CN112501113A - 一种hek293细胞组合梯度培养基及其用途 - Google Patents

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Abstract

一种用于HEK293细胞的浓度梯度培养基组，包括培养时按时间顺序添加的基础培养基，补料培养基X，补料培养基Y，补料培养基Z；其中维生素，血清替代物中不同成分的浓度从基础培养基到补料培养基Z呈不同变化趋势，从而达到提高外源蛋白浓度、提高细胞稳定性、提高包装病毒滴度的效果。

Description

一种HEK293细胞组合梯度培养基及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体属于HEK293细胞培养基领域。
背景技术
越来越多的基因和免疫疗法获批进入临床试验，无血清培养基成为抗体及重组蛋白生产的主要细胞培养基。培养基一般而言使用一次性加入的方式进行细胞培养，但有些工程类细胞种类除了承担基础代谢，还需要承担人工引入外源物质代谢，与特定信号通路的激活有关，需要多种物质供应，然而一次性加入所有的物质以及直接达到最高浓度，可能会导致培养基渗透压过高，培养基过于黏稠，溶氧降低，影响细胞生长效率以及代谢物质活性。分批补料可一定程度上解决上述问题。
现有技术中已有类似研究，EP592692B1即公开了一种293菌株培养方法，在初始细胞培养时维持一定钙离子浓度，使细胞增殖到细胞密度为3倍左右时，向培养液中加入糖和钙，基本上抑制细胞密度的增加以维持蛋白质的产生，继续增加直到蛋白质浓度不再显著增加后停止培养。然而上述方法中细胞倾向于通过添加钙盐而聚集成团块，虽然细胞密度增加被抑制，然而实际培养中，有用蛋白的分泌依然一定程度上被抑制，并且影响溶氧，使得细胞生长状态下降；CN106754817A公开了293细胞的分批培养表达重组ATX的方法，利用FreeStyle293表达培养基扩大培养，在24h、48h、60h进行不同体积的补料，这种方式补料培养基都采用相同的成份，对于细胞不同的生长阶段没有针对性，对于外源蛋白的表达仍然没有明显的提高；CN102604889A法采用了适应无血清培养的HEK293细胞系，使用了渐进式浓度以及血清含量的培养基，但其仍然采用基本相同的成分，没有对具体营养成分进行梯度优化；崔玉等发现，在293细胞培养过程中，不同类型的氨基酸代谢随着时间有一定变化，葡萄糖对293培养也有一定重要作用且不能被其他成份代替，调整培养基成份和细胞数量可以提高细胞的生长速率，但该文章仅考察了氨基酸变量并且只进行了粗分类，也并没有给出明确的培养基成份。Leticia Liste-Calleja等发现使用分批培养基添加培养293细胞，可以提高细胞密度，但其仍然局限于血清浓度的优化以及逐步添加，并且细胞密度最高达到106数量级。
根据现有技术可知，HEK293细胞是抗体和重组蛋白表达的重要平台，但培养过程中，常常由于细胞株差异、环境差异等造成生长速度、密度、状态降低，限制了表达药物的质量和产量。分批添加培养基可改善这一状态，但现有技术中采用分批培养的技术仍然存在一定问题。因此优化分批次的293细胞培养基是亟待解决的问题。
发明内容
根据现有技术存在的问题，发明人欲针对293细胞培养基进行分批次培养基的优化，以期提高代谢产物活性。由于血清可能带来不明污染，已经逐步被血清替代物取代，一般包括转铁蛋白、类脂混合物、胰岛素或IGF-1、生长因子、激素等；在细胞生长代谢中，维生素不作为能源，而是作为细胞的组成成分。维生素作为维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢中起调节及控制作用，许多维生素参与构成各种酶的活性基团的成分。发明人经过研究发现，HEK293细胞培养基的常见成份中，糖类、无机盐、氨基酸基础性营养物质，分批次加入对于细胞培养状态影响较小，微量元素含量极低，因此上述物质一次性加入可维持细胞正常培养状态。而血清替代物的部分物质以及维生素，因参与细胞表达，在细胞代谢中起到调控和调节作用，其浓度、种类与细胞生长曲线、生长周期有密切的联系，由于细胞培养启动时有一个适应过程，此时对于部分成份直接将全浓度的营养成分加入，会抑制细胞代谢，影响产物活性，而对于部分成份先以低浓度加入又会影响细胞状态，因此在同一类物质中细胞的生长代谢过程中仍然因具体种类不同而产生代谢速度、吸收选择、浓度抑制、以及参与信号通路的不同，发明人以此为契机进行分批次培养基设计。通过观察HEK293细胞对于营养物质代谢速度、细胞生长状态以及代谢物质活性，将营养物质进行浓度分类，其中氨基酸、无机盐、糖、微量元素可一次性加入无需分批，而维生素类和部分血清替代品需进行不同浓度分批，基础培养基，补料培养基X，补料培养基Y，补料培养基Z四组培养基中的浓度，分为无、低浓度、维持浓度、中浓度、高浓度五个级别。其中基础培养基为启动培养基，补料培养基X-补料培养基Z总体而言属于维持性培养基，而补料培养基Z加入后可提高细胞代谢活性。
A类（高—中—维—维）：维生素B1，维生素B2，维生素B12，维生素C，维生素E ，烟酰胺，胰岛素， 转铁蛋白；
B类（低—维—中—高）：核黄素， 维生素K2，维生素K3 ，生物素， D-泛酸钙， 胆固醇， 牛血清白蛋白， 类脂混合物；
C类（无—低—维—中）：叶酸， 肌醇， 吡哆醇盐酸盐， 硫辛酸， 氯化胆碱；聚乙二醇，Primatone。
其中维持浓度，为通过记录细胞密度、观察细胞状态、测量代谢物质活性等方面综合考量，计算得出的细胞状态仅限于维持状态的浓度，高浓度为激发细胞活力的最高浓度。
本发明公开了一种培养基组，所述趋势分为三类，A类为高浓度-中浓度-维持浓度-维持浓度，涉及的营养成分包括维生素B1，维生素B2，维生素B12，维生素C，维生素E，烟酰胺，胰岛素，转铁蛋白；B类为低浓度-维持浓度-中浓度-高浓度，涉及的营养成分包括核黄素，维生素K2，维生素K3，生物素，D-泛酸钙，胆固醇，牛血清白蛋白，类脂混合物；C类为无-低浓度-维持浓度-中浓度，涉及的营养成分包括叶酸，肌醇，吡哆醇盐酸盐，硫辛酸，氯化胆碱，聚乙二醇，Primatone。
其中，所述外源蛋白为VEGF蛋白、或寨卡病毒的M蛋白；所述病毒为表达猪瘟病毒E2蛋白的重组腺病毒。
本发明还公开了一种HEK293细胞培养方法，使用本发明所公开的基础培养基复苏HEK293细胞，12h后更换为补料培养基X，继续培养36h后传代使用补料培养基Y，继续培养36h后传代使用补料培养基Z，其中，每次传代细胞接种密度为1-2×106/ml。具体步骤为：
步骤1：将冻存的HEK293细胞在基础培养基中复苏，复苏条件为37℃，5%CO2，使用权利要求1-5任一项所述的培养基组中基础培养基进行复苏，保持细胞状态；
步骤2：对细胞进行计数，观察细胞活率，当复苏活率可达70%以上时，和/或培养时间达到12h，更换为补料培养基X，用于使细胞适应培养环境，继续培养计算细胞活率，当大于95%且判断细胞处于对数期时，和/或继续培养时间36h后，开始使用本发明优化的补料培养基Y，继续培养36h传代培养，使用补料培养基Z，保证细胞一直位于对数生长期，接种密度为1-2×106/ml；
步骤3：当细胞密度达到约3-4×106时，将细胞以3×106/ml的密度接种到六孔板中培养过夜；
步骤4：准备转染质粒1-2mg/ml，转染试剂PEI 2-4mg/ml，用本发明优化的补料培养基Z稀释转染质粒，使用涡旋振荡仪混匀后，加入六孔板中，并补入补料培养基Z进行培养；
步骤5：37℃，5%CO2条件进行孵育72h后，采用0.25%胰酶消化，1500rpm/min离心收集细胞；
步骤6：收获细胞和表达产物，检测细胞培养液中目的蛋白的浓度。
根据细胞状态优化出需梯度添加的营养物质最高浓度：（单位mg/L）
A类：维生素B1 10，B2 1，B12 2，维生素C 10，维生素E 2，烟酰胺 0.7；胰岛素20；转铁蛋白 20；
B类：核黄素 0.5，维生素K2 1，K3 1，生物素0.01，D-泛酸钙 10；胆固醇 200；牛血清白蛋白100；类脂混合物0.5%v/v；
C类：叶酸0.02；肌醇 0.05；吡哆醇盐酸盐0.05；硫辛酸0.5；氯化胆碱0.06；聚乙二醇0.08 Primatone 5000。
根据上述浓度优化，形成基础培养基，补料培养基X，补料培养基Y，补料培养基Z四组培养基，用于HEK293细胞培养。
表1 梯度优化培养基组（单位：mg/L）
基础培养基 补料培养基X 补料培养基Y 补料培养基Z
氨基酸
精氨酸 100-300 100-300 100-300 100-300
丙氨酸 0-30 0-30 0-30 0-30
谷氨酸 100-200 100-200 100-200 100-200
天冬酰胺 50-200 50-200 50-200 50-200
天冬氨酸 50-250 50-250 50-250 50-250
胱氨酸 10-500 10-500 10-500 10-500
半胱氨酸 100-200 100-200 100-200 100-200
甘氨酸 50-100 50-100 50-100 50-100
组氨酸 300-600 300-600 300-600 300-600
异亮氨酸 100-500 100-500 100-500 100-500
亮氨酸 800-1200 800-1200 800-1200 800-1200
赖氨酸 700-1500 700-1500 700-1500 700-1500
甲硫氨酸 100-300 100-300 100-300 100-300
苯丙氨酸 100-300 100-300 100-300 100-300
脯氨酸 0-50 0-50 0-50 0-50
丝氨酸 100-500 100-500 100-500 100-500
苏氨酸 100-300 100-300 100-300 100-300
谷氨酰胺 100-8000 100-8000 100-8000 100-8000
缬氨酸 10-500 10-500 10-500 10-500
酪氨酸 100-800 100-800 100-800 100-800
色氨酸 50-150 50-150 50-150 50-150
无机盐
MgSO<sub>4</sub> 30-60 30-60 30-60 30-60
MgCl<sub>2</sub> 50-100 50-100 50-100 50-100
NaCl 100-200 100-200 100-200 100-200
CaCl<sub>2</sub> 10-200 10-200 10-200 10-200
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>.2H<sub>2</sub>O 50-100 50-100 50-100 50-100
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>.2H<sub>2</sub>O 50-100 50-100 50-100 50-100
C<sub>3</sub>H<sub>3</sub>NaO<sub>3</sub> 10-50 10-50 10-50 10-50
微量元素
CuSO<sub>4</sub>.5H<sub>2</sub>O 0.001-0.01 0.001-0.01 0.001-0.01 0.001-0.01
AlCl<sub>3</sub> 0.005-0.05 0.005-0.05 0.005-0.05 0.005-0.05
CoCl<sub>2</sub>.6H<sub>2</sub>O 0.001-0.01 0.001-0.01 0.001-0.01 0.001-0.01
Na<sub>2</sub>SeO<sub>3</sub> 0.001-0.05 0.001-0.05 0.001-0.05 0.001-0.05
NiCl<sub>2</sub> 0.001-0.01 0.001-0.01 0.001-0.01 0.001-0.01
MnCl<sub>2</sub> 0.005-0.5 0.005-0.5 0.005-0.5 0.005-0.5
ZnSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O 0.005-0.05 0.005-0.05 0.005-0.05 0.005-0.05
FeSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O 0.005-0.05 0.005-0.05 0.005-0.05 0.005-0.05
糖
葡萄糖 1000-5000 1000-5000 1000-5000 1000-5000
葡聚糖 1-100 1-100 1-100 1-100
维生素
维生素B1 9.8-10.2 5.5-9.8 4.5-5.5 4.5-5.5
维生素B2 0.8-1.2 0.52-0.8 0.48-0.52 0.48-0.52
维生素B12 1.8-2.2 1.2-1.8 0.8-1.2 0.8-1.2
维生素C 9.8-10.2 5.2-9.8 4.8-5.2 4.8-5.2
维生素E 1.8-2.2 1.2-1.8 0.8-1.2 0.8-1.2
烟酰胺 0.65-0.75 0.37-0.65 0.33-0.37 0.33-0.37
核黄素 0.1-0.2 0.2-0.3 0.3-0.48 0.48-0.52
维生素K2 0.1-0.3 0.3-0.6 0.6-0.8 0.8-1.2
维生素K3 0.1-0.3 0.3-0.6 0.6-0.8 0.8-1.2
生物素 0.001-0.003 0.003-0.006 0.006-0.008 0.008-0.012
D-泛酸钙 2-3 3-6 6-9 9-11
叶酸 0 0.003-0.006 0.008-0.015 0.018-0.022
肌醇 0 0.015-0.02 0.02-0.03 0.048-0.052
吡哆醇盐酸盐 0 0.012-0.02 0.02-0.03 0.048-0.052
硫辛酸 0 0.12-0.2 0.2-0.4 0.48-0.52
氯化胆碱 0 0.014-0.02 0.02-0.05 0.055-0.065
血清替代物
胰岛素 18-22 12-18 9-11 9-11
转铁蛋白 18-22 12-18 9-11 9-11
胆固醇 47-53 90-110 110-190 190-210
牛血清白蛋白 34-36 45-55 55-95 95-105
类脂混合物 0 0.1-0.2%v/v 0.2-0.4%v/v 0.4-0.6%v/v
Primatone 0 1700-1900 1900-4800 4800-5200
聚乙二醇 0 0.03-0.04 0.04-0.07 0.07-0.09
表2 类脂混合物成分：（单位：mg/L）
油酸 5-20
亚油酸 5-20
亚麻酸 5-20
棕榈酸 5-20
吐温 80-2000
FluronicF-68 1100000-1300000
豆蔻酸 5-20
硬脂酸 5-20
DL-醋酸-生育酚 70-80
乙醇胺 10-25
有益效果
现有技术中虽然存在梯度添加培养基用于驯化的技术方案，但一般都基于血清浓度变化，而且一般而言都是逐级增高。而发明人发现，维生素、血清替代物中不同的成分，在细胞成长的不同阶段，对于细胞的活性有不同的影响，并非所有成分都阶段性增加更有利于细胞生长。将维生素中、血清替代物中的不同成分进行优化，分出高浓度、中浓度、维持浓度、低浓度、无的五个梯度，并在基础培养基和补料培养基X-3共4套培养基中以不同的浓度变化趋势出现，充分激活细胞信号通路，实现了提高细胞稳定性，提高代谢蛋白活性、包装病毒滴度的技术效果。
附图说明
图1 体外蛋白表达检测蛋白浓度（单位mg/L）。
图2 HEK293细胞形态学照片。
图3 HEK293细胞20代次培养生产病毒用时（单位：小时）。
图4 HEK293细胞20代次培养病毒滴度（单位-lgTCID50）。
图5 细胞培养间隔优化。
图6 细胞接种密度优化。
具体实施方式
实施例1 组合梯度培养基-高浓度培养基-市售培养基配置
1）梯度添加组合培养基的配置
表3梯度添加组合培养基配方（单位：mg/L）
基础培养基 补料培养基X 补料培养基Y 补料培养基Z
氨基酸
精氨酸 125 125 125 125
丙氨酸 12.5 12.5 12.5 12.5
谷氨酸 135.8 135.8 135.8 135.8
天冬酰胺 186.7 186.7 186.7 186.7
天冬氨酸 128.5 128.5 128.5 128.5
胱氨酸 386 386 386 386
半胱氨酸 118 118 118 118
甘氨酸 78.5 78.5 78.5 78.5
组氨酸 301 301 301 301
异亮氨酸 267.1 267.1 267.1 267.1
亮氨酸 287 287 287 287
赖氨酸 232.5 232.5 232.5 232.5
甲硫氨酸 132 132 132 132
苯丙氨酸 108 108 108 108
脯氨酸 17 17 17 17
丝氨酸 101.5 101.5 101.5 101.5
苏氨酸 108 108 108 108
谷氨酰胺 489 489 489 489
缬氨酸 98 98 98 98
酪氨酸 109 109 109 109
色氨酸 52 52 52 52
无机盐
MgSO<sub>4</sub> 47.5 47.5 47.5 47.5
MgCl<sub>2</sub> 57.2 57.2 57.2 57.2
NaCl 183 183 183 183
CaCl<sub>2</sub> 15 15 15 15
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>.2H<sub>2</sub>O 78 78 78 78
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>.2H<sub>2</sub>O 72 72 72 72
C<sub>3</sub>H<sub>3</sub>NaO<sub>3</sub> 22.5 22.5 22.5 22.5
微量元素
CuSO<sub>4</sub>.5H<sub>2</sub>O 0.01 0.01 0.01 0.01
AlCl<sub>3</sub> 0.02 0.02 0.02 0.02
CoCl<sub>2</sub>.6H<sub>2</sub>O 0.005 0.005 0.005 0.005
Na<sub>2</sub>SeO<sub>3</sub> 0.028 0.028 0.028 0.028
NiCl<sub>2</sub> 0.035 0.035 0.035 0.035
MnCl<sub>2</sub> 0.28 0.28 0.28 0.28
ZnSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O 0.013 0.013 0.013 0.013
FeSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O 0.038 0.038 0.038 0.038
糖
葡萄糖 5000 5000 5000 5000
葡聚糖 80 80 80 80
维生素
维生素B1 10 8 5 5
维生素B2 1 0.8 0.5 0.5
维生素B12 2 1.6 1 1
维生素C 10 8.5 5 5
维生素E 2 1.5 1 1
烟酰胺 0.7 0.65 0.35 0.35
核黄素 0.2 0.3 0.32 0.5
维生素K2 0.2 0.5 0.78 1
维生素K3 0.2 0.5 0.7 1
生物素 0.003 0.005 0.007 0.01
D-泛酸钙 3 5 8.3 10
叶酸 0 0.003 0.01 0.02
肌醇 0 0.015 0.025 0.05
吡哆醇盐酸盐 0 0.018 0.025 0.05
硫辛酸 0 0.12 0.25 0.5
氯化胆碱 0 0.014 0.03 0.06
血清替代物
胰岛素 20 17 10 10
转铁蛋白 20 18 10 10
胆固醇 50 100 150 200
牛血清白蛋白 35 50 75 100
类脂混合物 0 0.15%v/v 0.25%v/v 0.5%v/v
Primatone 0 1800 2500 5000
聚乙二醇 0 0.032 0.04 0.08
表4类脂混合物成分：（单位：mg/L）
油酸 15
亚油酸 15
亚麻酸 15
棕榈酸 15
吐温 1800
FluronicF-68 1200000
豆蔻酸 15
硬脂酸 15
DL-醋酸-生育酚 75
乙醇胺 12
2) 购买商用GIBCO培养基作为B组。
3) 按照以下配方进行培养基配置，即浓度均采用高浓度，培养时一次性加入，补液也相同-即对照组C组，其中类脂混合物配方同表4。
表5 高浓度培养基C组（单位：mg/L）
Figure DEST_PATH_IMAGE001
Figure DEST_PATH_IMAGE002
实施例2：组合培养基的外源蛋白表达、病毒包装实验
1）体外表达VEGF外源蛋白
步骤1：将冻存的HEK293细胞在基础培养基中复苏（细胞购自GIBCO公司），复苏条件为37℃，5%CO2；步骤2：对细胞进行计数，观察细胞活率，当复苏活率可达70%以上时，和/或培养时间达到12h，更换为补料培养基X，用于使细胞适应培养环境，继续培养计算细胞活率，当大于95%且判断细胞处于对数期时，和/或继续培养时间36h后，开始使用本发明优化的补料培养基Y，继续培养36h传代培养，使用补料培养基Z，保证细胞一直位于对数生长期，接种密度为1-2×106/ml；
步骤3：当细胞密度达到约3-4×106时，将细胞以3×106/ml的密度接种到六孔板中培养过夜；
步骤4：准备转染质粒:1-2mg/ml，转染试剂PEI 2-4mg/ml，用本发明优化的补料培养基Z稀释转染质粒，使用涡旋振荡仪混匀后，加入六孔板中，并补入补料培养基Z进行培养；
步骤5：37℃，5%CO2条件进行孵育72h后，采用0.25%胰酶消化，1500rpm/min离心收集细胞；
步骤6：收获细胞和表达产物，检测细胞培养液中目的蛋白的浓度。
对比例1：
步骤和上述相同，全程采用GIBCO商用培养基-B组培养基。
对比例2：
步骤和上述相同，全程采用对照组高浓度培养基-C组培养基。
2) 体外表达寨卡病毒抗原M蛋白
步骤与上述实施例相同，使用重组穿梭质粒pShuttle2-CMV-JE-prM-E，表达寨卡病毒抗原M蛋白（构建方法参见CN111088271A将其构建方法在此全部引入作为参考）。
对比例1：
步骤和上述相同，全程采用GIBCO商用培养基-B组培养基。
对比例2：
步骤和上述相同，全程采用对照组高浓度培养基-C组培养基。
3) 体外表达含有IL-17胞外域的外源蛋白
步骤与上述实施例相同，使用pME18X载体，引入外源基因，构建表达所需蛋白的质粒 pME18X-N-FLAG ILT7，表达含有IL-17胞外域的外源蛋白（构建方法参见CN110776566A，将其构建方法再次全部引入作为参考）。
对比例1：
步骤和上述相同，全程采用GIBCO商用培养基-B组培养基。
对比例2：
步骤和上述相同，全程采用对照组高浓度培养基-C组培养基。
表6 体外蛋白表达检测蛋白浓度（单位：mg/L）
VEGF 寨卡病毒M蛋白 含有IL-17胞外域的外源蛋白
A组-梯度培养基 1085 795 409
B组-GIBCO培养基 803 589 352
C组-高浓度培养基 586 605 308
结果见图1，可见梯度培养基可明显提高不同种类外源蛋白活性。
4）用于腺病毒包装
HEK293细胞培养方法同1），当细胞加入六孔板后，接种重组腺病毒rADV-SFV-E2，滴度104TCID50 /ml，继续培养46h后收获细胞，用4%甲醛固定10-30min，0.1-0.3TritonX100处理10min，加入抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体HQ05，室温孵育1h，再加入FITC标记的羊抗鼠IgG（1:100），在荧光显微镜下观察细胞形态学，通过有限稀释法计算病毒滴度。
结果
1 形态学
从加入本发明优化的培养基后开始使用显微镜观察细胞形态和生长状态，在使用补充培养基X之前，细胞生长状态良好，在使用补充培养基X、Y后细胞生长速度加快，平均传代72h左右，细胞逐渐呈现悬浮状态，静止培养时呈现细胞团块，可适应本发明优化的细胞培养基。
结果参见图2，左图为快速生长图，右图为细胞病变呈悬浮状态。
2 细胞稳定性
细胞连续传代20次，每代次细胞按照上述方法测定病毒滴度，期间统计病变所需时间、以及每代次病毒滴度，计算平均值。结果显示，采用A组梯度培养基，平均病变时间、平均病毒滴度，稳定性较好，20代次趋势相对平稳，标准差较B组C组均较低；且采用本发明使用的梯度培养基，可提高细胞增殖腺病毒能力，较B组-GIBCO商用培养基生产病毒时间平均减少10.2%，较C组-高浓度培养基生产病毒时间平均减少13.4%；病毒滴度，较B组-GIBCO商用培养基，病毒滴度提高73.7%，较C组-高浓度培养基，病毒滴度提高118%。结果见表7-9 ，图3-4。
表7 HEK293细胞20代次培养生产病毒用时（单位：h）
A组 B组 C组
F1 101.9 109 118.2
F2 99.2 107.3 110.2
F3 94.6 109.3 102.5
F4 102.3 105.8 120.8
F5 96.2 115.5 118.6
F6 99.5 99.9 107.6
F7 97 100.3 119.3
F8 101.1 109.2 109.6
F9 97.8 102.6 111.6
F10 102.4 106.5 106.7
F11 95.1 100.2 119.3
F12 96.8 116.3 108.4
F13 95.8 115.2 113.9
F14 96.2 107.6 104.6
F15 99.9 111.3 118.3
F16 95.9 109.2 106.7
F17 97 106.7 109.7
F18 94.9 110.9 116.7
F19 95.6 109.8 116.9
F20 99.8 110.7 119.6
表8 HEK293细胞20代次培养病毒滴度（单位-lgTCID50）
A组 B组 C组
F1 8.15 7.67 7.25
F2 7.95 7.85 7.55
F3 8 7.56 7.29
F4 8.01 7.74 7.99
F5 8.28 7.95 7.65
F6 7.98 8.01 8.08
F7 8.03 8.03 7.65
F8 8.44 7.68 7.46
F9 8.03 8.04 8.01
F10 7.88 7.56 7.48
F11 8.05 8.01 8.12
F12 8.32 8.03 8.12
F13 8.01 7.59 7.86
F14 8.22 7.66 8.01
F15 7.99 7.98 8.03
F16 8.03 8.04 7.65
F17 7.99 7.98 7.66
F18 8.02 7.65 7.95
F19 8.11 7.96 7.35
F20 7.89 7.44 7.41
表9 HEK293细胞传代20代次平均病变时间和平均病毒滴度
平均病变时间（h） 平均病毒滴度（TCID<sub>50</sub>/ml）
A组-梯度培养基 97.95±4.05 10<sup>8.06±0.38</sup>
B组-GIBCO培养基 108.17±9.10 10<sup>7.82±0.22</sup>
C组-高浓度培养基 112.96±10.80 10<sup>7.72±0.40</sup>
实施例3 组合梯度培养基的培养条件优化
以体外表达VEGF蛋白作为判断标准，优化293细胞培养参数
1）培养时间间隔优化
参考实施例2 VEGF蛋白表达步骤，
表10 培养时间间隔优化
加入基础培养基 加入补料培养基X 加入补料培养基Y 加入补料培养基Z
对比例1 细胞复苏 10h 24h 24h
对比例2 细胞复苏 12h 36h 36h
对比例3 细胞复苏 16h 48h 48h
对比例4 细胞复苏 24h 72h 72h
结果参见图5，结果可知，对比例2复苏时间12h，后续稳定传代时间2.5天，获得蛋白浓度较高，发明人还实验了其他外源蛋白，结果基本相同，在此省略数据。
2）细胞密度
将传代细胞接种密度进行优化，选择不同的细胞接种密度，用于传代时细胞计数后选择特定密度进行接种，其中细胞培养间隔采用上述对比例2。
表11 细胞密度优化
接种密度 VEGF蛋白浓度
0.5×10<sup>6</sup>/ml 988
1×10<sup>6</sup>/ml 1069
1.5×10<sup>6</sup>/ml 1073
2×10<sup>6</sup>/ml 1070
2.5×10<sup>6</sup>/ml 975
3×10<sup>6</sup>/ml 889
结果显示，1-2×106/ml结果没有显著差异，而低于1×106/ml和大于2×106/ml，因此使用1-2×106/ml的细胞接种密度可有利于外源蛋白表达。

Claims (11)

1.一种培养基组，包括按时间顺序添加的基础培养基、补料培养基X、补料培养基Y、补料培养基Z，所述培养基组的成分包括基础成分氨基酸、无机盐、微量元素、糖、维生素、血清替代物，其特征在于，所述维生素和血清替代物中各组分浓度，从基础培养基到补料培养基Z，其浓度变化呈现不同的趋势。
2.根据权利要求1所述的培养基组，其特征在于，所述浓度趋势分为无、低浓度、维持浓度、中浓度、高浓度五个级别，使得维生素和血清替代物的不同组分在从基础培养基到补料培养基Z中呈现浓度升高和/或浓度降低的趋势。
3.根据权利要求2所述的培养基组，其特征在于，所述趋势分为三类，A类为高浓度-中浓度-维持浓度-维持浓度，涉及的营养成分包括维生素B1，维生素B2，维生素B12，维生素C，维生素E，烟酰胺，胰岛素，转铁蛋白；B类为低浓度-维持浓度-中浓度-高浓度，涉及的营养成分包括核黄素，维生素K2，维生素K3，生物素，D-泛酸钙，胆固醇，牛血清白蛋白，类脂混合物；C类为无-低浓度-维持浓度-中浓度，涉及的营养成分包括叶酸，肌醇，吡哆醇盐酸盐，硫辛酸，氯化胆碱，聚乙二醇，Primatone。
4.根据权利要求3所述的培养基组，其特征在于，以mg/L为单位，所述培养基组中的维生素和血清替代物配方为：
维生素 基础培养基 补料培养基X 补料培养基Y 补料培养基Z 维生素B1 9.8-10.2 5.5-9.8 4.5-5.5 4.5-5.5 维生素B2 0.8-1.2 0.52-0.8 0.48-0.52 0.48-0.52 维生素B12 1.8-2.2 1.2-1.8 0.8-1.2 0.8-1.2 维生素C 9.8-10.2 5.2-9.8 4.8-5.2 4.8-5.2 维生素E 1.8-2.2 1.2-1.8 0.8-1.2 0.8-1.2 烟酰胺 0.65-0.75 0.37-0.65 0.33-0.37 0.33-0.37 核黄素 0.1-0.2 0.2-0.3 0.3-0.48 0.48-0.52 维生素K2 0.1-0.3 0.3-0.6 0.6-0.8 0.8-1.2 维生素K3 0.1-0.3 0.3-0.6 0.6-0.8 0.8-1.2 生物素 0.001-0.003 0.003-0.006 0.006-0.008 0.008-0.012 D-泛酸钙 2-3 3-6 6-9 9-11 叶酸 0 0.003-0.006 0.008-0.015 0.018-0.022 肌醇 0 0.015-0.02 0.02-0.03 0.048-0.052 吡哆醇盐酸盐 0 0.012-0.02 0.02-0.03 0.048-0.052 硫辛酸 0 0.12-0.2 0.2-0.4 0.48-0.52 氯化胆碱 0 0.014-0.02 0.02-0.05 0.055-0.065 血清替代物 基础培养基 补料培养基X 补料培养基Y 补料培养基Z 胰岛素 18-22 12-18 9-11 9-11 转铁蛋白 18-22 12-18 9-11 9-11 胆固醇 47-53 90-110 110-190 190-210 牛血清白蛋白 34-36 45-55 55-95 95-105 类脂混合物 0 0.1-0.2%v/v 0.2-0.4%v/v 0.4-0.6%v/v Primatone 0 1700-1900 1900-4800 4800-5200 聚乙二醇 0 0.03-0.04 0.04-0.07 0.07-0.09
。
5.根据权利要求4所述的培养基组，其特征在于，以mg/L为单位，所述培养基组中的维生素和血清替代物配方为：
维生素 基础培养基 补料培养基X 补料培养基Y 补料培养基Z 维生素B1 10 8 5 5 维生素B2 1 0.8 0.5 0.5 维生素B12 2 1.6 1 1 维生素C 10 8.5 5 5 维生素E 2 1.5 1 1 烟酰胺 0.7 0.65 0.35 0.35 核黄素 0.2 0.3 0.32 0.5 维生素K2 0.2 0.5 0.78 1 维生素K3 0.2 0.5 0.7 1 生物素 0.003 0.005 0.007 0.01 D-泛酸钙 3 5 8.3 10 叶酸 0 0.003 0.01 0.02 肌醇 0 0.015 0.025 0.05 吡哆醇盐酸盐 0 0.018 0.025 0.05 硫辛酸 0 0.12 0.25 0.5 氯化胆碱 0 0.014 0.03 0.06 血清替代物 基础培养基 补料培养基X 补料培养基Y 补料培养基Z 胰岛素 20 17 10 10 转铁蛋白 20 18 10 10 胆固醇 50 100 150 200 牛血清白蛋白 35 50 75 100 类脂混合物 0 0.15%v/v 0.25%v/v 0.5%v/v Primatone 0 1800 2500 5000 聚乙二醇 0 0.032 0.04 0.08
。
6.根据权利要求1-5任一项所述的培养基组用于HEK293细胞在体外瞬时表达外源蛋白的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述外源蛋白为VEGF蛋白、或寨卡病毒的M蛋白。
8.根据权利要求1-5任一项所述的培养基组用于HEK293细胞在体外进行病毒包装的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述病毒为表达猪瘟病毒E2蛋白的重组腺病毒。
10.一种HEK293细胞培养方法，其特征在于，使用权利要求1-5任一项所述的培养基组，使用基础培养基复苏HEK293细胞，12h后更换为补料培养基X，继续培养36h后传代使用补料培养基Y，继续培养36h后传代使用补料培养基Z，其中，每次传代细胞接种密度为1-2×106/ml。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，具体步骤为：
步骤1：将冻存的HEK293细胞在基础培养基中复苏，复苏条件为37℃，5%CO2，使用权利要求1-5任一项所述的培养基组中基础培养基进行复苏，保持细胞状态；
步骤2：对细胞进行计数，观察细胞活率，当复苏活率可达70%以上时，和/或培养时间达到12h，更换为补料培养基X，用于使细胞适应培养环境，继续培养计算细胞活率，当大于95%且判断细胞处于对数期时，和/或继续培养时间36h后，开始使用补料培养基Y，继续培养36h传代培养，使用补料培养基Z，保证细胞一直位于对数生长期，接种密度为1-2×106/ml；
步骤3：当细胞密度达到约3-4×106时，将细胞以3×106/ml的密度接种到六孔板中培养过夜；
步骤4：准备转染质粒1-2mg/ml，转染试剂PEI 2-4mg/ml，用补料培养基Z稀释转染质粒，使用涡旋振荡仪混匀后，加入六孔板中，并补入补料培养基Z进行培养；
步骤5：37℃，5%CO2条件进行孵育72h后，采用0.25%胰酶消化，1500rpm/min离心收集细胞；
步骤6：收获细胞和表达产物，检测细胞培养液中目的蛋白的浓度。
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