WO2020218584A1 - 細胞培養用組成物 - Google Patents

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WO2020218584A1
WO2020218584A1 PCT/JP2020/017847 JP2020017847W WO2020218584A1 WO 2020218584 A1 WO2020218584 A1 WO 2020218584A1 JP 2020017847 W JP2020017847 W JP 2020017847W WO 2020218584 A1 WO2020218584 A1 WO 2020218584A1
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WO
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cell culture
culture composition
tableting
medium
composition
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/017847
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English (en)
French (fr)
Inventor
鈴木　孝治
Original Assignee
味の素株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication of WO2020218584A1 publication Critical patent/WO2020218584A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M99/00—Subject matter not otherwise provided for in other groups of this subclass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure

Definitions

  • the present invention relates to a new form of medium for cell culture that suppresses powdering during use and has sufficient solubility in an aqueous solution, and is useful in the technical field related to cell culture.
  • the cell culture medium assists and maintains cell growth in an artificial environment.
  • the cell culture medium may contain more than 10 components.
  • Many cell culture media are provided as a finely ground dry powder mixture. They are manufactured for the purpose of dissolving in water and / or aqueous solution, and in the dissolved state, often used with other supplements (supplements), from cell growth and / or cells of the same organism. It is designed to supply biological cells with basic nutritional components for the production of biopharmaceutical preparations, and is widely used in fields such as pharmaceutical research and development.
  • the finely crushed powdered cell culture medium had a problem to be improved in terms of its handling. For example, there is a problem that it is very dusty to handle, and it becomes difficult to handle it especially when handling a large amount of dust.
  • Another challenge when using finely ground dry powder media is that it can be very difficult to moisten the finely ground powder and dissolve it in an aqueous liquid, which is not always convenient. The point is that. Therefore, there has been a demand for a cell culture medium that can solve such problems and is more convenient to handle.
  • Patent Document 1 and Patent Document 2 disclose a granulated cell culture medium, but do not disclose a hexahedral or tablet-shaped cell culture medium.
  • Patent Document 3 discloses pelletized cell culture medium, but does not disclose hexahedral or tablet-shaped cell culture medium.
  • Patent Document 4 discloses a tableted medium for cell culture, but the size of the specifically disclosed tablet is limited to one having a thickness of 1 to 5 mm and a diameter of 19 mm. The weight of one of these tablets is small, and when preparing a large amount of medium exceeding 100 ml, it is necessary to measure a large amount of tablets, which is not always necessary from the usage of cell culture medium in the field of research and development and production. It is not very convenient. Patent Document 4 does not disclose, and specifically discloses, a tableted cell culture medium containing a buffer such as HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine ethanesulfonic acid). The tableting method used is limited to the granulation tableting method including the step of granulating the medium component for cell culture.
  • a buffer such as HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine ethanesulfonic acid
  • An object of the present invention is a new form of cell culture medium that solves the above-mentioned problems of the powdered cell culture medium, suppresses powdering during use, and improves solubility in an aqueous solution.
  • the purpose is to provide a tablet-formed cell culture composition that is more convenient in research and development and production sites.
  • the medium powder for cell culture is formulated by the direct tableting method
  • the formulation cannot always be performed well depending on the medium components.
  • One of the objects of the present invention is to solve this new problem and to provide a high-quality tablet-molded cell culture composition by a direct locking method.
  • the present inventor has completed the present invention as a result of diligent studies to solve the above problems. Specifically, the present invention is as follows.
  • Composition for culture is provided.
  • a cell culture composition containing a cell culture medium component and a buffer which has a shape formed by tableting.
  • Step (1) A step of producing a mixed powder containing a cell culture medium component and a buffer and / or a surfactant.
  • Step (2) A step of directly locking the mixed powder produced in the step (1) by a locking method.
  • the composition for cell culture of the present invention suppresses powdering during use and has sufficient solubility in an aqueous solution, and is highly convenient in handling when preparing a medium for cell culture. It is improving. Furthermore, when packaging the cell culture composition of the present invention, nitrogen substitution and deaeration in the packaging material are also possible, so that the stability of the quality as a medium can be improved. In addition, the powder medium often causes a weighing error during use, but the cell culture composition of the present invention contains a certain amount of cell culture medium components per unit of the composition. Such weighing work can be omitted, work efficiency can be improved, and contamination by dust at the work site can be prevented.
  • the cell culture composition of the present invention is expected to be particularly convenient for use on a research scale.
  • the results of comparison of the compositions of BASAL3 medium component, FEED2 medium component and DMEM medium component are shown.
  • the correlation between the content of HEPES in the cell culture composition examined in Example 2 below and the disintegration strength of the tablet-molded cell culture composition is shown.
  • the correlation between the tableting pressure and the disintegration strength at the time of producing the cell culture composition examined in Example 3 described later is shown.
  • the correlation between the content of poloxamer in the cell culture composition examined in Example 4 below and the disintegration strength of the tableted cell culture composition is shown.
  • the evaluation result of the hygroscopicity of the cell culture composition examined in Test Example 1 described later is shown.
  • the evaluation result of the medium performance of the cell culture composition examined in Test Example 3 described later is shown.
  • the evaluation result of the medium performance of the cell culture composition examined in Test Example 4 described later is shown.
  • the first embodiment of the present invention is "A cell culture composition containing a cell culture medium component having a hexahedral shape having a side length of 10 mm or more or a tablet shape having a thickness of 10 mm or more and a diameter of 25 mm or more.” (Embodiment). 1) Is.
  • the cell culture composition can be produced by tableting a powder containing a cell culture medium component by a tableting method usually used in the art.
  • the "cell culture medium” used is not particularly limited, and is used for cell culture usually used in the art, including cells such as animals (for example, mammals), plants, insects, bacteria, fungi, yeast and the like. A medium can be used.
  • the “cell culture medium component” refers to a component contained in the cell culture medium.
  • an appropriate additive other than the “cell culture medium component” when producing the cell culture composition, an appropriate additive other than the “cell culture medium component” can be added, if necessary. Even if the "cell culture medium component" is already contained, for example, adding the same component further when the quantity is insufficient is also included in the “addition of additive” here.
  • additives include those commonly used in the art, such as buffers (HEPES), growth factors (insulin, transferrin), surfactants (water-soluble polymers (eg, poloxamers)). ), Lipids, glutamine, peptone and the like, and those skilled in the art can appropriately select and add them according to the purpose.
  • the content of the "cell culture medium component” is 70 to 100 wt%, and the content of the additive is 0 to 30 wt%.
  • the tableting method is not particularly limited, and a method of directly tableting a powder containing a cell culture medium component (hereinafter, may be abbreviated as "direct tableting method") or a powder containing a cell culture medium component is used. Any method can be used in which granules are once granulated to obtain granules and the granules are tableted (hereinafter, may be abbreviated as "granule tableting method”). Further, the granulation method when the "granule tableting method” is used is not particularly limited, and either the wet granulation method or the dry granulation method can be used.
  • a person skilled in the art can appropriately select a suitable method according to the characteristics of the cell culture medium component.
  • the above additives can be added as needed before tableting or before and after granulation, as appropriate according to methods usually practiced in the art.
  • the specific operation in each locking method can be performed according to the method usually performed in the art.
  • locking can be performed using a single-shot lock machine, a rotary lock machine, or the like.
  • Mixing operations and granulation operations can also be performed by methods usually performed in the art.
  • the tableting pressure at the time of tableting is not particularly limited, but in the present invention, the disintegration strength of the cell culture composition produced can be adjusted by adjusting the tableting pressure.
  • Those skilled in the art can appropriately select the locking pressure, but for example, it is preferable to lock in the range of 0.4 kN / cm 2 to 7.0 kN / cm 2 . More preferably, it is in the range of 0.7 kN / cm 2 to 4.0 kN / cm 2 .
  • the disintegration strength of the produced cell culture composition varies depending on the characteristics of the cell culture medium component and other added components, the tableting pressure, etc., but the disintegration strength is 0.5 kg / cm 2 or more. It is preferable, more preferably 0.5 kg / cm 2 or more and 15 kg / cm 2 or less, and particularly preferably 1.0 kg / cm 2 or more and 15 kg / cm 2 or less, which is convenient for use in research and development and production sites. Highly sexual.
  • the weight of one unit of the produced cell culture composition can be appropriately selected, but those of 0.5 g or more and 150 g or less, more preferably 5 g or more and 50 g or less, and more preferably 10 g or more and 20 g or less are studied. Highly convenient for use in development and production sites.
  • the "direct tableting method" When using, it is preferable, but not particularly limited, to tablet after adjusting so that the cell culture composition contains 2 to 20 wt% of each of the buffer and / or the surfactant.
  • the cell culture medium contains a buffer and / or a surfactant as a component thereof, the total amount of the added buffer and / or the surfactant may be the above content.
  • the cell culture composition has a hexahedral shape having a side length of 10 mm or more, or a tablet shape having a thickness of 10 mm or more and a diameter of 25 mm or more.
  • the tablet shape may have dents, secant lines, mark printing, and the like, if necessary.
  • the "hexahedron shape” includes both a rectangular parallelepiped shape and a cube shape. In the case of the hexahedral shape, the length of all sides is 10 mm or more, but the hexahedral shape in which the length of all sides is 10 mm or more and 70 mm or less is preferable.
  • the hexahedral shape has all side lengths of 10 mm or more and 50 mm or less, and more preferably 10 mm or more and 30 mm or less.
  • the "tablet shape” includes both a disk shape and a cylindrical shape. In the case of the tablet shape, the thickness is 10 mm or more and the diameter is 25 mm or more, but the tablet shape having a thickness of 10 mm or more and 50 mm or less and a diameter of 25 mm or more and 70 mm or less is preferable. A tablet shape having a thickness of 10 mm or more and 30 mm or less and a diameter of 25 mm or more and 50 mm or less is more preferable.
  • the shape and size can be achieved by appropriately selecting a locking machine in the locking process. Those skilled in the art can appropriately select the method.
  • the cell culture composition in the present embodiment solves various problems such as powdering and moisture absorption, which have been problems of the conventional powdered cell culture medium, and in addition to this, has a specific size as described above.
  • it is easier to handle and more easily quantified at the time of use as compared with the cell culture medium in the form of granules or smaller tablets due to having the shape and shape. It has higher convenience. It is expected that the effect will be great especially when used on a research scale.
  • a second embodiment of the present invention "A cell culture composition containing a cell culture medium component and a buffer having a shape formed by tableting" (Embodiment 2). Is.
  • the cell culture composition is prepared by producing a mixed powder containing a cell culture medium component and a buffer, and then the mixed powder is tableted and molded by a tableting method usually used in the art.
  • Can be manufactured by The "cell culture medium" used is as described in the first embodiment.
  • buffering agent examples include those commonly used in the art, such as HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine ethanesulfonic acid), MES, Bis-Tris, PIPES, MOPS. Etc. are preferable. Of these, HEPES is preferred.
  • an appropriate additive other than the "cell culture medium component” and the “buffering agent” can be added as necessary. Even if the "cell culture medium component” is already contained, for example, adding the same component further when the quantity is insufficient is also included in the “addition of additive” here. Suitable additives include those described in "Embodiment 1" above.
  • the content of the "cell culture medium component” is 70 to 98 wt%, and the total content of the buffer and the additive is 2 to 30 wt%.
  • the content of the "buffering agent” in the “cell culture composition” is 2 to 20 wt%.
  • the tableting method is not particularly limited, and a method of directly tableting a mixed powder containing a cell culture medium component and a buffer (hereinafter, may be abbreviated as "direct tableting method") or a cell culture medium component.
  • direct tableting method Any of the methods of granulating a mixed powder containing a buffer and obtaining granules and then tableting the granules (hereinafter, may be abbreviated as "granule tableting method”) can be used.
  • the granulation method when the "granule tableting method” is used is not particularly limited, and either the wet granulation method or the dry granulation method can be used.
  • a person skilled in the art can appropriately select a suitable method according to the characteristics of the cell culture medium component.
  • the above additives can be added as necessary before tableting or granulation, as appropriate according to methods usually practiced in the art.
  • the specific operation in each locking method can be performed according to the method usually performed in the art. For example, locking can be performed using a single-shot lock machine, a rotary lock machine, or the like. Mixing operations and granulation operations can also be performed by methods usually performed in the art.
  • the present inventor In the process of examining a cell culture composition that has been tablet-molded by the direct tableting method, the present inventor cannot necessarily lead to a cell culture composition of interest in all cell culture media. Faced with new challenges. As a result of appealing the cause, the presence of HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine ethanesulfonic acid), which is a component that may be contained in the medium as a buffer after dissolution in an aqueous solution, is struck. It was found that it is necessary for the formation of a cell culture composition by tablet molding.
  • the "cell culture composition" contains a "buffering agent", which is not particularly limited. However, it is considered that it is preferably contained in an amount of 2 wt% or more, more preferably 2 to 20 wt% for molding by the direct tableting method.
  • the tableting pressure at the time of tableting is not particularly limited, but in the present invention, the disintegration strength of the cell culture composition produced by adjusting the tableting pressure can be adjusted.
  • Those skilled in the art can appropriately select the locking pressure, but for example, it is preferable to lock in the range of 0.4 kN / cm 2 to 7.0 kN / cm 2 . More preferably, it is in the range of 0.7 kN / cm 2 to 4.0 kN / cm 2 .
  • the disintegration strength of the produced cell culture composition varies depending on the characteristics of the cell culture medium component and other added components, the tableting pressure, etc., but the disintegration strength is 0.5 kg / cm 2 or more. It is preferable, more preferably 0.5 kg / cm 2 or more and 15 kg / cm 2 or less, and particularly preferably 1.0 kg / cm 2 or more and 15 kg / cm 2 or less, which is convenient for use in research and development and production sites. Highly sexual.
  • the weight of one unit of the produced cell culture composition can be appropriately selected, but those having a weight of 0.5 g or more and 20 g or less are highly convenient for use in research and development and production sites.
  • the shape of the "cell culture composition” in this embodiment is not particularly limited, and has a shape formed by locking.
  • a hexahedral shape (rectangular parallelepiped shape or cubic shape), a tablet shape, a caplet shape, or the like can be taken.
  • it has a hexahedral shape and a tablet shape.
  • the shape can be selected by appropriately selecting a locking machine or the like.
  • the size of the "cell culture composition” in the present embodiment is not particularly limited, but for example, when the "cell culture composition" has a hexahedral shape, the length of one side is 10 mm or more. It is preferable that the hexahedral shape has a side length of 10 mm or more and 70 mm or less.
  • the "cell culture composition” has a tablet shape, it preferably has a thickness of 10 mm or more and a diameter of 25 mm or more, a thickness of 10 mm or more and 50 mm or less, and a diameter of 25 mm. It is more preferable that the tablet shape is 70 mm or more and 70 mm or less.
  • the cell culture composition in the present embodiment solves various problems such as powdering, which has been a problem of the conventional powdered cell culture medium, as in the case of the first embodiment, and is specific. When carried out in the form of a composition having a size and shape, it is easier to handle and more convenient to quantify at the time of use than a medium for cell culture in the form of granules or a smaller tablet. Etc., which have higher convenience in the field of cell culture. Further, the cell culture composition of the present embodiment has a novel feature of appropriately adding a buffer such as HEPES regardless of the type of cell culture medium, and thus is a direct tableting method instead of the granule tableting method.
  • a buffer such as HEPES
  • the present invention has new features not found in conventional products.
  • a medium for culture can be provided.
  • the direct tableting method since there is no moisture absorption or heat history in the granulation step in the granule tableting method, the cell culture composition by the direct tableting method is compared with that by the granule tableting method. Therefore, the quality becomes more stable.
  • a third embodiment of the present invention "A cell culture composition containing a cell culture medium component and a surfactant having a shape formed by tableting" (Embodiment 3). Is.
  • the cell culture composition is prepared by producing a mixed powder containing a cell culture medium component and a surfactant, and then the mixed powder is tableted by a tableting method usually used in the art. It can be manufactured by.
  • the "cell culture medium” used is as described in the first embodiment.
  • surfactant examples include those usually used in the art, but a water-soluble polymer is preferable, and poloxamer is particularly preferable.
  • an appropriate additive other than the “cell culture medium component” and the “surfactant” can be added as necessary. Even if the "cell culture medium component” is already contained, for example, adding the same component further when the quantity is insufficient is also included in the “addition of additive” here. Suitable additives include those described in "Embodiment 1" above.
  • the content of the "cell culture medium component” is 70 to 98 wt%, and the total content of the buffer and the additive is 2 to 30 wt%.
  • the content of the "surfactant” in the “cell culture composition” is 2 to 20 wt%.
  • the tableting method is not particularly limited, and the cell culture composition of the present invention can be obtained by tableting according to the method described in "Embodiment 2" above.
  • a fourth embodiment of the present invention "A cell culture composition containing a cell culture medium component, a buffering agent and a surfactant, which has a shape formed by tableting" (Embodiment 4). Is.
  • the cell culture composition is prepared by producing a mixed powder containing a cell culture medium component, a buffering agent and a surfactant, and then the mixed powder is beaten by a tableting method usually used in the art. It can be manufactured by tablet molding.
  • the "cell culture medium” used is as described in the first embodiment.
  • the content of the "cell culture medium component” is 60 to 96 wt%, and the total content of the buffer and the additive is 4 to 40 wt%.
  • the contents of the "buffering agent” and the “surfactant” in the “cell culture composition” are 2 to 20 wt%, respectively.
  • the tableting method is not particularly limited, and the cell culture composition of the present invention can be obtained by tableting according to the method described in "Embodiment 2" above.
  • the advantages of containing a buffer in the cell culture composition of the present invention are as described above, but as a result of further studies by the present inventor, the presence of the surfactant is found in cells produced by tableting. It has also been found to affect the disintegration strength of the culture composition. As demonstrated in Example 4 below, it is possible to adjust the disintegration strength of the produced cell culture composition by adding a surfactant, and the cell culture has a disintegration strength according to the purpose. Composition can be obtained. Therefore, although not essential, in the case of producing a tablet-molded cell culture composition, it is desirable and particularly limited that the "cell culture composition" contains a "surfactant". However, it is preferably contained in an amount of 2 wt% or more, more preferably 2 to 20 wt%.
  • the tableting pressure at the time of tableting is not particularly limited, but in the present invention, the cell culture produced by adjusting the tableting pressure is used.
  • the decay strength of the composition for use can be adjusted.
  • Those skilled in the art can appropriately select the locking pressure, but for example, it is preferable to lock in the range of 0.4 kN / cm 2 to 7.0 kN / cm 2 . More preferably, it is in the range of 0.7 kN / cm 2 to 4.0 kN / cm 2 .
  • the disintegration strength of the produced cell culture composition varies depending on the characteristics of the cell culture medium component and other added components, the tableting pressure, etc., but the disintegration strength is 0.5 kg / cm 2 or more. It is preferable, more preferably 0.5 kg / cm 2 or more and 15 kg / cm 2 or less, and particularly preferably 1.0 kg / cm 2 or more and 15 kg / cm 2 or less, which is convenient for use in research and development and production sites. Highly sexual.
  • the weight of one unit of the produced cell culture composition can be appropriately selected, but those having a weight of 0.5 g or more and 20 g or less are highly convenient for use in research and development and production sites.
  • the shape of the "cell culture composition” is not particularly limited, and has a shape formed by locking.
  • a hexahedral shape (rectangular parallelepiped shape or cubic shape), a tablet shape, a caplet shape, or the like can be taken.
  • it has a hexahedral shape and a tablet shape.
  • the shape can be selected by appropriately selecting a locking machine or the like.
  • the size of the "cell culture composition” is not particularly limited, but for example, when the "cell culture composition" has a hexahedral shape, the length of one side is preferably 10 mm or more, and one side is preferable. More preferably, it has a hexahedral shape having a length of 10 mm or more and 70 mm or less.
  • the "cell culture composition” has a tablet shape, it preferably has a thickness of 10 mm or more and a diameter of 25 mm or more, a thickness of 10 mm or more and 50 mm or less, and a diameter of 25 mm. It is more preferable that the tablet shape is 70 mm or more and 70 mm or less.
  • the cell culture composition in the present embodiment is a problem of the conventional powdered cell culture medium as in the case of the first embodiment.
  • it is more than a cell culture medium in the form of granules or a smaller tablet. It is more convenient in the field of cell culture because it is easy to handle and quantification at the time of use is easier.
  • the method for producing a cell culture composition containing a cell culture medium component by the direct tableting method of the present invention includes "a cell culture medium component having a shape formed by tableting and a cell culture medium component having a shape formed by tableting" including the following two steps.
  • a method for producing a cell culture composition containing a buffer and / or a surfactant that is, (1) a buffer only, (2) a surfactant only, or (3) both a buffer and a surfactant).
  • Step (1) A step of producing a mixed powder containing a cell culture medium component and a buffer and / or a surfactant
  • Step (2) A direct tableting method of the mixed powder produced in the step (1). The process of locking by.
  • step (1) a mixed powder containing a cell culture medium component and a buffer and / or a surfactant is produced, and the cell culture medium used contains a buffer and / or a surfactant as a component thereof. If not, it is necessary to add a buffer and / or surfactant from the outside. In addition, even if the cell culture medium used contains a buffer and / or a surfactant as a component thereof, if the amount is insufficient, the buffer and / or the surfactant should be added from the outside. Is required.
  • a mixed powder containing a cell culture medium component and a buffer and / or a surfactant is prepared by mixing the cell culture medium component and a buffer and / or a surfactant by a method commonly used in the art. can do. If the cell culture medium used already contains a sufficient buffer component and / or surfactant component, it is not always necessary to add the buffer and / or surfactant from the outside. In this case, a mixture of the media can be applied to the next step (2) as the "mixed powder" in the step (1).
  • step (1) if necessary, an appropriate additive other than the "cell culture medium component", buffer and / or surfactant can be added to prepare a mixed powder.
  • the content of the "cell culture medium component" in the “cell culture composition” is 60 to 96 wt%, and the buffer and / or the surfactant and the additive are used.
  • the total content is 4-40 wt%.
  • the contents of the "buffering agent” and the “surfactant” in the “cell culture composition” are 2 to 20 wt%, respectively.
  • the step (2) is a step of directly locking the mixed powder produced in the step (1) by a direct locking method, but the specific locking operation may be performed according to a method usually performed in the art. it can.
  • the tableting pressure at the time of tableting can be appropriately selected by those skilled in the art, but for example, it is preferable to lock in the range of 0.4 kN / cm 2 to 7.0 kN / cm 2 . More preferably, it is in the range of 0.7 kN / cm 2 to 4.0 kN / cm 2 .
  • Example 1 Examination of tableting characteristics of various cell culture media
  • the "cell culture composition” was produced by the direct tableting method according to the following procedure. 1. 1. 13.5 g of BASAL3 medium, 11 g of FFED2 medium, and 13.5 g of DMEM medium were weighed in a weighing dish. 2. Using a spatula, each weighed medium is filled into a mortar 24 ⁇ 19 mm set in a desktop prototype locker (FY-TQMB-30 Tabquick Mini) manufactured by Fuji Yakuhin Kikai Co., Ltd. If the filling could not be completed, the upper pestle was manually lowered and all the weighed medium was filled in the mortar by applying pressure. 3. 3. The amount of penetration of the upper punch was set to 9 mm, and locking was started. 4.
  • the tableting pressure was 0.62 to 0.66 kN / cm 2 . 5. After confirming that the position of the upper punch returned to the initial value, the lever of the lower punch was pulled, the lower punch was pushed up, and the locked medium was pushed out from the mortar.
  • the BASAL3 medium and the FEED2 medium may be abbreviated as the target “composition for cell culture having a shape formed by tableting (" rectangular parallelepiped shape "in this example)” (hereinafter, "target composition"). I was able to get). On the other hand, the DMEM medium could not be tableted and the target composition could not be obtained.
  • the tablet-molded BASAL3 medium and FEED2 medium had rectangular parallelepiped shapes with sides of 18 mm, 23 mm, and 26 mm, respectively.
  • FIG. 1 shows a composition comparison of each component of BASAL3 medium, FEED2 medium and DMEM medium.
  • DMEM medium for which the "target composition” could not be produced due to insufficient tableting molding, inorganic salts accounted for 50% of the total, and the types of sugar and amino acid components were small.
  • the FEED2 medium does not contain saccharides, it was judged that the saccharides are components that do not affect the tableting characteristics because the "target composition" can be produced.
  • HEPES which is the buffering agent having the highest content in FEED2 medium, was judged to be a component affecting the tableting characteristics, and the effect of the HEPES content on the tableting characteristics was further investigated.
  • Example 2 Examination of the effect of the HEPES content in the cell culture composition on the tableting characteristics
  • each mixed powder sample was prepared by adding finely pulverized HEPES to DMEM medium so as to be 0.1 wt%, 3 wt%, and 10 wt%. 6. 13.5 g of each mixed powder sample prepared was weighed and placed in a 50 ml polypropylene conical tube. Five of these were prepared for each mixed powder sample. 7. A ⁇ 30 mm ordinary R lock pestle was set on HANDTAB-100T15 manufactured by Ichihashi Seiki Co., Ltd. The mixed powder sample weighed in an 8.50 ml polypropylene conical tube was filled into a mortar using a spatula.
  • the upper punch was manually lowered to pressurize, and the weighed mixed powder sample was filled in the whole punch. 9.
  • the upper pestle was manually lowered to adjust the height to the mortar surface.
  • the lower punch was raised with a hydraulic jack, and the pressure was increased to 5 kN (0.71 kN / cm 2 ) with the pressure gauge of the hydraulic jack.
  • the pressure of the hydraulic jack is released, the upper punch is manually pulled up, while the lower punch is raised by the hydraulic jack, the tableted mixed powder sample is pushed up, and the tablet is locked with a gauge pressure of 5 kN (0.71 kN / cm 2 ).
  • a sample for measuring the decay strength of the molded "cell culture composition" was prepared.
  • the HEPES content in the "cell culture composition” is preferably 0.1 wt% or more in order to obtain good disintegration strength. It was considered necessary to contain 2 wt% or more, more preferably 3 wt% or more.
  • the upper limit of the HEPES content is not particularly limited and can be appropriately determined in consideration of the characteristics of the cell culture medium to be used, but it is preferable that the content in the "cell culture composition” is 20 wt% or less. Conceivable.
  • Example 3 Examination of the effect of tableting pressure on the disintegration strength during the production of a cell culture composition
  • a "cell culture composition" for measuring disintegration strength was prepared by tableting with a gauge pressure of 8.0.71 kN / cm 2 . 9. 8. Of the pressure of the hydraulic jacks, respectively 1.06kN / cm 2, 1.42kN / cm 2, and 2.12kN / cm 2 to change do the same procedure, for a different disintegration strength measurements of tableting pressure ""Composition for cell culture” was prepared.
  • Example 4 Examination of the effect of the poloxamer content in the cell culture composition on the tableting properties
  • DMEM medium self-prepared DMEM medium (SIGMA-AldrichD2902 equivalent)
  • finely pulverized poroxamer manufactured by BASF; using Kolliphor P188Bio
  • BASF self-prepared DMEM medium
  • Kolliphor P188Bio finely pulverized poroxamer
  • each mixed powder sample was prepared by adding finely pulverized poloxamer to DMEM medium so as to be 0.5 wt%, 1.0 wt%, 5.0 wt%, and 10.0 wt%. 6. 13.5 g of each mixed powder sample prepared was weighed and placed in a 50 ml polypropylene conical tube. Three of these were prepared for each mixed powder sample. 7. A ⁇ 30 mm ordinary R lock pestle was set on HANDTAB-100T15 manufactured by Ichihashi Seiki Co., Ltd. The mixed powder sample weighed in an 8.50 ml polypropylene conical tube was placed in a mortar using a spatula.
  • the upper punch was manually lowered to pressurize, and the weighed mixed powder sample was filled in the whole punch. 9.
  • the upper pestle was manually lowered to adjust the height to the mortar surface.
  • the lower punch was raised with a hydraulic jack, and the pressure was increased to 5 kN (0.71 kN / cm 2 ) with the pressure gauge of the hydraulic jack.
  • the pressure of the hydraulic jack is released, the upper punch is manually pulled up, while the lower punch is raised with the hydraulic jack, and the tableted mixed powder sample is pushed up and locked with a gauge pressure of 5 kN (0.71 kN / cm 2 ).
  • a sample for measuring the decay strength of the molded "cell culture composition" was prepared.
  • Test Example 1 Evaluation of hygroscopicity
  • Espec Stability Test Chamber CHS-122 (Espec Co., Ltd.) controlled at 3.25 ° C./60% RH and absolute humidity 13.81 g / m 3 , each medium placed on a petri dish on which the weight was recorded was placed and exposed. It was. Then, it was taken out from Espec Stability Test Chamber CHS-122 at 5 min intervals, and the weight of each medium was measured and recorded. The evaluation was repeated at 5 min intervals until the elapse of 4.30 min, and the weight was measured and recorded. After 5.30 min, moisture was absorbed in Espec Stability Test Chamber CHS-122 for up to 60 min. After 6.60 minutes, the weight of each medium was measured and recorded, and the test was completed. 7.
  • Hygroscopicity For each medium, the hygroscopicity (%) was determined from the amount of increase in each weight measurement frequency from the weight of Initial. Hygroscopicity (%) is [Measured value (g) -Initial (g)] / Initial (g) x 100 Calculated in.
  • BASAL3 Powder medium a tableted product was placed in a 500 ml beaker, and FEED2Powerer medium was used in a 200 ml beaker, and Otsuka's water for injection determined from the sample weight was weighed. 4. After the stirrer bar 30 mm was put in, it was placed on an As ONE magnet stirrer RS-6AN magnet stirrer and stirring was started. The stirring strength was adjusted to the same strength as when the Powerer medium was dissolved. 5. The weighed BASAL3 Powerer medium and BASAL3 tableted cell culture composition, and FEED2 Powder medium and FEED2 tableted cell culture composition were put into each beaker, the measurement of the dissolution time was started, and the time of complete dissolution was recorded. did.
  • the difference in the total number of insoluble substances is that each component is dispersed in the solution immediately after the Poder medium is added, and dissolution starts from the easily soluble component, but the tableting medium is in the form of a block at the initial stage of dissolution and exists in the solution. Therefore, it is dissolved from the surface where the solution is in contact with the surface as a medium component, and it is considered that it is easily affected by the salt dissolution effect and the change of the isoelectric point at the time of amino acid dissolution, and this difference is totally insoluble. It was considered that there was a difference in the number of items.
  • a cell culture test was conducted using a cell culture composition obtained by tableting and molding a BASAL3 medium (compression-molded cell culture composition in Example 1) (sometimes referred to as a Cube product in this test) and a BASAL3 Powerer medium. Then, VCD (live cell density) and IgG titer (antibody production amount) were compared. The cells used and other evaluation conditions are shown in Table 2 below. The measurement was performed on the 4th, 7th, 9th and 11th days after the start of the culture.
  • BASAL3 medium compression-molded cell culture composition in Example 1
  • VCD live cell density
  • IgG titer antibody production amount
  • a cell culture test was conducted using a cell culture composition obtained by tableting and molding FEED2 medium (compression-molded cell culture composition in Example 1) (sometimes referred to as a Cube product in this test) and FEED2 Powerer medium. Then, VCD (live cell density) and IgG titer (antibody production amount) were compared. The cells used and other evaluation conditions are shown in Table 3 below. The measurement was performed on the 4th, 7th, 9th and 11th days after the start of the culture.
  • the present invention relates to a new form of medium for cell culture that suppresses powdering during use and has sufficient solubility in an aqueous solution, and is useful in the technical field related to cell culture.

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Abstract

本発明は、使用時の粉立ちを抑え、かつ十分な水溶液への溶解性を有する新たな形態の細胞培養用培地であって、研究開発や生産現場でのより利便性の高い固形細胞培養用培地組成物である、打錠により成形された特定の形状を有する、細胞培養用培地成分含む細胞培養用組成物を提供する。

Description

細胞培養用組成物
　本発明は、使用時の粉立ちを抑え、かつ十分な水溶液への溶解性を有する新たな形態の細胞培養用の培地に関し、細胞培養関連の技術分野において有用である。
　細胞培養用培地は、人工環境において細胞の成長を補助および維持する。成長を補助しようとする生物の種類に応じて、細胞培養用培地は、１０種を超える成分を含み得る。多くの細胞培養用培地は、微粉砕された乾燥粉末混合物として提供されている。これらは、水および／または水溶液中に溶解させる目的で製造され、更に、溶解された状態で、多くの場合他の補充添加物（サプリメント）と共に用いて、細胞成長および／または同一生物細胞からのバイオ医薬製剤の生産のための基本的な栄養主成分を生物細胞に供給できるように設計されており、医薬品の研究開発等の分野で広く用いられている。
　しかし、微細に粉砕された粉末状の細胞培養用培地は、その取扱い上改善すべき課題があった。例えば、取り扱うには非常に粉塵が多く、特に大量の取り扱いではその取り扱いが困難になるという課題があった。微粉砕された乾燥粉末培地を使用するに際しての別の課題としては、微粉砕粉末を湿潤させ、それを水性液体に溶解させることは非常に困難な場合があり、必ずしも利便性の高いものではないとの点が挙げられる。従って、このような課題を解決できるより取り扱い上の利便性の向上した細胞培養用培地が求められていた。
　特許文献１と特許文献２は、顆粒化された細胞培養用培地について開示しているが、６面体形状やタブレット形状の細胞培養用培地については開示していない。
　特許文献３は、ペレット化された細胞培養用培地について開示しているが、６面体形状やタブレット形状の細胞培養用培地については開示していない。
　特許文献４は、タブレット化された細胞培養用培地について開示しているが、具体的に開示されたタブレットの大きさは、厚さが１～５ｍｍ、直径が１９ｍｍのものに限られている。これらのタブレット１つでは重量が小さく、１００ｍｌを超えて大量に培地を調整する場合は、タブレットを大量に計測する必要があり研究開発や生産の現場での細胞培養用培地の使用状況からは必ずしも利便性の高いものではない。特許文献４は、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）のような緩衝剤を含むタブレット化された細胞培養用培地を開示しておらず、また具体的に開示されたタブレット化の手法は、細胞培養用培地成分を造粒する工程を含む顆粒打錠法に限られている。
特表２０１３－５４５４８４号公報 特表２００２－５１５７５８号公報 特表２０１８－５３７１１３号公報 特開平２－５７１７５号公報
　本発明の目的は、上記の粉末状の細胞培養用培地の有する課題を解決し、使用時の粉立ちを抑え、かつ水溶液への溶解性を向上させた新たな形態の細胞培養用培地であって、研究開発や生産現場でより利便性の高い打錠成形された細胞培養用組成物を提供することである。
　また、本発明の過程で、細胞培養用培地粉末を直接打錠法により製剤化する場合、培地成分によっては必ずしも製剤化を良好に行うことができないという課題も見出された。本発明は、この新たな課題をも解決して、直接打錠法による良質な打錠成形された細胞培養用組成物を提供することを、その目的の一つとする。
　本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討した結果本発明を完成した。具体的には、本発明は以下の通りである。
［１］一辺の長さが１０ｍｍ以上である６面体形状、または厚みが１０ｍｍ以上であり、直径が２５ｍｍ以上であるタブレット形状を有する、細胞培養用培地成分を含む細胞培養用組成物。
［２］一辺の長さが１０ｍｍ以上７０ｍｍ以下である６面体形状、または、厚みが１０ｍｍ以上５０ｍｍ以下であり、直径が２５ｍｍ以上７０ｍｍ以下であるタブレット形状を有する、上記［１］に記載の細胞培養用組成物。
［３］打錠により成形された形状を有する、細胞培養用培地成分および緩衝剤を含む細胞培養用組成物。
［４］打錠により成形された形状を有する、細胞培養用培地成分および界面活性剤を含む細胞培養用組成物。
［５］打錠により成形された形状を有する、細胞培養用培地成分、緩衝剤および界面活性剤を含む細胞培養用組成物。
［６］緩衝剤を２ｗｔ％以上２０ｗｔ％以下含む、上記［３］または［５］に記載の細胞培養用組成物。
［７］緩衝剤が、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）である、上記［３］、［５］または［６］のいずれか一つに記載の細胞培養用組成物。
［８］界面活性剤を２ｗｔ％以上２０ｗｔ％以下含む、上記［４］～［７］に記載の細胞培養用組成物。
［９］界面活性剤が、水溶性ポリマーである、上記［４］～［８］のいずれか一つに記載の細胞培養用組成物。
［１０］界面活性剤が、ポロキサマーである、上記［４］～［９］のいずれか一つに記載の細胞培養用組成物。
［１１］６面体形状またはタブレット形状を有する、上記［３］～［１０］のいずれか一つに記載の細胞培養用組成物。
［１２］直接打錠法により製造される、上記［３］～［１１］のいずれか一つに記載の細胞培養用組成物。
［１３］崩壊強度が、０．５ｋｇ／ｃｍ２以上１５ｋｇ／ｃｍ２以下である、上記［１］～［１２］のいずれか一つに記載の細胞培養用組成物。
［１４］一組成物の重量が、０．５ｇ以上１５０ｇ以下である、上記［１］～［１３］のいずれか一つに記載の細胞培養用組成物。
［１５］以下の２工程を含む、打錠により成形された形状を有する、細胞培養用培地成分、および、緩衝剤および／または界面活性剤、を含む細胞培養用組成物の製造方法。
工程（１）：細胞培養用培地成分と緩衝剤および／または界面活性剤を含む混合粉末を製する工程。
工程（２）：工程（１）で製せられた混合粉末を直接打錠法により打錠する工程。
［１６］工程（２）における打錠圧が、０．４ｋＮ／ｃｍ２以上７．０ｋＮ／ｃｍ２以下である、上記［１５］に記載の製造方法。
［１７］細胞培養のための、上記［１］～［１４］のいずれか一つに記載の細胞培養用組成物、または上記［１５］または［１６］に記載の製造方法により得られた細胞培養用組成物の使用。
［１８］上記［１］～［１４］のいずれか一つに記載の細胞培養用組成物、または上記［１５］または［１６］に記載の製造方法により得られた細胞培養用組成物から調製された液体中で、細胞を培養する方法。
［１９］上記［１］～［１４］のいずれか一つに記載の細胞培養用組成物、または上記［１５］または［１６］に記載の製造方法により得られた細胞培養用組成物から調製された液体中で、タンパク質を培養する方法。
　本発明の細胞培養用組成物は、使用時の粉立ちが抑えられ、かつ十分な水溶液への溶解性を有しており、細胞培養用の培地を調製するに際しての取り扱い上の利便性が大きく向上している。さらに、本発明の細胞培養用組成物をパッケージングするにあたって、包材内の窒素置換や脱気も可能となるため、培地としての品質の安定性を向上させることが可能となる。また、粉末培地では使用時の秤量ミスが発生することが多かったが、本発明の細胞培養用組成物では、一単位の組成物あたり一定量の細胞培養用培地成分が包含されているため、このような秤量作業を省略することができ、作業効率の向上が可能であるとともに、作業現場の粉塵による汚染をも防ぐことができる。本発明の細胞培養用組成物は、とりわけ、研究スケールでの使用の利便性が高いことが期待される。
ＢＡＳＡＬ３培地成分、ＦＥＥＤ２培地成分およびＤＭＥＭ培地成分の組成の比較結果を示す。 後記の実施例２で検討された細胞培養用組成物中のＨＥＰＥＳの含有量と打錠成形された細胞培養用組成物の崩壊強度との相関を示す。 後記の実施例３で検討された細胞培養用組成物製造時の打錠圧と崩壊強度との相関を示す。 後記の実施例４で検討された細胞培養用組成物中のポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）の含有量と打錠成形された細胞培養用組成物の崩壊強度との相関を示す。 後記の試験例１で検討された細胞培養用組成物の吸湿性の評価結果を示す。 後記の試験例３で検討された細胞培養用組成物の培地性能の評価結果を示す。 後記の試験例４で検討された細胞培養用組成物の培地性能の評価結果を示す。
　以下、本発明をその実施形態に沿って詳述する。
［第一の実施形態］
　本発明の第一の実施形態は、
「一辺の長さが１０ｍｍ以上である６面体形状、または厚みが１０ｍｍ以上であり、直径が２５ｍｍ以上であるタブレット形状を有する、細胞培養用培地成分を含む細胞培養用組成物。」（実施形態１）
である。
　本実施形態では、細胞培養用組成物は、細胞培養用培地成分を含む粉末を当技術分野で通常使用される打錠方法により打錠成形することにより製造することができる。
　用いられる「細胞培養用培地」は特に限定されず、例えば動物（例えば、哺乳動物等）、植物、昆虫、細菌、真菌、酵母等の細胞を含む当技術分野で通常使用される細胞培養用の培地を用いることができる。
　「細胞培養用培地成分」とは、当該細胞培養用培地が含有する成分をいう。
　本実施形態では、細胞培養用組成物を製造するにあたっては、必要により「細胞培養用培地成分」以外の適当な添加剤を追加することができる。なお、「細胞培養用培地成分」が既に含む成分であっても、例えば量的に不十分な場合に同じ成分をさらに加えることもここでの「添加剤の追加」に包含される。
　かかる「添加剤」としては、当技術分野で通常使用されるものが挙げられるが、例えば、緩衝剤（ＨＥＰＥＳ）、成長因子（インスリン、トランスフェリン）、界面活性剤（水溶性ポリマー（例えば、ポロキサマー））、脂質、グルタミン、ペプトン等が挙げられ、目的に応じて当業者は適宜選択して添加することができる。
　「細胞培養用組成物」中、「細胞培養用培地成分」の含有量は、７０～１００ｗｔ％、添加剤の含有量は、０～３０ｗｔ％である。
　打錠方法は特に限定されず、細胞培養用培地成分を含む粉末を直接打錠する方法（以下、「直接打錠法」と略称する場合がある）、または細胞培養用培地成分を含む粉末をいったん造粒して顆粒を得て、この顆粒を打錠する方法（以下、「顆粒打錠法」と略称する場合がある）のいずれをも用いることができる。また、「顆粒打錠法」を用いる場合の造粒方法は特に限定されず、湿式造粒法または乾式造粒法のいずれをも用いることができる。いずれの方法を用いるかは、例えば、細胞培養用培地成分の特性に応じて当業者であれば適宜好適な方法を選択することができる。
　上記の添加剤の追加は、打錠前または造粒の前後に適宜当技術分野で通常行われる方法に従って、必要により行うことができる。
　また、各打錠法での具体的な操作は当技術分野で通常行われる方法に従って行うことができる。例えば、単発型打錠機、ロータリー型打錠機等を用いて打錠を行うことができる。混合操作や造粒操作も当技術分野で通常行われる方法により行うことができる。
　打錠を行う際の打錠圧は、特に限定されないが、本発明においては、打錠圧を調節することにより製造された細胞培養用組成物の崩壊強度を調節することができる。当業者であれば適宜打錠圧を選択することができるが、例えば、０．４ｋＮ／ｃｍ２～７．０ｋＮ／ｃｍ２の範囲で打錠することが好ましい。さらに好ましくは、０．７ｋＮ／ｃｍ２～４．０ｋＮ／ｃｍ２の範囲である。
　製造された細胞培養用組成物の崩壊強度は、細胞培養用培地成分やその他添加された成分の特性や打錠圧等により変動するが、崩壊強度が０．５ｋｇ／ｃｍ２以上であるものが好ましく、より好ましくは０．５ｋｇ／ｃｍ２以上１５ｋｇ／ｃｍ２以下、取り分け好ましくは１．０ｋｇ／ｃｍ２以上１５ｋｇ／ｃｍ２以下、であるものが、研究開発や生産現場での使用にあたっての利便性が高い。
　製造された細胞培養用組成物の一単位の重量は適宜選択することができるが、０．５ｇ以上１５０ｇ以下、より好ましくは５ｇ以上５０ｇ以下、より好ましくは１０g以上２０ｇ以下であるものが、研究開発や生産現場での使用にあたって利便性が高い。
　細胞培養用培地成分の特性に応じて当業者であれば適宜好適な打錠方法を選択することができるが、後記の実施形態２～４において詳述されるように、「直接打錠法」を用いる場合には、特に限定される訳ではないが、細胞培養用組成物中に緩衝剤および／または界面活性剤がそれぞれ２～２０ｗｔ％含まれるように調整した後に打錠することが好ましい。細胞培養用培地がその成分として緩衝剤および／または界面活性剤を含む場合には、添加された緩衝剤および／または界面活性剤との総量を上記の含有量とすればよい。
　細胞培養用組成物は、一辺の長さが１０ｍｍ以上である６面体形状、または厚みが１０ｍｍ以上であり、直径が２５ｍｍ以上であるタブレット形状を有する。ここでタブレット形状は、必要により窪みや割線、マークの印字等を有していてもよい。
　「６面体形状」には直方体形状および立方体形状のいずれもが包含される。
　６面体形状の場合、全ての辺の長さが１０ｍｍ以上の形状であるが、全ての辺の長さが１０ｍｍ以上７０ｍｍ以下である６面体形状が好ましい。より好ましくは、全ての辺の長さが１０ｍｍ以上５０ｍｍ以下、さらに好ましくは、１０ｍｍ以上３０ｍｍ以下である６面体形状である。
　「タブレット形状」には円盤形状および円柱形状のいずれもが包含される。
　タブレット形状の場合、厚みが１０ｍｍ以上であり、直径が２５ｍｍ以上の形状であるが、厚みが１０ｍｍ以上５０ｍｍ以下であり、直径が２５ｍｍ以上７０ｍｍ以下であるタブレット形状が好ましい。厚みが１０ｍｍ以上３０ｍｍ以下であり、直径が２５ｍｍ以上５０ｍｍ以下であるタブレット形状がより好ましい。
　当該形状や大きさは、打錠工程で適宜打錠機を選択すること等により達成することができる。当業者であれば適宜その方法を選択することができる。
　本実施形態での細胞培養用組成物は、従来の粉末状の細胞培養用培地の課題であった粉立ちや吸湿等の諸課題を解決するとともに、これに加えて上記のような特定の大きさと形状を有することにより、例えば、顆粒形態やより小型のタブレット形態の細胞培養用培地に比べて、より取扱いが容易であり、かつより使用時の定量が簡便である等、細胞培養の現場においてより高い利便性を有するものである。特に研究スケールでの使用時にその効果が大きいと期待される。
［第二の実施形態］
　本発明の第二の実施形態は、
「打錠により成形された形状を有する、細胞培養用培地成分および緩衝剤を含む細胞培養用組成物。」（実施形態２）
である。
　本実施形態では、細胞培養用組成物は、細胞培養用培地成分および緩衝剤を含む混合粉末を製した後、当該混合粉末を当技術分野で通常使用される打錠方法により打錠成形することにより製造することができる。
　用いられる「細胞培養用培地」は、上記実施形態１で説明された通りである。
　「緩衝剤」は、当技術分野で通常使用されるものが挙げられるが、例えば、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、ＭＥＳ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ等が好ましい。中でも好ましいものは、ＨＥＰＥＳである。
　本実施形態でも、細胞培養用組成物を製造するにあたっては、必要により「細胞培養用培地成分」および「緩衝剤」以外の適当な添加剤を追加することができる。なお、「細胞培養用培地成分」が既に含む成分であっても、例えば量的に不十分な場合に同じ成分をさらに加えることもここでの「添加剤の追加」に包含される。好適な添加剤としては、前記「実施形態１」において説明されたものが挙げられる。
　「細胞培養用組成物」中、「細胞培養用培地成分」の含有量は、７０～９８ｗｔ％、緩衝剤および添加剤の総量の含有量は、２～３０ｗｔ％である。
　「細胞培養用組成物」中、「緩衝剤」の含有量は、２～２０ｗｔ％である。
　打錠方法は特に限定されず、細胞培養用培地成分と緩衝剤を含む混合粉末を直接打錠する方法（以下、「直接打錠法」と略称する場合がある）、または細胞培養用培地成分と緩衝剤を含む混合粉末をいったん造粒して顆粒を得て、この顆粒を打錠する方法（以下、「顆粒打錠法」と略称する場合がある）のいずれをも用いることができる。また、「顆粒打錠法」を用いる場合の造粒方法は特に限定されず、湿式造粒法または乾式造粒法のいずれをも用いることができる。いずれの方法を用いるかは、例えば、細胞培養用培地成分の特性に応じて当業者であれば適宜好適な方法を選択することができる。
　上記の添加剤の追加は、打錠前または造粒前に適宜当技術分野で通常行われる方法に従って、必要により行うことができる。
　また、各打錠法での具体的な操作は当技術分野で通常行われる方法に従って行うことができる。例えば、単発型打錠機、ロータリー型打錠機等を用いて打錠を行うことができる。混合操作や造粒操作も当技術分野で通常行われる方法により行うことができる。
　本発明者は、直接打錠法により打錠成形された細胞培養用組成物を検討する過程で、必ずしも全ての細胞培養用培地を目的とする細胞培養用組成物へと導くことができないとの新たな課題に直面した。その原因を訴求した結果、水溶液への溶解後の緩衝剤として培地中に含まれることがある成分であるＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）の存在が、打錠成形による細胞培養用組成物の形成に必要であることを見出した。直接打錠法により打錠成形された細胞培養用組成物を製造する場合には、「細胞培養用組成物」中に「緩衝剤」が含まれていることが望ましく、特に限定される訳ではないが、好ましくは２ｗｔ％以上、より好ましくは２～２０ｗｔ％含まれていることが直接打錠法による成形には望ましいと考えられる。
　打錠を行う際の打錠圧は、特に限定されないが、本発明においては、打錠圧を調整することにより製造された細胞培養用組成物の崩壊強度を調整することができる。当業者であれば適宜打錠圧を選択することができるが、例えば、０．４ｋＮ／ｃｍ２～７．０ｋＮ／ｃｍ２の範囲で打錠することが好ましい。さらに好ましくは、０．７ｋＮ／ｃｍ２～４．０ｋＮ／ｃｍ２の範囲である。
　製造された細胞培養用組成物の崩壊強度は、細胞培養用培地成分やその他添加された成分の特性や打錠圧等により変動するが、崩壊強度が０．５ｋｇ／ｃｍ２以上であるものが好ましく、より好ましくは０．５ｋｇ／ｃｍ２以上１５ｋｇ／ｃｍ２以下、取り分け好ましくは１．０ｋｇ／ｃｍ２以上１５ｋｇ／ｃｍ２以下、であるものが、研究開発や生産現場での使用にあたっての利便性が高い。
　製造された細胞培養用組成物の一単位の重量は適宜選択することができるが、０．５ｇ以上２０ｇ以下であるものが、研究開発や生産現場での使用にあたって利便性が高い。
　本実施形態での「細胞培養用組成物」の形状は特に限定されず、打錠により成形された形状を有する。例えば、６面体形状（直方体形状または立方体形状）、タブレット形状、カプレット形状等をとることができる。好ましくは、６面体形状およびタブレット形状である。当該形状は、打錠機を適宜選択すること等により選択することができる。
　本実施形態での「細胞培養用組成物」の大きさは特に限定されないが、例えば「細胞培養用組成物」が６面体形状である場合は、一辺の長さが１０ｍｍ以上の形状である場合が好ましく、一辺の長さが１０ｍｍ以上７０ｍｍ以下である６面体形状である場合がより好ましい。
　また、「細胞培養用組成物」がタブレット形状の場合には、厚みが１０ｍｍ以上であり、直径が２５ｍｍ以上の形状である場合が好ましく、厚みが１０ｍｍ以上５０ｍｍ以下の形状であり、直径が２５ｍｍ以上７０ｍｍ以下であるタブレット形状である場合がより好ましい。
　本実施形態での細胞培養用組成物は、第一の実施形態における場合と同様に、従来の粉末状の細胞培養用培地の課題であった粉立ち等の諸課題を解決するとともに、特定の大きさと形状を有する組成物の形態で実施する場合には、顆粒形態やより小型のタブレット形態の細胞培養用培地に比べて、より取扱いが容易であり、かつより使用時の定量が簡便である等、細胞培養の現場においてより高い利便性を有するものである。
　さらに、本実施形態での細胞培養用組成物は、細胞培養用培地の種類を問わず、ＨＥＰＥＳ等の緩衝剤を適宜添加するという新規な特徴により、顆粒打錠法に代えて直接打錠法による場合でも効率良く良質の細胞培養用組成物を製造することができるという利点も有している。直接打錠法による場合には、顆粒打錠法では得られない特定の空隙率を有する細胞培養用組成物を製造することができるため、本発明は従来品にはない新たな特長を有する細胞培養用の培地を提供することができる。また、直接打錠法による場合には、顆粒打錠法における顆粒化工程での吸湿や熱履歴がないため、直接打錠法による細胞培養用組成物は、顆粒打錠法によるものと比較して、品質がより安定したものとなる。
［第三の実施形態］
　本発明の第三の実施形態は、
「打錠により成形された形状を有する、細胞培養用培地成分および界面活性剤を含む細胞培養用組成物。」（実施形態３）
である。
　本実施形態では、細胞培養用組成物は、細胞培養用培地成分および界面活性剤を含む混合粉末を製した後、当該混合粉末を当技術分野で通常使用される打錠方法により打錠成形することにより製造することができる。
　用いられる「細胞培養用培地」は、上記実施形態１で説明された通りである。
　「界面活性剤」は、当技術分野で通常使用されるものが挙げられるが、水溶性ポリマーが好ましく、特にポロキサマーが好ましい。
　本実施形態でも、細胞培養用組成物を製造するにあたっては、必要により「細胞培養用培地成分」および「界面活性剤」以外の適当な添加剤を追加することができる。なお、「細胞培養用培地成分」が既に含む成分であっても、例えば量的に不十分な場合に同じ成分をさらに加えることもここでの「添加剤の追加」に包含される。好適な添加剤としては、前記「実施形態１」において説明されたものが挙げられる。
　「細胞培養用組成物」中、「細胞培養用培地成分」の含有量は、７０～９８ｗｔ％、緩衝剤および添加剤の総量の含有量は、２～３０ｗｔ％である。
　「細胞培養用組成物」中、「界面活性剤」の含有量は、２～２０ｗｔ％である。
　打錠方法は特に限定されず、上記「実施形態２」について説明された方法に準じて打錠して本発明の細胞培養用組成物を得ることができる。
［第四の実施形態］
　本発明の第四の実施形態は、
「打錠により成形された形状を有する、細胞培養用培地成分、緩衝剤および界面活性剤を含む細胞培養用組成物。」（実施形態４）
である。
　本実施形態では、細胞培養用組成物は、細胞培養用培地成分、緩衝剤および界面活性剤を含む混合粉末を製した後、当該混合粉末を当技術分野で通常使用される打錠方法により打錠成形することにより製造することができる。
　用いられる「細胞培養用培地」は、上記実施形態１で説明された通りである。
　使用される「緩衝剤」および「界面活性剤」については、上記「実施形態２」および「実施形態３」での説明を参照することができる。
　本実施形態でも、細胞培養用組成物を製造するにあたっては、必要により「細胞培養用培地成分」、「緩衝剤」および「界面活性剤」以外の適当な添加剤を追加することができる。なお、「細胞培養用培地成分」が既に含む成分であっても、例えば量的に不十分な場合に同じ成分をさらに加えることもここでの「添加剤の追加」に包含される。好適な添加剤としては、前記「実施形態１」において説明されたものが挙げられる。
　「細胞培養用組成物」中、「細胞培養用培地成分」の含有量は、６０～９６ｗｔ％、緩衝剤および添加剤の総量の含有量は、４～４０ｗｔ％である。
　「細胞培養用組成物」中、「緩衝剤」および「界面活性剤」の含有量は、それぞれ２～２０ｗｔ％である。
　打錠方法は特に限定されず、上記「実施形態２」について説明された方法に準じて打錠して本発明の細胞培養用組成物を得ることができる。
　本発明の細胞培養用組成物に緩衝剤を含有させることの利点については先に述べた通りであるが、本発明者は、さらに検討した結果、界面活性剤の存在が、打錠成形による細胞培養用組成物の崩壊強度に影響を与えることをも見出した。後記の実施例４において実証されているように界面活性剤の添加により、製せられた細胞培養用組成物の崩壊強度を調節することが可能であり、目的に応じた崩壊強度を有する細胞培養用組成物を得ることができる。従って、必須ではないが、打錠成形された細胞培養用組成物を製造する場合には、「細胞培養用組成物」中に「界面活性剤」が含まれていることが望ましく、特に限定される訳ではないが、好ましくは２ｗｔ％以上、より好ましくは２～２０ｗｔ％含まれていることが望ましい。
　このように、本発明者は、細胞培養用組成物を製造する場合には、「界面活性剤」（または「界面活性剤」および「緩衝剤」の両者）を加えて製造することが有利であることを併せて見出し、上記の「実施形態３」および「実施形態４」を完成した。
　上記の「実施形態３」および「実施形態４」においては、打錠を行う際の打錠圧は、特に限定されないが、本発明においては、打錠圧を調整することにより製造された細胞培養用組成物の崩壊強度を調整することができる。当業者であれば適宜打錠圧を選択することができるが、例えば、０．４ｋＮ／ｃｍ２～７．０ｋＮ／ｃｍ２の範囲で打錠することが好ましい。さらに好ましくは、０．７ｋＮ／ｃｍ２～４．０ｋＮ／ｃｍ２の範囲である。
　製造された細胞培養用組成物の崩壊強度は、細胞培養用培地成分やその他添加された成分の特性や打錠圧等により変動するが、崩壊強度が０．５ｋｇ／ｃｍ２以上であるものが好ましく、より好ましくは０．５ｋｇ／ｃｍ２以上１５ｋｇ／ｃｍ２以下、取り分け好ましくは１．０ｋｇ／ｃｍ２以上１５ｋｇ／ｃｍ２以下、であるものが、研究開発や生産現場での使用にあたっての利便性が高い。
　製造された細胞培養用組成物の一単位の重量は適宜選択することができるが、０．５ｇ以上２０ｇ以下であるものが、研究開発や生産現場での使用にあたって利便性が高い。
　上記の「実施形態３」および「実施形態４」においては、「細胞培養用組成物」の形状は特に限定されず、打錠により成形された形状を有する。例えば、６面体形状（直方体形状または立方体形状）、タブレット形状、カプレット形状等をとることができる。好ましくは、６面体形状およびタブレット形状である。当該形状は、打錠機を適宜選択すること等により選択することができる。
　当該「細胞培養用組成物」の大きさは特に限定されないが、例えば「細胞培養用組成物」が６面体形状である場合は、一辺の長さが１０ｍｍ以上の形状である場合が好ましく、一辺の長さが１０ｍｍ以上７０ｍｍ以下である６面体形状である場合がより好ましい。
　また、「細胞培養用組成物」がタブレット形状の場合には、厚みが１０ｍｍ以上であり、直径が２５ｍｍ以上の形状である場合が好ましく、厚みが１０ｍｍ以上５０ｍｍ以下の形状であり、直径が２５ｍｍ以上７０ｍｍ以下であるタブレット形状である場合がより好ましい。
　上記の「実施形態３」および「実施形態４」においては、本実施形態での細胞培養用組成物は、第一の実施形態における場合と同様に、従来の粉末状の細胞培養用培地の課題であった粉立ち等の諸課題を解決するとともに、特定の大きさと形状を有する組成物の形態で実施する場合には、顆粒形態やより小型のタブレット形態の細胞培養用培地に比べて、より取扱いが容易であり、かつより使用時の定量が簡便である等、細胞培養の現場においてより高い利便性を有するものである。
［直接打錠法による細胞培養用培地成分、および、緩衝剤および／または界面活性剤を含む細胞培養用組成物の製造方法］
　本発明の直接打錠法による細胞培養用培地成分を含む細胞培養用組成物の製造方法は、以下の２工程を含む「打錠により成形された形状を有する、細胞培養用培地成分、および、緩衝剤および／または界面活性剤（すなわち、（１）緩衝剤のみ、（２）界面活性剤のみ、または（３）緩衝剤および界面活性剤の両者）、を含む細胞培養用組成物の製造方法」である。
工程（１）：細胞培養用培地成分と緩衝剤および／または界面活性剤を含む混合粉末を製する工程、および
工程（２）：工程（１）で製せられた混合粉末を直接打錠法により打錠する工程。
　工程（１）では、細胞培養用培地成分と緩衝剤および／または界面活性剤を含む混合粉末が製せられるが、用いられる細胞培養用培地が緩衝剤および／または界面活性剤をその成分として含んでいない場合には、外部から緩衝剤および／または界面活性剤を添加することが必要である。また、用いられる細胞培養用培地が緩衝剤および／または界面活性剤をその成分として含んでいる場合でも量的に不十分な場合には、緩衝剤および／または界面活性剤を外部から追加することが必要となる。細胞培養用培地成分と緩衝剤および／または界面活性剤とを当技術分野で通常使用される方法で混合することにより細胞培養用培地成分と緩衝剤および／または界面活性剤を含む混合粉末を製することができる。　
　なお、用いられる細胞培養用培地が既に十分な緩衝剤成分および／または界面活性剤成分を内包している場合には、緩衝剤および／または界面活性剤の外部からの追加は必ずしも必要ではない。この場合は、当該培地を混合したものを工程（１）での「混合粉末」として次の工程（２）に付すことができる。
　工程（１）では、必要により「細胞培養用培地成分」、緩衝剤および／または界面活性剤以外の適当な添加剤を追加して、混合粉末を製することができる。
　工程（１）を実施するにあたっては、「細胞培養用組成物」中の「細胞培養用培地成分」の含有量は、６０～９６ｗｔ％であり、緩衝剤および／または界面活性剤および添加剤の総量の含有量は、４～４０ｗｔ％である。また、「細胞培養用組成物」中の「緩衝剤」および「界面活性剤」の含有量は、それぞれ２～２０ｗｔ％である。
　工程（２）は、工程（１）で製された混合粉末を直接打錠法により打錠する工程であるが、具体的な打錠操作は、当技術分野で通常行われる方法に従って行うことができる。
　打錠を行う際の打錠圧は、当業者であれば適宜選択することができるが、例えば、０．４ｋＮ／ｃｍ２～７．０ｋＮ／ｃｍ２の範囲で打錠することが好ましい。さらに好ましくは、０．７ｋＮ／ｃｍ２～４．０ｋＮ／ｃｍ２の範囲である。
　以下、本発明の細胞培養用組成物について実施例および試験例を用いて具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
［略語表］
　本実施例および試験例において使用される各略語の意味は、特に断りのない限り、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［細胞培養用組成物の製造］
実施例１：各種細胞培養用培地の打錠特性の検討
（目的）
　ＢＡＳＡＬ３培地、ＦＥＥＤ２培地、および、ＤＭＥＭ培地を直接打錠法により打錠し、それらの打錠状況を比較することにより、細胞培養用培地成分の組成が打錠特性に与える影響について検討する。
（打錠手順）
　以下の手順で直接打錠法により「細胞培養用組成物」の製造を行った。
１．ＢＡＳＡＬ３培地１３．５ｇ、ＦＦＥＤ２培地１１ｇ、ＤＭＥＭ培地１３．５ｇを各々秤量皿に秤取った。
２．スパチュラを使い、株式会社富士薬品機械製の卓上型試作打錠機（ＦＹ－ＴＱＭＢ－３０タブクイック・ミニ）にセットされた臼２４×１９ｍｍに、秤量した各培地を充填する。充填しきれない場合は上杵を手動で下し、与圧することで秤量した全ての培地を臼に充填した。
３．上杵侵入量を９ｍｍに設定し、打錠を開始した。
４．打錠圧は０．６２～０．６６ｋＮ/cm2であった。
５．上杵位置が初期値に戻ったことを確認後、下杵のレバーを引き、下杵を押し上げ、打錠された培地を臼より押し出した。
（結果）
　ＢＡＳＡＬ３培地およびＦＥＥＤ２培地は、目的とする「打錠により成形された形状を有する（本実施例においては「直方体形状」）細胞培養用組成物」（以下、「目的組成物」と略称する場合がある）を得ることができた。一方、ＤＭＥＭ培地は、打錠成形することができず目的組成物を得ることができなかった。
　打錠成形されたＢＡＳＡＬ３培地およびＦＥＥＤ２培地は、各一辺が１８ｍｍ、２３ｍｍおよび２６ｍｍ長の直方体形状であった。
（考察）
　ＢＡＳＡＬ３培地、ＦＥＥＤ２培地およびＤＭＥＭ培地各成分の組成比較を図１に示す。
　打錠成形が不十分なため「目的組成物」を製造できなかったＤＭＥＭ培地は、無機塩が全体の５０％を占め、糖類、アミノ酸類の成分の種類が少ない。一方、ＦＥＥＤ２培地には糖類が含まれていないが、「目的組成物」を製造できていることから、糖類は打錠特性に影響を与えない成分と判断した。ＤＭＥＭ培地に含まれない成分の内、ＦＥＥＤ２培地において最も含量が多い緩衝剤であるＨＥＰＥＳが、打錠特性に影響を与える成分と判断し、ＨＥＰＥＳ含量が打錠特性に与える影響をさらに検討した。
実施例２：細胞培養用組成物中のＨＥＰＥＳ含量が打錠特性に与える影響の検討
（目的）
　打錠特性と細胞培養用組成物中のＨＥＰＥＳ含量との関連性を検証するため、ＤＭＥＭ培地に、微粉砕したＨＥＰＥＳをＤＭＥＭ培地に対し０．１ｗｔ％、３．０ｗｔ％、１０ｗｔ％となるように添加した混合粉末試料を作成し、各々を直接打錠法により打錠成形して得た「細胞培養用組成物」の崩壊強度の変化を確認する。
（打錠手順）
　以下の手順で直接打錠法により各混合粉末試料からの「細胞培養用組成物」の製造を行った。
１．ＨＥＰＥＳを秤量皿に約１００ｇ秤取った。
２．Ｒｅｔｃｈ社製遠心粉砕機ＺＭ－２００にΦ０．２５ｍｍスクリーンと櫛形のローターをセットし、回転数を１０，０００ｒｐｍに調整した。
３．秤量したＨＥＰＥＳを当該遠心粉砕機で微粉砕した。
４．遠心粉砕機を停止し、微粉砕したＨＥＰＥＳをＰＥ袋に回収した。
５．ＤＭＥＭ培地に対し、微粉砕したＨＥＰＥＳを０．１ｗｔ％、３ｗｔ％、１０ｗｔ％となるように添加した混合粉末試料を各１００ｇ調製した。
６．調製した各混合粉末試料の１３．５ｇを秤取り、５０ｍｌポリプロピレン・コニカル・チューブに入れた。これを各混合粉末試料につき５個作成した。
７．市橋精機株式会社製ＨＡＮＤＴＡＢ－１００Ｔ１５にΦ３０ｍｍ普通Ｒ錠用杵臼をセットした。
８．５０ｍｌポリプロピレン・コニカル・チューブに秤取った当該混合粉末試料を、スパチュラを使用し、臼に充填した。充填しきれない場合は、上杵を手動で下げて与圧し、秤量した混合粉末試料を全量杵に充填した。
９．上杵を手動で下げ、高さを臼面に合わせた。
１０．油圧ジャッキで下杵を上げ、油圧ジャッキの圧力計で５ｋＮ（０．７１ｋＮ／ｃｍ２）まで加圧した。
１１．油圧ジャッキの圧を抜き、上杵を手動で引き上げ、他方油圧ジャッキで下杵を上げ、打錠成形された混合粉末試料を押し上げて、５ｋＮ（０．７１ｋＮ／ｃｍ２）のゲージ圧で打錠成形した「細胞培養用組成物」の崩壊強度測定用サンプルを調製した。
（崩壊強度の測定）
　以下の手順で、上記で打錠成形された「細胞培養用組成物」の崩壊強度測定用サンプルの崩壊強度を測定した。
１．ＩＭＡＤＡ社製デジタルフォースゲージＤＰＸ－５０ＴＲに円型平型Φ１５ｍｍのアタッチメントを取り付けた。
２．デジタルフォースゲージＤＰＸ－５０ＴＲを電動計測スタンドＭＶ－１００にセットし、電動計測スタンドＭＶ－１００の移動速度を１００ｍｍ／ｍｉｎに調整した。
３．調製した上記崩壊強度測定用サンプルを、電動計測スタンドＭＶ－１００上に置き、移動速度１００ｍｍ／ｍｉｎでデジタルフォースゲージＤＰＸ－５０ＴＲを下降させ、ピークホールドＭｏｄｅで崩壊強度を測定した。測定した強度を基に、アタッチメントの面積より、１平方ｃｍ当りの崩壊強度を求めた。
（結果）
　細胞培養用組成物中のＨＥＰＥＳ含量と崩壊強度との関係を図２に示す。
（考察）
　「細胞培養用組成物」中のＨＥＰＥＳ含量が０．１ｗｔ％から３ｗｔ％へと増加するに従って、崩壊強度が上昇したが、３ｗｔ％から１０ｗｔ％に増加させても崩壊強度に大きな差は生じなかった。以上の結果より、ＨＥＰＥＳの影響という観点からは、直接打錠法による場合、良好な崩壊強度を得るためには、「細胞培養用組成物」中のＨＥＰＥＳ含量が、０．１ｗｔ％以上、好ましくは２ｗｔ％以上、より好ましくは３ｗｔ％以上含有することが必要であると考えられた。ＨＥＰＥＳ含量の上限は特に限定されず用いる細胞培養用培地の特性等を考慮して適宜決定することができるが、「細胞培養用組成物」中の含量が、２０ｗｔ％以下であることが好ましいと考えられる。
実施例３：細胞培養用組成物製造時の打錠圧が崩壊強度に与える影響の検討
（目的）
　各種打錠圧で打錠成形された細胞培養用組成物の崩壊強度を測定し、打錠圧と崩壊強度との関係を検討する。
（打錠手順）
１．ＢＡＳＡＬ３培地を１３．５ｇ秤取り、５０ｍｌポリプロピレン・コニカル・チューブに充填した（２０本作製）。
２．市橋精機株式会社製ＨＡＮＤＴＡＢ－１００Ｔ１５にΦ３０ｍｍ普通Ｒ錠用杵臼をセットした。
３．５０ｍｌポリプロピレン・コニカル・チューブに秤取ったＢＡＳＡＬ３培地を、スパチュラを使用し、臼に充填した。充填しきれない場合は、上杵を手動で下げて与圧し、秤量した培地を全量杵に充填した。
４．上杵を手動で下げ、高さを臼面に合わせた。
５．油圧ジャッキで下杵を上げ、油圧ジャッキの圧力計で５ｋＮ（０．７１ｋＮ／ｃｍ２）まで加圧する。
６．油圧ジャッキの圧を抜き、上杵を手動で引き上げた。
７．油圧ジャッキで下杵を上げ、打錠成形物を押し上げた。
８．０．７１ｋＮ／ｃｍ２のゲージ圧で打錠成形した崩壊強度測定用の「細胞培養用組成物」を調製した。
９．前記８．の油圧ジャッキの圧力を、それぞれ１．０６ｋＮ／ｃｍ２、１．４２ｋＮ／ｃｍ２、および２．１２ｋＮ／ｃｍ２に変えて同様の手順で操作を行い、打錠圧の異なる崩壊強度測定用「細胞培養用組成物」を調製した。
（崩壊強度の測定）
　以下の手順で、上記で調製した各「細胞培養用組成物」の崩壊強度を測定した。
１．ＩＭＡＤＡ社製デジタルフォースゲージＤＰＸ－５０ＴＲに円型平型Φ１５ｍｍのアタッチメントを取り付け、電動計測スタンドをＭＶ－１００にセットした。
２．各打錠圧で打錠成形された「細胞培養用組成物」を電動計測スタンドＭＶ－１００上に置き、移動速度１００ｍｍ／ｍｉｎでデジタルフォースゲージＤＰＸ－５０ＴＲを下降させ、ピークホールドＭｏｄｅで崩壊強度を測定した。
３．測定した強度を基に、アタッチメントの面積より、１平方ｃｍ当りの崩壊強度を求めた。
（結果）
　細胞培養用組成物製造時の打錠圧と崩壊強度との関係を、図３に示す。
（考察）
　打錠圧の増加に従って崩壊強度も比例して増加し、その相関係数は０．９７であることからも、打錠圧と崩壊強度との間に強い相関が確認された。以上より、打錠圧により目的とする「細胞培養用組成物」が圧縮形成されていることが確認された。このことから「細胞培養用組成物」の製造にあたって、打錠圧を適宜調整することにより、適宜崩壊強度を調整できることが明らかとなった。
実施例４：細胞培養用組成物中のポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）含量が打錠特性に与える影響の検討
（目的）
　さらに細胞培養用組成物中の界面活性剤が打錠特性に与える影響を評価することを目的として、打錠特性と細胞培養用組成物中のポロキサマー含量との関連性を検証するため、ＤＭＥＭ培地（自家調製ＤＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ－ＡｌｄｒｉｃｈＤ２９０２同等品））に、微粉砕したポロキサマー（ＢＡＳＦ社製；ＫｏｌｌｉｐｈｏｒＰ１８８Ｂｉｏを使用）をＤＭＥＭ培地に対し０．５ｗｔ％、１．０ｗｔ％、５．０ｗｔ％、１０．０ｗｔ％となるように添加した混合粉末試料を作成し、各々を直接打錠法により打錠成形して得た「細胞培養用組成物」の崩壊強度の変化を確認する。
（打錠手順）
１．ポロキサマーを秤量皿に約１００ｇ秤取った。
２．Ｒｅｔｃｈ社製遠心粉砕機ＺＭ－２００にΦ０．２５ｍｍスクリーンと櫛形のロータをセットし、回転数を１０，０００ｒｐｍに調整した。
３．秤量したポロキサマーを当該遠心粉砕機で微粉砕した。
４．遠心粉砕機を停止し、微粉砕したポロキサマーをＰＥ袋に回収した。
５．ＤＭＥＭ培地に、微粉砕したポロキサマーを０．５ｗｔ％、１．０ｗｔ％、５．０ｗｔ％、１０．０ｗｔ％となるように添加した混合粉末試料各２５０ｇ調製した。
６．調製した各混合粉末試料の１３．５ｇ秤取り、５０ｍｌポリプロピレン・コニカル・チューブに入れた。これを各混合粉末試料につき３個作成した。
７．市橋精機株式会社製ＨＡＮＤＴＡＢ－１００Ｔ１５にΦ３０ｍｍ普通Ｒ錠用杵臼をセットした。
８．５０ｍｌリプロピレン・コニカル・チューブに秤取った当該混合粉末試料を、スパチュラを使用し、臼に入れた。充填しきれない場合は、上杵を手動で下げて与圧し、秤量した混合粉末試料を全量杵に充填した。
９．上杵を手動で下げ、高さを臼面に合わせた。
１０．油圧ジャッキで下杵を上げ、油圧ジャッキの圧力計で５ｋＮ（０．７１ｋＮ／ｃｍ２）まで加圧した。
１１．油圧ジャッキの圧を抜き、上杵を手動で引き上げ、他方油圧ジャッキで下杵を上げ、打錠成形された混合粉末試料を押し上げて、５ｋＮ（０．７１ｋＮ／ｃｍ２）のゲージ圧で打錠成形した「細胞培養用組成物」の崩壊強度測定用サンプルを調製した。
（崩壊強度の測定）
　以下の手順で、上記で打錠成形された「細胞培養用組成物」の崩壊強度測定用サンプルの崩壊強度を測定した。
１．ＩＭＡＤＡ社製デジタルフォースゲージＤＰＸ－５０ＴＲに円型平型Φ１５ｍｍのアタッチメントを取り付けた。
２．デジタルフォースゲージＤＰＸ－５０ＴＲを電動計測スタンドＭＶ－１００にセットし、電動計測スタンドＭＶ－１００の移動速度を１００ｍｍ／ｍｉｎに調整した。
３．調製した上記崩壊強度測定用サンプルを、電動計測スタンドＭＶ－１００上に置き、移動速度１００ｍｍ／ｍｉｎでデジタルフォースゲージＤＰＸ－５０ＴＲを下降させ、ピークホールドＭｏｄｅで崩壊強度を測定した。測定した強度を基に、アタッチメントの面積より、１平方ｃｍ当りの崩壊強度を求めた。
（結果）
　細胞培養用組成物中のポロキサマー含量と崩壊強度との関係を図４に示す。
（考察）
　「細胞培養用組成物」中のポロキサマー含量が増加するに従って、崩壊強度が上昇することが判明した。以上の結果より、「細胞培養用組成物」中のポロキサマー含量を調整することにより、崩壊強度を調整することが可能であることが明らかとなった。
［細胞培養用組成物の特性］
試験例１：吸湿性の評価
（目的）
　本発明の細胞培養用組成物では、打錠成形により比表面積が減少し、吸湿率が低下することが期待される。本評価では、従来の粉末培地（本試験例、および以下の試験例２～４において、「Ｐｏｗｄｅｒ培地」と称する場合がある）と本発明の打錠成形された「細胞培養用組成物」の吸湿率（％）を比較検討する。
（評価手順）
１．上記「実施例１：各種細胞培養用培地の打錠特性の検討」で打錠成形されたＢＡＳＡＬ３培地をシャーレにのせ、重量を測定し、記録した。他方、ＢＡＳＡＬ３Ｐｏｗｄｅｒ培地をシャーレに１３．６ｇ秤取り、重量を記録した。
２．上記「実施例１：各種細胞培養用培地の打錠特性の検討」で打錠成形されたＦＥＥＤ２培地をシャーレにのせ、重量を測定し、記録した。他方、ＦＥＥＤ２Ｐｏｗｄｅｒ培地をシャーレに１１．０ｇ秤取り、重量を記録した。
３．２５℃／６０％ＲＨ、絶対湿度１３．８１ｇ／ｍ３でコントロールしているＥｓｐｅｃ　Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　Ｔｅｓｔ　Ｃｈａｍｂｅｒ　ＣＨＳ－１２２（エスペック株式会社）に、重量を記録したシャーレにのせた各培地を入れ暴露させた。その後、５ｍｉｎ間隔でＥｓｐｅｃ　Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　Ｔｅｓｔ　Ｃｈａｍｂｅｒ　ＣＨＳ－１２２より取り出し、各培地の重量を測定し記録した。
４．３０ｍｉｎ経過まで、５ｍｉｎ間隔で当該評価を繰り返し、重量を測定し記録した。
５．３０ｍｉｎ経過後、６０ｍｉｎまでＥｓｐｅｃ　Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　Ｔｅｓｔ　Ｃｈａｍｂｅｒ　ＣＨＳ－１２２中で吸湿させた。
６．６０ｍｉｎ経過後、各培地の重量を測定し記録して、試験を終了した。
７．各培地について、Ｉｎｉｔｉａｌの重量からの各重量測定頻度における増加量より、吸湿率（％）を求めた。吸湿率（％）は、
［測定値（ｇ）－Ｉｎｉｔｉａｌ（ｇ）］／Ｉｎｉｔｉａｌ（ｇ）×１００
で算出した。
（結果）
　評価結果を、図５に示す。細胞培養用培地の種類に関係なく、本発明の打錠成形された「細胞培養用組成物」では、吸湿率（％）がＰｏｗｄｅｒ培地の１／３にまで低下した。また、Ｐｏｗｄｅｒ培地は変質し全体がキャラメル状となったが、本発明の打錠成形された「細胞培養用組成物」ではこのような性状変化は見られなかった。
（考察）
　本発明の打錠成形された「細胞培養用培地」では吸湿性が対応するＰｏｄｅｒ培地に比べて大きく改善されており、研究・開発、生産現場での利便性が向上していることが明らかとなった。
試験例２：溶解性の評価
（目的）
　Ｐｏｗｄｅｒ培地をＣｏｎｔｒｏｌとして、本発明の打錠成形された「細胞培養用組成物」の溶解性を目視で評価する。
（評価手順）
１．上記「実施例３：細胞培養用組成物製造時の打錠圧が崩壊強度に与える影響の検討」において製造された、ＢＡＳＡＬ３培地を打錠成形した細胞培養用組成物およびＦＥＥＤ２培地を５ｋＮ（０．７１ｋＮ／ｃｍ２で打錠成形した細胞培養用組成物の重量を測定し、処方濃度から溶解試験のための溶解水量を算出した。処方濃度はＢＡＳＡＬ３培地が２７．０ｇ／Ｌであり、ＦＥＥＤ２培地が１１０ｇ／Ｌであった。
２．ＢＡＳＡＬ３Ｐｏｗｄｅｒ培地１３．５ｇおよびＦＥＥＤ２Ｐｏｗｄｅｒ培地１１．０ｇを各々秤量皿に秤取った。
３．ＢＡＳＡＬ３Ｐｏｗｄｅｒ培地、打錠成形物は５００ｍｌビーカー、ＦＥＥＤ２Ｐｏｗｄｅｒ培地、打錠成形物は２００ｍｌビーカーに、試料重量から求めた大塚社製注射用水を秤取った。
４．スターラーバー３０ｍｍを投入後、Ａｓ　ＯＮＥマグネットスターラー　ＲＳ－６ＡＮマグネットスターラーに置き、攪拌を開始した。攪拌強度はＰｏｗｄｅｒ培地を溶解する時と同等の強度に調整した。
５．秤取ったＢＡＳＡＬ３Ｐｏｗｄｅｒ培地およびＢＡＳＡＬ３打錠成形細胞培養用組成物、ならびにＦＥＥＤ２Ｐｏｗｄｅｒ培地およびＦＥＥＤ２打錠成形細胞培養用組成物を各ビーカーに投入し、溶解時間の測定を開始し、完全溶解した時間を記録した。
（結果）
　完全溶解した時間は、いずれの種類の培地においても、Ｐｏｗｄｅｒ培地、打錠成形細胞培養用組成物ともに８０ｍｉｎであった。
（考察）
　完全溶解時間は、Ｐｏｗｄｅｒ培地、本発明の打錠成形細胞培養用組成物ともに同等であり、打錠時の加圧による溶解性の悪化は確認されなかった。このことからも、本発明の「細胞培養用培地」は、研究・開発、生産現場で十分な利便性を有することが明らかとなった。
　溶解性を詳細に評価するため、両培地の溶解時の不溶物数を液体自動粒子計測器にて測定を行い検討した。総不溶物数はＰｏｗｄｅｒ培地が最も多かった。総不溶物数の差は、Ｐｏｗｄｅｒ培地は投入直後に溶解液中に各成分が分散し、溶けやすい成分から溶解が始まるが、打錠培地は、溶解初期にブロック状で溶解液中に存在しているため、培地成分としての表面と溶液が接している面から溶解しており、塩溶効果やアミノ酸溶解時の等電点の変化等の影響を受けやすいと考えられ、この違いが総不溶物数の差となっていると考察した。
試験例３：培地性能の評価（１）
（目的）
　本発明の打錠成形された「細胞培養用組成物」とＰｏｗｄｅｒ培地の細胞培養用培地としての性能を比較検討する。
（評価手順）
　ＢＡＳＡＬ３培地を打錠成形した細胞培養用組成物（実施例1で圧縮成形した細胞培養用組成物）（本試験においてＣｕｂｅ品と称する場合がある）と、ＢＡＳＡＬ３　Ｐｏｗｄｅｒ培地を用いて細胞培養試験を行い、ＶＣＤ（生細胞密度）とＩｇＧ　ｔｉｔｅｒ（抗体産生量）を比較した。使用された細胞やその他の評価条件を、下記の表２に示す。測定は培養開始後４日、７日、９日および１１日に行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（結果）
　評価結果を、図６に示す。
（考察）
　本発明の打錠成形細胞培養用組成物のＶＣＤおよびＩｇＧ　ｔｉｔｅｒは、打錠成形による悪影響はなく、Ｐｏｗｄｅｒ培地のものと同等であった。このことからも、本発明の「細胞培養用組成物」は、研究・開発、生産現場で十分な利便性を有することが明らかとなった。
試験例４：培地性能の評価（２）
（目的）
　本発明の打錠成形された「細胞培養用組成物」とＰｏｗｄｅｒ培地の細胞培養用培地としての性能を比較検討する。
（評価手順）
　ＦＥＥＤ２培地を打錠成形した細胞培養用組成物（実施例1で圧縮成形した細胞培養用組成物）（本試験においてＣｕｂｅ品と称する場合がある）と、ＦＥＥＤ２　Ｐｏｗｄｅｒ培地を用いて細胞培養試験を行い、ＶＣＤ（生細胞密度）とＩｇＧ　ｔｉｔｅｒ（抗体産生量）を比較した。使用された細胞やその他の評価条件を、下記の表３に示す。測定は培養開始後４日、７日、９日および１１日に行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（結果）
　評価結果を、図７に示す。
（考察）
　本発明の打錠成形細胞培養用組成物のＶＣＤおよびＩｇＧ　ｔｉｔｅｒは、打錠成形による悪影響はなく、Ｐｏｗｄｅｒ培地のものと同等であった。このことからも、本発明の「細胞培養用組成物」は、研究・開発、生産現場で十分な利便性を有することが明らかとなった。
　本発明は、使用時の粉立ちを抑え、かつ十分な水溶液への溶解性を有する新たな形態の細胞培養用の培地に関し、細胞培養関連の技術分野において有用である。
　本出願は、日本で出願された特願２０１９－０８６５４２（出願日：２０１９年４月２６日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (18)

  1. 　一辺の長さが１０ｍｍ以上である６面体形状、または厚みが１０ｍｍ以上であり、直径が２５ｍｍ以上であるタブレット形状を有する、細胞培養用培地成分を含む細胞培養用組成物。
  2. 　一辺の長さが１０ｍｍ以上７０ｍｍ以下である６面体形状、または、厚みが１０ｍｍ以上５０ｍｍ以下であり、直径が２５ｍｍ以上７０ｍｍ以下であるタブレット形状を有する、請求項１に記載の細胞培養用組成物。
  3. 　打錠により成形された形状を有する、細胞培養用培地成分および緩衝剤を含む細胞培養用組成物。
  4. 　打錠により成形された形状を有する、細胞培養用培地成分および界面活性剤を含む細胞培養用組成物。
  5. 　打錠により成形された形状を有する、細胞培養用培地成分、緩衝剤および界面活性剤を含む細胞培養用組成物。
  6. 　緩衝剤を２ｗｔ％以上２０ｗｔ％以下含む、請求項３または５に記載の細胞培養用組成物。
  7. 　緩衝剤が、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）である、請求項３、５または６に記載の細胞培養用組成物。
  8. 　界面活性剤を２ｗｔ％以上２０ｗｔ％以下含む、請求項４～７のいずれか１項に記載の細胞培養用組成物。
  9. 　界面活性剤が、水溶性ポリマーである、請求項４～８のいずれか１項に記載の細胞培養用組成物。
  10. 　界面活性剤が、ポロキサマーである、請求項４～９のいずれか１項に記載の細胞培養用組成物。
  11. 　６面体形状またはタブレット形状を有する、請求項３～１０のいずれか１項に記載の細胞培養用組成物。
  12. 　直接打錠法により製造される、請求項３～１１のいずれか１項に記載の細胞培養用組成物。
  13. 　崩壊強度が、０．５ｋｇ／ｃｍ２以上１５ｋｇ／ｃｍ２以下である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の細胞培養用組成物。
  14. 　一組成物の重量が、０．５ｇ以上１５０ｇ以下である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の細胞培養用組成物。
  15. 　以下の２工程を含む、打錠により成形された形状を有する細胞培養用培地成分、および、緩衝剤および／または界面活性剤を含む細胞培養用組成物の製造方法。
    工程（１）：細胞培養用培地成分と緩衝剤および／または界面活性剤を含む混合粉末を製する工程。
    工程（２）：工程（１）で製せられた混合粉末を直接打錠法により打錠する工程。
  16. 　工程（２）における打錠圧が、０．４ｋＮ／ｃｍ２以上７．０ｋＮ／ｃｍ２以下である、請求項１５に記載の製造方法。
  17. 　細胞培養のための、請求項１５または１６に記載の製造方法により得られた細胞培養用組成物の使用。
  18. 　請求項１５または１６に記載の製造方法により得られた細胞培養用組成物から調製された液体中で、細胞を培養する方法。
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