CN117402827A - 一种稳定表达Cas9蛋白的细胞株及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了一种稳定表达Cas9蛋白的细胞株及其制备方法和应用。本发明利用CRISPR/Cas9技术将Cas9基因序列通过同源重组整合入细胞基因组中的AAVS1位点，使细胞在稳定表达Cas9蛋白的同时避免了随机整合带来的风险。本发明制备的细胞株可用于进一步的基因编辑，为肿瘤病理研究、抗肿瘤药物等领域的研发提供有力工具。

Description

一种稳定表达Cas9蛋白的细胞株及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生命科学领域，涉及一种稳定表达Cas9蛋白的细胞株及其制备方法和应用，尤其涉及一种稳定表达Cas9蛋白的A549细胞株及其制备方法和应用。
背景技术
规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspersed shortpalindromic repeat，CRISPR)，是细菌和古细菌防御病毒或噬菌体入侵的免疫系统，可将外源DNA序列整合到CRISPR序列中。同时具有核酸内切酶活性的CRISPR相关蛋白(CRISPRassociated，Cas)与CRISPR系统中的sgRNA(crRNA、tracrRNA退火互补后形成)组成复合体，通过sgRNA的PAM序列特异性地切割外源序列，起到防御效果。CRISPR/Cas系统有I、II、III三种类型，与其他类型相比，属于II型的CRISPR/Cas9仅需要一个Cas9蛋白就发挥防御功能，因此是目前应用最广泛的。2012年，Emmanuelle Charpentier和Jennifer A.Doudna发现CRISPR/Cas9系统可高效地编辑基因组。2013年张锋和George Church几乎同时成功使用CRISPR/Cas9系统在哺乳动物细胞中实现了基因编辑。随后，CRISPR/Cas9系统对各种细胞、生物的基因编辑逐步实现。
依照crRNA和tracrRNA的序列特点，可人为设计特异性识别目的基因的sgRNA。将装载sgRNA序列、Cas9基因序列的质粒载体转入待编辑细胞可实现目的基因的编辑。但由于Cas9基因序列过长(4106bp)，导致质粒载体过大，常常出现转染效率低、基因编辑失败的情况。近年来，研究人员先将Cas9基因转入细胞中，构建出稳定表达Cas9蛋白的细胞株，然后按需转入相应的sgRNA序列即可实现基因编辑。
质粒载体根据来源不同可分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体常用的有慢病毒载体和腺相关病毒(AAV)载体等。慢病毒载体会随机整合入靶细胞基因组，在稳定表达sgRNA和Cas9的同时，可能造成靶细胞基因组的未知改变。AAV载体在复制酶存在的情况下会定向整合入19号染色体的AAVS1位点，在复制酶缺失的情况下同慢病毒载体一样会随机整合入靶细胞基因组。但是AAV载体最大装载量为4.7kbp，其中还包括了自身元件，因此难以承载4kbp多的Cas9基因序列。另外，病毒载体在转染细胞的过程中会产生病毒颗粒，操作风险等级较高。非病毒质粒安全等级高，通过质粒设计，可将Cas9序列通过同源重组整合到靶细胞基因组的基因插入安全位点中(如人源细胞常用AAVS1，鼠源细胞常用Rosa26)，在稳定表达Cas9基因的同时，避免了序列的随机插入，对细胞的正常生命活动不造成任何影响。但是采用非病毒质粒、常规转染试剂PEI进行转染存在转染效率极低的问题。尤其对于序列长度大于10kd且同时转染多个质粒时转染效率仅有10％左右。在转染体系中添加阳离子物质可协同PEI与DNA分子结合并将DNA分子带入细胞内。月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐(LAE)是一种阳离子化合物，分子量为421，常用于食品及化妆品防腐剂。目前尚无有关LAE在质粒转染方面的用途，本发明发现在转染体系中添加LAE可使PEI法的双质粒共转效率大幅度提升。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种稳定表达Cas9蛋白的细胞株及其制备方法和应用，用于解决现有技术中同时转染多个大质粒时所面临的转染效率低、在对细胞进行基因编辑时由于Cas9基因序列过长难以转染编辑的问题。
本发明的目的之一是提供一种能够稳定表达Cas9蛋白的细胞株；所述细胞株为A549 Cas9-copGFP-1，保藏编号为：CCTCC NO:C202264。
本发明所述的稳定表达Cas9蛋白的A549细胞株，已于2022年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学(湖北省武汉市武昌区八一路299号)，保藏名称为：A549 Cas9-copGFP-1，保藏编号为：CCTCC NO:C202264。
本发明的另一目的是提供稳定表达Cas9蛋白的细胞株的制备方法，所述方法包括：在PEI和LAE的存在下，将Cas9基因转染细胞。
本发明的另一目的是提供上述细胞株在生命科学领域的应用，尤其是在基因编辑中的应用。
本发明的另一目的是提供一种提高转染效率的方法，所述方法通过添加LAE进行。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：
本发明首次利用LAE提升PEI法转染非病毒质粒的转染效率可达4.28倍。
本发明首次制备出在A549细胞中稳定表达Cas9蛋白的细胞株，且Cas9基因序列插入在A549基因组的AAVS1安全位点中。
本发明用上述细胞株成功对copGFP基因进行了基因敲除。
附图说明
图1为AAS1位点切割质粒AAVS1-sgRNA-Cas9的质粒图谱图。
图2为Cas9供体质粒AAVS1-Cas9 donor的质粒图谱图。
图3为不同浓度LAE转染质粒后A549 Cas9重组多克隆的荧光显微图。
图4为不同浓度嘌呤霉素(puromycin)处理A549细胞48h后细胞存活率图。
图5为Cas9基因敲入AAVS1位点PCR验证引物组合示意图。
图6为A549 Cas9重组多克隆Cas9基因敲入AAVS1位点的PCR验证结果。
图7为连续稀释法分离单克隆的示意图。
图8为A549、A549 Cas9单克隆1#、A549 Cas9单克隆2#的荧光显微图。
图9为A549 Cas9单克隆1#、A549 Cas9单克隆2#Cas9基因敲入AAVS1位点的PCR验证结果。
图10为蛋白免疫印迹法检测A549、A549 Cas9单克隆1#、A549 Cas9单克隆2#的Cas9蛋白表达结果。
图11为A549 Cas9单克隆2#STR检测结果。
图12为A549 Cas9单克隆2#依次传到第3、10、50代时Cas9蛋白表达结果。
图13为用A549 Cas9单克隆2#敲除copGFP基因后的荧光显微图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
本发明提供了一种稳定表达Cas9蛋白的细胞株，其中，所述细胞株为A549 Cas9-copGFP-1，保藏编号为：CCTCC NO:C202264。本发明中，所述细胞株A549 Cas9-copGFP-1的基因组中包含Cas9基因序列。所述细胞株A549 Cas9-copGFP-1的基因组中还包含嘌呤霉素抗性基因序列。所述细胞株A549 Cas9-copGFP-1的基因组中还包含copGFP基因序列。
本发明还提供了一种稳定表达Cas9蛋白的细胞株的制备方法，所述方法包括：在PEI和LAE的存在下，将Cas9基因转染细胞。
本发明所述方法中，所述LAE的浓度为2～30μg/mL，可以是2-5、5-8、8-10、10-15、15-20、20-25、25-30μg/mL。优选地，所述LAE的浓度为2～20μg/mL；进一步优选地，为5～10μg/mL，可以是5、6、7、8、9、10μg/mL；进一步优选地，为10μg/mL。
本发明所述方法中，所述Cas9基因转染的细胞可以是任何合适的细胞，只要该细胞可以进一步作为工具用于后续基因编辑等用途。在一优选实施方式中，所述被转染的细胞为人肺泡腺癌基底上皮细胞；进一步优选地，所述Cas9基因转染的细胞为A549细胞。
本发明所述方法中，转染后通过嘌呤霉素筛选得到；优选地，所述嘌呤霉素的浓度为0.0625μg/mL～8μg/mL；进一步优选地，所述方法包括：在转染后，通过2μg/mL嘌呤霉素处理细胞48h，然后在1μg/mL嘌呤霉素的条件下持续培养细胞。本发明所述方法通过添加LAE，可以大大提升转染效率，在一实施方式中，提升转染效率4.28倍。
本发明所述方法中，在一优选实施方式中，所述Cas9基因为spCas9。
本发明所述方法中，将Cas9基因序列插入在A549细胞基因组的AAVS1基因中。
本发明所述方法中，将嘌呤霉素抗性基因序列插入在A549细胞基因组的AAVS1基因中。
本发明所述方法中，将copGFP基因序列插入在A549细胞基因组的AAVS1基因中。
在一实施方式中，本发明提供的稳定表达Cas9蛋白的细胞株的制备方法，包括以下步骤：
S1、设计并构建能表达sgRNA、Cas9蛋白表达基因、AAVS1基因同源序列、抗生素筛选标记基因和荧光标记基因的载体；
S2、将载体转入细胞；
S3、通过抗生素和荧光筛选阳性细胞株；
S4、经单克隆建系后、鉴定即得单克隆细胞株。
本发明还提供了如上所述方法制备得到的稳定表达Cas9蛋白的细胞株。
本发明还提供了如上所述的稳定表达Cas9蛋白的细胞株在基因编辑中的用途。例如使用上述能够稳定表达Cas9蛋白的细胞株作为工具细胞进行后续基因编辑操作，获得所述基因编辑细胞系。由于细胞株本身能够表达Cas9蛋白，因此只需转入相应的sgRNA片段快速进行目的基因的基因编辑，研究目的基因对于生物体的影响，如对于寻找疾病治疗靶点、建立动物模型等具有科研意义及市场价值。
本发明还提供了一种提高基因转染效率的方法，所述方法通过在LAE的存在下，将基因转染细胞进行；优选地，所述方法通过在PEI和LAE的存在下，将基因转染细胞进行。本发明所述方法通过添加LAE，可以大大提升转染效率如提升转染效率4.28倍。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
实验材料及方法
(1)细胞、菌种与质粒
A549细胞来源于国家模式与特色实验细胞资源库，保藏号：SCSP-503，本发明也可用其它来源的A549细胞来代替；大肠杆菌trans-5α(全式金#CD201-01)；质粒AAVS1-sgRNA-Cas9、AAVS1-Cas9 donor均由GeneCopoeia构建，质粒图谱分别见图1、图2。质粒copGFPsgRNA inpCDN3.1(含G418抗性)由安升达公司构建，质粒载体为pCDN3.1(含G418抗性)，其中copGFPsgRNA序列为：
TAATTAAGGTACCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTACGAGGCCGGCCGCGTGATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTGAATTCGCTAGCTAGGTC(SEQ ID NO.1)。
(2)仪器设备
水浴锅，CO2恒温细胞培养箱，生物安全柜，PCR仪，凝胶成像仪，蛋白电泳系统，高速离心机，移液器，核酸电泳系统，微波炉，振荡器，高压灭菌锅。
(3)试剂
PBS缓冲液(生工生物，#E607008)，RIPA细胞裂解液(生工生物，#C500005-0050)，DMEM(Invitrogen，#11960044)，F-12K(Invitrogen，#21127-022)，Glutamax(Invitrogen，#35050061)，胎牛血清(GIBCO)，puromycin(Solarbir，P8230)，neomycin(生工生物，#A600958-0100)，ampicillin(生工生物，#A100339)，PEI(翌圣生物，#40815ES03)，LAE(麦克林，#E857058)，BCA试剂盒(赛默飞，#23227)，BSA(生工生物，#A600332-0100)，Anti-CRISPR-Cas9 antibody(abcam，#ab189380)，β-Actin(13E5)Rabbit mAb(CST，#4970S)，无内毒素质粒小提中量试剂盒(天根，DP118-02)，Goat Anti-Rabbit IgG H&L(HRP)(abcam，#ab205718)，丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺30％溶液(生工生物，#B546018)，TEMED(生工生物，#A100761-0025)，TAE(生工生物，#B548101)，SDS(生工生物，#A600485-0100)，pH6.8 Tris-HCl(生工生物，#C526034-0250)，pH8.8 Tris-HCl(生工生物，#C506033-0250)，琼脂糖(生工生物，#A620014-0100)，running buffer(生工生物，#C520001-0500)，trans buffer(生工生物，#B540152-0500)。
(4)细胞培养
培养A549细胞的培养基组成为：89v％F-12K培养基、10v％FBS、1v％glutamax培养；其中，v％表示占总培养基体积百分数。
培养转染质粒后的A549细胞的培养基组成为：89v％F12K培养基、10v％FBS(Gbico)、1v％glutamax、终浓度为1μg/mL puromycin，其中，v％表示占总培养基体积百分数。
实施例1质粒转染A549细胞
1.1质粒转化与扩增
取两支灭菌EP管，各加入50μL冰上融化的感受态大肠杆菌trans5α，分别轻轻加入10μL 50ng AAVS1-sgRNA-Cas9或AAVS1-Cas9 donor，轻轻混匀，冰上放置40min。42℃水浴中热激45秒，快速转移至冰浴中2分钟。加入200μL LB液体无抗培养基，37℃摇床，摇1小时复苏。复苏完的菌于1000rpm离心3min，将上清弃去一些，留50μL左右，重悬大肠杆菌，分别涂在含有50μg/mL AMP的LB平板上和不含AMP的LB平板上，37℃倒置培养过夜。挑取含AMP的LB平板上的单克隆，置于200mL含50μg/mL AMP的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养16-24h。
使用天根无内毒素质粒小提中量试剂盒对过夜的菌液进行质粒抽提，分别获得AAVS1-sgRNA-Cas9和AAVS1-Cas9 donor，用紫外分光光度计测定所提质粒的浓度。
1.2细胞转染
将A549细胞铺于6孔板中，待密度达到40-50％时，将每孔细胞用2mL完全培养基换液，其中A组不加LAE作为阴性对照，B、C、D组添加LAE至终浓度分别为5、10、15μg/mL。将100μL无血清F-12K培养基、AAVS1-sgRNA-Cas9质粒和AAVS1-Cas9 donor质粒各2μg轻柔混匀为质粒稀释液。立即向100μL的质粒稀释液中加入5μL1mg/mL的PEI转染试剂，轻柔混匀。在室温下孵育10-25min。将孵育产物以每孔100μL的体积加入到6孔板中。轻柔混匀后于37℃，5％CO2培养箱培养，24h后换液并用显微镜拍摄每组细胞的白光图和荧光图，统计并计算每组的转染效率，转染效率＝绿色荧光细胞数/白光图中细胞数*100％。
结果如图3和表1所示，仅用PEI的转染效率仅为7.58％，添加5、10、15μg/mLLAE的转染效率分别为23.75％、32.37％和32.48％，依次提升转染效率3.13倍、4.27倍和4.28倍。由于LAE浓度从10μg/mL增加至15μg/mL转染效率仅从32.37％上升至32.48％，因此LAE最优浓度为10μg/mL。
表1不同浓度LAE的转染效率
实施例2采用嘌呤霉素(puromycin)筛选获得A549重组多克隆
2.1嘌呤霉素(puromycin)对A549重组多克隆的致死浓度测定
(1)将在培养基中生长状态良好的A549重组多克隆细胞以每孔3000个细胞的量铺于96孔板中，将其放入37℃、5％CO2的培养箱中培养。
(2)待细胞贴壁后，向96孔板中每孔加入嘌呤霉素，使每组终浓度依次为0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4μg/mL。
(3)将96孔板置于37℃、5％CO2培养箱中培养48h。
(4)将CCK8溶液以每孔10μL的量加入到96孔板中，将96孔板置于37℃、5％CO2培养箱中培养4h。
(5)使用酶标仪对待测样品进行450nm吸光度检测。
结果如图4所示，由图4可知，2μg/mL的嘌呤霉素处理48h能杀死A549细胞97.62％，故用2μg/mL的嘌呤霉素与转染后的A549Cas9重组多克隆细胞孵育48h，以对其进行筛选。
2.2A549重组多克隆的筛选富集
待A549细胞或A549Cas9重组多克隆细胞长满后，采用0.25％的胰酶消化，传入6cm培养皿中，待细胞贴壁后，加入2μg/mL嘌呤霉素进行筛选48h。由于转染后的A549细胞用2μg/mL的嘌呤霉素持续培养时生长速度过慢，因此更换为1μg/mL的嘌呤霉素持续培养(空白组为A549细胞)。5天后，空白组中的细胞全部死亡漂浮，转染组仍有部分细胞存活。将转染组存活细胞传代至T25瓶，待长满后进行1:3传代，取1/5细胞用于基因敲入验证。
2.3A549重组多克隆AAVS1位点基因敲入的验证
通过重组位点验证PCR验证供体载体装载的DNA片段是否被特异整合到AAVS1位点。验证PCR的引物组合分别设在5’端AAVS1重组臂(5’AAVS1-HA-L)和3’端AAVS1重组臂(AAVS1-HA-R)的两端(如图5所示)。其中5’端PCR产物为1.1kd，3’端PCR产物为1.2kd。引物序列如下：
3’端验证引物：
Forward Primer:5'-AAGCTCATCTGGTCTCCCTTCC-3'(SEQ ID NO.2)
Reverse Primer:5'-TCCTGGGATACCCCGAAGAG-3'(SEQ ID NO.3)
5’端验证引物：
Forward Primer:5'-CCGGAACTCTGCCCTCTAAC-3'(SEQ ID NO.4)
Reverse Primer:5'-AGTAGGAAAGTCCCATAAGGTCA-3'(SEQ ID NO.5)
采用QuickExtractTM DNA Extraction Solution 1.0分别对A549、A549 Cas9多克隆的基因组进行提取。向细胞沉淀中加入50μLQuickExtractTM DNA Extraction Solution1.0，涡旋混匀后，65℃下加热6min，98℃下加热2min即获得细胞基因组。
采用雅酶2*Rapid Taq Master Mix分别对重组位点3’端、5’端重组臂进行PCR扩增。PCR体系如下：
采用伯乐PCR仪对以上样品进行PCR，程序如下：
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用天根D15000+2000DNA Marker，120V，电泳30min。用天能化学发光图像分析系统对电泳凝胶进行拍照。
结果如图6所示，A549细胞作为阴性对照没有扩增出特异性验证片段，A549Cas9多克隆用5’端验证引物组合或3’端验证引物组合均扩增出特异性验证片段，且片段大小正确，说明A549 Cas9多克隆细胞中发生了质粒片段正确插入AAVS1位点。
实施例三筛选A549 Cas9单克隆并扩大培养
3.1连续稀释法分离单克隆细胞
如图7所示，采用梯度稀释法分散于96孔板中，使得每孔1个细胞。96孔板第一列的孔分别编号为A1、B1、C1、D1、E1、F1、G1、H1，第二列的孔依次编号为A2、B2、C2、……。具体操作如下：在灭菌的96孔板第一列的每孔中加入100μL培养基，留空A1孔。在A1孔加入200μL细胞悬浮液，取其中100μL与B1孔中的培养基混匀，混匀过程中避免产生气泡。继续在第1列进行同样的1:2稀释至H1孔完成第一步稀释，并用培养基将第1列每孔体积定容至200μL。混匀第1列的细胞悬浮液，各取其中100μL加至第2列孔中。用移液器轻柔混匀。重复此1:2稀释至第12列完成第二步稀释，并用培养基将每孔体积定容至200μL，将培养板放在37℃培养。
3.2荧光显微镜观察单克隆细胞的绿色荧光
培养8天后，显微镜下对含单群落的孔进行标记。待单克隆长起来后依次传入24孔板、6孔板直至T25培养瓶，得到两株A549 Cas9单克隆细胞株：A549 Cas9单克隆1#、A549Cas9单克隆2#。用荧光显微镜对A549细胞、A549 Cas9单克隆细胞进行拍照。结果如图8所示，A549细胞不发绿色荧光，A549 Cas9单克隆1#、A549 Cas9单克隆2#细胞可观察到绿色荧光。
实施例四A549 Cas9单克隆的鉴定
待A549 Cas9单克隆T25瓶长满后，采用0.25％胰酶消化并离心，取1/3细胞沉淀进行传代，1/3细胞沉淀用于后续基因组提取，1/3细胞沉淀用于后续总蛋白的提取。
4.1A549 Cas9单克隆AAVS1位点基因敲入的验证
以野生型A549作为对照，采用2.3中所述的细胞基因组提取技术、PCR技术进行A549 Cas9单克隆细胞中重组片段插入AAVS1位点的验证。
结果如图9所示，A549细胞作为阴性对照没有扩增出特异性验证片段；针对A549Cas9单克隆1#、A549 Cas9单克隆2#，采用5’端验证引物组合或3’端验证引物组合均扩增出特异性验证片段，且片段大小正确，说明A549 Cas9单克隆1#、A549 Cas9单克隆2#中发生了质粒片段正确插入AAVS1位点。
4.2蛋白免疫印迹法检测重组单克隆Cas9蛋白表达
将100μL预冷的RIPA(含有1v％的蛋白酶抑制剂cocktail和终浓度为1mM的PMSF，其中v％表示占总RIPA体积百分数)分别加入到2*106个A549、A549 Cas9单克隆1#、A549Cas9单克隆2#细胞沉淀中，涡旋使沉淀完全分散以提取总蛋白。12000rpm 4℃离心20min后取上清，用BCA试剂盒定量后，将各蛋白样品和五分之一体积的5×loading的混合物煮沸10分钟。SDS-PAGE凝胶(4％-20％梯度胶)分离目的蛋白，将目的蛋白转移到PVDF膜，5％牛血清白蛋白(BSA)或脱脂牛奶封闭1小时，4℃过夜孵育兔Anti-CRISPR-Cas9、β-actin一抗，1％PBST(0.5mL Tween 20+500mL PBS)洗三次，分别用HPR兔二抗孵育1小时，再次用1％PBST洗三次，用ECL化学发光液孵育PVDF膜2min后，用天能化学发光图像分析系统对蛋白条带进行曝光并拍照。
结果如图10所示，A549细胞作为阴性对照不表达Cas9蛋白，A549 Cas9单克隆1#、A549 Cas9单克隆2#均表达Cas9蛋白。其中，A549 Cas9单克隆2#的Cas9蛋白表达量要显著高于A549 Cas9单克隆1#的Cas9蛋白，因此本发明选取A549 Cas9单克隆2#继续进行后续的鉴定。
实施例五A549 Cas9单克隆2#的STR鉴定
为鉴定A549 Cas9单克隆2#的遗传稳定性，取10*106个A549 Cas9单克隆2#细胞送第三方公司进行STR鉴定。利用荧光标记扩增产物长度多态分析方法对样本9个STR位点进行分型。设计了9对PCR引物，组成1个PANEL用于扩增9个多态位点。位点的荧光标记采用引物上标记5’FAM荧光标记或5’VIC荧光标记。引物用在线Primer3软件设计(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)。PCR产物稀释后取少量与分子内标混匀后直接上ABI3730xl进行毛细管电泳，数据文件用GeneMapper5.0(Appliedbiosystems)来分析。
结果如图11所示，所获得的A549 Cas9单克隆2#与A549细胞STR结果100％匹配，说明所获得的A549 Cas9单克隆2#不存在细胞之间的交叉污染。
实施例六A549 Cas9单克隆2#稳定表达Cas9蛋白能力的检测
为了检测传代次数对A549 Cas9单克隆2#表达Cas9蛋白能力的影响，即检测A549Cas9单克隆2#细胞系是否能持续稳定表达Cas9蛋白，本实施例采用4.2中的方法对分别传到第3代(F3)、第10代(F10)及第50代(F50)的A549 Cas9单克隆2#进行了蛋白免疫印迹法实验。
结果如图12所示，A549 Cas9单克隆2#传代到F3、F10、F50均能表达Cas9蛋白，并且蛋白表达量并没有随代数的增加而改变，说明A549 Cas9单克隆2#具有稳定表达Cas9蛋白的能力。
实施例七A549 Cas9单克隆2#基因编辑能力的检测
为了检测A549 Cas9单克隆2#是否具备CRISPR基因编辑能力，将携带copGFPsgRNA的质粒转入其中以实现对该细胞的copGFP基因敲除。将A549 Cas9单克隆2#铺于6孔板中，待密度达到40-50％时，将每孔细胞用2mL含有10μg/mL LAE的完全培养基换液。将100μL无血清F-12K培养基和质粒copGFPsgRNA inpCDN3.1(含G418抗性)2μg轻柔混匀为质粒稀释液。立即向100μL的质粒稀释液中加入5μL1 mg/mL的PEI转染试剂，轻柔混匀。在室温下孵育10-25min。将孵育产物以每孔100μL的体积加入到6孔板中。轻柔混匀后于37℃，5％CO2培养箱培养，24h后换液并用显微镜拍摄每组细胞的白光图和荧光图。
结果如图13所示，A549 Cas9单克隆2#细胞转入copGFPsgRNA后，表达绿色荧光蛋白copGFP的细胞量大幅度减少，说明copGFP基因在A549 Cas9单克隆2#所表达的Cas9蛋白和copGFPsgRNA的共同作用下被敲除。因此A549 Cas9单克隆2#具备CRISPR基因编辑能力，可用于基因编辑。
综上结果说明，稳定表达Cas9蛋白的A549细胞株构建成功，该细胞株已于2022年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学(湖北省武汉市武昌区八一路299号)，该稳定表达Cas9蛋白的A549细胞株在保藏中心的保藏名称为：A549 Cas9-copGFP-1，保藏编号为：CCTCC NO:C202264。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种稳定表达Cas9蛋白的细胞株，其中，所述细胞株为A549 Cas9-copGFP-1，保藏编号为：CCTCC NO:C202264。
2.一种稳定表达Cas9蛋白的细胞株的制备方法，其特征在于，所述方法通过在PEI和LAE的存在下，将Cas9基因转染细胞进行。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述LAE的浓度为2～30μg/mL；优选地，所述LAE的浓度为2～20μg/mL。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Cas9基因转染的细胞为人肺泡腺癌基底上皮细胞；优选地，所述Cas9基因转染的细胞为A549细胞。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，转染后通过嘌呤霉素筛选得到；优选地，所述嘌呤霉素的浓度为0.0625μg/mL～8μg/mL；进一步优选地，所述方法包括：在转染后，通过2μg/mL嘌呤霉素处理细胞48h，然后在1μg/mL嘌呤霉素的条件下持续培养细胞。
6.如权利要求2所述的细胞株，其特征在于，所述Cas9基因为spCas9。
7.如权利要求2所述的细胞株，其特征在于，所述方法包括以下：
i)将Cas9基因序列插入在A549细胞基因组的AAVS1基因中；
ii)将嘌呤霉素抗性基因序列插入在A549细胞基因组的AAVS1基因中；
iii)将copGFP基因序列插入在A549细胞基因组的AAVS1基因中。
8.如权利要求2～7任一项所述的方法制备的稳定表达Cas9蛋白的细胞株。
9.如权利要求1或8所述的稳定表达Cas9蛋白的细胞株在基因编辑中的用途。
10.一种提高基因转染效率的方法，其特征在于，所述方法通过在LAE的存在下，将基因转染细胞进行；优选地，所述方法通过在PEI和LAE的存在下，将基因转染细胞进行。
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