蛋白表达情况
图6.CTGF蛋白表达情况
图7.PSMA蛋白表达情况
图8.Mouse Beta Klotho蛋白表达情况
其中，图4-8中，标框的批次对应的曲线代表稳转结果。
具体实施方式
本发明能够实施多种变更且能够具有各种实施例，因而要在附图中例示各特定实施例并对其进行说明。但这并不是要将本发明限定在特定的实施方式，而应当理解为包括落入本发明的思想以及技术范围的所有变更、等同物乃至替代物。
实施例1.本实施例提出的筛选Expi293稳转细胞株的方法
S1．质粒构建和大抽
1.1从Uniprot官网上找出自己感兴趣蛋白对应的氨基酸序列，按照蛋白表达序列要求需在两端添加酶切位点，N端添加Kozak序列和信号肽序列，C端添加终止子。并发送至基因合成公司进行密码子优化和合成；本实施例涉及到的有Human DLL3 Uniprot为Q9NYJ7，Human FCRH5 Uniprot为Q96RD9，Human CTGF Uniprot为Q5M8T4,Human PSMAUniprot为Q04609，Mouse Beta-klotho Uniprot为Q99N32。
1.2 拿到目的基因后，分别将其连接至pCDNA3.4空载体上。化转至DH5α感受态中，将验证正确的单菌落接种至LB培养基中过夜培养，次日用大抽试剂盒抽提质粒。要求质粒大抽后用灭菌超纯水溶解，质粒浓度要求大于1μg/μL且不含TE、EDTA等螯合剂；纯度要求琼脂糖胶上无其他杂带，且260/280在1.8-2.0范围内；
1.3 大抽完成的质粒用Sal I或者Pvu I进行线性化，将线性化后产物进行醇沉回收，去除酶切引入的成分，此时即得到了感兴趣待用线性化的质粒；
S2.细胞准备和空白细胞G418筛选
2.1 复苏Expi293空白细胞，细胞操作代次必须为复苏操作三代稳定以后，且传代生长时间在一个月以内；将复苏的细胞进行传代，要求每次按照0.5~1*10^6 cells/mL接种，最高活细胞密度不要超过4*10^6 cells/mL，活率不得低于95%；
2.2 空白Expi293细胞按照转染对应的活细胞密度2.5*10^6 cells/mL进行接种。
由于不同哺乳动物细胞对G418耐受性不同，工作浓度范围在50 ug/mL到1000ug/mL内。先进行G418（厂家生工，货号为A600858-0001）大梯度筛选，确定大致的浓度范围，如200 μg/mL--1000 μg/mL，每隔200μg/mL设置一个浓度梯度，加上空白0μg/mL对照，共六瓶。选择在十天左右杀死空白细胞的最低G418浓度，如图1所示，此次实验初步确定G418浓度为200 μg/mL。为了使空白Expi293细胞全部被G418杀死且含有目的基因的细胞不受影响，于是进行进一步筛选找出更合适的G418浓度。本次选择G418从100--200μg/mL中设置5个浓度梯度做G418杀伤曲线。如图2所示，结果显示差别不是很明显，最终确定G418工作浓度为200μg/mL;
S3.细胞转染和G418筛选
3.1空白Expi293细胞调整为2.5*10^6 cells/mL，体积为30 mL。准备好感兴趣的质粒和母液为1 g/L的PEI转染试剂（厂家Polyscience，货号23966-1）。调整DNA终浓度为1μg/mL，PEI/DNA质量比为6.7，质粒和PEI分别用CD05培养基（厂家奥浦迈，货号81075-001）稀释后室温孵育5min，分别将稀释后的PEI溶液加至稀释好的质粒溶液中，混匀后室温孵育20min，用移液管轻柔吸取PEI/DNA复合物滴加至密度调整好的Expi293空白细胞中，边滴加边摇匀，做好标记放置120rpm 37℃恒温摇床内培养；
3.2 42h后离心换液,200g离心5min，轻敲使细胞松散后加入含有200ug/mL G418抗生素的培养基，轻柔混匀移至125mL摇瓶内；
3.3 隔两天换液一次，当密度低于1*10^6 cells/mL，或者活率低于30%，加入50%条件培养基可以增加细胞的存活率。当活率上升至95%，可进行冻存作为后续种子细胞使用；
在本研究过程中，关于培养基进行了如下对比实验
（1）关于是否添加条件培养基，其对比结果如图3所示：
第一批未加条件培养基，细胞筛选周期为40天，其中在低活率期停滞时间较长，筛选成功率低于30%，较DLL3 后又筛选了多个难表达的重组蛋白，在不加条件培养基的基础上，细胞株能恢复过来的极少。第一批三个为同一个质粒，分别做不同培养基的对比。第二批在筛选过程中添加50%条件培养基，此个批次一共筛选了4个细胞株，且都能很好的存活，且在筛选的30天左右细胞活率达到95%以上，细胞能完全正常翻倍，且在后期培养过程中也未添加G418抗生素维持，无论是在产量还是活性上均获得了很满意的结果。
（2）关于添加不同种类的条件培养基：
不加条件培养基表达的DLL3蛋白，分别用现有的三种培养基进行尝试，Medium A为CD05（厂家奥浦迈，货号81075-001），Medium B为Transpro CD01（厂家多宁生物，货号MS002），Medium C为Trans293（厂家奥浦迈，货号P82019）不同培养基条件，其结果表明均筛选成功。
针对DLL3，单克隆筛选后，第一次放大表达，优选选择活性相对较高的CD05筛选的细胞株用于后续的表达。
S4.放大表达及纯化
4.1 用125ml摇瓶表达30ml体积进行流加培养，按照0.7*10^6 cells/mL接种30mL,day3按照总体积4%进行补料PFF05（厂家奥浦迈，货号F81279-001），同时补葡萄糖（厂家沪试，货号10010518）至6g/L,从37℃降温至34℃培养至day4/5收样；从day3开始每天取样进行小试初步纯化，根据SDS-PAGE条带对比，确定收样的天数。按照小体积的条件，进行放大培养2-5L，收样后精纯计算出回收率和表达量。送样进行细胞水平或者ELISA/SPR测活分析。
实施例2.本实施例Expi293稳转与传统Expi293瞬转DLL3的对比结果
如下DLL3收率数据对比表可以发现，Expi293稳转的细胞株在收率上比瞬时转染高出4倍多。
| Expi293瞬转收率 | Expi293稳转收率 | |
| 平均收率 | 0.54mg/L | 2.4mg/L |
如图4所示，ELISA结果显示稳转DDL3蛋白和瞬转DLL3蛋白与DLL3抗体结合差异不大（其中，-1 和-2 是筛选的两个单克隆，图 4 显示 051201-2活性相对较 051201-1 好，第二批 060403 表达的DLL3 是与 051201-2 源于同一个细胞株）。
实施例3.本实施例Expi293稳转与传统Expi293瞬转FcRH5的对比结果
如下FcRH5收率数据对比表可以发现，Expi293稳转的细胞株在收率上比瞬时转染高出5倍多。
| Expi293瞬转收率 | Expi293稳转收率 | |
| 平均收率(mg/L) | 0.19 | 0.98 |
如图5所示，ELISA结果显示稳转FcRH5蛋白和瞬转FcRH5蛋白与FcRH5抗体结合一致。
实施例4.本实施例Expi293稳转与传统Expi293瞬转CTGF的对比结果
如下CTGF收率数据对比表可以发现，Expi293稳转的细胞株在收率上比瞬时转染高出4倍多。
| Expi293瞬转收率 | Expi293稳转收率 | |
| 平均收率(mg/L) | 0.32 | 1.4 |
如图6所示，ELISA结果显示稳转CTGF蛋白和瞬转CTGF蛋白与CTGF抗体结合一致。
实施例5.本实施例Expi293稳转与传统Expi293瞬转PSMA的对比结果
如下PSMA收率数据对比表可以发现，Expi293稳转的细胞株在收率上比瞬时转染相差不大。
| Expi293瞬转收率 | Expi293稳转收率 | |
| 平均收率(mg/L) | 0.33 | 0.4 |
如图7所示，ELISA结果显示稳转PSMA蛋白和瞬转PSMA蛋白与PSMA抗体结合一致。且在细胞活性实验上，均优于竞品。
实施例6.本实施例Expi293稳转与传统Expi293瞬转Mouse Beta Klotho的对比结果
如下Mouse Beta Klotho收率数据对比表可以发现，Expi293稳转的细胞株在收率上比瞬时转染高出7倍多。
| Expi293瞬转收率 | Expi293稳转收率 | |
| 平均收率(mg/L) | 0.16 | 1.2 |
如图8所示，SPR结果显示Mouse Beta Klotho能与对应的抗体很好的结合。
以上虽然以实施例为中心进行了说明，但这只是例示而已，并不限定本发明，本领域普通技术人员清楚，在不逸出本实施例的本质特性的范围内能够进行以上并未例示的各种变形和应用。例如，实施例中所具体示出的各构成要素能够经变形而实施。而且，与这种变形和应用相关的各种不同点应当解释为包括在所附的权利要求书中所规定的本发明的范围。
Claims (7)
1.一种快速高成功率筛选Expi293稳转细胞株的方法，其特征在于，包含如下步骤：
S1.质粒构建和大抽；
S2.基于空白Expi293细胞的杀伤情况，筛选抗生素浓度；
S3.将转染剂/DNA的复合物加入空白Expi293细胞中进行细胞培养后，向内加入S2筛选所得浓度的抗生素进行筛选，期间添加条件培养基进行培养直至其活率达到预设值，即获得种子细胞；
S4.基于种子细胞的放大表达及纯化；
其中，在步骤S3，隔两天换液一次，当密度低于1*10^6cells/mL，或者活率低于30％，加入50％条件培养基可以增加细胞的存活率，当活率上升至95％，进行冻存作为后续的种子细胞使用；
所述条件培养基选自CD05、Transpro CD01、Trans293。
2.如权利要求1所述的一种快速高成功率筛选Expi293稳转细胞株的方法，其特征在于：
在S1中，包含如下步骤：
S1-1.基于目标蛋白对应的氨基酸序列，按照蛋白表达序列要求在两端添加酶切位点，N端添加Kozak序列和信号肽序列，C端添加终止子后，进行密码子优化和合成，获得目标基因；
S1-2.拿到目的基因后，将其连接至空载体上，化转至感受态细胞中，将验证正确的单菌落接种至培养基中过夜培养，次日用大抽试剂盒抽提质粒；
S1-3.大抽完成的质粒进行线性化，将线性化后产物进行醇沉回收，去除酶切引入的成分，此时即得到待用线性化的质粒。
3.如权利要求2所述的一种快速高成功率筛选Expi293稳转细胞株的方法，其特征在于：
在S1-2中，要求质粒大抽后用灭菌超纯水溶解，质粒浓度要求大于1μg/μL且不含TE、EDTA螯合剂；纯度要求琼脂糖胶上无其他杂带，且260/280在1.8-2.0范围内。
4.如权利要求1所述的一种快速高成功率筛选Expi293稳转细胞株的方法，其特征在于：
在步骤S2中，包含如下步骤：
S2-1.复苏Expi293空白细胞，细胞操作代次必须为复苏操作三代稳定以后，且传代生长时间在一个月以内；
S2-2.空白Expi293细胞按照转染对应的活细胞密度2.5*10^6cells/mL进行接种；S2-3.先进行抗生素大梯度筛选后，根据大梯度筛选结果再进行最终浓度的筛选获得最终抗生素浓度。
5.如权利要求1所述的一种快速高成功率筛选Expi293稳转细胞株的方法，其特征在于：
在步骤S3中，当抗生素为G418时，其浓度在50ug/mL到1000ug/mL的范围内。
6.如权利要求1所述的一种快速高成功率筛选Expi293稳转细胞株的方法，其特征在于：
在步骤S3中，包含如下步骤：
S3-1.将S1中的质粒和转染剂用培养基稀释；
S3-2.将转染剂加入到质粒中，混匀后室温孵育5-30min；
S3-3.将S3-2的复合物加入至空白Expi293细胞中，恒温摇床内培养24-48小时；S3-4.离心换液后，向松散的细胞中加入抗生素，混匀；
S3-5.固定频次换液直至活率上升至95％。
7.如权利要求6所述的一种快速高成功率筛选Expi293稳转细胞株的方法，其特征在于：
在步骤S3-1中，转染剂和质粒的质量比为5-10。
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