CN106062205A - 细胞培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明大体上涉及一种培养基，例如血清替代物、培养基补充物、完全培养基或低温保存培养基，所述培养基包含基础生理缓冲剂和包含胆固醇、卵磷脂以及脂肪酸的脂质体。预期与不使用本文中所描述的血清替代物培养的细胞相比，培养基提供改良的培养中细胞生长的优点。

Description

细胞培养基
本申请要求2013年12月20日提交的美国临时专利申请第61/918,833号的优先权，所述临时专利申请以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明大体上涉及一种细胞培养基组合物，例如血清替代物、完全培养基或培养基补充物，其包含热力学稳定脂质体和液体基础混合物以在无血清环境中培养细胞。预期脂质体包含胆固醇和卵磷脂以及脂肪酸。也预期包含脂质体的低温保存培养基，其用于在冷冻期间保存细胞。
背景技术
用于体外实验或离体培养以投予人类或动物的细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)培养为人类疾病研究和治疗的一种重要工具。细胞培养广泛用于生产各种生物活性产品，如病毒疫苗、单克隆抗体、多肽生长因子、激素、酶以及肿瘤特异性抗原。然而，用于培养细胞的许多培养基或方法包含可能对细胞生长和/或未分化细胞培养物的维持具有负面影响的组分。举例来说，哺乳动物或昆虫细胞培养基常常补充有来自血液的血清，如小牛血清(fetal calf serum；FCS)或胎牛血清(fetal bovine serum；FBS)，以便提供促进细胞在培养物中增殖和生长的生长因子、载体蛋白、附着和扩散因子、养分以及微量元素。然而，在FCS或FBS中发现的因子(如转型生长因子(transforming growth factor；TGF)β或网膜酸)可促进特定细胞类型分化(Ke等人,《美国病理学杂志(Am J Pathol.)》137:833-43,1990)或引发细胞中可促进培养物中非所需细胞活性的不希望的下游信号传导(Veldhoen等人,《自然免疫学(Nat Immunol.)》7(11)：1151-6,2006)。
血清组合物的非典型性和血清的批间差异使得无血清培养基中血清替代物和培养物的使用为理想的(Pei等人,《男科学集刊(Arch Androl.)》49(5):331-42,2003)。另外，由于在向人体投予时潜在的病毒污染和/或动物蛋白的潜在免疫原性效应，因此对于在细胞培养物中生长的用于治疗用途的细胞、重组蛋白或疫苗来说，添加来源于动物的组分为不希望的。
已经研发血清替代物以尝试最小化FCS对细胞培养的影响，以及最小化用于人类细胞培养的动物蛋白的量。如KNOCKOUTTM血清替代物(Invitrogen,Carlsbad,CA)的血清替代物称为化学成分确定的培养基，其缺乏血清且含有用于细胞生长的基本养分和其它蛋白质。由于缺乏附着因子，使得此调配物中细胞附着不充分，因此KNOCKOUT SRTM无法用作饲养细胞平板培养中的FBS的替代物。PC-1TM无血清培养基(Lonza,Walkersville,MD)为在特殊改性DMEM/F12培养基基础中调配的低蛋白无血清培养基且含有具有已知量的胰岛素、转铁蛋白、脂肪酸以及专有蛋白质的完全HEPES缓冲系统。
Cellgro COMPLETETM(Cellgro,Manassas,VA)为基于DMEM/F12、RPMI 1640以及麦克柯伊氏(McCoy's)5A基础培养基混合物的无血清低蛋白培养基。Cellgro COMPLETETM不含胰岛素、转铁蛋白、胆固醇、生长或附着因子，但包含微量元素和高分子量碳水化合物、附加维生素、非动物蛋白源以及牛血清白蛋白的混合物。
无血清培养基也描述于国际专利公开案第WO2009023194号、国际专利公开案第WO2008137641号、国际专利公开案第WO2006017370号、国际专利公开案第WO2001011011号、国际专利公开案第WO2007071389号、国际专利公开案第WO2007016366号、国际专利公开案第WO2006045064号、国际专利公开案第WO2003064598号、国际专利公开案第WO2001011011号；美国专利公开案第US20050037492号、美国专利公开案第US20080113433号、美国专利公开案第US20080299540号；美国专利第4,560,655号、美国专利第5,324,666号、美国专利第6,162,643号、美国专利第6,103,529号、美国专利第6,048,728号、美国专利第7,709,229号以及欧洲专利申请第EP2243827号中。
美国专利7,220,538描述一种包含亲脂性纳米粒子和基础营养培养基的细胞培养基。
发明内容
本发明提供一种包含基础生理缓冲剂液体混合物和包含胆固醇、卵磷脂以及脂肪酸的脂质体的培养基，其可用作血清替代物、完全培养基或培养基补充物。所述培养基适用于促进初生细胞或细胞系在细胞培养物中存活、生长和增殖，其中所述培养基包含具有有助于细胞维持和生长的脂质形态的脂质体。也预期包含脂质体的低温保存培养基。
在各种实施例中，本发明提供一种用于悬浮液或贴壁培养物中的细胞的培养基，所述培养基包含：基础生理缓冲剂液体混合物；和(a)包含胆固醇、卵磷脂以及脂肪酸的脂质体，其中所述脂质体的量使得胆固醇在细胞悬浮液或贴壁培养物中的最终浓度为1毫克/升到20毫克/升，且其中卵磷脂在细胞悬浮液或贴壁培养物中的最终浓度为100毫克/升到1000毫克/升；或(b)果胶；或(a)和(b)。
在各种实施例中，脂质体包含脂质、脂肪酸、固醇和/或游离脂肪酸。示例性脂肪酸包括(但不限于)次亚麻油酸、亚麻油酸、肉豆蔻酸、油酸肉豆蔻油酸、棕榈油酸、十六碳烯酸、反油酸、异油酸、反亚油酸、α-次亚麻油酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、芥子酸、二十二碳六烯酸、辛酸、癸酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、二十烷酸、二十二烷酸、二十四烷酸以及蜡酸。在各种实施例中，脂质体包含一或多种由次亚麻油酸、亚麻油酸、肉豆蔻酸以及油酸所构成的群组中选出的脂肪酸。
在各种实施例中，脂质体进一步包含乙醇胺和聚山梨醇酯。在各种实施例中，脂质体包含抗氧化剂。
在各种实施例中，基础生理缓冲剂液体混合物包含有机盐、无机盐、缓冲剂、铁源或铁转运体、甘油、氨基酸、维生素、糖以及微量元素中的一或多者。任选地，基础生理缓冲剂液体混合物包含抗氧化剂。
在各种实施例中，铁源或铁转运体是由以下各者所构成的群组中选出：转铁蛋白、乳铁蛋白、硫酸亚铁、柠檬酸亚铁、柠檬酸铁、硝酸铁、硫酸铁、柠檬酸铁铵、草酸铁铵、反丁烯二酸铁铵、苹果酸铁铵以及丁二酸铁铵。
在各种实施例中，基础生理缓冲剂液体混合物包含一或多种由以下各者所构成的群组中选出的氨基酸：甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-瓜氨酸、盐酸L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸以及L-缬氨酸。
在各种实施例中，基础生理缓冲剂液体混合物包含一或多种由以下各者所构成的群组中选出的有机盐或无机盐：磷酸钾、氯化钙(无水)、硫酸铜、硝酸铁、硫酸铁、氯化镁(无水)、硫酸镁(无水)、氯化钾、氯化钠、无水磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化锡、硫酸锌以及碳酸氢钠。
在各种实施例中，脂质体或基础生理缓冲剂液体混合物包含一或多种抗氧化剂。示例性抗氧化剂包括(但不限于)生育酚、生育三烯酚、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、α-生育醌、水溶性维生素E(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-甲酸)、丁基化羟基甲氧苯(butylated hydroxyanisole；BHA)、丁基化羟基甲苯(butylated hydroxytoluene；BHT)、类黄酮、异黄酮、西红柿红素、β-胡萝卜素、硒、泛醌、梅毒菌素、S-腺苷甲硫氨酸、谷胱甘肽、牛磺酸、N-乙酰半胱氨酸、柠檬酸、L-肉碱、BHT、单硫代甘油、抗坏血酸、没食子酸丙酯、甲硫氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽、胱胺和胱硫醚(cysstathionine)以及甘氨酸-甘氨酸-组氨酸(三肽)。
在各种实施例中，基础生理缓冲剂液体混合物包含一或多种由以下各者所构成的群组中选出的维生素：生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟碱酰胺、盐酸吡哆醇、双黄素(biboflavin)、盐酸硫胺、维生素B12以及异肌醇。
在各种实施例中，基础生理缓冲剂液体混合物包含一或多种由以下各者所构成的群组中选出的微量元素：硒、钼酸盐、铬、钴、镍、锌、铜、锰、钡、镓、锂、锡、钛、溴、碘、钒、锗、钼、硅、铁、氟、银、铷、锆、镉以及铝。在各种实施例中，液体混合物包含硒和钼酸盐。
在各种实施例中，培养基为血清替代物、完全培养基、培养基补充物或低温保存培养基。
在各种实施例中，用于细胞培养的血清替代物、完全培养基或培养基补充物包含脂质体和基础生理缓冲剂液体混合物。任选地，完全培养基或培养基补充物包含果胶。在各种实施例中，血清替代物、完全培养基或培养基补充物进一步包含基础生理缓冲剂液体混合物，其包含一或多种有机盐或无机盐、铁供体，且任选地包含果胶、甘油、氨基酸、维生素、糖、有机盐、无机盐以及微量元素。
在各种实施例中，本发明也提供包含脂质体和基础生理缓冲剂液体混合物的血清替代物、完全培养基或培养基补充物，其中脂质体包含卵磷脂、乙醇胺、次亚麻油酸、亚麻油酸、胆固醇以及聚山梨醇酯，且基础液体混合物包含至少一种有机盐或无机盐、至少一种糖、甘油、至少一种微量元素、至少一种非离子表面活性剂以及至少一种铁源。在各种实施例中，脂质体或基础液体混合物包含至少一种抗氧化剂。
在各种实施例中，对于本文中所描述的血清替代物、完全培养基或培养基补充物，脂质体的量使得胆固醇在细胞悬浮液或贴壁培养物中的最终浓度为1毫克/升到20毫克/升，且其中卵磷脂在细胞悬浮液或贴壁培养物中的最终浓度为100毫克/升到1000毫克/升。
在各种实施例中，脂质体包含一或多种由次亚麻油酸、亚麻油酸、肉豆蔻酸以及油酸所构成的群组中选出的脂肪酸。预期的额外脂肪酸包括(但不限于)肉豆蔻油酸、棕榈油酸、十六碳烯酸、反油酸、异油酸、反亚油酸、α-次亚麻油酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、芥子酸、二十二碳六烯酸、辛酸、癸酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、二十烷酸、二十二烷酸、二十四烷酸以及蜡酸。
在各种实施例中，脂质体进一步包含乙醇胺。在各种实施例中，脂质体进一步包含聚山梨醇酯。预期聚山梨醇酯可为聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯80。示例性聚山梨醇酯包括20和80。
在各种实施例中，一或多种有机盐或无机盐是由以下各者所构成的群组中选出：磷酸钾、氯化钙(无水)、硫酸铜、硝酸铁、硫酸铁、氯化镁(无水)、硫酸镁(无水)、氯化钾、氯化钠、无水磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化锡、硫酸锌以及碳酸氢钠。在各种实施例中，液体混合物包含氯化钠、氯化钾、磷酸钠以及磷酸钾。
在各种实施例中，培养基进一步包含铁源或铁转运体。在各种实施例中，铁源或铁转运体是由以下各者所构成的群组中选出：转铁蛋白、乳铁蛋白、硫酸亚铁、柠檬酸亚铁、柠檬酸铁、硝酸铁、硫酸铁、柠檬酸铁铵、草酸铁铵、反丁烯二酸铁铵、苹果酸铁铵以及丁二酸铁铵。在各种实施例中，铁源为柠檬酸铁。在各种实施例中，铁转运体为转铁蛋白。
在各种实施例中，血清替代物进一步包含铜源或铜转运体(例如GHK-Cu)。示例性铜源包括(但不限于)氯化铜和硫酸铜。
在各种实施例中，液体混合物包含一或多种由Pluronic-68(F68pastille)、Pluronic-128、去水山梨醇、聚山梨醇酯以及嵌段共聚物所构成的群组中选出的非离子表面活性剂。在各种实施例中，非离子表面活性剂为Pluronic-68(F68pastille)。
在各种实施例中，每升培养基提供甘油在细胞培养物(例如细胞悬浮液或贴壁培养物)中的最终浓度为约2微升/升到0.5毫升/升。
在各种实施例中，培养基提供果胶在细胞培养物(例如细胞悬浮液或贴壁培养物)中的最终浓度为约0.25克/升到0.5克/升，或25毫克/升到500毫克/升。
在各种实施例中，培养基提供硒在细胞培养物(例如细胞悬浮液或贴壁培养物)中的最终浓度为约0.005毫克/升到0.050毫克/升。
在各种实施例中，也预期血清替代物，其中来自脂质体的胆固醇在血清替代物中的最终浓度为约10毫克/升到200毫克/升，且来自脂质体的卵磷脂在血清替代物中的最终浓度为约50毫克/升到1克/升，或约1000毫克/升到10克/升。
在各种实施例中，本发明提供一种完全培养基，其中来自脂质体的胆固醇在完全培养基中的浓度为约1毫克/升到20毫克/升，且来自脂质体的卵磷脂在完全培养基中的浓度为约100毫克/升到1000毫克/升。
在各种实施例中，本发明提供一种培养基补充物，其中来自脂质体的胆固醇在培养基补充物中的浓度为约100毫克/升到2000毫克/升或大于2000毫克/升，且来自脂质体的卵磷脂在培养基补充物中的浓度为约10克/升到100克/升。
在各种实施例中，本发明提供一种低温保存培养基，其中来自脂质体的胆固醇在低温保存培养基中的最终浓度为约10毫克/升到200毫克/升，且来自脂质体的卵磷脂在低温保存培养基中的最终浓度为约1000毫克/升到10克/升。
在各种实施例中，脂质体为纳米粒子。在各种实施例中，纳米粒子具有范围为约50纳米到500纳米，约100纳米到约300纳米或约100纳米到200纳米的平均直径。
本文提供脂质体为热力学稳定的。在各种实施例中，脂质体在水溶液中为稳定的(例如不沉淀)。在各种实施例中，脂质体在水溶液中在37℃、25℃、4℃、0℃或-20℃下稳定至少7天、10天、14天、21天、30天、2个月、3个月、6个月或1年或大于1年的时间段。示例性水溶液包括(但不限于)水、缓冲生理盐水和其它平衡盐溶液、基础细胞培养基以及完全细胞培养基。
本文也提供一种细胞低温保存培养基，其包含脂质体、基础生理缓冲剂液体混合物以及任选的果胶。
本文也预期一种细胞低温保存培养基，其包含基础生理缓冲剂液体混合物和果胶。
在各种实施例中，在低温保存培养基中，果胶在细胞悬浮液中的最终浓度为约0.25克/升到5克/升，或250毫克/升到5000毫克/升或约50毫克/升到5克/升。
在各种实施例中，本文中所描述的低温保存培养基进一步包含甘油。在各种实施例中，当使用低温保存培养基时，甘油在细胞悬浮液中的最终浓度为约0.2毫升/升到5毫升/升。
在各种实施例中，低温保存培养基进一步包含脂质体，其中脂质体包含胆固醇、卵磷脂以及脂肪酸，其中脂质体的量使得胆固醇在细胞悬浮液中的最终浓度为约10毫克/升到200毫克/升，且其中卵磷脂在细胞悬浮液中的最终浓度为约1克/升到10克/升。
在各种实施例中，低温保存培养基进一步包含二甲亚砜(dimethyl sulfoxide；DMSO)，其中DMSO在低温保存培养基中的浓度小于或等于4％。在各种实施例中，DMSO的浓度为4％、3％、2％、1％或0.5％。
在各种实施例中，低温保存培养基进一步包含聚赖氨酸。在各种实施例中，聚赖氨酸为改性聚赖氨酸。在各种实施例中，聚赖氨酸为ε-聚-L-赖氨酸。在某些实施例中，聚赖氨酸包含羧化胺基。在各种实施例中，聚赖氨酸的最终浓度为约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％。
在各种实施例中，在添加到细胞培养物前，将血清替代物或培养基补充物添加到基础培养基。标准基础培养基在所属领域中已知且可购得。此类培养基的实例包括(但不限于)杜尔贝科氏改性伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium；DMEM)、DMEMF12、伊斯寇氏改性达尔伯克培养基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)、汉姆氏养分混合物F-10(Ham's Nutrient mixture F-10)(汉姆氏F-10(Ham's F-10))或汉姆氏F-12、罗斯威尔帕克纪念学会培养基(Roswell Park Memorial Institute Medium；RPMI)、MCDB 131、克里克氏培养基(Click's medium)、麦克柯伊氏5A培养基、培养基199、威廉姆氏培养基E(William's Medium E)以及如格雷斯氏培养基(Grace's medium)和TNM-FH的昆虫培养基。
这些培养基中的任一者任选地补充有盐、氨基酸、维生素、缓冲剂、核苷酸、抗生素、微量元素以及葡萄糖或等效能量来源。也可包括所属领域的技术人员已知的适当浓度的其它任选的补充物。培养基补充物为所属领域中众所周知且可购得，且更详细描述于具体实施方式中。
在各种实施例中，更预期血清替代物本身包含如上文所描述的基础培养基和补充物的要素，例如盐、氨基酸、维生素、缓冲剂、核苷酸、抗生素、微量元素、抗氧化剂以及葡萄糖或等效能量来源，以使得血清替代物以无血清完全培养基形式提供。
在各种实施例中，培养基不含动物组分。
在各种实施例中，脂质体负载有本文中所描述的基础液体混合物。更预期脂质体负载有在细胞培养中有利的其它组合物。在细胞培养中有利的示例性组合物包括(但不限于)缓冲剂、铁转运体、游离脂肪酸、生长肽(例如胰岛素、包含甘氨酸-组氨酸-赖氨酸三聚体的GHK肽)、氨基酸(必需和非必需)、维生素、微量元素、抗氧化剂和/或盐。
在各种实施例中，本发明提供一种培养细胞的方法，其包含在完全培养基或含有本文中所描述的血清替代物或培养基补充物的培养基中培养细胞。
在各种实施例中，细胞在由哺乳动物细胞和昆虫细胞所构成的群组中选出。在各种实施例中，细胞自哺乳动物个体分离。在各种实施例中，细胞为原始培养物或细胞系。在各种实施例中，细胞是由以下各者所构成的群组中选出：多能性干细胞、胚胎干细胞、骨髓基质细胞、造血祖细胞、淋巴干细胞、骨髓干细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、肝细胞、胰腺细胞以及细胞系。
预期的哺乳动物细胞系包括(但不限于)CHO、CHOK1、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL 3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC5、FS4、T细胞系(例如Jurkat)、B细胞系(例如BJAB、EW36、CA46、ST486以及MC116、Raji、Namalva以及Daudi)、3T3、RIN、A549、PC 12、K562、SP2/0、NS-0、U20S、HT1080、L929、融合瘤、癌细胞系以及所属领域中众所周知的其它细胞系。预期的昆虫细胞系包括(但不限于)Sf9、Sf21、HIGH FIVETM、S2、Tn5、TN-368、BmN、Schneider 2、D2、C6/36以及KC细胞。
在各种实施例中，本发明涵盖一种低温保存细胞的方法，其包含使细胞悬浮在本文中所描述的低温保存培养基中，所述低温保存培养基任选地包含果胶或任选地包含脂质体，且将细胞置于小于8℃的环境中。低于8℃的示例性温度包括(但不限于)温度处于或低于4℃、0℃、-20℃、-70℃、-135℃或在液氮(-196℃)中。
在各种实施例中，所述方法进一步包含使细胞解冻且将其置于如本文所描述的培养基中。
在各种实施例中，解冻后，当置于本文中所描述的培养基时，无论用作血清替代物、培养基补充物或完全培养基，至少30％的冷冻细胞仍然有活力。在各种实施例中，解冻后细胞的存活率为约40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％或高于80％。
在一个实施例中，以10毫升、50毫升、100毫升、500毫升或1升的体积封装培养基(血清替代物、培养基补充物、完全培养基或低温保存培养基)。在一个相关实施例中，将血清替代物、培养基补充物或低温保存培养基封装于1×、5×、10×或20×溶液中。
也提供一种制造本文中所描述的脂质体的方法。在各种实施例中，制造脂质体的方法包含将所需量的胆固醇溶解于非甲醇或非氯仿溶液中。在各种实施例中，将胆固醇溶解于液体磷脂溶液中。在各种实施例中，在室温下胆固醇混合在非甲醇或非氯仿溶液中，或在非甲醇或非氯仿溶液中加热，直到胆固醇成溶液。溶液可加热到约35℃、40℃、45℃、50℃、55℃或60℃，且不超过80℃。一旦成溶液，将以下组合物添加到胆固醇组合物且混合：聚山梨醇酯、乙醇胺以及脂肪酸。将最终混合物储存在4℃、0℃或-20℃下。任选地，混合胆固醇溶液，随后添加残余化合物。
在各种实施例中，预期如本文所描述的某些培养基组合物或脂质体组合物促进改良的细胞培养，例如相比于包含不同组的组分的培养基或脂质体组合物，细胞生长增加、细胞存活率增加或重组蛋白质表达增加。预期那些促进改良的细胞培养的培养基或脂质体组合物用于进一步实验。
应理解本文中所描述的各特征或实施例或组合为本发明方面中任一者的非限制性、示例性实例，且因此，打算与本文中所描述的任何其它特征或实施例或组合可组合。这些类型实施例中每一者为特征的一个非限制性实例，所述特征打算与本文中所描述的任何其它特征或特征组合进行组合而不必列出每个可能的组合。此类特征或特征组合适用于本发明方面中的任一者。当揭露落在范围内的数值实例时，预期这些实例中任一者为一个范围的可能端点，预期在所述端点之间的任何和所有数值，且预想上端点与下端点的任何和所有组合。
附图说明
图1展示相比于可商购的美国食品药物管理局(FDA)认可的无血清培养基，本文中描述的血清替代物对所刺激脾细胞的影响。
图2A和图2B展示相比于在包含胎牛血清的培养基中的脾细胞培养，本文中所描述的血清替代物对所刺激脾细胞生长的影响。
图3A展示与培养基加FBS相比，血清替代物加生长因子将诱发更大程度的细胞增殖。图3B展示相比于FBS，当用血清替代物培养细胞时，增殖中的实验内差异减小。
图4A展示历经3天培养，相比于在培养基加FBS中培养的细胞，血清替代物加生长因子中的细胞培养减少细胞死亡水平。图4B展示相比于包含FBS的培养基，当用含血清替代物的培养基培养细胞时，细胞凋亡的实验内差异减小。
具体实施方式
本发明提供一种包含基础生理缓冲剂液体混合物和包含胆固醇、卵磷脂以及脂肪酸的脂质体的培养基，其中培养基可为血清替代物、完全培养基或培养基补充物组合物，其用于体外细胞培养以便提供类似在胎牛血清细胞(FBS)中生长的生长而没有FBS对细胞生理机能所贡献的非特定副作用。血清替代物、完全培养基或培养基补充物提供一种包含生理学相关浓度的胆固醇和卵磷脂与脂肪酸组合的脂质体以使得在血清替代物、完全培养基或培养基补充物中的脂质体向细胞提供一个类似于血浆膜的环境。任选地，完全培养基、血清替代物或培养基补充物包含果胶。也提供一种包含脂质体和/或果胶的低温保存培养基。本文的培养基(血清替代物、完全培养基、培养基补充物或低温保存培养基)组合物提供优于在含FBS培养基中或在无血清培养基中进行细胞培养的优势。
如本说明书和所附权利要求书中所使用，除非上下文明确规定，否则不定冠词“一(a)”和“一(an)”以及定冠词“所述(the)”包括复数以及单数指示物。
术语“约(about)”或“大约(approximately)”意指由所属领域的技术人员确定的可接受特定值误差，其在某种程度上视所述值如何测量或测定而定。在某些实施例中，术语“约”或“大约”意指在1、2、3或4个标准偏差内。在某些实施例中，术语“约”或“大约”意指在给定值或范围的30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.05％内。
如本文中所使用，“培养基(media)”或“细胞培养基(cell culture media)”是指提供细胞生长、存活或储存的水溶液类溶液。如本文中预期的培养基可补充有如实施方式中描述的养分以促进培养基中所培养的细胞的所需细胞活性，如细胞存活率、生长、增殖、分化。如本文所使用的培养基包括血清替代物、培养基补充物、完全培养基或低温保存培养基。
如本文所使用，“血清替代物(serum replacement)”或“血清替代物培养基(serumreplacement media)”是指可与基础培养基结合使用或用作完全培养基以便促进培养物中细胞生长和生存的组合物。在各种实施例中，血清替代物作为典型地添加到体外细胞培养的培养基中的任何血清的替代物用于基础或完全培养基中。预期血清替代物包含蛋白质和用于培养物中细胞生长和生存的其它因子。在各种实施例中，在用于细胞培养前，将血清替代物添加到基础培养基。在各种实施例中，更预期血清替代物可包含基础培养基和基础养分，如盐、氨基酸、维生素、微量元素、抗氧化剂等，以使得血清替代物适用作用于细胞培养的无血清完全培养基。
如本文所使用，“基础培养基(basal media/base media/base medium)”或“基础营养培养基(base nutritive media)”是指基础盐养分或盐和其它要素的水溶液，其向细胞提供正常细胞代谢所必需的水和某些大量无机离子，且维持细胞内和细胞外渗透平衡。在各种实施例中，基础培养基包含至少一种碳水化合物作为能量来源，和/或缓冲系统以维持培养基在生理pH范围内。可商购基础培养基的实例包括(但不限于)磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline；PBS)、杜尔贝科氏改性伊格尔培养基(DMEM)、最低必需培养基(Minimal Essential Medium；MEM)、伊格尔基础培养基(Basal Medium Eagle；BME)、RPMl 1640、汉姆氏F-10、汉姆氏F-12、α-最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(Glasgow's Minimal Essential Medium；G-MEM)、伊斯科夫氏改性杜尔贝科氏培养基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)或经改性用于多能细胞的通用培养基，如X-VIVO(Lonza)或造血干细胞基础培养基。基础培养基可补充有如实施方式中更详细描述的养分。
如本文中所使用，“完全培养基(complete media)”是指进一步包含可促进细胞生长的额外补充物(如生长因子、激素、蛋白质、血清或血清替代物、微量元素、糖、抗生素抗氧化剂等)的基础培养基。举例来说，可商购完全培养基包含补充物，如乙醇胺、谷胱甘肽(还原型)、抗坏血酸磷酸酯、胰岛素、人类转铁蛋白、富含脂质牛血清蛋白、微量盐、亚硒酸钠、偏钒酸铵、硫酸铜以及氯化亚锰(DMEM ADVANCEDTM培养基，Life Technologies)。
如本文中所使用，“培养基补充物(media supplement)”是指在细胞培养前添加到基础培养基的试剂或组合物。培养基补充物可为对培养物中细胞生长有利的试剂，如生长因子、激素、蛋白质、血清或血清替代物、微量元素、糖、抗生素、抗氧化剂等。典型地，培养基补充物为所需补充物的浓缩溶液，其稀释成完全或基础培养基以达到适用于细胞培养的最终浓度。
如本文所使用，“低温保存培养基(cryopreservation media)”是指适于在处于或低于8℃温度(包括处于或低于4℃、0℃、-20℃、-70℃、-135℃或在液氮(-196℃)中的温度)下将细胞悬浮储存或冷冻的培养基。
如本文所使用，“果胶(pectin)”是指来源于植物细胞壁的结构性杂多糖，其分子量为30,000道尔顿(Da)到250,000道尔顿。果胶主要由α-1-4键联半乳糖醛酸残基构成。在某些实施例中，果胶酯化，例如55％、60％、65％、70％、75％或高于75％酯化，且可为高酯果胶或低酯果胶。在各种实施例中，果胶对钙敏感。钙敏感果胶能够与钙相互作用形成凝胶，而非钙敏感果胶不能。预期果胶在pH 4.5-6.9范围内的酸性溶液内或pH7.5到10范围内的碱性溶液内，视所用果胶类型而定。任选地，果胶在pH范围7.0-7.4的溶液中。使用所属领域中的常识和技能，可测定在不同pH水准下使用的果胶，且在所需pH水准下使用的果胶受果胶的酯化程度或钙敏感性影响。
通过商业来源供应果胶，且其可来自具有果胶的任何植物，如梨、苹果、番石榴、冥栌、李子、醋栗、柑橘和其它柑桔类水果、樱桃、葡萄以及草莓。具有不同酯化(甲基化)度和钙敏感性的果胶组合物描述于WO 2000008952中，其以引用的方式并入本文中。
如本文中所使用，“脂质体(liposome)”是指包含包围内部水溶液空间的外脂质双层或多层膜的封闭结构。脂质体可为多层或单层。预期脂质体的尺寸在直径5微米到10微米到纳米粒子尺寸范围内。在某些实施例中，脂质体纳米粒子直径为约50纳米到500纳米，约100纳米到300纳米或约100纳米到200纳米。
如本文所使用，“液体基础混合物(liquid base mix)”或“基础生理缓冲剂液体混合物(base physiological buffer liquid mix)”是指血清替代物或培养基补充物的基础液体溶液，其中脂质体悬浮以形成细胞培养基组合物。在各种实施例中，更预期将液体基础混合物装载入脂质体以使得当与细胞培养物中的细胞融合/由细胞吸收时，脂质体向细胞传递一定量的液体基础混合物。在各种实施例中，本文中预期液体基础混合物或基础生理缓冲剂液体混合物为基础培养基、完全培养基或生理缓冲溶液，如磷酸盐缓冲盐水(PBS)和其它平衡盐溶液，其可与脂质体和/或本文中其它组分结合使用来形成血清替代物、完全培养基、培养基补充物或低温保存培养基。
如本文所使用，“改良的细胞培养”是指相比于使用不包含脂质体的血清替代物或无血清培养基的细胞培养，当使用本文中所描述的培养基组合物(血清替代物、完全培养基或培养基补充物)培养时，细胞增殖增加、细胞生长增加、细胞死亡减少或细胞的蛋白质产生(重组型或内源性)增加。使用所属领域中众所周知的方法，包括生长曲线分析、刺激指数、锥虫蓝微观评估、氚化胸苷(3H)、增殖分析、MTT分析、刃天青类分析以及DNA梯度变化分析来测量增殖增加、生长增加和细胞死亡变化。使用所属领域中已知的技术，包括量化总蛋白质或mRNA，或定量相关特定蛋白质的含量，测量细胞的蛋白质产生(重组型或内源性)增加。
如本文中所使用，“无动物组分”是指其中组分不来源于动物的组合物。预期组分以重组方式产生或来源于植物或其它来源，而非直接自动物分离。如本文中所使用，无动物组分允许培养基组分在动物类细胞系中重组产生。
培养基组合物
先前已描述包含脂质组分和脂质体的细胞培养基用于细胞培养，但成就有限。举例来说，Hams等人(《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad USA)》78:5588-92,1981)揭露在包含不同脂质组分(例如包含胆固醇、卵磷脂或纯化卵磷脂、鞘磷脂以及维生素E的脂质体)的培养基中培养人类纤维母细胞。然而，Hams描述脂质体不稳定，因为其需要在使用的24小时内制备，且展示在完全培养基中仅使用脂质体不促进细胞生长。Spens等人(《生物技术进展(Biotechnol Prog)》21:87-95,2005)描述在尤其进一步包含胆固醇、环糊精、卵磷脂、维生素E、柠檬酸铁、Pluronic和氨基酸的无蛋白质培养基中培养NS0骨髓瘤细胞。Spens(前述)描述脂质自溶液以高水平沉淀(引用Keen等人,《细胞技术学(Cytotechnology)》17(3):203-11,1995)。
制造脂质体的方法在所属领域中已知，包括用于制造多层小泡(具有一系列同心双层脂质)的液体水合或溶剂小球制备，用以制备单层小泡(具有单层脂质)的卫生设备、法式压制、溶剂注入、清洁剂去除、逆相蒸发、钙诱发融合、微流体化或冻融方法。
脂质体制备描述于美国专利7,220,538号、美国专利第6,217,899号；美国专利公开案第20100021531号；Lichtenberg等人,《生物化学分析方法(Methods Biochem Anal.)》33:337-462,1988；以及G.Gregoriadis:《脂质体技术脂质体制备和相关技术(LiposomeTechnology Liposome Preparation and Related Techniques)》,第2版,第I-III卷,CRCPress。用于医药用途的脂质体已揭露于Mozafari M,《脂质体、方法和方案(Liposomes,Methods and Protocols)》第1卷,第2章,V.Wessing编2010,Humana Press。
在各种实施例中，本发明提供一种用于悬浮液或贴壁培养物中的细胞的培养基，所述培养基包含基础生理缓冲剂液体混合物和(a)包含胆固醇、卵磷脂以及脂肪酸的脂质体，其中所述脂质体的量使得胆固醇在细胞悬浮液或贴壁培养物中的最终浓度为1毫克/升到20毫克/升，且其中卵磷脂在细胞悬浮液或贴壁培养物中的最终浓度为5毫克/升到100毫克/升；或(b)果胶；或(a)和(b)。
在各种实施例中，培养基为血清替代物、培养基补充物或完全培养基。在各种实施例中，本发明提供一种包含脂质体和基础生理缓冲剂液体混合物，任选地包含果胶的细胞低温保存培养基，其中脂质体包含胆固醇、卵磷脂以及脂肪酸。在各种实施例中，脂质体的量使得胆固醇在细胞悬浮液中的最终浓度为1毫克/升到20毫克/升，且其中卵磷脂在细胞悬浮液中的最终浓度为5毫克/升到100毫克/升。
在各种实施例中，本发明提供一种包含基础生理缓冲剂液体混合物和果胶的低温保存培养基。
脂质体可为多层或单层。预期脂质体的尺寸在直径5微米到10微米到纳米粒子尺寸范围内。在一些实施例中，脂质体为纳米粒子。在某些实施例中，纳米粒子具有范围为约50纳米到500纳米，约100纳米到约300纳米，或约100纳米到200纳米的平均直径。可使用所属领域中已知的方法，包括使用Zetasizer(Malvern Instruments,United Kingdom)测量脂质体尺寸，其通过动态光散射方法将粒度测量为整个粒子的平均直径值。
在各种实施例中，脂质体包含脂质、脂肪酸、固醇和/或游离脂肪酸。在各种实施例中，脂质体包含为细胞生长提供更加生理相关环境的浓度的胆固醇和卵磷脂以及脂肪酸。血清替代物、完全培养基或培养基补充物组合物中的脂质体组分的示例性最终浓度阐明于表1中。
表1
在各种实施例中，血清替代物脂质体包含最终浓度为约10毫克/升到200毫克/升、25毫克/升到175毫克/升、50毫克/升到150毫克/升、60毫克/升到120毫克/升、20毫克/升到100毫克/升、30毫克/升到90毫克/升、40毫克/升到80毫克/升或50毫克/升到70毫克/升的胆固醇。在各种实施例中，血清替代物脂质体包含最终浓度为约50毫克/升、约55毫克/升、约60毫克/升、约65毫克/升、约70毫克/升或约75毫克/升的胆固醇。
在各种实施例中，血清替代物中脂质体的量使得胆固醇在细胞悬浮液或贴壁培养物中的最终浓度为1毫克/升到20毫克/升，且其中卵磷脂在细胞悬浮液或贴壁培养物中的最终浓度为5毫克/升到100毫克/升或100毫克/升到1000毫克/升。
在各种实施例中，脂质体包含一或多种脂肪酸。示例性脂肪酸包括(但不限于)次亚麻油酸、亚麻油酸、肉豆蔻酸、油酸、肉豆蔻油酸、棕榈油酸、十六碳烯酸、反油酸、异油酸、反亚油酸、α-次亚麻油酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、芥子酸、二十二碳六烯酸、辛酸、癸酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、二十烷酸、二十二烷酸、二十四烷酸以及蜡酸。在各种实施例中，血清替代物脂质体包含最终浓度为约0.5毫克/升到5毫克/升、0.75毫克/升到4毫克/升、1毫克/升到3毫克/升、0.5毫克/升到3毫克/升、0.5毫克/升到2毫克/升或1毫克/升到2毫克/升的脂肪酸。在各种实施例中，血清替代物脂质体包含最终浓度为约0.5毫克/升到5毫克/升的亚麻油酸或次亚麻油酸。
在各种实施例中，血清替代物脂质体包含最终浓度为约0.5毫克/升到50毫克/升、1毫克/升到50毫克/升、2.5毫克/升到40毫克/升、5毫克/升到35毫克/升、10毫克/升到30毫克/升或15毫克/升到25毫克/升的乙醇胺。在各种实施例中，乙醇胺在血清替代物中的最终浓度为约1毫克/升、2.5毫克/升、5毫克/升、10毫克/升、15毫克/升、20毫克/升、25毫克/升、30毫克/升、35毫克/升、40毫克/升、45毫克/升或50毫克/升。
在各种实施例中，脂质体进一步包含聚山梨醇酯。在某些实施例中，聚山梨醇酯为聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯80。示例性聚山梨醇酯包括20或80。预期聚山梨醇酯在血清替代物中的最终浓度在约100微升/升与1000微升/升之间，200微升/升到800微升/升，300微升/升到700微升/升或400到600微升/升。在各种实施例中，聚山梨醇酯在血清替代物中的最终浓度为约500微升/升。
上文所描述的关于血清替代物组合物的最终浓度可用作计算培养基补充物或完全培养基中的组分浓度的基础。各别组分在培养基补充物中的最终浓度为用于血清替代物组合物中的最终浓度的10倍。各别组分在完全培养基中的最终浓度为用于血清替代物中的最终浓度的1/10。示例性浓度阐明于表1和表2中。
更预期以大于5×或10×的稀释度使用血清替代物。在各种实施例中，以1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:50、1:100、1:200、1:250、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000、1:1500或1:2000的稀释度使用血清替代物。
对于低温保存培养基，组分的起始浓度与用于血清替代物培养基的浓度相同，即，为用于完全培养基浓度的10倍浓度。然而，低温保存培养基无需稀释或仅在最低稀释度下即可使用，使得组分的最终浓度与起始浓度大约相等。举例来说，在各种实施例中，对于低温保存培养基，胆固醇在细胞悬浮液中的最终浓度为10毫克/升到200毫克/升，且卵磷脂在细胞悬浮液中的最终浓度为50毫克/升到1克/升，或1000毫克/升到10克/升。
预期当用于完全细胞培养基溶液中时，尽管高浓度的胆固醇和卵磷脂存在于用于血清替代物或培养基补充物中的脂质体中且考虑到长期暴露于水溶液，本文中所描述的脂质体在水溶液中为热力学稳定的。本发明提供本文中所描述的具有如表1中阐明的组分最终浓度的脂质体在水溶液中为稳定的(例如不沉淀)。在各种实施例中，脂质体在水溶液中在37℃、25℃、4℃、0℃或-20℃下稳定至少7天、10天、14天、21天、30天、2个月、3个月、6个月或1年或大于1年的时间段。示例性水溶液包括(但不限于)水、缓冲生理盐水和其它平衡盐溶液、基础细胞培养基以及完全细胞培养基。本发明脂质体组合物的优势为其含有生理学相关含量的固醇和脂肪酸，此提供极佳生长增效而在若干天后不自溶液沉淀，所述优势已在包含高含量如胆固醇和卵磷脂的试剂的其它培养基中观察到(Spens等人、Keen等人,前述)。
预期培养基的液体基础混合物组分包含果胶、甘油、硒和铁源中的一或多者。任选地，液体基础混合物进一步包含氨基酸、维生素、糖、无机盐、抗氧化剂以及微量元素。类似于上文所描述的脂质体复合物，在其中制造脂质体的液体基础混合物可以用于血清替代物、培养基补充物或完全培养基的不同浓度制造。示例性最终浓度阐明于表2中。
表2
组分 培养基补充物 血清替代物 完全培养基
甘油 2毫升/升到100毫升/升 0.02毫升/升到5毫升/升 2微升/升到0.5毫升/升
果胶 2.5克/升到50克/升 0.25克/升到5克/升 25毫克/升到500毫克/升
硒 0.5毫克/升到5毫克/升 0.05毫克/升到0.5毫克/升 0.005毫克/升到0.050毫克/升
在各种实施例中，甘油在血清替代物中的最终浓度为约0.02毫升/升到5毫升/升(L)，或0.05毫升/升到4毫升/升、0.1毫升/升到3毫升/升、0.5毫升/升到2.5毫升/升或1毫升/升到2毫升/升。在各种实施例中，甘油在血清替代物中的最终浓度为约0.02毫升/升、0.05毫升/升、0.1毫升/升、0.25毫升/升、0.5毫升/升、1.0毫升/升、1.5毫升/升、2毫升/升、2.5毫升/升、3毫升/升、3.5毫升/升、4毫升/升、4.5毫升/升或5毫升/升。
在各种实施例中，果胶在血清替代物中的最终浓度为约0.25克/升到5克/升、0.5克/升到4克/升、1.5克/升到3克/升或1克/升到2克/升。在各种实施例中，果胶在血清替代物中的最终浓度为约0.25克/升、0.5克/升、0.75克/升、1克/升、1.5克/升、2克/升、2.5克/升、3克/升、3.5克/升、4克/升、4.5克/升或5克/升。
示例性无机盐包括(但不限于)磷酸钾、氯化钙(无水)、硫酸铜、硝酸铁、硫酸铁、氯化镁(无水)、硫酸镁(无水)、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、无水磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化锡以及硫酸锌。示例性有机盐包括(但不限于)碳酸氢钠或HEPES。
示例性糖包括(但不限于)右旋糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖以及这些糖的多聚体。
示例性抗氧化剂包括(但不限于)生育酚、生育三烯酚、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、α-生育醌、水溶性维生素E(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-甲酸)、丁基化羟基甲氧苯(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、类黄酮、异黄酮、西红柿红素、β-胡萝卜素、硒、泛醌、梅毒菌素、S-腺苷甲硫氨酸、谷胱甘肽、牛磺酸、N-乙酰半胱氨酸、柠檬酸、L-肉碱、BHT、单硫代甘油、抗坏血酸、没食子酸丙酯、甲硫氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽、胱胺和胱硫醚以及甘氨酸-甘氨酸-组氨酸(三肽)。
示例性微量元素包括(但不限于)铜、铁、锌、锰、硅、钼酸盐、钼、钒、镍、锡、铝、银、钡、溴、镉、钴、铬、钙、二价阳离子、氟、锗、碘、铷、锆或硒。额外微量金属揭露于WO 2006/004728中。
在各种实施例中，培养基或液体基础混合物包含铁源或铁转运体。示例性铁源包括(但不限于)铁盐和亚铁盐，如硫酸亚铁、柠檬酸亚铁、柠檬酸铁、硝酸铁、硫酸铁；铁铵化合物，如柠檬酸铁铵、草酸铁铵、反丁烯二酸铁铵、苹果酸铁铵以及丁二酸铁铵。示例性铁转运体包括(但不限于)转铁蛋白和乳铁蛋白。
在各种实施例中，培养基或液体基础混合物或脂质体包含一或多种如上文所描述的基础培养基和补充物的要素，例如盐、氨基酸、维生素、缓冲剂、核苷酸、抗生素、微量元素、抗氧化剂以及葡萄糖或等效能量来源，以使得培养基能够用作无血清完全培养基。
在各种实施例中，培养基或液体基础混合物进一步包含铜源或铜转运体(例如GHK-Cu)。示例性铜源包括(但不限于)氯化铜和硫酸铜。
在各种实施例中，铁源或铜源以在约0.05纳克/毫升到250纳克/毫升、0.05纳克/毫升到100纳克/毫升、约0.05纳克/毫升到50纳克/毫升、约0.05纳克/毫升到10纳克/毫升、约0.1纳克/毫升到5纳克/毫升、约0.5纳克/毫升到2.5纳克/毫升或约1纳克/毫升到5纳克/毫升范围内的最终浓度添加到血清替代物培养基。更预期铁源或铜源在血清替代物中的最终浓度为约0.05纳克/毫升、0.1纳克/毫升、0.25纳克/毫升、0.35纳克/毫升、0.45纳克/毫升、0.5纳克/毫升、0.6纳克/毫升、0.7纳克/毫升、0.8纳克/毫升、1纳克/毫升、1.5纳克/毫升、2纳克/毫升、2.5纳克/毫升、3纳克/毫升、4纳克/毫升、5纳克/毫升、6纳克/毫升、7纳克/毫升、8纳克/毫升、9纳克/毫升或10纳克/毫升。
上文所描述的关于血清替代物组合物的培养基或液体混合物中的组分的最终浓度可用作计算培养基补充物或完全培养基中组分浓度的基础。各别组分在培养基补充物中的最终浓度为用于血清替代物组合物中的最终浓度的10倍。各别组分在完全培养基中的最终浓度为用于血清替代物中的最终浓度的1/10。
关于低温保存培养基，预期用于血清替代物的起始浓度范围与预期用于低温保存培养基的起始浓度范围相同。然而，低温保存培养基无需稀释或仅在最低稀释度下即可使用，使得组分的最终浓度与起始浓度大约相等。举例来说，在低温保存培养基的各种实施例中，果胶在细胞悬浮液中的最终浓度为约0.25克/升到5克/升、0.5克/升到4克/升、1.5克/升到3克/升或1克/升到2克/升。
在各种实施例中，脂质体负载有有利于细胞培养的组分。有利于细胞培养的示例性组合物包括(但不限于)铁转运体、游离脂肪酸、生长肽(例如胰岛素、包含甘氨酸-组氨酸-赖氨酸三聚体的GHK肽)、氨基酸(必需和非必需)、维生素、微量元素、抗氧化剂以及盐。在各种实施例中，预期脂质体负载有额外乙醇胺和游离脂肪酸。
在各种实施例中，将血清替代物或培养基补充物添加到基础培养基。标准基础培养基为细胞培养领域中已知且可购得。基础培养基的实例包括(但不限于)杜尔贝科氏改性伊格尔培养基(DMEM)、DMEM F12(1∶1)、伊斯寇氏改性达尔伯克培养基、汉姆氏养分混合物F-10或F-12、罗斯威尔帕克纪念学会培养基(RPMI)、MCDB 131、克里克氏培养基、麦克柯伊氏5A培养基、培养基199、威廉姆氏培养基E以及如格雷斯氏培养基和TNM-FH的昆虫培养基。
也预期本文中所描述的血清替代物和培养基补充物用于可商购无血清培养基。示例性无血清培养基包括(但不限于)AIM-V(Life Technologies,Carlsbad,CA)、PER-C6(Life Technologies,Carlsbad,CA)、Knock-OutTM(Life Technologies)、(LifeTechnologies)、(Corning Life Sciences-Mediatech Inc.,Manassas,VA)。
这些培养基中的任一者任选地补充有盐(如氯化钠、钙、镁以及磷酸盐)、氨基酸、维生素、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如庆大霉素(gentamicin)药物)、微量元素(定义为通常以在微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)、抗氧化剂以及葡萄糖或等效能量来源。也可包括所属领域的技术人员已知的适当浓度的任何其它必要的补充物。如温度、pH值等的培养条件将为所属领域的技术人员所显而易见。
预期培养基组合物呈单元形式封装。在一个实施例中，以10毫升、50毫升、100毫升、500毫升或1升的体积封装培养基(血清替代物、培养基补充物、完全培养基或低温保存培养基)。在一个相关实施例中，将血清替代物、培养基补充物或低温保存培养基封装于1×、5×、10×或20×溶液中。
细胞培养
预期本文中所描述的培养基，例如血清替代物、培养基补充物、完全培养基或低温保存培养基适用于细胞体外培养，较佳适用于体外充分生长典型地需要血清补充物或明确培养基的细胞。此类细胞包括真核细胞(如哺乳动物细胞)和昆虫细胞。预期得益于使用血清替代物、完全培养基或培养基补充物的哺乳动物细胞包括(但不限于)仓鼠、猴、黑猩猩、狗、猫、母牛/公牛、猪、小鼠、大鼠、家兔、绵羊以及人类细胞。昆虫细胞包括来源于草地粘虫(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃和斑蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白蚊伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)以及家蚕(Bombyxmori)的细胞。
预期经血清替代物、完全培养基或培养基补充物培养或经低温保存培养基冷冻的细胞为不朽化细胞(细胞系)或非不朽化(初级或次生)细胞，且可为在体内发现的多种细胞类型中的任一者。示例性细胞类型包括(但不限于)纤维母细胞、角质细胞、上皮细胞、卵巢细胞、内皮细胞、胶质细胞、神经细胞、血液成形成分(例如淋巴细胞、骨髓细胞)、软骨细胞和其它骨来源细胞、肝细胞、胰腺细胞以及这些体细胞类型的前驱细胞。
在各种实施例中，预期用于培养基的细胞自哺乳动物个体分离。自哺乳动物个体分离的细胞包括(但不限于)多能干细胞、胚胎干细胞、骨髓基质细胞、造血祖细胞、淋巴干细胞、骨髓干细胞、淋巴细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、内皮细胞、胶质细胞、神经细胞、软骨细胞和其它骨来源细胞、肝细胞、胰腺细胞、体细胞类型的前驱细胞以及任何癌瘤或肿瘤来源细胞。
在各种实施例中，细胞为细胞系。示例性细胞系包括(但不限于)中国仓鼠卵巢细胞，包括CHOK1、DXB-11、DG-44以及CHO/-DHFR；猴肾CV1、COS-7；人胚肾(HEK)293；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞特利氏(sertoli)细胞(TM4)；非洲绿猴肾脏细胞(VERO)；人类子宫颈癌细胞(HELA)；犬类肾脏细胞(MDCK)；布法罗(buffalo)大鼠肝脏细胞(BRL 3A)；人类肺细胞(W138)；人类肝癌细胞(Hep G2；SK-Hep)；小鼠乳房肿瘤(MMT)；TRI细胞；MRC 5细胞；FS4细胞；T细胞系(Jurkat)、B细胞系、小鼠3T3、RIN、A549、PC12、K562、SP2/0、NS-0、U20S、HT 1080、L929、融合瘤、肿瘤细胞以及不朽化初生细胞。
示例性昆虫细胞系包括(但不限于)Sf9、Sf21、HIGH FIVETM、S2、Tn5、TN-368、BmN、Schneider 2、D2、C6/36以及KC细胞。
额外细胞类型和细胞系揭露于WO 2006/004728中，其以引用的方式并入本文中。这些细胞包括(但不限于)CD34+造血细胞和骨髓谱系细胞、293胚胎肾脏细胞、A-549、Jurkat、Namalwa、HELA、293BHK细胞、HeLa子宫颈上皮细胞、PER-C6视网膜细胞(PER.C6)、MDBK(NBL-I)细胞、911细胞、CRFK细胞、MDCK细胞、BeWo细胞、张氏细胞(Chang cell)、Detroit 562细胞、HeLa 229细胞、HeLa S3细胞、Hep-G2细胞、KB细胞、LS 180细胞、LS 174T细胞、NCI-H-548细胞、RPMI 2650细胞、SW-13细胞、T24细胞、WI-28VAl 3、2RA细胞、WISH细胞、BS-C-I细胞、LLC-MK2细胞、克隆M-3细胞、1-10细胞、RAG细胞、TCMK-I细胞、Y-I细胞、LLC-PK1细胞、PK(15)细胞、GH1细胞、GH3细胞、L2细胞、LLC-RC 256细胞、MH1C1细胞、XC细胞、MDOK细胞、VSW细胞、TH-I、Bl细胞或其衍生物；来自任何组织或器官(包括(但不限于)心脏、肝脏、肾脏、结肠、肠、食道、胃、神经组织(大脑、脊髓)、肺、血管组织(动脉、静脉、毛细管)、淋巴组织(淋巴腺、腺样增殖体、扁桃体、骨髓以及血液)、脾、纤维母细胞以及纤维母细胞类细胞系)的纤维母细胞、TRG-2细胞、IMR-33细胞、Don细胞、GHK-21细胞、瓜氨酸血症细胞、登普西细胞(Dempsey cell)、Detroit551细胞、Detroit 510细胞、Detroit 525细胞、Detroit 529细胞、Detroit 532细胞、Detroit539细胞、Detroit 548细胞、Detroit 573细胞、HEL 299细胞、MR-90细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、WI-26细胞、MiCl1细胞、CV-I细胞、COS-I细胞、COS-3细胞、COS-7细胞、VERO细胞、DBS-FrhL-2细胞、BALB/3T3细胞、F9细胞、SV-T2细胞、M-MSV-BALB/3T3细胞、K-BALB细胞、BLO-Il细胞、NOR-IO细胞、C3H/IOTI/2细胞、HSDM1C3细胞、KLN205细胞、麦克柯伊细胞、小鼠L细胞、株系2071(小鼠L)细胞、L-M株系(小鼠L)细胞、L-MTK(小鼠L)细胞、NCTC克隆体2472和2555、SCC-PSAl细胞、NSO、NSl、Swiss/3T3细胞、印度麂细胞、SIRC细胞、Cn细胞、延森细胞(Jensen cell)、COS细胞、和Sp2/0细胞、模拟细胞和/或其衍生物。
本文中预期的细胞培养条件可经调整以适于适用于生长细胞的任何培养基质。具有适合表面的基质包括组织培养孔、培养瓶、滚瓶、可透气容器、平面或平行板生物反应器或细胞培养器。也预期其中细胞附着到悬浮保存于搅拌槽容器中的微载体或粒子的培养条件。
细胞培养方法通常描述于《动物细胞的培养：基础技术手册(Culture of AnimalCells:A Manual of Basic Technique)》,第6版,2010(R.I.Freshney编,Wiley&Sons)；《细胞培养的一般技术(General Techniques of Cell Culture)》(M.A.Harrison和I.F.Rae,Cambridge Univ.Press)；以及《胚胎干细胞：方法和方案(Embryonic Stem Cells:Methodsand Protocols)》(K.Turksen编,Humana Press)。其它参考文献文本包括《创造高效能培养物(Creating a High Performance Culture)》(Aroselli,Hu《研究发展进程(Res.Dev.Pr.)》1996)和《生长限制(Limits to Growth)》(D.H.Meadows等人,UniversePubl.1974)。组织培养用品和试剂为技术人员众所周知且可购得。
应了解，将细胞以适合于与血清替代物、完全培养基或培养基补充物一起使用的特定细胞系或分离细胞类型的密度置于具有培养物中。在某些实施例中，细胞以1×103个细胞/毫升、5×103个细胞/毫升、1×104个细胞/毫升、5×104个细胞/毫升、1×105个细胞/毫升、5×105个细胞/毫升、1×106个细胞/毫升或5×106个细胞/毫升培养。
在各种实施例中，预期本文中所描述的培养基用作低温保存培养基。低温保存是指细胞或组织储存在小于8℃的环境中，其允许细胞长期储存且可处于低于8℃的任何温度下，包括处于或低于4℃、0℃、-20℃、-70℃、-135℃或在液氮(-196℃)中的温度。用含胆碱盐和蔗糖的培养基低温保存细胞的方法揭露于美国专利5,985,538中。额外低温保存组合物和方法揭露于美国专利7,935,478和美国专利7,112,576中。预期本文中所描述的低温保存培养基可进一步包含以下试剂中的一或多者：二甲亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、糖(如蔗糖、右旋糖、海藻糖、果胶)、蛋白质、碳水化合物(如羟基乙基淀粉(hydroxyethyl starch；HES))、聚葡萄糖和/或聚赖氨酸。在各种实施例中，低温保存培养基包含脂质体和/或果胶。
在各种实施例中，解冻后，当置于本文中的培养基时，无论用作血清替代物、培养基补充物或完全培养基，至少30％细胞仍然有活力。在各种实施例中，解冻后细胞的存活率为40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％或高于80％。
测量在低温保存后存活率的额外分析包括(但不限于)干细胞菌落形成单位的测定、细胞倍增时间和增殖的测定、MTT分析、刃天青分析以及所属领域用以测量细胞存活率和生长的其它分析。
在各种实施例中，预期如本文所描述的某些培养基组合物或脂质体组合物促进改良的细胞培养，例如相比于包含不同组的组分的培养基或脂质体组合物，细胞生长增加、细胞存活率增加或重组蛋白质表达增加。预期那些促进改良的细胞培养的培养基或脂质体组合物用于进一步实验。
在各种实施例中，已证明包含具有抗氧化剂的脂质体的血清替代物培养基支持细胞在培养物中生长增加。这个结果与展示抗氧化剂维生素E或α-生育酚抑制培养物中的细胞生长的先前研究形成对比。
试剂盒
本发明更提供一种包含如本文所描述的培养基(例如血清替代物、培养基补充物、完全培养基或低温保存培养基)和使用说明书的试剂盒。在各种实施例中，培养基为血清替代物、培养基补充物或低温保存培养基，且试剂盒提供适用于产生完全培养基的基础培养基和/或附加因子。在各种实施例中，培养基封装在标签贴附到容器的容器中，或包括于描述组合物用于体外、体内或离体用途的包装中。示例性容器包括(但不限于)容器、小瓶、管、安瓿、瓶、烧瓶等。更预期容器经调整以适于封装液体或冷暖形式的培养基，例如血清替代物、培养基补充物或低温保存培养基。预期容器由所属领域中众所周知的材料制成，包括(但不限于)玻璃、聚丙烯、聚苯乙烯以及其它塑料。在各种方面中，组合物以单位剂型封装。试剂盒任选地包括一种适用于组合血清替代物、培养基补充物或低温保存培养基与基础培养基，且或者组合培养基与附加生长因子的装置。在各种方面中，试剂盒含有描述培养基用于细胞培养或低温保存用途的标签和/或说明书。
本发明血清替代物的额外方面和细节将自以下实例显而易见，所述实例意图为说明性而非限制性的。
实例1
示例性脂质体血清替代物组合物
下文描述本文中预期的制造示例性脂质体和血清替代物培养基的方法。适用于血清替代物的组分阐明于表3和表4中。在所述表中列出的组分不打算限制，而是证明脂质体复合物在血清替代物中的功效。表3阐明脂质体组合物的示例性组分。任选地，脂质体复合物可包含(例如50微升/升)。
表3
为制成脂质体，将700微升乙醇置入1.5毫升微量离心管，且将250微升53添加到乙醇。将50毫克胆固醇添加到混合物且加热到50℃直到胆固醇成溶液。使混合物涡旋(VORTEXScientific Industries Inc.,Bohemia,NY)10秒，历经20秒到30秒增量，直到溶液为透明琥珀色(短暂涡旋且将脂质混合物放回，进行加热且重复直到其成溶液)。任选地，将50微升20添加到脂质混合物且涡旋。将乙醇胺添加到混合物且涡旋。随后，添加如亚麻油酸和次亚麻油酸的脂肪酸且通过涡旋混合。最终脂质混合物储存在暗处4℃下。
血清替代物也包含与上文所描述的脂质混合物组合的基础培养基液体混合物。在一个实施例中，基础培养基液体混合物包含以下组分：果胶、氯化钠(NaCl)、右旋糖、氯化钾(KCl)、磷酸钠(Na2HPO4)、磷酸钾(KH2PO4)、硒、钼酸盐、柠檬酸铁、甘油以及pluronic。基础液体混合物的一个示例性实施例描述于表4中。
表4
成分 浓度(每升) 实例来源 目录号
液态组分
NaCl 8克 Sigma S9888
KCl 0.2克 Sigma P4504
Na2HPO4 1.5克 Sigma S0876
KH2PO4 0.2克 Sigma P5379
右旋糖 5克 Sigma G6138
果胶 1克 Gillco(DuPont) 413720
甘油 0.03毫升 Sigma G2025
硒 50微克 Sigma S5261
Pluronic 68 0.5克 Sigma P1300
钼酸盐 10微克 Sigma M1651
柠檬酸铁 2毫克 Sigma F3388
将右旋糖、果胶以及NaCl混合成粉末且缓慢添加到600毫升再蒸馏水(doubledistilled water；ddH2O)。将氯化钾、磷酸钠以及磷酸钾粉末添加到果胶-NaCl溶液且混合直到成溶液。硒、钼酸盐以及柠檬酸铁在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释且混合直到成溶液。添加甘油，且使用1N NaOH使溶液pH到7.2。将Pluronic添加到溶液且体积用ddH2O增加到1升。
为组合脂质和液体混合物，随后将1毫升脂质混合物在10毫升血清替代物基础液体中混合。经由低粘结过滤器孔径(例如0.22微米)过滤脂质混合物。将10毫升基础培养基混合物置入100毫升无菌容器。将脂质混合物缓慢滴入10毫升基础培养基，同时例如使用涡旋，且随后震荡瓶来涡旋10毫升基础培养基且剧烈混合。任选地，使脂质体混合物经过微流化床，其将有助于制造均匀尺寸化的纳米脂质体。为制得较大体积溶液，将10毫升脂质体混合物缓慢滴入990毫升液体混合物，同时涡旋基础培养基以达到1升溶液。
实例2
脂质体血清替代物促进细胞生长和存活
为证明实例1中描述的血清替代物促进细胞的细胞生长和增殖的能力，在包含血清替代物的储备液培养基中培养分离自小鼠的初生细胞或细胞系。
如先前所描述，脾细胞自预先用磷酸脂蛋白(phospholipoprotein；PLP)139-151免疫接种的SJL小鼠分离(McRae等人,《实验医学杂志(J Exp Med.)》182(1):75-85,1995)，且将在DMEM+10％血清替代物中的细胞生长与在可商购无血清培养基(Invitrogen,Carlsbad CA)中的生长相比较。将5×105个细胞于200微升生长培养基中置于96孔板中，且在3天后测量回应PLP139-151(0微克/毫升、0.5微克/毫升、5微克/毫升或50微克/毫升)再刺激的脾细胞增殖程度。图1展示在DMEM+10％血清替代物中的细胞培养与无血清培养基相比产生显著更大的增殖。也比较脾细胞在含FBS的DMEM或DMEM+10％血清替代物中的生长。图2A展示无论受刺激还是未受刺激，在DMEM+10％FBS中培养的细胞均增殖，刺激指数低，而DMEM+10％血清替代物中培养的脾细胞的数目加倍。图2B表示第二增殖分析，其中脾细胞在DMEM+10％FBS或DMEM+10％血清替代物中培养。图2B展示在DMEM/10％FBS中培养的细胞具有高于3的刺激指数，而在DMEM/10％血清替代物中培养的细胞具有略低于3的刺激指数。有趣的是，图2A和图2B中的数据展示在DMEM/10％血清替代物中的细胞培养与在DMEM/FBS中的细胞培养相比提供一致的增殖结果，即使在未受刺激细胞群体中其也可产生非特定增殖。相比于在FBS中培养，本文中所描述的血清替代物提供更一致、可再生的细胞培养条件，其可具有细胞刺激特性且可引起具有内部批间差异的细胞刺激。
除了原生细胞培养外，测定血清替代物对细胞系生长的影响。单独在汉姆氏(F12)或含10％血清替代物的汉姆氏培养基中培养中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary；CHO)细胞(5×105个，在96孔板中)，且测量细胞生长和存活率。在汉姆氏培养基中培养的CHO细胞数目在4天内加倍，而在汉姆氏/10％血清替代物中培养的CHO细胞数目在4天内增加大约8倍。在4天内，细胞在任一培养条件中的存活率为大约90％。
也已证明相比于具有缺乏抗氧化剂的脂质体的血清替代物，包括包含α生育酚的脂质体的血清替代物培养基改良细胞生长。这个结果与α生育酚在培养中抑制细胞生长的报导形成对比。参见例如Sylvester等人,“维生素E抑制正常乳房上皮细胞生长与蛋白激酶C(α)活性减小相关(Vitamin E inhibition of normal mammary epithelial cellgrowth is associated with a reduction in protein kinase C(alpha)activation)”《细胞增殖(Cell Prolif.)》34(6):347-57,2001或Neuzil等人,“维生素E类似物作为细胞凋亡的诱导剂：其潜在抗肿瘤作用的影响(Vitamin E analogues as inducers ofapoptosis:implications for their potential antineoplastic role)”《氧化还原报告(Redox Rep.)》6(3):143-51,2001。
这些结果证明包含本文中所描述的脂质体的血清替代物有效地提供体外细胞系生长。
实例3
相比于血清，脂质体血清替代物减少细胞死亡和实验内变化
也使用经分离的CD4+T细胞，检验本文中所描述的血清替代物在培养期间减缓或减少细胞死亡的能力。
使用磁珠分离度方案(参见例如Miltenyi Biotec Inc.,Auburn,CA的分离或Life Technologies,Carlsbad,CA的)，自小鼠脾分离CD4+T细胞。比较细胞在DMEM+10％血清替代物中的生长与在包含10％FBS的DMEM中的生长。包含血清替代物的培养基也补充有各种生长因子以补偿在FBS中发现的那些额外生长因子(参见例如美国专利公开案20130130373)。将5×105个CD4+T细胞于200微升生长培养基中置于96孔板中，且经由并入WST-1历经3天测量回应于抗-CD3/抗-CD28刺激的T细胞增殖程度(参见例如Francoeur等人,《生物化学(Biochemica)》3:19-25,1996)。WST-1分析使用四唑鎓盐WST-1断裂成可溶性甲染料来测量细胞增殖。随着细胞数目增加，四唑鎓还原酶的含量上升，使WST-1到可检测染料的转化增加。在440纳米处，通过吸光度测量染料的量。
图3展示受刺激CD4+T细胞的增殖比在培养基加FBS中培养的细胞中观察到的增殖更好或至少相当。八个复制培养物用于各刺激组以可以计算实验内变量。差异确定为增殖中观察到的标准偏差的平方。图3B展示与在FBS中培养相比，血清替代物与生长因子中的细胞培养产生最低实验内差异。通过乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase；LDH)细胞凋亡分析，也测量历经3天培养过程的细胞死亡(参见例如Wolterbeek H.T.和van deer MeerJ.G.M.《分析药物发展技术(Assay Drug Dev Technol)》3:675-682,2005)。分析测量LDH在由细胞膜断裂产生的上清液中的含量。经由一系列反应，LDH引起可检测可溶性染料产生，通过490纳米到520纳米的吸光度来定量。更高LDH含量表示细胞凋亡增加。图4A展示与用FBS培养相比，培养基加血清替代物和生长因子中的培养减少在培养期间发生的细胞凋亡程度。图4B展示与用含FBS培养基培养的实验内差异相比，在这个实验中，在血清替代物中培养的细胞中的实验内差异也为最低。
这些结果展示本文中所描述的血清替代物，以及包含脂质体的完全培养基或培养基补充物提供类似于FBS中生长的细胞培养环境，但缺乏在用FBS培养中所见的缺点，如批间差异和实验内差异。
预期所属领域的技术人员想到如上文说明性实例中阐明的本发明的大量修改和变化。因此，仅如在所附权利要求书中呈现的限制应施于本发明。

Claims (46)

1.一种用于悬浮或贴壁培养中细胞的培养基，所述培养基包含基础生理缓冲剂液体混合物和
(a)包含胆固醇、卵磷脂以及脂肪酸的脂质体，其中所述脂质体的量使得胆固醇在细胞悬浮液或贴壁培养物中的最终浓度为1毫克/升到20毫克/升，且其中卵磷脂在细胞悬浮液或贴壁培养物中的最终浓度为100毫克/升到1000毫克/升；或
(b)果胶；或
(a)和(b)。
2.根据权利要求1所述的培养基，其中所述脂质体包含一或多种由次亚麻油酸、亚麻油酸、肉豆蔻酸以及油酸所组成的群组中选出的脂肪酸。
3.根据权利要求1或2所述的培养基，其中所述脂质体进一步包含乙醇胺和聚山梨醇酯。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的培养基，其中果胶在细胞悬浮液或贴壁培养物中的最终浓度为25毫克/升到500毫克/升。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的培养基，其中所述基础生理缓冲剂液体混合物包含一或多种有机盐、无机盐、缓冲剂、铁源或铁转运体、甘油、氨基酸、维生素、糖、抗氧化剂以及微量元素。
6.根据权利要求5所述的培养基，其中甘油在细胞悬浮液或贴壁培养物中的最终浓度为2微升/升到0.5毫升/升。
7.根据权利要求5所述的培养基，其中所述铁源或铁转运体是由以下各者所构成的群组中选出：转铁蛋白、乳铁蛋白、硫酸亚铁、柠檬酸亚铁、柠檬酸铁、硝酸铁、硫酸铁、柠檬酸铁铵、草酸铁铵、反丁烯二酸铁铵、苹果酸铁铵以及丁二酸铁铵。
8.根据权利要求5所述的培养基，其中所述培养基包含一或多种由以下各者所构成的群组中选出的氨基酸：甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-瓜氨酸、盐酸L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸以及L-缬氨酸。
9.根据权利要求5所述的培养基，其中所述培养基包含一或多种由以下各者所构成的群组中选出的盐：磷酸钾、氯化钙(无水)、硫酸铜、硝酸铁、硫酸铁、氯化镁(无水)、硫酸镁(无水)、氯化钾、氯化钠、无水磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化锡、硫酸锌以及碳酸氢钠。
10.根据权利要求5所述的培养基，其中所述培养基包含一或多种由以下各者所构成的群组中选出的维生素：生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟碱酰胺、盐酸吡哆醇、双黄素(biboflavin)、盐酸硫胺、维生素B12以及异肌醇。
11.根据权利要求5所述的培养基，其中所述培养基包含一或多种由以下各者所构成的群组中选出的微量元素：硒、钼酸盐、铬、钴、镍、锌、铜、锰、钡、镓、锂、锡、钛、溴、碘、钒、锗、钼、硅、铁、氟、银、铷、锆、镉以及铝。
12.根据权利要求11所述的培养基，其中所述微量元素为硒，且硒在细胞悬浮液或贴壁培养物中的最终浓度为0.005毫克/升到0.05毫克/升。
13.根据前述权利要求中任一项所述的培养基，其中所述培养基为血清替代物、完全培养基、培养基补充物或低温保存培养基。
14.一种血清替代物、完全培养基或培养基补充物，其包含脂质体和基础生理缓冲剂液体混合物，其中所述脂质体包含卵磷脂、乙醇胺、次亚麻油酸、亚麻油酸、胆固醇以及聚山梨醇酯，且所述基础液体混合物包含至少一种无机盐、至少一种糖、甘油以及至少一种微量元素。
15.根据权利要求14所述的血清替代物、完全培养基或培养基补充物，进一步包含至少一种非离子表面活性剂和至少一种铁源。
16.根据权利要求14所述的血清替代物、完全培养基或培养基补充物，其中所述脂质体的量使得胆固醇在细胞悬浮液或贴壁培养物中的最终浓度为1毫克/升到20毫克/升，且其中卵磷脂在细胞悬浮液或贴壁培养物中的最终浓度为100毫克/升到1000毫克/升。
17.根据权利要求14到16中任一项所述的血清替代物、完全培养基或培养基补充物，其中所述基础生理缓冲剂液体混合物包含一或多种由以下各者所构成的群组中选出的盐：磷酸钾、氯化钙(无水)、硫酸铜、硝酸铁、硫酸铁、氯化镁(无水)、硫酸镁(无水)、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、无水磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸锌以及氯化锡。
18.根据权利要求14到17中任一项所述的血清替代物、完全培养基或培养基补充物，其中所述液体混合物包含氯化钠、氯化钾、磷酸钠以及磷酸钾。
19.根据权利要求14到18中任一项所述的血清替代物、完全培养基或培养基补充物，其中所述液体混合物包含一或多种由以下各者所构成的群组中选出的微量元素：硒、钼酸盐、铬、钴、镍、锌、铜、锰、钡、镓、锂、锡以及钛。
20.根据权利要求19所述的血清替代物、完全培养基或培养基补充物，其中所述液体混合物包含硒和钼酸盐。
21.根据权利要求13到19中任一项所述的血清替代物、完全培养基或培养基补充物，其中所述液体混合物包含一或多种由以下各者所构成的群组中选出的铁源或铁转运体：转铁蛋白、乳铁蛋白、硫酸亚铁、柠檬酸亚铁、硝酸铁、硫酸铁、柠檬酸铁、柠檬酸铁铵、草酸铁铵、反丁烯二酸铁铵、苹果酸铁铵以及丁二酸铁铵。
22.根据权利要求20所述的血清替代物、完全培养基或培养基补充物，其中所述铁源为柠檬酸铁。
23.根据权利要求14到22中任一项所述的血清替代物、完全培养基或培养基补充物，其中所述液体混合物包含一或多种由以下各者所构成的群组中选出的非离子表面活性剂：Pluronic-68、F68 Pastille、Pluronic-128、去水山梨醇、聚山梨醇酯以及嵌段共聚物。
24.根据权利要求23所述的血清替代物、完全培养基或培养基补充物，其中所述非离子表面活性剂为Pluronic-68。
25.根据权利要求14到24中任一项所述的血清替代物，其中胆固醇在所述血清替代物中的最终浓度为约10毫克/升到200毫克/升，且卵磷脂在所述血清替代物中的最终浓度为约1000毫克/升到10克/升。
26.根据权利要求14到24中任一项所述的完全培养基，其中胆固醇在所述完全培养基中的浓度为约1毫克/升到20毫克/升，且卵磷脂在所述完全培养基中的浓度为约100毫克/升到1000毫克/升。
27.根据权利要求14到24中任一项所述的培养基补充物，其中胆固醇在所述培养基补充物中的浓度为约100毫克/升到2000毫克/升，且卵磷脂在所述培养基补充物中的浓度为约10克/升到100克/升。
28.根据权利要求14到24中任一项所述的血清替代物、完全培养基或培养基补充物，其进一步包含果胶。
29.根据前述权利要求中任一项所述的培养基、血清替代物、完全培养基或培养基补充物，其中所述脂质体为纳米粒子。
30.根据权利要求28或29所述的培养基、血清替代物、完全培养基或培养基补充物，其中所述纳米粒子具有在约50纳米到约500纳米范围内的平均直径。
31.根据前述权利要求中任一项所述的培养基、血清替代物、完全培养基或培养基补充物，其不含动物性成分。
32.一种细胞低温保存培养基，其包含脂质体和基础生理缓冲剂液体混合物，其中胆固醇在所述低温保存培养基中的最终浓度为约10毫克/升到200毫克/升，且卵磷脂在所述低温保存培养基中的最终浓度为约1000毫克/升到10克/升。
33.根据权利要求32所述的低温保存培养基，其进一步包含果胶。
34.根据权利要求33所述的低温保存培养基，其中果胶在细胞悬浮液中的最终浓度为约50毫克/升到5克/升。
35.根据权利要求32或33所述的低温保存培养基，其进一步包含甘油。
36.根据权利要求35所述的低温保存培养基，其中甘油在细胞悬浮液中的最终浓度为约0.02毫升/升到5毫升/升。
37.根据权利要求32到36中任一项所述的低温保存培养基，其进一步包含二甲亚砜(dimethyl sulfoxide；DMSO)，其中所述DMSO的浓度小于4％。
38.根据权利要求32到37中任一项所述的低温保存培养基，其中所述培养基进一步包含聚赖氨酸。
39.一种培养细胞的方法，其包含在含有如前述权利要求中任一项所述的血清替代物、完全培养基或培养基补充物的培养基中培养细胞。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述细胞是由以下所构成的群组中选出：多能干细胞、胚胎干细胞、骨髓基质细胞、造血祖细胞、淋巴干细胞、骨髓干细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、肝细胞、胰腺细胞、癌瘤细胞以及细胞系。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述细胞系是由以下各组所构成的群组中选出：CHO、CHOK1、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC5、FS4、T细胞系、B细胞系、3T3、RIN、A549、PC12、K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、U20S、HT1080、L929、融合瘤以及癌细胞系。
42.一种低温保存细胞的方法，其包含将细胞悬浮于如前述权利要求中任一项所述的低温保存培养基中，且将所述细胞置于小于8℃的环境中。
43.根据权利要求42所述的方法，其进一步包含使所述细胞解冻且将其置于如前述权利要求中任一项所述的培养基中。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中至少30％所述细胞在解冻后仍然有活力。
45.根据权利要求42到44中任一项所述的方法，其中所述细胞是由以下各者所构成的群组中选出：多能干细胞、胚胎干细胞、骨髓基质细胞、造血祖细胞、淋巴干细胞、骨髓干细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、肝细胞、胰腺细胞、癌瘤细胞以及细胞系。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述细胞系是由以下各者所构成的群组中选出：CHO、CHOK1、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC5、FS4、T细胞系、B细胞系、3T3、RIN、A549、PC12、K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、U20S、HT1080、L929、融合瘤以及癌细胞系。
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