KR20200064131A - 관류 배지 - Google Patents

Abstract

본 개시 내용은 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유효량의 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물을 포함하는 배양 배지에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 세포 배양에서 이종 단백질을 발현하는, 예를 들어, 관류 세포 배양에 의해, 포유 동물 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 조합물은 세포 배출 감소에 의해 성장 억제 및/또는 생산성 증가를 초래할 수 있다. 본 개시 내용은 또한 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유효량의 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물을 포함하는 배양 배지에서 세포를 배양함으로써 세포 배양의 생산성을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 개시 내용은 또한 치료학적 단백질을 증가된 생산성으로 생산하는데 사용하기 위한 배양 배지를 제공하며, 여기서, 상기 배지는 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유효량의 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물을 포함한다.

Description

관류 배지

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2017년 10월 13일자로 출원된 미국 가출원 62/571,915의 우선권에 대한 이익을 주장하며, 상기 출원은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다.

기술분야

본 발명은 최신 방법에 비해 보다 큰 세포 비생산성 (cell specific productivity) 및 보다 우수하게 지속되고/되거나 유지되는 생존력을 달성하는 개선된 세포 배양 배지 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 세포 배양 동안, 예를 들어, 관류 세포 배양의 생산기 동안 세포 성장을 부분적으로 효과적인 억제를 통해 세포 배양 생존력을 보다 효과적으로 유지하고 세포 비생산성을 증가시키는 신규하고 개선된 세포 배양 배지 지질계 첨가제의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 수반되는 세포 배출 감소, 높은 세포 생존력 유지 및/또는 생산 동안 세포 비생성물 역가의 증가에 의한 성장 억제를 초래하는 관류 세포 배양 방법 동안 (예를 들어, 생산기 동안) 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체를 비롯한 유효량의 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물 첨가제의 사용에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 세포 생존력 개선 및/또는 유지 및/또는 세포 비생산성 증가를 초래하는 관류 세포 배양 방법 동안, 특히, 생산기 동안 사용하기 위한 유효량의 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2 중 하나 이상, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체를 포함하는 세포 배양 배지에 관한 것이다. 본 발명은 또한 유전적 및/또는 생화학적 수단에 의해 리놀레산, 아라키돈산 및/또는 프로스타글란딘 E2의 합성을 증가시킴으로써 관류 상태에서 세포의 성장을 억제하는 방법에 관한 것이다.

다음 3가지 방법이 전형적으로 포유 동물 세포 배양에 의한 재조합 단백질의 생산을 위한 상업적 공정에서 이용된다: 회분식 배양, 유가식 배양 및 관류 배양.

관류 기반 방법은 개선된 생성물 품질 및 안정성, 개선된 확장성 및 증가된 세포 비생산성을 비롯하여 회분식 및 유가식 방법에 비해 잠재적인 개선을 제공한다. 회분식 및 유가식 생물 반응기와는 달리, 관류 시스템은 소모된 배지의 연속 제거를 포함한다. 소모된 배지를 연속적으로 제거하고 이를 새로운 배지로 교체함으로써, 영양소의 수준을 더 잘 유지하고, 동시에 성장 조건을 최적화하고 세포 폐기물을 제거한다. 감소된 폐기물은 세포 및 발현 산물에 대한 독성을 감소시킨다. 따라서, 관류 생물 반응기는 전형적으로 유의하게 더 적은 단백질 분해 및 이에 따른 고품질의 생성물을 초래한다. 생성물은 또한 훨씬 보다 신속하고 연속적으로 수확 및 정제될 수 있으며, 이는 불안정한 생성물을 생산할 때 특히 효과적이다.

관류 생물 반응기는 또한 보다 용이하게 확장 가능하다. 관류 생물 반응기는 전통적인 회분식 또는 유가식 시스템과 비교하여 확장성 및/또는 수요 증가와 관련하여 몇 가지 이점을 제공한다. 하나로서, 관류 생물 반응기는 크기가 보다 작으며, 적은 양으로 동일한 생산성 (즉, 생성물 수율)을 제공할 수 있다. 관류 생물 반응기는 유가식 생물 반응기와 비교하여 5 내지 20배의 농도로 기능할 수 있는 것으로 인정된다. 예를 들어, 100 리터 관류 생물 반응기는 1,000 리터 유가식 생물 반응기와 동일한 생성물 수율을 제공할 수 있다. 따라서 1,000 리터 관류 생물 반응기의 사용은 전반적인 생산성에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 전형적인 10,000 리터의 전통적인 유가식 생물 반응기를 대체할 수 있다. 이러한 중요한 이점은 생산을 확장할 때 더 작은 공간 필요로 해석된다. 이것은 또한 운영 유틸리티 감소, 인프라 스트럭쳐 감소, 노동력 감소, 장비 복잡성 감소, 연속적 수확 및 생성물 수율 증가와 관련된 다양한 이점으로 해석될 수 있다.

높은 세포 배양 밀도의 달성은 관류 시스템의 생산성 증가의 일부를 설명한다. 전형적인 대규모 유가식 상업적 세포 배양 공정에서, 10~50×10⁶ 세포/mL의 세포 밀도에 도달할 수 있다. 그러나, 관류 기반 생물 반응기에 의해, > 1×10⁸ 세포/mL의 극한 세포 밀도를 달성하였다. 또한, 관류 모드에서, 높은 세포 수가 소모된 배지의 연속적인 보충을 통해 훨씬 더 오랜 기간 동안 유지된다. 관류 생물 반응기에서 증가된 시간 동안 보다 높은 세포 밀도는 부분적으로 이의 보다 효율적인 성능을 설명한다.

전형적인 관류 배양은, 1일 이상 동안 지속되는 회분식 배양 개시로 시작하여 급속한 초기 세포 성장 및 바이오매스 축적을 가능하게 한 후, 상기 배양에 새로운 관류 배지의 연속적, 단계적 및/또는 간헐적 첨가, 및 상기 배양의 성장기 및 생산기 전체에 걸친 세포의 보유와 함께 소비된 배지의 동시 제거를 수행한다. 침강, 원심 분리 또는 여과와 같은 다양한 방법을 사용하여, 세포를 유지하면서 소비된 배지를 제거할 수 있다. 분수의 작업 부피 (working volume)/일에서 많은 배수의 작업 부피/일까지 관류 유속을 사용하였다.

연속식 관류 시스템은 전통적인 유가식 및 회분식 시스템에 비해 다수의 이점을 갖지만, 관류 생물 반응기가 생물제제 제조 산업에서 보다 널리 수용되고 활용되기 전에는 많은 도전이 여전히 남아 있다. 예를 들어, 관류 생물 반응기는 배지의 제거 및 보충의 연속적인 주기로 인해 전통적인 유가식 시스템보다 훨씬 더 많은 양의 배지를 소비한다. 또한, 현재 샘플링 및 분석에 의해서만 결정될 수 있는, 단백질 폴딩, 응집, 글리코실화, 산화 및 오염과 같은 생성물 품질의 실시간 직접 평가를 위한 일반적인 적절한 센서 기술 부족이 존재한다. 이러한 기술 능력이 있으면 장기 정상 상태 관류의 조작을 크게 지원할 수 있다. 또 다른 한계는 일반적인 이용 가능한 관류 바이오 프로세스 모델링 소프트웨어 부족이며, 이는 주로 관류 기반 시스템에 관한 강력한 데이터 소스가 부족하기 때문이다. 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [E. Langer and R. Rader, "Continuous Bioprocessing and Perfusion: Wider Adoption Coming as Bioprocessing Matures," BioProcess J, 2014; 13(1): 43-49]을 참조한다.

개선이 필요한 아주 중요한 분야 중 하나는 보다 우수한 관류 생물 반응기 배지를 개발하는 것이다. 관류로 성장한 세포의 영양 요구량에 대한 과학적 데이터는 회분식 배양으로 성장한 세포의 잘 확립된 지식과 비교하여 비교적 적다. 온라인으로 이용 가능한 문헌 [BSargent, "Are Perfusion Cell Culture Systems the Future for Cell-Culture Based Biomanufacturing," The Cell Culture Dish, February 3, 2012]을 참조한다. 배지의 최근 개선은 어느 정도까지 보다 높은 생존 세포 밀도 및, 결국 관류 공정에서 보다 높은 역가를 달성하였다. 그러나, 생존 세포 밀도가 높으면 다른 문제가 발생할 수 있다. 특히, 이러한 상승된 생존 세포 밀도는 지속 불가능하게 되어 배양 생존력 감소, 관류 배양 실행 단축 및 이에 수반하여 생산성 감소를 초래할 수 있다. 따라서, 세포 배양 배지 디자인은 관류 세포 배양을 수행하면서 더 큰 세포 건강, 생존력 및 생산성을 달성하는데 있어서 중요하다. 관류 세포 배양 배지 디자인 및 배양 방법에 대한 개선은 당해 분야의 단점 및 도전을 극복하기 위해 필요하다.

연속식 관류 세포 배양 시스템이 직면하는 또 다른 문제는 일정한 생존 세포 밀도 및 그 결과로 더 건강하고 생산적인 세포 배양을 유지하는 도전이다. 이것은 전형적으로 "세포 배출"을 허용함으로써 해결되었다. 세포 배출 동안, 세포는 정상 상태 관류 세포 배양을 가능하게 하기에 충분한 속도로 폐기물로서 제거 및 폐기된다. 결국, 이것은 생존 세포 밀도를 일정하게 유지한다. 그러나, 세포 배출은 제거된 세포가 관심 대상 생성물을 함유하더라도 폐기되기 때문에 낭비적이다. 따라서, 임의의 양의 세포 배출은 공정 효율, 생성물 회수 및 가장 중요하게는 생성물 손실에 부정적인 영향을 미친다. 세포 배출 속도는 세포 성장 속도에 의해 결정된다. 보다 빠른 배가 시간은 또한 일정한 세포 밀도를 유지하기 위한 보다 높은 세포 배출 및 결과적으로 보다 많은 폐기물을 필요로 한다.

세포 배출의 대안으로서, 다른 사람들은 세포 성장 속도를 늦추기 위해 화학 첨가제를 시도하였다. 예를 들어, 문헌 [Du et al., Biotechnology and Bioengineering, Vol. 112, No. 1, January 2015]은 성장을 제어하고 세포 배양 생산성을 개선시키기 위한 소분자 세포 주기 억제제의 사용을 보고하였다. 유사한 개시 내용은 회분식, 유가식 및 관류 배양과 같은 세포 배양에서 CDK4 억제제의 사용을 개시하고 있는 국제공개공보 WO 2014/109858에서 발견되었다. 두 등 (Du et al.)은 CDK4/6 억제제가 다른 세포 표적에 영향을 미치지 않으면서 세포 주기를 특이적으로 억제한다고 추가로 교시하고 있다. 다른 세포 성장 억제제는 개시되어 있지 않다.

따라서, 관류 상태에서 세포 성장을 억제하고 세포 배출에 대한 필요성을 회피하는데 효과적인 추가의 방법 및 제제는 당해 분야의 진보에 유의하게 도움을 줄 것이다.

관류 생물 반응기가 직면하는 추가의 또 다른 문제는 영양 보충제에 관한 전반적인 지식 부족이다. 회분식 세포 배양 배지는 세포 생존력, 성장 및 생산성을 비롯하여 세포 배양의 다양한 양태를 개선하는데 도움을 주는 영양 보충제 또는 첨가제의 사용과 오랫동안 관련되어 왔다. 문헌 [Gorfien et al., "Optimized Nutrient Additives for Fed-Batch Cultures," BioPharm International, April 2003, pp. 34-40]을 참조한다. 그러나, 상기에서 언급한 바와 같이, 연속식 관류 배양 시스템을 위한 배지 디자인은 훨씬 덜 개발되었다.

지질계 보충제와 관련하여, 지질 성분 및 리포솜은 세포 배양에 사용하기 위해 이전에 기술되었지만, 제한적인 성공을 거두었다. 예를 들어, 문헌 [Hams et al., Proc Natl Acad Sci USA 78: 5588-92, 1981]은 다양한 지질 성분, 예를 들어, 콜레스테롤, 레시틴 또는 정제된 포스파티딜콜린, 스핑고미엘린 및 비타민 E를 포함하는 리포솜을 포함하는 배지에서 사람 섬유아세포를 배양시키는 것을 개시하고 있다. 그러나, 햄스 등 (Hams et al.)은, 리포솜이 사용 24 시간 이내에 제조될 필요가 있다는 점에서 안정적이지 않다고 기재하고 있으며, 완전 배지에서의 리포좀의 단순한 사용이 세포 성장을 촉진하지 않는다는 것을 보여준다. 또한, 배양 시스템은 관류 기반이 아니다.

지질계 보충제는 또한 문헌 [Spens et al., Biotechnol Prog 21: 87-95, 2005]에 기재되어 있다. 스펜스 등 (Spens et al.)은 그 중에서도 콜레스테롤, 사이클로덱스트린, 포스파티딜콜린, 비타민 E, 제2철 시트레이트, 플루로닉 및 아미노산을 추가로 포함하는 무단백 배지에서 NS0 골수종 세포의 배양을 기술하고 있다. 그러나, 스펜스 등은 지질이 높은 수준으로 용액에서 침전된다고 기재하고 있다. 또한, 배양 시스템은 관류 기반이 아니다.

국제공개공보 WO 94/23572 A2 ("세포 배양 방법 및 배지")는 다른 유형의 동물 세포 중에서도 간 세포의 세포 배양물을 생성하는 방법에 관한 것이다. 상기 참고 문헌은 조직 샘플을 절단하고 리놀레산을 포함할 수 있는 배지에서 조직 배양으로 세포를 성장시킴으로써 세포를 제조하는 것에 관한 것이다. 그러나, 상기 참고 문헌에서 세포 배양의 목적은 세포 증식을 억제하지 않고 세포를 증식시키는 것이다. 세포 배양은 또한 관류 배양이 아니다. 따라서, 상기 참고 문헌은 관류 배양에 사용하기 위한 영양 보충제로서 리놀레산의 사용을 교시하거나 제안하고 있지 않으며, 관류 상태에서 세포 성장을 억제하기 위한 리놀레산의 사용을 교시하거나 제안하고 있지도 않다.

국제공개공보 WO 98/04681 A2 ("연골 세포 배지 제형 및 배양 절차")는 동물로부터 단리된 연골 세포의 배양물을 증식시키는 것을 준비하기 위한 성장 배지 및 절차에 관한 것이다. 상기 참고 문헌은 리놀레산을 포함할 수 있는 다양한 무혈청 제한 세포 배양 배지를 개시하고 있다. 그러나, 상기 참고 문헌에서 세포 배양의 목적은 세포 증식을 억제하지 않고 세포를 증식시키는 것이다. 세포 배양은 또한 관류 배양이 아니다. 따라서, 상기 참고 문헌은 관류 배양에 사용하기 위한 영양 보충제로서 리놀레산의 사용을 교시하거나 제안하고 있지 않으며, 관류 상태에서 세포 성장을 억제하기 위한 리놀레산의 사용을 교시하거나 제안하고 있지도 않다.

국제공개공보 WO 2000/027996 ("연골 세포 유사 세포를 위한 무혈청 배지")은 배양에서 연골 세포 및 중간엽 줄기 세포의 성장 및 증식을 위한 무혈청 배지에 관한 것이다. 상기 참고 문헌은 리놀레산을 포함할 수 있는 다양한 무혈청 제한 세포 배양 배지를 개시하고 있다. 그러나, 상기 참고 문헌에서 세포 배양의 목적은 세포 증식을 억제하지 않고 세포를 증식시키는 것이다. 세포 배양은 또한 관류 배양이 아니다. 따라서, 상기 참고 문헌은 관류 배양에 사용하기 위한 영양 보충제로서 리놀레산의 사용을 교시하거나 제안하고 있지 않으며, 관류 상태에서 세포 성장을 억제하기 위한 리놀레산의 사용을 교시하거나 제안하고 있지도 않다.

국제공개공보 WO 2003/064598 ("연골 세포를 위한 무혈청 배지 및 사용 방법")은 배양에서 연골 세포의 성장 및 증식을 위한 무혈청 배지에 관한 것이다. 상기 참고 문헌은 리놀레산 및 아라키돈산을 포함할 수 있는 다양한 무혈청 제한 세포 배양 배지를 개시하고 있다. 그러나, 상기 참고 문헌에서 세포 배양의 목적은 세포 증식을 억제하지 않고 세포를 번식시키는 것이다. 세포 배양은 또한 관류 배양이 아니다. 따라서, 상기 참고 문헌은 관류 배양에 사용하기 위한 영양 보충제로서 리놀레산 또는 아라키돈산의 사용을 교시하거나 제안하고 있지 않으며, 관류 상태에서 세포 성장을 억제하기 위한 리놀레산의 사용을 교시하거나 제안하고 있지도 않다.

당해 분야에서 언급된 관류 세포 배양의 도전을 고려하여, 관류 상태에서 세포 성장을 억제하는데 효과적이고 세포 배출에 대한 필요성을 회피하는 추가의 배지 보충제 또는 첨가제는 당해 분야의 진보에 유의하게 도움을 줄 것이다.

발명의 개요

본 발명은 부분적으로는, 예를 들어, 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체가 세포 배양 배지에 단독으로 또는 조합으로 포함될 때, 특정 지질 및 지질 대사 산물, 및/또는 이들의 유도체 및/또는 전구체가 세포 비생산성의 증가를 초래하는데 효과적이고/이거나 높은 세포 생존력을 유지하거나 지속하고/하거나 세포 배양의 세포 성장을 억제하는데 효과적이다는 발견에 관한 것이다. 이들 제제는 회분식, 유가식 및 연속식 관류 세포 배양 시스템을 비롯한 임의의 유형의 세포 배양 시스템과 관련하여 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 세포 배양 시스템은 연속식 관류 세포 배양 시스템이다.

본 출원에서 기재된 지질 및 지질 대사 산물, 예를 들어, 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체는 세포 성장을 억제하는데 효과적이며, 이러한 성장 억제는 세포 비생산성의 증가를 초래하고 세포 배양에서 높은 생존력을 유지하는데 도움을 주는 것으로 밝혀졌다.

관류 세포 배양과 관련하여, 본 출원에서 기재된 지질 및/또는 지질 대사 산물 (예를 들어, 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체)에 의한 세포 성장 억제는 세포 비생산성의 증가 및 관류 세포 배양에서의 지속적인 높은 세포 생존력을 초래할 뿐만 아니라, 관류 상태 동안 세포 배출 기술을 사용할 필요성을 감소시키거나 제거하여 세포를 정상 상태의 성장으로 유지한다. 환언하면, 본 발명의 지질 및 지질 대사 산물에 의한 관류 상태에서의 세포 성장의 억제는, 낭비적이고 바람직하지 않은 세포 배출 기술을 최소화하거나 제거하면서, 전체 세포 비생산성을 증가시키며, 높은 세포 생존력을 유지하는데 도움을 준다.

상기에서 명시된 바와 같이, 연속식 세포 배양 공정과 관련하여 지속 가능한 생존 세포 밀도를 유지하고 생존력을 보존하기 위해 낭비적인 세포 배출을 이용할 수 있다. 연속식 공정에서, 배양 배지의 대부분 및 이로 인한 생성물은 생물 반응기 내에서 일정하고 지속 가능한 생존 세포 밀도를 유지하기 위해서 증식성 세포 및 배지를 빨아들이는 세포 배출의 기술로 인해 손실될 수 있다. 수확 가능한 물질의 최대 1/3은 세포 배출 기술로 인해 손실될 수 있다. 따라서, 세포 배출의 사용은, 세포 배출에 의해 제거된 부분 내의 생성물이 수확되지 않기 때문에, 실행 당 생성물 수율을 감소시킨다. 세포 배출에 의해 제거된 배양물의 부피를 감소시키고, 이에 따라 수확을 위해 상청액을 더 유지하기 위해, 생산기에서 목적하는 생존 세포 밀도에 도달하면 세포 증식을 억제하는 것이 유리하다. 낭비적인 세포 배출 기술을 이용하지 않고 최적의 생존 세포 밀도가 수득되면 세포 성장을 제어함으로써, 관류 실행 당 회수되는 생성물을 증가시키고, 관류 공정을 조작시키기 위한 보다 효율적인 방법을 개발할 필요성이 존재한다.

본 출원의 실시예의 특정 실시형태에서 입증된 바와 같이, 본 발명은 리놀레산, 아라키돈산 또는 프로스타글란딘 E2 중 하나 이상을 포함하는 관류 배양 배지를 제공한다. 본 발명은 상기 배지를 사용하여 포유 동물 세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary: CHO) 세포를 배양시키는 방법을 추가로 제공한다. 특정 실시형태에서, 상기 세포 배양 방법은 유가식 또는 회분식 방법일 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 세포 배양 방법은 연속식 관류 배양 방법일 수 있다. 실시예는 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2가 - 단독으로 또는 조합으로 - 세포 배양, 예를 들어, 관류 세포 배양에서 포유 동물 세포에 대해 동일한 효과를 가지며, 여기서, 상기 효과가 낭비적인 세포 배출에 대한 필요성 없이 수반되는 생성물 생산의 증가에 의한 성장 억제인 것을 입증한다.

따라서, 본 개시 내용의 하기 양태들이 본 출원에서 제공된다.

본 개시 내용의 제1 양태에서, 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유효량의 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물을 포함하는 배양 배지에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키는 단계를 포함하는, 세포 배양에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 조합물은 성장 억제 및/또는 세포 비생산성 증가를 초래한다. 관류 세포 배양에 관한 다른 특정 실시형태에서, 상기 성장 억제 및/또는 세포 비생산성 증가는 세포 배출에 대한 필요성을 감소시키거나 제거하여 정상 상태를 유지하거나 달성할 수 있다.

본 개시 내용의 제2 양태에서, 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유효량의 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물을 포함하는 관류 배양 배지에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키는 단계를 포함하는, 관류 세포 배양에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키는 방법이 제공된다.

본 개시 내용의 제3 양태에서, 유효량의 리놀레산을 포함하는 관류 배양 배지에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키는 단계를 포함하는, 관류 세포 배양에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키는 방법이 제공된다.

본 개시 내용의 제4 양태에서, 유효량의 아라키돈산을 포함하는 관류 배양 배지에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키는 단계를 포함하는, 관류 세포 배양에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키는 방법이 제공된다.

본 개시 내용의 제5 양태에서, 유효량의 프로스타글란딘 E2를 포함하는 관류 배양 배지에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키는 단계를 포함하는, 관류 세포 배양에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키는 방법이 제공된다.

본 개시 내용의 제6 양태에서, (a) 목적하는 세포 밀도에 도달할 때까지 관류 성장 배지에서 관심 대상 단백질을 암호화하는 재조합 포유 동물 세포를 배양시키는 단계, 및 (b) 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유효량의 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물을 상기 성장 배지에 도입하는 단계를 포함하는, 관류 세포 배양의 비생산성을 증진시키는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 조합물은 성장 억제 및/또는 세포 비생산성 증가를 초래한다. 관류 세포 배양에 관한 다른 특정 실시형태에서, 상기 성장 억제 및/또는 세포 비생산성 증가는 세포 배출에 대한 필요성을 감소시키거나 제거하여 정상 상태를 유지하거나 달성할 수 있다.

본 개시 내용의 제7 양태에서, 포유 동물 세포를 배양시키고 개선된 생산성으로 치료학적 단백질을 생산하기 위한 세포 배양 배지가 제공된다. 상기 세포 배양 배지는 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유효량의 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 조합물은 성장 억제 및/또는 세포 비생산성 증가를 초래한다. 관류 세포 배양에 관한 다른 특정 실시형태에서, 상기 성장 억제 및/또는 세포 비생산성 증가는 세포 배출에 대한 필요성을 감소시키거나 제거하여 정상 상태를 유지하거나 달성할 수 있다. 상기 세포 배양 배지는 회분식 배양, 유가식 배양 및 연속식 관류 배양을 비롯한 연속식 배양을 포함하는 임의의 세포 배양 플랫폼에서 사용될 수 있다.

상기 양태의 다양한 실시형태에서, 상기 세포 배양은 특별히 제한되지 않으며, 유가식, 회분식, 관류, 연속식, 유한 (finite), 현탁, 부착성 또는 단층, 앵커리지-의존성 및 3D 배양을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 세포 배양의 모든 형태 및 기술을 포괄할 수 있다. 세포 배양의 임의의 구성이 본 출원에서 고려된다. 바람직한 실시형태에서, 상기 세포 배양은 연속식 관류 세포 배양이다.

다양한 실시형태에서, 세포 배양에서 성장된 포유 동물 세포는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 다양한 다른 실시형태에서, 상기 포유 동물 세포는 특별히 제한되지 않는다. 이들은 햄스터 (예를 들어, CHO 또는 CHO-S 세포), 사람 (예를 들어, 저캇 세포 (Jurkat cell), 293 세포, HeLa 세포), 원숭이 (예를 들어, CV-1 세포) 또는 마우스 (예를 들어, 3T3 세포)로부터 유래된 임의의 통상적으로 사용되는 세포주를 포함할 수 있다. 상기 세포는 임의의 조직, 예를 들어, 난소 세포 (예를 들어, CHO-S의 CHO) 또는 신장 세포 (예를 들어, 293 세포)로부터 유래될 수 있다. 본 출원의 임의의 방법에서 사용되는 세포는 또한 상업적 공급원, 예를 들어, THERMOFISHER SCIENTIFIC®로부터 수득될 수 있는 임의의 세포를 포괄할 수 있다.

다양한 실시형태에서, 리놀레산의 유효량은 약 1800~2000 μM이다. 다른 실시형태에서, 리놀레산의 유효량은 약 1~5000 μM, 또는 약 1~2500 μM, 또는 약 1~1250 μM, 또는 약 1~1000 μM, 또는 약 1~800 μM, 또는 약 1~600 μM, 또는 약 1~400 μM, 또는 약 1~200 μM, 또는 약 1~100 μM, 또는 약 1~50 μM, 또는 약 1~25 μM이다. 하나의 실시형태에서, 리놀레산은 500~2000 μM의 농도로 존재한다.

다른 실시형태에서, 아라키돈산의 유효량은 약 150~500 μM이다. 또 다른 실시형태에서, 아라키돈산의 유효량은 약 1~5000 μM, 또는 약 1~2500 μM, 또는 약 1~1250 μM, 또는 약 1~1000 μM, 또는 약 1~800 μM, 또는 약 1~600 μM, 또는 약 1~400 μM, 또는 약 1~200 μM, 또는 약 1~100 μM, 또는 약 1~50 μM, 또는 약 1~25 μM이다. 하나의 실시형태에서, 아라키돈산은 100~600 μM의 농도로 존재한다.

다른 실시형태에서, 프로스타글란딘 E2의 유효량은 약 0.001 μM 내지 60 μM이다. 또 다른 실시형태에서, 프로스타글란딘 E2의 유효량은 0.000001 μM 이상, 0.00001 μM 이상, 0.0001 μM 이상, 0.001 μM 이상, 0.01 μM 이상, 0.1 μM 이상, 1 μM 이상, 10 μM 이상, 20 μM 이상, 30 μM 이상, 40 μM 이상, 50 μM 이상, 60 μM 이상, 70 μM 이상, 80 μM 이상, 90 μM 이상, 100 μM 이상, 150 μM 이상, 또는 200 μM 이상이며, 여기서, 각 범위의 상한은 1000 μM 이하일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 프로스타글란딘 E2의 유효량은 약 1~5000 μM, 또는 약 1~2500 μM, 또는 약 1~1250 μM, 또는 약 1~1000 μM, 또는 약 1~800 μM, 또는 약 1~600 μM, 또는 약 1~400 μM, 또는 약 1~200 μM, 또는 약 1~100 μM, 또는 약 1~50 μM, 또는 약 1~25 μM, 또는 약 0.0001~0.001 μM, 또는 약 0.0005~0.01 μM, 또는 약 0.005~0.1 μM, 또는 약 0.05~1.0 μM, 또는 약 0.5~100 μM, 또는 약 50~1000 μM 또는 그 이상이다. 하나의 실시형태에서, 프로스타글란딘 E2는 0.0001~100 μM의 농도로 존재한다.

일부 실시형태에서, 상기 배양 배지는 적어도 2개의 상기 지질 또는 지질 대사 산물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 배양 배지는 100~300 μM 농도의 아라키돈산 및 500~1800 μM 농도의 리놀레산을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 배양 배지는 500~1800 μM 농도의 리놀레산 또는 100~150 μM 농도의 아라키돈산과 조합하여 0.0001~0.0009 μM 농도의 프로스타글란딘 E2를 포함한다.

추가의 또 다른 실시형태에서, 상기 배양 배지는 3개의 모든 상기 지질 또는 지질 대사 산물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 배양 배지는 500~2000 μM 농도의 리놀레산, 100~300 μM 농도의 아라키돈산, 및 0.0001~0.0009 μM 농도의 프로스타글란딘 E2를 포함한다.

다양한 실시형태에서, 상기 이종 단백질은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 항체, 융합 단백질, 사이토카인 또는 성장 인자 (이들에 한정되는 것은 아님)와 같은 치료학적 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. 상기 항체는 단클론 항체일 수 있으며, (a) 항원 결합 빌딩 블록 (예를 들어, 단일 가변 도메인 결합 부위; 2개의 가변 도메인 결합 부위; 디아바디), (b) 이중 특이적 항체 단편 (예를 들어, 직렬 (tandem) scFv, 직렬 scFv-Fc, scFv-Fc 놉스-인투-홀 (knobs-into-holes), scFv-Fc-scFv, F(ab')_2, Fab-scFv, (Fab'scFv)_2, 디아바디, sc디아바디 (scDiabody), sc디아바디-Fc, sc디아바디-C_H3), (c) IgG 기반 이중 특이적 항체 (예를 들어, 하이브리드 하이브리도마, 공통 경쇄를 갖는 놉스-인투-홀, 투-인-원 (two-in-one) IgG, 이중 V 도메인 IgG, IgG-scFv, scFv-IgG, IgG-V 및 V-IgG)를 비롯한 임의의 대안적인 분자 형태일 수 있다. 본 출원에 참조로 포함된 문헌 [Chan et al., Nature Reviews Immunology, Vol. 10, pp. 301-316 (May 2010)]을 참조한다.

다양한 실시형태에서, 상기 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물은 세포 배양에서의 세포가 특정 밀도에 도달할 때에만 첨가되거나 개시된다. 특정 실시형태에서, 상기 세포 밀도는 10×10⁶ 세포/ml 내지 약 120×10⁶ 세포/ml 또는 훨씬 초과이다. 지질 개시를 위한 세포 밀도는 또한 적어도 10×10⁶ 세포/ml, 적어도 20×10⁶ 세포/ml, 적어도 30×10⁶ 세포/ml, 적어도 40×10⁶ 세포/ml 또는 적어도 50×10⁶ 세포/ml일 수 있다.

특정 실시형태에서, 포유 동물 세포가 목적하는 생존 세포 밀도에 도달할 때까지 상기 세포를 무혈청 관류 배지에 의한 관류에 의해 성장기 동안 배양시키고; 이어서, 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유효 유도체 및/또는 전구체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물을 포함하는 무혈청 관류 배지에서 상기 세포를 생산기 동안 성장시키는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 아라키돈산은 존재하는 경우 100~300 μM의 농도이고, 리놀레산은 존재하는 경우 500~1800 μM의 농도이고, 프로스타글란딘 E2는 존재하는 경우 0.0001~0.0009 μM의 농도이다. 다른 특정 실시형태에서, 성장기는 목적하는 생존 세포 밀도 (viable cell density: VCD)가 10×10⁶ 세포/ml 내지 약 120×10⁶ 세포/ml 또는 훨씬 더 초과에 도달하거나, 약 10×10⁶ 세포/ml 또는 약 20×10⁶ 세포/ml 또는 약 30×10⁶ 세포/ml 또는 약 40×10⁶ 세포/ml 또는 약 50×10⁶ 세포/ml에 도달할 때까지 계속된다.

관류 세포 배양에 관한 특정 실시형태에서, 상기 세포 배양 방법은 추가의 세포 배출 단계를 포함할 수 있다. 그러나, 상기 세포 배출의 사용은, 동일한 관류 배지를 사용하지만 본 출원에서 기재된 지질 또는 지질 대사 산물을 포함하지 않는 관류 세포 배양과 비교하여, 본 출원에서 기재된 방법의 지질 함유 배지에 의해 감소되거나 제거될 수 있다.

상기 관류 배지의 삼투압은 300 내지 1400 mOsmol/kg, 바람직하게는 300 내지 500 mOsmol/kg, 보다 바람직하게는 330 내지 450 mOsmol/kg, 보다 더 바람직하게는 360 내지 390 mOsmol/kg의 범위일 수 있다.

상기 관류 배지는 무혈청일 수 있으며, 추가로 화학적으로 제한되고/되거나 가수분해물을 함유하지 않을 수 있다. 바람직하게는 상기 관류 배지는 무단백이거나, 재조합 인슐린 및/또는 인슐린 유사 성장 인자를 제외하고는 무단백이며, 보다 바람직하게는 상기 무혈청 관류 배지는 화학적으로 제한되고, 무단백이거나, 재조합 인슐린 및/또는 인슐린 유사 성장 인자를 제외하고는 무단백이다.

추가의 양태에서, 치료학적 단백질을 정제하고 약제학적으로 허용되는 제형으로 제형화하는 추가의 단계를 임의로 포함하는, 본 발명의 방법을 사용하여 치료학적 단백질을 생산하는 방법이 제공된다.

추가의 특정 실시형태에서, 본 개시 내용은 어떠한 방식으로든 본 개시 내용의 범위를 제한하도록 의도되지 않는 하기 실시형태들을 제공한다.

하나의 실시형태에서, 본 개시 내용은 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유효량의 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물을 포함하는 배양 배지에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키는 단계를 포함하는, 세포 배양에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 조합물은 성장 억제 및/또는 세포 비생산성 증가를 초래한다. 관류 세포 배양에 관한 다른 특정 실시형태에서, 상기 성장 억제 및/또는 세포 비생산성 증가는 세포 배출에 대한 필요성을 감소시키거나 제거하여 정상 상태를 유지하거나 달성할 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 세포 배양으로부터 치료학적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다:

(a) 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유효량의 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물을 포함하는 배양 배지에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키는 단계,

(b) 상기 세포 배양물로부터 상기 이종 단백질을 수확하는 단계.

특정 실시형태에서, 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 조합물은 성장 억제 및/또는 세포 비생산성 증가를 초래한다. 관류 세포 배양에 관한 다른 특정 실시형태에서, 상기 성장 억제 및/또는 세포 비생산성 증가는 세포 배출에 대한 필요성을 감소시키거나 제거하여 정상 상태를 유지하거나 달성할 수 있다.

다양한 실시형태에서, 상기 관류 세포 배양 배지는 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2, 및 이들의 기능적으로 동등한 유도체 및/또는 전구체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물을 포함한다.

다양한 실시형태에서, 리놀레산 또는 이의 유도체는 500~2000 μM의 농도로 존재한다.

다양한 실시형태에서, 아라키돈산 또는 이의 유도체는 100~600 μM의 농도로 존재한다.

다양한 실시형태에서, 프로스타글란딘 E2 또는 이의 유도체는 0.0001~100 μM의 농도로 존재한다.

다양한 실시형태에서, 상기 배양 배지는 2개의 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체를 포함한다.

다양한 실시형태에서, 상기 배양 배지는 100~300 μM 농도의 아라키돈산 및 500~1800 μM 농도의 리놀레산을 포함한다.

다양한 실시형태에서, 상기 배양 배지는 500~1800 μM 농도의 리놀레산 또는 100~150 μM 농도의 아라키돈산과 조합하여 0.0001~0.0009 μM 농도의 프로스타글란딘 E2를 포함한다.

다양한 실시형태에서, 상기 배양 배지는 상기 3개의 모든 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체를 포함한다.

다양한 실시형태에서, 상기 리놀레산은 500~2000 μM의 농도이고, 상기 아라키돈산은 100~300 μM의 농도이고, 상기 프로스타글란딘 E2는 0.0001~0.0009 μM의 농도이다.

다양한 실시형태에서, 상기 세포 배양은 회분식, 유가식 또는 연속식 관류 세포 배양이다.

다양한 실시형태에서, 상기 포유 동물 세포는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 저캇 세포, 293 세포, HeLa 세포, CV-1 세포 또는 3T3 세포, 또는 이들 세포 중 임의의 세포의 유도체를 포함하며, 여기서, 상기 CHO 세포는 CHO-DG44 세포, CHO-K1 세포, CHO DXB11 세포, CHO-S 세포 및 CHO GS 결핍 세포 또는 이들 세포 중 임의의 세포의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 추가로 선택될 수 있다.

다양한 실시형태에서, 상기 이종 단백질은 치료학적 단백질, 항체 또는 이의 치료학적 유효 단편이다.

다양한 실시형태에서, 상기 항체는 단클론 항체 또는 이의 단편이다.

다양한 실시형태에서, 상기 항체는 이중 특이적 항체이다.

다양한 실시형태에서, 상기 배양 배지는 무혈청 관류 배지이다.

다양한 실시형태에서, 상기 배양 배지는 임의로 (a) 화학적으로 제한되거나, (b) 가수 분해물을 함유하지 않거나, (c) 무단백이지만 임의로 인슐린 및/또는 인슐린 유사 성장 인자를 포함한다.

다양한 실시형태에서, 상기 생산성 증가는, 상기 세포 배양에 의해 생산된 이종 단백질의 총 생산이 상기 지질 또는 지질 대사 산물을 포함하지 않는 대조군 세포 배양에서의 총 생산의 수준에 비해 적어도 5% 또는 적어도 6% 또는 적어도 7% 또는 적어도 8% 또는 적어도 9% 또는 적어도 10% 또는 적어도 15% 또는 적어도 20% 또는 적어도 25% 또는 적어도 30% 또는 적어도 35% 또는 적어도 40% 또는 적어도 45% 또는 적어도 50% 또는 적어도 60% 또는 적어도 70% 또는 적어도 80% 또는 적어도 90% 또는 적어도 100% 또는 적어도 200% 증가할 때, 달성될 수 있다.

다양한 실시형태에서, 상기 생산성 증가는, 상기 세포 배양의 세포 비생산성 (pg/세포/일)이 상기 지질 또는 지질 대사 산물을 포함하지 않는 대조군 세포 배양에서의 세포 비생산성에 비해 적어도 5% 또는 적어도 6% 또는 적어도 7% 또는 적어도 8% 또는 적어도 9% 또는 적어도 10% 또는 적어도 15% 또는 적어도 20% 또는 적어도 25% 또는 적어도 30% 또는 적어도 35% 또는 적어도 40% 또는 적어도 45% 또는 적어도 50% 또는 적어도 60% 또는 적어도 70% 또는 적어도 80% 또는 적어도 90% 또는 적어도 100% 또는 적어도 200%, 또는 적어도 5~10%, 또는 적어도 7.5~20%, 또는 적어도 10~30%, 또는 적어도 12.5~40%, 또는 적어도 15~50%, 또는 적어도 5~50% 증가할 때, 달성될 수 있다.

다양한 실시형태에서, 상기 성장 억제는 상기 지질 또는 지질 대사 산물을 포함하지 않는 대조군 세포 배양에 비해 적어도 50% 미만, 적어도 40% 미만, 적어도 30% 미만, 적어도 20% 미만, 적어도 15% 미만 또는 적어도 10% 미만 또는 적어도 5% 미만 또는 적어도 2.5% 미만 또는 1% 이하인 생존 세포 밀도를 갖는 정상 상태로 상기 세포를 유지하기에 충분하다.

다양한 실시형태에서, 2일째의 상기 세포 배양은 관류 세포 배양으로 변경된다.

다양한 실시형태에서, 상기 관류 속도는 관류 시작 후에 증가한다.

다양한 실시형태에서, 상기 관류 속도는 0.5 용기 부피/일 이하에서 5 용기 부피/일로 증가한다.

다양한 실시형태에서, 상기 관류 속도는 0.5 용기 부피/일 이하에서 2 용기 부피/일로 증가한다.

다양한 실시형태에서, 상기 세포 배양물로부터 상기 이종 단백질을 연속 방식으로 수확하는 단계를 추가로 포함한다.

다양한 실시형태에서, 상기 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 유도체가 10×10⁶ 세포/ml 내지 약 120×10⁶ 세포/ml의 세포 밀도에 도달하면 상기 세포 배지에 첨가된다. 하나의 실시형태에서, 본 출원에서 개시된 방법 및/또는 성장 배지는 리놀레산을 성장 배지에 포함하지 않는 세포 배양에 비해 VCD를 6~10% 감소시키는 500 μM의 리놀레산 또는 이의 유도체를 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 본 출원에서 개시된 방법 및/또는 성장 배지는 리놀레산을 성장 배지에 포함하지 않는 세포 배양에 비해 VCD를 11~14% 감소시키는 900 μM의 리놀레산 또는 이의 유도체를 포함한다.

추가의 또 다른 실시형태에서, 본 출원에서 개시된 방법 및/또는 성장 배지는 리놀레산을 성장 배지에 포함하지 않는 세포 배양에 비해 VCD를 11~25% 감소시키는 1350 μM의 리놀레산 또는 이의 유도체를 포함한다.

하나의 실시형태에서, 본 출원에서 개시된 방법 및/또는 성장 배지는 리놀레산을 성장 배지에 포함하지 않는 세포 배양에 비해 VCD를 23~39.8% 감소시키는 1800 μM의 리놀레산 또는 이의 유도체를 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 본 출원에서 개시된 방법 및/또는 성장 배지는 아라키돈산을 성장 배지에 포함하지 않는 세포 배양에 비해 VCD를 15~36% 감소시키는 500 μM의 아라키돈산 또는 이의 유도체를 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 본 출원에서 개시된 방법 및/또는 성장 배지는 아라키돈산을 성장 배지에 포함하지 않는 세포 배양에 비해 VCD를 17% 감소시키는 0.001 μM의 프로스타글란딘 E2, 또는 이의 유도체 및/또는 전구체를 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 본 출원에서 개시된 방법 및/또는 성장 배지는 아라키돈산을 성장 배지에 포함하지 않는 세포 배양에 비해 VCD를 28% 감소시키는 10 μM의 프로스타글란딘 E2, 또는 이의 유도체 및/또는 전구체를 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 본 출원에서 개시된 방법 및/또는 성장 배지는 아라키돈산을 성장 배지에 포함하지 않는 세포 배양에 비해 VCD를 39% 감소시키는 20 μM의 프로스타글란딘 E2, 또는 이의 유도체 및/또는 전구체를 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 본 출원에서 개시된 방법 및/또는 성장 배지는 아라키돈산을 성장 배지에 포함하지 않는 세포 배양에 비해 VCD를 30% 감소시키는 60 μM의 프로스타글란딘 E2, 또는 이의 유도체 및/또는 전구체를 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 본 출원에서 개시된 방법 및/또는 성장 배지는 아라키돈산을 성장 배지에 포함하지 않는 세포 배양에 비해 VCD를 28% 감소시키는 10 μM의 프로스타글란딘 E2, 또는 이의 유도체 및/또는 전구체를 포함한다.

하나의 실시형태에서, 본 출원에서 개시된 방법 및/또는 성장 배지는 리놀레산을 성장 배지에 포함하지 않는 세포 배양에 비해 세포 비생산성을 최대 10% 증가시키는 500 μM의 리놀레산 또는 이의 유도체를 포함한다.

하나의 실시형태에서, 본 출원에서 개시된 방법 및/또는 성장 배지는 리놀레산을 성장 배지에 포함하지 않는 세포 배양에 비해 세포 비생산성을 최대 14% 증가시키는 900 μM의 리놀레산 또는 이의 유도체를 포함한다.

하나의 실시형태에서, 본 출원에서 개시된 방법 및/또는 성장 배지는 리놀레산을 성장 배지에 포함하지 않는 세포 배양에 비해 세포 비생산성을 최대 14% 증가시키는 1350 μM의 리놀레산 또는 이의 유도체를 포함한다.

하나의 실시형태에서, 본 출원에서 개시된 방법 및/또는 성장 배지는 리놀레산을 성장 배지에 포함하지 않는 세포 배양에 비해 세포 비생산성을 최대 30% 증가시키는 1800 μM의 리놀레산 또는 이의 유도체를 포함한다.

하나의 실시형태에서, 본 출원에서 개시된 방법 및/또는 성장 배지는 아라키돈산을 성장 배지에 포함하지 않는 세포 배양에 비해 세포 비생산성을 최대 52% 증가시키는 500 μM의 아라키돈산 또는 이의 유도체를 포함한다.

하나의 실시형태에서, 본 출원에서 개시된 방법 및/또는 성장 배지는 프로스타글란딘 E2를 성장 배지에 포함하지 않는 세포 배양에 비해 세포 비생산성을 최대 13.5% 증가시키는 0.001 μM의 프로스타글란딘 E2 또는 이의 유도체를 포함한다.

하나의 실시형태에서, 본 출원에서 개시된 방법 및/또는 성장 배지는 프로스타글란딘 E2를 성장 배지에 포함하지 않는 세포 배양에 비해 세포 비생산성을 최대 34.4% 증가시키는 10 μM의 프로스타글란딘 E2 또는 이의 유도체를 포함한다.

하나의 실시형태에서, 본 출원에서 개시된 방법 및/또는 성장 배지는 프로스타글란딘 E2를 성장 배지에 포함하지 않는 세포 배양에 비해 세포 비생산성을 최대 31% 증가시키는 20 μM의 프로스타글란딘 E2 또는 이의 유도체를 포함한다.

하나의 실시형태에서, 본 출원에서 개시된 방법 및/또는 성장 배지는 프로스타글란딘 E2를 성장 배지에 포함하지 않는 세포 배양에 비해 세포 비생산성을 최대 31% 증가시키는 60 μM의 프로스타글란딘 E2 또는 이의 유도체를 포함한다.

도 1. 관류 세포 배양에서 이종 단백질을 발현하는 CHO 세포주의 (A) 생존력 (%), (B) 생존 세포 밀도 (e⁵ 세포/ml) 및 (C) 비생산성 (pg/세포/일)에 대한 온도 변화의 영향. 세포 배양 2일째에 관류를 시작하였으며, 2 용기 부피/일 (2VVD)의 교환으로 점진적으로 증가시켰다. 화살표는 온도가 37℃에서부터 범례에서 표시된 값 (29℃ - 사각형 또는 28℃ - 삼각형)으로 변화된 일자를 나타낸다. 추가의 세부 사항은 실시예 1에서 발견될 수 있다.
도 2. 리놀레산 대사의 대사 경로를 도시한다. 고농도의 외인성 유리 리놀레산은 세포막을 통해 확산된 후 아라키돈산으로 전환되는 것으로 나타났다. 이어서, 상기 아라키돈산은 다단계 반응을 통해 다른 다운스트림 대사 산물 중에서도 PGE₂로 대사된다.
도 3. 리놀레산이 관류 배지에 첨가될 때 세포 성장을 억제하고 CHO 관류 세포 배양에서 세포 비생산성 (q_p)을 증가시킨다는 것을 입증한다. 500 μM, 900 μM, 1350 μM 및 1800 μM의 다양한 농도의 리놀레산을 세포 배양 배지에 첨가하고, (A) 생존 세포 밀도 (e⁵ 세포/ml), (B) 세포 생존력 (%) 및 (C) 비생산성 (q_p)을 측정하였다. 추가의 세부 사항은 실시예 2에서 발견될 수 있다.
도 4. 아라키돈산이 관류 배지에 첨가될 때 세포 성장을 억제하고 세포 비생산성 (q_p)을 증가시킨다는 것을 입증한다. 세포 배양의 (A) 생존 세포 밀도 (e⁵ 세포/ml), (B) 세포 생존력 (%) 및 (C) 비생산성 (q_p)에 대한 아라키돈산의 영향을 측정하였다. 정상 관류 배지에 첨가된 500 μM의 아라키돈 농도는 세포 성장을 최대 31% 억제하고 세포 비생산성을 46% 이상 증가시켰다. 추가의 세부 사항은 실시예 3에서 발견될 수 있다.
도 5. 아라키돈산이 관류 "k-팝 (k-pop)" 배지에 첨가될 때 세포 성장을 억제하고 세포 비생산성 (q_p)을 증가시킨다는 것을 입증한다. 이 경우의 k-팝 배지는 약 34 mM의 나트륨 농도 및 대략 94 mM의 상승된 칼륨 농도, 즉, 0.4 mol Na⁺/mol K⁺의 감소된 나트륨 대 칼륨 비를 갖는다. k-팝 기준선에서의 150 μM, 300 μM 및 500 μM의 아라키돈산 농도의 영향을 (A) 생존 세포 밀도 (e⁵ 세포/ml), (B) 세포 생존력 (%) 및 (C) 비생산성 (q_p)에 대해 측정하였다. 추가의 세부 사항은 실시예 4에서 발견될 수 있다.
도 6. 프로스타글란딘 E2가 관류 배지에 첨가될 때 세포 성장을 억제하고 세포 비생산성 (q_p)을 증가시킨다는 것을 입증한다. 도 6은 관류 배지에 첨가된 500 μM의 아라키돈산, 0.001 μM, 10 μM, 20 μM 및 60 μM의 PGE2의 농도의 영향을 (A) 생존 세포 밀도 (VCD) (e⁵ 세포/ml), (B) 세포 생존력 (%) 및 (C) 비생산성 (pg/세포/일)에 대해 측정하였다. 추가의 세부 사항은 실시예 5에서 발견될 수 있다.
도 7. 500 μM의 아라키돈산을 함유하는 관류 배지에서 (A) 생존 세포 밀도, (B) 생존력 (%) 및 (C) 비생산성에 대한 아세틸살리실산 (ASA)의 영향을 입증한다. 추가의 세부 사항은 실시예 6에서 발견될 수 있다.

본 발명은 부분적으로는, 예를 들어, 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체가 세포 배양 배지에 단독으로 또는 조합으로 포함될 때, 특정 지질 및 지질 대사 산물이 세포 배양의 생존 세포 밀도 및 세포 비생산성의 증가를 초래하는데 효과적이다는 발견에 관한 것이다. 이들 제제는 회분식, 유가식 및 연속식 관류 세포 배양 시스템을 비롯한 임의의 유형의 세포 배양 시스템과 관련하여 사용될 수 있다. 관류 세포 배양의 경우, 상기 지질 및/또는 지질 대사 산물의 사용은 세포 배양을 정상 상태로 유지하기 위한 수단으로서 세포 배출에 대한 필요성을 감소시키거나 제거시킬 수 있는데, 즉, 상기 지질 및/또는 지질 대사 산물 단독은 생존 세포 밀도를 감소시키고 세포 성장을 억제함으로써 세포 배양을 정상 상태로 유지하거나 지속시킬 수 있다.

이론에 의해 구속되는 것은 아니지만, 실시예에서 입증되는 바와 같이, 프로스타글란딘 E2는 세포 성장 억제 및 세포 비생산성 증가를 촉발시키는 중심 핵심 인자이다. 리놀레산 및 아라키돈산은 프로스타글란딘 E2 합성의 전구체이며, 동일한 대사 경로의 일부이다 (도 2 참조). 따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 리놀레산 및/또는 아라키돈산을 비롯하여, 외인성 프로스타글란딘 E2를 상기 세포 배양 배지에 첨가하고 외인성 프로스타글란딘 E2 대사 전구체를 상기 세포 배양 배지에 첨가하는 것을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 프로스타글란딘 E2의 세포내 농도를 증가시키는 직접 또는 간접 수단에 의한 효과적인 광범위한 접근법을 고려한다.

정의

특정 용어의 정의는 하기에서 제공된다. 일반적으로, 본 개시 내용에서 제시된 임의의 용어는, 달리 명시되거나 정의되지 않는다면, 당해 분야에서의 일반적인 의미를 가져야 한다.

"...을 포함하는" 또는 "...으로 포함된"의 일반적인 실시형태는 "...로 이루어진"의 보다 구체적인 실시형태를 포괄한다. 또한, 단수 및 복수 형태는 제한적인 방식으로 사용되지 않는다. 본 출원에서 사용되는 단수형 "a", "an" 및 "the"는, 단수로만 나타내는 것으로 명백히 명시되지 않는다면, 단수와 복수 둘 다를 나타낸다.

본 출원에서 사용되는 "관류"라는 용어는, 세포가 반응기에서 유지되는 동안, 동등한 부피의 배지가 동시에 첨가되고 반응기로부터 제거되는 세포 배양 생물 반응기를 유지하는 것을 지칭한다. 관류 배양은 또한 연속 배양으로 지칭될 수 있다. 이것은 새로운 영양소의 꾸준한 공급 및 세포 폐기물의 끊임없는 제거를 제공한다. 관류는 일반적으로 통상적인 생물 반응기의 회분식 또는 유가식 조건보다 훨씬 더 높은 세포 밀도 및 이로 인한 보다 높은 부피 생산성을 달성하기 위해 사용된다. 분비된 단백질 생성물은, 예를 들어, 여과, 교호 접선 유동 (alternating tangential flow: ATF), 세포 침강, 초음파 분리, 하이드로사이클론, 또는 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되거나 콤팔라 및 오즈투르크 (문헌 [Kompala and Ozturk, Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies, (2006), Taylor & Francis Group, LLC, pages 387-416])에 의해 개시된 임의의 다른 방법에 의해, 반응기에서 세포를 유지하면서 연속적으로 수확될 수 있다. 포유 동물 세포는 현탁 배양으로 성장하거나 (균질 배양), 표면에 부착되거나 상이한 장치에 포획될 수 있다 (불균질 배양). 생물 반응기에서 작업 부피를 일정하게 유지하기 위해서, 수확 속도와 세포 배출 (유체 제거)은 예정된 관류 속도와 동일해야 한다. 배양은 전형적으로 회분식 배양에 의해 개시되며, 관류는, 세포가 여전히 대수 증식기에 있을 때 접종 후 2~3일째와 영양소 제한이 발생하기 전에 시작된다.

관류 기반 방법은 새로운 배지를 첨가하고 소비된 배지를 동시에 제거함으로써 회분식 및 유가식 방법에 비해 잠재적인 개선을 제공한다. 대규모의 상업적 세포 배양 전략은 60~90×10⁶ 세포/mL의 높은 세포 밀도에 도달할 수 있으며, 이때 반응기 부피의 약 1/3 내지 절반 이상은 바이오매스일 수 있다. 관류 기반 배양으로, > 1×10⁸ 세포/mL의 극한 세포 밀도가 달성되었다. 전형적인 관류 배양은, 1일 이상 동안 지속되는 회분식 배양 개시로 시작하여 급속한 초기 세포 성장 및 바이오매스 축적을 가능하게 한 후, 상기 배양에 새로운 유가 배지의 연속적, 단계적 및/또는 간헐적 첨가, 및 상기 배양의 성장기 및 생산기 전체에 걸친 세포의 보유와 함께 소비된 배지의 동시 제거를 수행한다. 침강, 원심 분리 또는 여과와 같은 다양한 방법을 사용하여, 세포를 유지하면서 소비된 배지를 제거할 수 있다. 분수의 작업 부피/일에서 많은 배수의 작업 부피/일까지 관류 유속을 사용하였다.

본 출원에서 사용되는 "관류 속도"라는 용어는, 첨가되고 제거되는 부피이며, 전형적으로 1일 당 측정된다. 이것은 세포 밀도와 배지에 좌우된다. 영양소 첨가 및 부산물 제거의 적절한 속도를 보장하면서 관심 대상의 생성물, 즉, 수확 역가의 희석을 감소시키기는 것은 최소화되어야 한다. 관류는 전형적으로 세포가 여전히 대수 증식기에 있을 때 접종 후 2~3일째에 시작되고, 이로 인해, 관류 속도는 배양에 따라 증가될 수 있다. 관류 속도의 증가는 점증적이거나 연속적이며, 즉, 세포 밀도 또는 영양소 소비에 기초할 수 있다. 전형적으로 0.5 또는 1의 용기 부피/일 (vessel volume per day: VVD)로 시작하며, 약 5 VVD까지 올라갈 수 있다. 바람직하게는, 관류 속도는 0.5 내지 2 VVD이다. 증가는 0.5 내지 1 VVD일 수 있다. 관류의 연속적인 증가를 위해, 바이오매스 프로브는 수확 펌프와 접속될 수 있어서, 관류 속도는 목적하는 세포 비 관류 속도 (cell specific perfusion rate: CSPR)에 기초하여 바이오매스 프로브에 의해 결정된 세포 밀도의 선형 함수로서 증가된다. CSPR은 세포 밀도 당 관류 속도와 동일하며, 이상적인 CSPR은 세포주 및 세포 배지에 의존한다. 이상적인 CSPR은 최적의 성장 속도 및 생산성을 제공해야 한다. 1일 당 50 내지 100 pL/세포의 CSPR은 특정 세포주에 대한 최적 속도를 찾도록 조정될 수 있는 합리적인 시작 범위일 수 있다.

본 출원에서 사용되는 "정상 상태"라는 용어는, 세포 밀도 및 생물 반응기 환경이 비교적 일정하게 유지되는 상태를 지칭한다. 이것은 세포 배출, 영양 제한 및/또는 온도 감소에 의해 달성될 수 있다. 대부분의 관류 배양에서, 영양소 공급 및 폐기물 제거는 일정한 세포 성장 및 생산성을 가능하게 할 것이며, 세포 배출은 일정한 생존 세포 밀도를 유지하거나 세포를 정상 상태로 유지하기 위해 필요하다. 정상 상태에서의 전형적인 생존 세포 밀도는 10 내지 50e⁶ 세포/ml이다. 생존 세포 밀도는 관류 속도에 따라 달라질 수 있다. 보다 높은 세포 밀도는 관류 속도를 증가시키거나 관류에 사용하기 위한 배지를 최적화함으로써 도달될 수 있다. 매우 높은 생존 세포 밀도에서, 관류 배양은 생물 반응기 내에서 제어하기 어려워진다.

"세포 배출 (cell bleed)" 및 "세포 배출 (cell bleeding)"이라는 용어는, 본 출원에서 상호교환적으로 사용되며, 생물 반응기 내에서 일정하고 지속 가능한 생존 세포 밀도를 유지하기 위해 생물 반응기로부터 세포 및 배지의 제거를 지칭한다. 일정하고 지속 가능한 생존 세포 밀도는 또한 목표 세포 밀도로 지칭될 수 있다. 이러한 세포 배출은 규정된 유량으로 침적관 및 연동 펌프를 사용하여 수행될 수 있다. 너무 좁은 튜브는 세포 응집 및 막힘이 쉬운 반면, 너무 크면 세포가 침전될 수 있으므로, 배관은 올바른 크기를 가져야 한다. 세포 배출은 성장 속도에 기초하여 결정될 수 있으므로, 생존 세포 밀도는 연속적인 방식으로 목적하는 부피로 제한될 수 있다. 대안으로, 세포는 특정 빈도, 예를 들어, 하루에 1회 제거되며, 세포 밀도를 예측 가능한 범위 내로 유지하기 위해 배지로 대체될 수 있다. 이상적으로, 세포 배출 속도는 성장 속도와 동일하여 꾸준한 세포 밀도를 유지한다.

전형적으로, 세포 배출에 의해 제거된 관심 대상 생성물은 폐기되므로, 수확을 위해 손실된다. 투과물과는 정반대로, 세포 배출은 세포를 함유하고 있어 정제 전에 생성물의 저장을 더욱 어렵게 하고 생성물 품질에 해로운 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 세포는 저장 및 생성물 정제 전에 연속적으로 제거되어야 하는데, 이것은 힘들고 비용 비효율적이다. 느리게 성장하는 세포의 경우에는 세포 배출이 제거된 유체의 약 10%일 수 있으며, 빠르게 성장하는 세포의 경우에는 세포 배출 제거된 유체의 약 30%일 수 있다. 따라서, 세포 배출을 통한 생성물 손실은 총 생산된 생성물의 약 30%일 수 있다. 본 출원에서 사용되는 "투과물"은, 세포가 배양 용기에 보유되도록 분리된 수확물을 지칭한다.

"배양" 또는 "세포 배양"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 세포 집단의 생존 및/또는 성장을 가능하게 하기에 적합한 조건하에 배지에서 유지되는 세포 집단을 지칭한다. 본 발명은 포유 동물 세포 배양에만 관한 것이다. 포유 동물 세포는 현탁액 중에서 배양되거나 고체 지지체에 부착될 수 있다. 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 세포 배양은 세포 집단 및 상기 집단이 현탁된 배지를 포함하는 조합을 지칭한다. 세포 배양의 특정 유형은 특별히 제한되지 않으며, 유가식, 회분식, 관류, 연속식, 유한, 현탁, 부착성 또는 단층, 앵커리지-의존성 및 3D 배양을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 세포 배양의 모든 형태 및 기술을 포괄할 수 있다.

본 출원에서 사용되는 "배양"이라는 용어는, 포유 동물 세포가 제어된 조건하에 및 세포의 성장 및/또는 생존을 지원하는 조건하에 성장 또는 유지되는 과정을 지칭한다. 본 출원에서 사용되는 "세포를 유지하는"이라는 용어는 "세포를 배양시키는"과 상호교환적으로 사용된다. 배양은 또한 배양 배지에 세포를 접종하는 단계를 지칭할 수 있다.

본 출원에서 사용되는 "회분식 배양"이라는 용어는, 단시간 동안 고정된 부피의 배양 배지에서 세포를 성장시킨 후 완전히 수확하는 불연속적인 방법이다. 회분식 방법을 사용하여 성장된 배양물은, 최대 세포 밀도에 도달할 때까지, 세포 밀도의 증가 이후, 배지 성분이 소비되고 대사 부산물 (예를 들어, 락테이트 및 암모니아)의 수준이 축적됨에 따라, 생존 세포 밀도의 감소를 경험한다. 수확은 전형적으로는, 최대 세포 밀도 (전형적으로는 5~10×10⁶ 세포/mL, 배지 제형, 세포주 등에 따름)가 달성되는 시점에 또는 이러한 시점후 곧, 전형적으로는 대략 3 내지 7일에 발생한다.

본 출원에서 사용되는 "유가식 배양"이라는 용어는, 소비된 배지 성분을 보충하기 위해 볼루스 또는 연속 배지 공급물을 제공함으로써 회분식 공정을 개선시킨다. 유가식 배양은 배양 공정 전체에 걸쳐 추가의 영양소를 공급받기 때문에, 이것은 회분식 방법과 비교할 때 더 높은 세포 밀도 (> 10 내지 30×10⁶ 세포/mL, 배지 제형, 세포주 등에 따름) 및 증가된 생성물 역가를 달성할 수 있다. 회분식 공정과 달리, 공급 전략 및 배지 제형을 조작하여 목적하는 세포 밀도를 달성하기 위한 세포 증식의 기간 (성장기)을 현탁되거나 느린 세포 성장의 기간 (생산기)과 구별함으로써 2상 배양을 생성하고 유지할 수 있다. 이와 같이, 유가식 배양은 회분식 배양과 비교하여 더 높은 생성물 역가를 달성할 가능성이 있다. 회분식 방법과 마찬가지로, 대사 부산물 축적은 시간 경과에 따라 세포 배양 배지 내에 점진적으로 축적되어 생산기의 지속 시간을 약 1.5 내지 3주로 제한하므로 세포 생존능을 감소시킬 것이다. 유가식 배양은 불연속적이며, 수확은 전형적으로는 대사 부산물 수준 또는 배양 생존능이 예정된 수준에 도달할 때 일어난다.

"폴리펩타이드" 또는 "단백질"이라는 용어는 본 출원에서 "아미노산 잔기 서열"과 상호교환적으로 사용되며, 아미노산의 중합체를 지칭한다. 이들 용어는 또한 당화, 아세틸화, 인산화 또는 단백질 가공을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 반응을 통해 번역후 변형되는 단백질을 포함한다. 변형 및 변화, 예를 들어, 다른 단백질에 대한 융합, 아미노산 서열 치환, 결실 또는 삽입은 폴리펩타이드의 구조에서 이루어질 수 있는 반면, 분자는 이의 생물학적 기능 활성을 유지한다. 예를 들어, 특정 아미노산 서열 치환은 폴리펩타이드 또는 이의 원래의 핵산 암호화 서열에서 이루어질 수 있으며, 동일한 특성을 갖는 단백질이 수득될 수 있다. 상기 용어는 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 유사체 또는 모방체인 아미노산 중합체에 적용된다. "폴리펩타이드"라는 용어는 전형적으로는 10개 초과의 아미노산을 갖는 서열을 지칭하며, "펩타이드"라는 용어는 10개 이하의 아미노산 길이를 갖는 서열을 지칭한다.

본 출원에서 사용되는 "이종 단백질"이라는 용어는 숙주 세포와 상이한 유기체 또는 상이한 종으로부터 유래된 폴리펩타이드를 지칭한다. 이종 단백질은 해당 단백질을 자연적으로 발현하지 않는 숙주 세포에 실험적으로 삽입되는 이종 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된다. 이종 폴리뉴클레오타이드는 또한 전이유전자로서 지칭될 수 있다. 따라서, 이것은 이종 단백질을 암호화하는 유전자 또는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame: ORF)일 수 있다. 단백질과 관련하여 사용될 때의 "이종"이라는 용어는 또한 단백질이 서로 동일한 관계로 또는 동일한 길이로 자연에서 발견되지 않는 아미노산 서열을 포함한다는 것을 나타낼 수 있다. 따라서, 이것은 또한 재조합 단백질을 포괄한다. 이종은 또한 전형적으로 발견되지 않는 위치에서 포유 동물 세포의 게놈에 삽입되는 유전자 또는 전이유전자 또는 이의 일부와 같은 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭할 수 있다. 본 발명에서, 이종 단백질은 치료학적 단백질인 것이 바람직하다.

"배지", "세포 배양 배지" 및 "배양 배지"라는 용어는 본 출원에서 상호교환적으로 사용되며, 세포, 특히, 포유 동물 세포에 영양분을 공급하는 영양소의 용액을 지칭한다. 세포 배양 배지 제형은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 전형적으로, 세포 배양 배지는 최소 성장 및/또는 생존을 위해 세포에 필요한 필수 및 비필수 아미노산, 비타민, 에너지원, 지질 및 미량 원소 뿐만 아니라 완충제 및 염을 제공한다. 배양 배지는, 호르몬 및/또는 기타 성장 인자, 특정 이온 (예를 들면, 나트륨, 클로라이드, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제, 비타민, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드, 미량 원소 (일반적으로 매우 낮은 최종 농도로 존재하는 무기 화합물), 아미노산, 지질 및/또는 글루코오스 또는 기타 에너지원을 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 성장 및/또는 생존을 최소 속도 이상으로 향상시키는 보충 성분을 또한 함유할 수 있다. 특정 실시형태에서, 배지는 유리하게는 세포 생존 및 증식에 최적인 pH 및 염 농도로 제형화된다. 본 발명에 따른 배지는 세포 배양의 시작 후에 첨가되는 관류 배양 배지이다. 특정 실시형태에서, 세포 배양 배지는 출발 영양소 용액 (기본 배지 또는 접종 배지)과 세포 배양의 시작 후에 첨가되는 임의의 배양 배지의 혼합물이다. 일부 세포 배양 시스템, 예를 들어, 관류 세포 배양은 성장기 및 생산기를 비롯하여 상이한 배양 단계를 가질 수 있다. 성장기 및 생산기 동안 사용되는 특정 배지는 상기 특정 단계에서 실시하기 위해 특별히 디자인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 지질 및/또는 지질 대사 산물은 생산기에서만, 또는 성장기에서만, 또는 성장기와 생산기 둘 다에서 첨가되거나 포함될 수 있다.

본 출원에서 사용되는 "무혈청"이라는 용어는 소 태아 혈청과 같은 동물 또는 사람 혈청을 함유하지 않는 세포 배양 배지를 지칭한다. 바람직하게는, 무혈청 배지는 임의의 동물 또는 사람 유래 혈청으로부터 단리된 단백질이 없다. 제한 배양 배지를 비롯한 다양한 조직 배양 배지는 시판 중이며, 예를 들어, 다음 세포 배양 배지 중 임의의 하나 또는 조합이 사용될 수 있다: 특히, RPMI-1640 배지, RPMI-1641 배지, 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: DMEM), 최소 필수 배지 이글 (Minimum Essential Medium Eagle), F-12K 배지, 햄 F12 배지 (Ham's F-12 Medium), 이스코브 변형 둘베코 배지, 맥코이 5A 배지 (McCoy's 5A Medium), 라이보비츠 L-15 배지 (Leibovitz's L-15 Medium), 및 무혈청 배지, 예를 들어, EX-CELL™ 300 시리즈 (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas). 이러한 배양 배지의 무혈청 버전도 또한 이용 가능하다. 세포 배양 배지는 배양시키고자 하는 세포의 필요조건 및/또는 목적하는 세포 배양 파라미터에 따라 아미노산, 염, 당류, 비타민, 호르몬, 성장 인자, 완충제, 항생제, 지질, 미량 원소 등과 같은 추가의 또는 증가된 농도의 성분으로 보충될 수 있다.

본 출원에서 사용되는 "무단백"이라는 용어는 어떠한 단백질도 함유하지 않는 세포 배양 배지를 지칭한다. 따라서, 이것은 포유 동물, 세균, 곤충 또는 효모 세포에서 생산된 재조합 단백질과 같은 혈청 또는 재조합적으로 생산된 단백질로부터 유래되는, 동물 또는 사람으로부터 단리된 단백질이 없다. 무단백 배지는 인슐린 또는 인슐린 유사 성장 인자와 같은 단일 재조합 단백질을 함유할 수 있지만, 이러한 첨가가 명시적으로 언급된 경우에만 가능하다.

본 출원에서 사용되는 "화학적으로 제한된"이라는 용어는, 혈청이 없고 효모, 식물 또는 동물로부터 유래된 단백질 가수분해물과 같은 어떠한 가수분해물도 함유하지 않는 배양 배지를 지칭한다. 바람직하게는, 화학적 제한 배지는 또한 단백질이 없거나, 인슐린 또는 인슐린 유사 성장 인자와 같은 선택된 재조합적으로 생산된 (동물 유래가 아님) 단백질만을 함유한다. 화학적 제한 배지는 특성화되고 정제된 물질의 혼합물로 이루어진다. 화학적 제한 배지의 예는, 예를 들어, Invitrogen (Carlsbad, CA, US)의 CD-CHO 배지이다.

본 출원에서 사용되는 "부유성 세포" 또는 "비부착성 세포"라는 용어는, 액체 배지 중에서 현탁액으로 배양되는 세포에 관한 것이다. CHO 세포와 같은 접착성 세포는 현탁액 중에서 성장하도록 적합화될 수 있으며, 이에 따라 용기 또는 조직 배양 접시의 표면에 부착하는 이의 능력을 상실할 수 있다.

본 출원에서 사용되는 "생물 반응기"라는 용어는 세포 배양물의 성장에 유용한 임의의 용기를 의미한다. 생물 반응기는 세포의 배양에 유용한 한 임의의 크기일 수 있으며; 전형적으로, 생물 반응기는 이의 내부에서 성장하는 세포 배양물의 부피에 적절한 크기를 갖는다. 전형적으로, 생물 반응기는 적어도 1 리터일 것이며, 2, 5, 10, 50, 100, 200, 250, 500, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 5,000, 8,000, 10,000, 12,000 리터 또는 그 이상, 또는 이들 사이의 임의의 부피일 수 있다. pH 및 온도를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 생물 반응기의 내부 조건은 배양 기간 동안 제어될 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자는 관련 고려사항에 기초하여 본 발명을 실시하는데 사용하기에 적합한 생물 반응기를 인식하고 선택할 수 있을 것이다. 본 발명의 방법에서 사용된 세포 배양물은 관류 배양에 적합한 임의의 생물 반응기에서 성장할 수 있다. 생물 반응기의 특정 유형은 특별히 제한되지 않으며, 유가식, 회분식, 관류, 연속식, 유한, 현탁, 부착성 또는 단층, 앵커리지-의존성 및 3D 배양을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 생물 반응기의 모든 유형을 포괄할 수 있다.

본 출원에서 사용되는 "세포 밀도"는 주어진 부피의 배양 배지 중 세포의 수를 지칭한다. "생존 세포 밀도"는, 표준 생존능 검정 (예를 들어, 트리판 블루 염료 배제 방법)에 의한 결정시, 주어진 부피의 배양 배지 중 생세포의 수를 지칭한다.

본 출원에서 사용되는 "세포 생존능"이라는 용어는 주어진 세트의 배양 조건 또는 실험적 변동하에 생존하는 배양물에서 세포의 능력을 의미한다. 본 출원에서 사용되는 용어는 또한 특정 시간에 배양에서 생존하고 사망한 세포의 총 수에 관하여 해당 시간에 생존하는 세포의 부분을 지칭한다.

본 출원에서 사용되는 "역가"라는 용어는 배지 부피의 주어진 양에서 세포 배양물에 의해 생산된 관심 대상 폴리펩타이드 또는 단백질 (관심 대상의 자연 발생 또는 재조합 단백질일 수 있음)의 총량을 의미한다. 역가는 배지의 밀리리터 (또는 부피의 다른 단위) 당 폴리펩타이드 또는 단백질의 밀리그램 또는 마이크로그램의 단위로 표현될 수 있다.

본 출원에서 사용되는 "수율"이라는 용어는 특정 기간에 걸쳐 관류 배양에서 생산된 이종 단백질의 양을 지칭한다. "총 수율"은 전체 실행에 걸쳐 관류 배양에서 생산된 이종 단백질의 양을 지칭한다.

본 출원에서 사용되는 "감소", "감소된" 또는 "감소하다"라는 용어는, 일반적으로 기준 수준과 비교하여 적어도 10% 만큼의 감소, 예를 들어, 본 발명의 관류 배지에서 사용된 농도의 상기 지질 및 지질 대사 산물이 없는 동일한 무혈청 관류 배지를 사용하여 동일한 조건하에 배양되는 대조군 포유 동물 세포 배양물과 비교하여 적어도 약 20% 또는 적어도 약 30% 또는 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50% 또는 적어도 약 60% 또는 적어도 약 70% 또는 적어도 약 75% 또는 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90% 또는 100% 이하 만큼의 감소, 또는 10~100%의 임의의 정수 감소를 의미한다.

본 출원에서 사용되는 "증진", "증진된", "증진되다", "증가" 또는 "증가된"이라는 용어는, 일반적으로 대조군 세포와 비교하여 적어도 10% 만큼의 증가, 예를 들어, 본 발명의 관류 배지에서 사용된 농도의 상기 지질 및 지질 대사 산물이 없는 동일한 무혈청 관류 배지를 사용하여 동일한 조건하에 배양되는 포유 동물 세포 배양물과 비교하여 적어도 약 20% 또는 적어도 약 30% 또는 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50% 또는 적어도 약 75% 또는 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90% 또는 적어도 약 100% 또는 적어도 약 200% 또는 적어도 약 300% 만큼의 증가, 또는 10~300%의 임의의 정수 증가를 의미한다.

본 출원에서 사용되는 "대조군 세포 배양물" 또는 "대조군 포유 동물 세포 배양물"은, 관류 배지가 본 발명의 관류 배지의 Fe 이온 및 레티노이드 농도를 갖지 않는다는 것을 제외하고, 비교하고자 하는 세포 배양물과 동일한 세포이다.

본 출원에서 사용되는 "포유 동물 세포"라는 용어는 이종 단백질, 바람직하게는 치료학적 단백질, 보다 바람직하게는 분비된 재조합 치료학적 단백질의 생산에 적합한 세포주이다. 본 발명에 따른 바람직한 포유 동물 세포는 햄스터 세포와 같은 설치류 세포이다. 포유 동물 세포는 단리된 세포 또는 세포주이다. 포유 동물 세포는 바람직하게는 형질 전환 및/또는 불멸화 세포주이다. 이들은 세포 배양에서 일련의 계대에 적합하며, 장기 구조의 일부인 일차 비-형질 전환 세포 또는 세포들을 포함하지 않는다. 바람직한 포유 동물 세포는 BHK21, BHK TK^-, CHO, CHO-K1, CHO-S 세포, CHO-DXB11 (CHO-DUKX 또는 DuxB11로도 또한 지칭됨) 및 CHO-DG44 세포, 또는 임의의 이러한 세포주의 유도체/자손이다. CHO-DG44, CHO-K1 및 BHK21이 특히 바람직하며, CHO-DG44 및 CHO-K1 세포가 보다 더 바람직하다. CHO-DG44 세포가 가장 바람직하다. 포유 동물 세포, 특히, CHO-DG44 및 CHO-K1 세포의 글루타민 신타아제 (glutamine synthetase: GS)-결핍 유도체도 또한 포함된다. 포유 동물 세포는 이종 단백질, 바람직하게는 재조합 분비된 치료학적 단백질을 암호화하는 하나 이상의 발현 카세트(들)를 추가로 포함할 수 있다. 포유 동물 세포는 또한 쥐과 동물 골수종 세포, 예를 들어, NS0 및 Sp2/0 세포와 같은 쥐과 동물 세포, 또는 이러한 세포주 중 임의의 세포주의 유도체/자손일 수 있다. 그러나, 이들 세포의 유도체/자손, 사람, 마우스, 래트, 원숭이 및 설치류 세포주를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다른 포유 동물 세포도 또한 본 발명에서, 특히, 생물 약제학적 단백질의 생산을 위해 사용될 수 있다.

본 출원에서 사용되는 "성장기"라는 용어는, 세포가 기하급수적으로 증식하고 생물 반응기 중의 생존 세포 밀도가 증가하는 세포 배양의 단계를 지칭한다. 배양 중의 세포는 일반적으로 표준 성장 패턴에 따라 증식한다. 배양물이 씨딩된 후의 제1 성장기는, 세포가 배양 환경에 적응하고 빠른 성장을 준비할 때 느린 성장의 기간인 유도기이다. 유도기 이후에는 세포가 기하급수적으로 증식하고 성장 배지의 영양소를 소비하는 기간인 성장기 (대수증식기 또는 대수기로도 또한 지칭됨)가 이어진다. 본 출원의 특정 실시형태에서, 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체 중 하나 이상의 첨가제는 성장기의 시작시에 또는 성장기 동안 어느 때에 첨가될 수 있다. 다른 실시형태에서, 초기 성장 배지는 성장기의 시작시에, 즉, 세포 배양의 시작시에 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체 중 하나 이상의 첨가제를 포함할 수 있다.

"생산기"라는 용어는 목표 세포 밀도에 도달하고/하거나 수확이 시작되는 세포 배양의 단계를 지칭한다. 전형적인 목표 세포 밀도는 10×10⁶ 세포/ml 내지 약 120×10⁶ 세포/ml의 범위이지만, 훨씬 더 높을 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 목표 세포 밀도는 적어도 10×10⁶ 세포/ml, 적어도 20×10⁶ 세포/ml, 적어도 30×10⁶ 세포/ml, 적어도 40×10⁶ 세포/ml 또는 적어도 50×10⁶ 세포/ml이다. 가장 바람직하게는, 목표 세포 밀도는 약 30 내지 약 50×10⁶ 세포/ml이다. 생존 세포 밀도는 관류 속도에 의존하며, 규칙적이거나 연속적인 세포 배출을 사용하여 일정한 수준으로 유지될 수 있다. 본 출원의 특정 실시형태에서, 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체 중 하나 이상의 첨가제는 생산기의 시작시에 또는 생산기 동안 어느 때에 첨가될 수 있다.

본 출원에서 사용되는 "성장 정지"라는 용어는, 즉, 세포 분열로부터 수의 증가가 정지된 세포를 지칭한다. 세포 주기는 간기 및 분열기를 포함한다. 간기는 3가지 단계로 이루어진다: DNA 복제는 S기에 국한되며; G₁은 M기와 S기 사이의 간격인 반면, G₂는 S기와 M기 사이의 간격이다. M기에서, 핵 및 이어서 세포질이 분열한다. 증식하는 유사분열 신호의 부재하에 또는 성장 정지를 유도하는 화합물의 존재하에, 세포 주기는 정지한다. 세포는 이의 세포 주기 제어 시스템을 부분적으로 해체시키고 상기 주기로부터 G₀으로 호칭되는 특수한 비분열 상태로 빠져 나갈 수 있다.

본 출원에서 사용되는 "볼루스 첨가"라는 용어는 세포 배양물 중의 농도를 목적하는 농도로 즉시 조정하는 첨가를 지칭한다. 본 발명에 따르면, 이것은 세포 배양물 중 레티노이드 농도가 본 발명의 레티노이드 농도로 순간적으로 조정되는 것을 의미한다. 이것은 세포가 원치않는 증식 활성을 초래할 수 있는 보다 낮은 레티노이드 농도에서 배양되는 이행기를 회피하기 위한 것이다.

다양한 양태에서, 본 발명은 본 개시 내용의 방법 및 세포 배양 배지와 관련하여 "리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체 중 하나 이상"을 지칭할 수 있다. "하나 이상"이라는 문구는 본 출원에서 개시된 방법 및 배지와 관련하여 사용되는 다음 중 임의의 것을 고려한다: 리놀레산 또는 이의 유도체 및/또는 전구체 단독; 아라키돈산 또는 이의 유도체 및/또는 전구체 단독; 프로스타글란딘 E2 또는 이의 유도체 및/또는 전구체 단독; 리놀레산 및 아라키돈산 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체의 이중 조합물; 리놀레산 및 프로스타글란딘 E2 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체의 이중 조합물; 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체의 이중 조합물; 및 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체의 삼중 조합물. 조합물에서 사용될 때 첨가제의 상대적인 양, 농도 및/또는 비율은 본 출원의 다른 곳에서 기재되어 있다.

리놀레산, 아라키돈산 또는 프로스타글란딘 E2와 같은 화합물의 "유도체 및/또는 전구체"에 대한 언급은 "유도체" 및 "전구체"를 지칭한다. 유도체는, 출발 화합물로부터 화학 반응에 의해 유도되고 구조적 및/또는 기능적 유사체인 화합물, 즉, 출발 화합물과 동일하거나 거의 동일한 구조 및 기능을 갖는 화합물이다. 본 발명의 경우, 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2의 유도체는, 출발 화합물의 구조 또는 원자 조성을 변화시키거나 변형시키는 화학 반응 (예를 들어, 작용기의 가감)을 통해 이들 3가지 화합물 중 임의의 화합물로부터 유도되고 구조적으로 유사하고 (즉, 구조적 유사체) 동일하거나 유사한 기능 (즉, 기능성 유사체)을 갖는 화합물이다. 전구체는 대사 경로에서 또 다른 화합물에 (직접 또는 간접적으로) 선행하는 화합물이다. 본 발명에서, 리놀레산은 동일한 대사 경로에서 프로스타글란딘 E2 ("PGE₂")에 대한 전구체인 아라키돈산의 전구체이다 - 도 2 참조. 도 2를 참조하면, 프로스타글란딘 E2에 대한 추가의 전구체는, 세포에서 COX-1 및 COX-2 효소에 의해 전환되어 PGE₂를 형성하는, PGG₂ (프로스타글란딘 G₂) 및 PGH₂ (프로스타글란딘 H₂)를 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한 리놀레산, 아라키돈산 및/또는 프로스타글란딘 H₂ 각각의 대사 전구체도 또한 본 출원의 방법 및 배지에서 사용될 수 있다는 것을 고려한다. 본 출원에서 사용되는 "약"이라는 용어는 제공된 실제 값 주위의 변동을 지칭하며, 해당 값의 +/- 10%를 포함한다.

세포 배양 방법

어떠한 제한도 없이 이해를 목적으로, 단백질 생산을 위한 세포 배양 및 배양 실행이 적어도 3가지의 일반적인 유형, 즉, 관류 배양, 회분식 배양 및 유가식 배양을 포함할 수 있다는 것은 통상의 기술자라면 인식할 것이다. 다른 생물 반응기 시스템이 분명히 고려되며, 즉, 본 발명은 관류, 회분식 및 유가식 세포 배양 시스템에 한정되는 것은 분명히 아니다. 관류 배양에서, 예를 들어, 오래된 배양 배지가 매일 제거되며, 생성물이, 예를 들어, 매일 또는 연속적으로 수확되면서, 새로운 배양 배지 보충제가 배양 기간 동안 세포에 제공된다. 관류 배양에서, 관류 배지는 매일 첨가될 수 있으며, 연속적으로, 즉, 적하 또는 주입으로서 첨가될 수 있다. 관류 배양의 경우, 세포가 생존 상태로 유지되고 환경 및 배양 조건이 유지되는 한, 세포는 목적하는 만큼 배양 상태로 유지될 수 있다. 세포가 연속적으로 성장하기 때문에, 일정한 생존 세포 밀도를 유지하기 위해 실행 동안 세포를 제거하는 것이 전형적으로 필요하며, 이는 세포 배출로서 지칭된다. 세포 배출은, 전형적으로 폐기되어 낭비되는 생성물을 세포와 함께 제거된 배양 배지 중에 함유한다. 따라서, 세포 배출이 없거나 최소의 세포 배출만으로 생산기 동안 생존 세포 밀도를 유지하는 것이 유리하며 실행 당 총 수율을 증가시킨다.

회분식 배양에서, 세포는 초기에 배지에서 배양되고, 당해 배지는 제거, 교체 또는 보충되지 않으며, 즉, 세포는 배양 실행의 동안 또는 종료 전에 새로운 배지가 "공급되지" 않는다. 목적하는 생성물은 배양 실행의 종료시에 수확된다.

유가식 배양의 경우, 배양 실행 시간은, 실행 동안 배양 배지를 새로운 배지로 매일 1회 이상 (또는 연속적으로) 보충함으로써, 즉, 배양 기간 동안 세포에 새로운 배지 ("공급 배지")를 "공급함"으로써, 증가한다. 유가식 배양은 상기에서 기재된 바와 같은 다양한 공급 계획 및 시간, 예를 들어, 매일, 격일로, 2일마다 등, 하루에 1회 이상 또는 하루에 1회 미만 등을 포함할 수 있다. 또한, 유가식 배양은 공급 배지가 연속적으로 공급될 수 있다. 이어서, 목적하는 생성물은 배양/생산 실행의 종료시에 수확된다.

본 발명의 특정 실시형태에 따르면, 포유 동물 세포는 관류 배양으로 배양될 수 있다. 이종 단백질 생산 동안, 세포가 목적하는 생존 세포 밀도로 성장하고, 이어서, 세포가 에너지 및 기질을 사용하여 세포 성장 및 세포 분열보다는 오히려 관심 대상 이종 단백질을 생산하는 성장 정지된 높은 생산성 상태로 세포가 전환되는 제어 시스템을 갖는 것이 바람직하다. 온도 이동 및 아미노산 결핍과 같은 이러한 목표를 달성하는 방법은 항상 성공적인 것은 아니며, 생성물 품질에 바람직하지 않은 영향을 미칠 수 있다. 본 출원에서 기재된 바와 같이, 생산기 동안의 생존 세포 밀도는 규칙적인 세포 배출을 수행함으로써 바람직한 수준으로 유지될 수 있다. 그러나, 이것은 관심 대상 이종 단백질의 폐기를 초래한다. 생산기 동안의 세포 성장 정지는 세포 배출에 대한 필요성을 감소시키며, 심지어 세포를 보다 생산적인 상태로 유지할 수 있다.

본 개시 내용의 하나의 양태에서, 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유효량의 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물을 포함하는 배양 배지에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키는 단계를 포함하는, 세포 배양에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키는 방법이 제공되며, 여기서, 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 조합물은 세포 배출에 대한 필요성 없이 성장 억제 및 생산성 증가를 초래한다.

본 개시 내용의 또 다른 양태에서, 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유효량의 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물을 포함하는 관류 배양 배지에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키는 단계를 포함하는, 관류 세포 배양에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키는 방법이 제공된다.

본 개시 내용의 추가의 또 다른 양태에서, 유효량의 리놀레산을 포함하는 관류 배양 배지에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키는 단계를 포함하는, 관류 세포 배양에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키는 방법이 제공된다.

본 개시 내용의 추가의 또 다른 양태에서, 유효량의 아라키돈산을 포함하는 관류 배양 배지에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키는 단계를 포함하는, 관류 세포 배양에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키는 방법이 제공된다.

본 개시 내용의 또 다른 양태에서, 유효량의 프로스타글란딘 E2를 포함하는 관류 배양 배지에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키는 단계를 포함하는, 관류 세포 배양에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키는 방법이 제공된다.

본 개시 내용의 또 다른 양태에 따르면, (a) 목적하는 세포 밀도에 도달할 때까지 관류 성장 배지에서 관심 대상 단백질을 암호화하는 재조합 포유 동물 세포를 배양시키는 단계, 및 (b) 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유효량의 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물을 상기 성장 배지에 도입하는 단계를 포함하는, 관류 세포 배양의 비생산성을 증진시키는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 첨가된 상기 지질 및/또는 지질 대사 산물은 정상 상태에 도달하도록 세포 성장을 억제하여 관류 세포 배양의 증진된 비생산성을 달성한다.

본 개시 내용의 추가의 또 다른 양태에 따르면, 포유 동물 세포를 배양시키고 개선된 생산성으로 치료학적 단백질을 생산하기 위한 세포 배양 배지가 제공된다. 상기 세포 배양 배지는 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유효량의 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 첨가된 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 조합물은 성장 억제 및 세포 비생산성 증가를 초래한다. 일부 실시형태에서, 상기 성장 억제는 특히 관류 세포 배양과 관련하여 세포 배출에 대한 필요성을 감소시키거나 제거할 수 있다. 상기 세포 배양 배지는 회분식 배양, 유가식 배양 및 연속식 관류 배양을 비롯한 연속식 배양을 포함하는 임의의 세포 배양 플랫폼에서 사용될 수 있다.

상기 양태의 다양한 실시형태에서, 상기 "세포 배양"은 특별히 제한되지 않으며, 유가식, 회분식, 관류, 연속식, 유한, 현탁, 부착성 또는 단층, 앵커리지-의존성 및 3D 배양을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 세포 배양의 모든 형태 및 기술을 포괄할 수 있다. 세포 배양의 임의의 구성이 본 출원에서 고려된다. 바람직한 실시형태에서, 상기 세포 배양은 연속식 관류 세포 배양이다.

다양한 실시형태에서, 리놀레산의 유효량은 약 1800~2000 μM이다. 다른 실시형태에서, 리놀레산의 유효량은 약 1~5000 μM, 또는 약 1~2500 μM, 또는 약 1~1250 μM, 또는 약 1~1000 μM, 또는 약 1~800 μM, 또는 약 1~600 μM, 또는 약 1~400 μM, 또는 약 1~200 μM, 또는 약 1~100 μM, 또는 약 1~50 μM, 또는 약 1~25 μM이다. 하나의 실시형태에서, 리놀레산은 500~2000 μM의 농도로 존재한다.

다른 실시형태에서, 아라키돈산의 유효량은 약 150~500 μM이다. 또 다른 실시형태에서, 아라키돈산의 유효량은 약 1~5000 μM, 또는 약 1~2500 μM, 또는 약 1~1250 μM, 또는 약 1~1000 μM, 또는 약 1~800 μM, 또는 약 1~600 μM, 또는 약 1~400 μM, 또는 약 1~200 μM, 또는 약 1~100 μM, 또는 약 1~50 μM, 또는 약 1~25 μM이다. 하나의 실시형태에서, 아라키돈산은 100~600 μM의 농도로 존재한다.

다른 실시형태에서, 프로스타글란딘 E2의 유효량은 약 0.001 μM 내지 60 μM이다. 또 다른 실시형태에서, 프로스타글란딘 E2의 유효량은 0.000001 μM 이상, 0.00001 μM 이상, 0.0001 μM 이상, 0.001 μM 이상, 0.01 μM 이상, 0.1 μM 이상, 1 μM 이상, 10 μM 이상, 20 μM 이상, 30 μM 이상, 40 μM 이상, 50 μM 이상, 60 μM 이상, 70 μM 이상, 80 μM 이상, 90 μM 이상, 100 μM 이상, 150 μM 이상, 또는 200 μM 이상이며, 여기서, 각 범위의 상한은 1000 μM 이하일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 프로스타글란딘 E2의 유효량은 약 1~5000 μM, 또는 약 1~2500 μM, 또는 약 1~1250 μM, 또는 약 1~1000 μM, 또는 약 1~800 μM, 또는 약 1~600 μM, 또는 약 1~400 μM, 또는 약 1~200 μM, 또는 약 1~100 μM, 또는 약 1~50 μM, 또는 약 1~25 μM, 또는 약 0.0001~0.001 μM, 또는 약 0.0005~0.01 μM, 또는 약 0.005~0.1 μM, 또는 약 0.05~1.0 μM, 또는 약 0.5~100 μM, 또는 약 50~1000 μM 또는 그 이상이다. 하나의 실시형태에서, 프로스타글란딘 E2는 0.0001~100 μM의 농도로 존재한다.

일부 실시형태에서, 상기 배양 배지는 2개의 상기 지질 또는 지질 대사 산물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 배양 배지는 100~300 μM 농도의 아라키돈산 및 500~1800 μM 농도의 리놀레산을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 배양 배지는 500~1800 μM 농도의 리놀레산 또는 100~150 μM 농도의 아라키돈산과 조합하여 0.0001~0.0009 μM 농도의 프로스타글란딘 E2를 포함한다.

추가의 또 다른 실시형태에서, 상기 배양 배지는 3개의 모든 상기 지질 또는 지질 대사 산물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 배양 배지는 500~2000 μM 농도의 리놀레산, 100~300 μM 농도의 아라키돈산, 및 0.0001~0.0009 μM 농도의 프로스타글란딘 E2를 포함한다.

본 개시 내용의 또 다른 양태에서, 500~2000 μM 농도의 리놀레산, 100~300 μM 농도의 아라키돈산 및 0.0001~0.0009 μM 농도의 프로스타글란딘 E2 중 하나 이상을 유효량으로 포함하는 배양 배지에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키는 단계를 포함하는, 세포 배양에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키는 방법이 제공되며, 여기서, 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 조합물은 세포 배출에 대한 필요성 없이 성장 억제 및 생산성 증가를 초래한다.

다른 실시형태에서, 본 발명은 몰비 또는 중량비의 관점으로 표현된 하기 양의 리놀레산, 아라키돈산 및/또는 프로스타글란딘 E2를 포함한다. 이들 비는 세포 배양 배지에서 리놀레산, 아라키돈산 또는 프로스타글란딘 E2 중 적어도 2개 또는 3개의 모든 첨가제를 조합하기 위해 사용될 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자는 첨가되는 총 중량의 비로서 또는 이들의 몰비를 기준으로 하여 결정된 하기 비율로 2 또는 3개의 첨가제의 조합으로 이들 성분을 첨가할 수 있다. 상기 구성 성분들은 동시에 또는 상이한 시간에 첨가될 수 있다. 리놀레산 대 아라키돈산 대 프로스타글란딘 E2의 다음 비율 (리놀레산 : 아라키돈산 : 프로스타글란딘 E2)이 사용될 수 있다: (1) 1:1:1; (2) 5~1:1:1; (3) 10~1:1:1; (4) 100~1:1:1; (5) 1000~1:1:1; (6) 1:5~1:1; (7) 1:10~1:1; (8) 1:100~1:1; (9) 1:1000~1:1; (10) 1:1:0.1~0.01; (11) 1:1:0.1~0.001; (12) 1:1:0.1~0.0001; (13) 1:1:0.1~0.00001; (14) 1:1:0.1~0.0000001; (15) 1~1000:1~1000:1~0.1; (16) 1~1000:1~1000:0.1~0.01; (17) 1~1000:1~1000:0.1~0.001; (18) 1~1000:1~1000:0.1~0.0001; (19) 1~1000:1~1000:0.1~0.00001; (20) 1~1000:1~1000:0.1~0.0000001; (16) 0.1~1000:1~1000:1~0.1; (17) 0.01~1000:1~1000:0.1~0.01; (18) 0.001~1000:1~1000:0.1~0.001; (19) 1~1000:0.1~1000:0.1~0.0001; (20) 1~1000:0.01~1000:0.1~0.00001; (21) 1~1000:0.001~1000:0.1~0.0000001; (22) 1:1:0.1~0.0000001; (23) 5~1:1:0.1~0.0000001; (24) 10~1:1:0.1~0.0000001; (25) 100~1:1:0.1~0.0000001; (26) 1000~1:1:0.1~0.0000001; (27) 1:5~1:0.1~0.0000001; (28) 1:10~1:0.1~0.0000001; (29) 1:100~1:0.1~0.0000001; (30) 1:1000~1:0.1~0.0000001. 특정 실시형태에서, 본 발명은 5:1:0.000001 내지 2:0.6:0.1의 비율 범위에 속하는 특정 비율을 이용할 수 있으며, 이것은 500~2000 μM의 리놀레산 농도, 100~600 μM의 아라키돈산 농도 및 0.0001~100 μM의 프로스타글란딘 E2 농도를 사용하는 것에 상응하는 비율이다. 다른 비율이 고려되며, 상기 비율의 목록은 본 발명을 어떠한 방식으로든 제한하도록 의도되지 않는다.

다른 실시형태에서, 본 개시 내용은, (a) 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 무혈청 배양 배지에서 배양시키는 단계; (b) 상기 포유 동물 세포를 무혈청 관류 배지에 의한 관류에 의해 성장기 동안 배양시키는 단계; 및 (c) 500~2000 μM 농도의 리놀레산, 100~300 μM 농도의 아라키돈산 및 0.0001~0.0009 μM 농도의 프로스타글란딘 E2 중 하나 이상을 포함하는 무혈청 관류 배지에 의한 관류에 의해 생산기 동안 상기 포유 동물 세포를 유지하는 단계를 포함하는, 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 관류 세포 배양으로 배양시키는 방법을 제공하며, 여기서, 단계 (b)는 임의적이다. 단계 (c) 이전의 방법의 하나의 실시형태에서, 상기 지질 또는 지질 대사 산물은 볼루스로 첨가된다.

(a) 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 무혈청 배양 배지에서 배양시키는 단계; (b) 상기 포유 동물 세포를 무혈청 관류 배지에 의한 관류에 의해 성장기 동안 배양시키는 단계; 및 (c) 500~2000 μM 농도의 리놀레산, 100~300 μM 농도의 아라키돈산 및 0.0001~0.0009 μM 농도의 프로스타글란딘 E2 중 하나 이상을 포함하는 무혈청 관류 배지에 의한 관류에 의해 생산기 동안 상기 포유 동물 세포를 유지하는 단계를 포함하는, 관류 세포 배양에서 세포 배출을 감소시키고/시키거나 이종 단백질을 발현하는 관류 세포 배양에서 단백질 생산을 증가시키는 방법이 또한 본 출원에서 제공되며, 여기서, 단계 (b)는 임의적이다. 단계 (c) 이전의 방법의 하나의 실시형태에서, 상기 지질 또는 지질 대사 산물은 볼루스로 첨가된다.

또한, 본 발명은 관류 배양물이 매우 높은 세포 밀도로 접종되고, 관류가 무혈청 배양 배지에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포의 접종후 즉시 또는 곧 시작된다는 것을 포함한다. 또한, 상기 포유 동물 세포를 무혈청 관류 배지에 의한 관류에 의해 성장기 동안 배양시키는 단계 (b)는 임의적일 수 있어서, 상기 포유 동물 세포는 500~2000 μM 농도의 리놀레산, 100~300 μM 농도의 아라키돈산 및 0.0001~0.0009 μM 농도의 프로스타글란딘 E2 중 하나 이상을 포함하는 무혈청 관류 배지에 의한 관류에 의해 생산기 동안 단계 (c)에 따라 즉시 배양된다. 바람직하게는, 단계 (c) 이전에, 상기 포유 동물 세포 배양 중 상기 지질의 농도는 바람직하게는 볼루스 첨가에 의해 목적하는 농도로 조정된다.

따라서, 하기 단계들을 포함하는, 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키고/시키거나 관류 세포 배양에서 세포 배출을 감소시키고/시키거나 이종 단백질을 발현하는 관류 세포 배양에서 단백질 생산을 증가시키는 방법이 또한 본 출원에서 제공된다: (a) 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 무혈청 배양 배지에서 배양시키는 단계; (b) 상기 포유 동물 세포를 무혈청 관류 배지에 의한 관류에 의해 성장기 동안 배양시키는 단계; 및 (c) 500~2000 μM 농도의 리놀레산, 100~300 μM 농도의 아라키돈산 및 0.0001~0.0009 μM 농도의 프로스타글란딘 E2 중 하나 이상을 포함하는 무혈청 관류 배지에 의한 관류에 의해 생산기 동안 상기 포유 동물 세포를 유지하는 단계. 바람직하게는, 단계 (c) 이전에, 상기 포유 동물 세포 배양 중 상기 지질의 농도는 바람직하게는 볼루스 첨가에 의해 목적하는 농도로 조정된다. 단백질 생산의 증가는 관류 실행에 걸쳐 또는 특정 기간에 걸쳐 증가된 단백질 생성물 수율을 포괄한다. 이것은 또한 세포 당 증가된 특정 단백질 생산을 포괄한다.

본 발명의 방법에 따르면, 단계 (a)에서 포유 동물 세포를 배양시키는 것은 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 무혈청 배지에서 접종하는 것으로 제한될 수 있으며, 이에 따라, 관류의 시작 전에 실제 배양 단계를 포함할 필요는 없다. 또한, 본 발명의 방법에 따르면, 관류에 의해 생산기 동안 포유 동물 세포를 유지하는 것은 일정한 생존 세포 밀도에서 관류에 의해 생산기 동안 포유 동물 세포를 배양시키는 것을 포함한다.

상기 생산기는 목표 세포 밀도에 도달하면 시작한다. 바람직하게는, 단계 (c)는 목표 세포 밀도에 도달하면 시작한다. 이것은 10×10⁶ 세포/ml 내지 약 120×10⁶ 세포/ml 또는 훨씬 초과의 세포 밀도에서 시작할 수 있다. 바람직하게는, 단계 (c)는 적어도 10×10⁶ 세포/ml, 적어도 20×10⁶ 세포/ml, 적어도 30×10⁶ 세포/ml, 적어도 40×10⁶ 세포/ml 또는 적어도 50×10⁶ 세포/ml의 세포 밀도에서 개시된다. 가장 바람직하게는, 단계 (c)는 약 30 내지 약 50×10⁶ 세포/ml의 세포 밀도에서 개시된다.

상기에서 이미 설명한 바와 같이, 본 발명의 방법은, 단계 (c)에서 세포 밀도가 세포 배출에 의해 유지되는 것을 추가로 포함한다. 이러한 맥락에서 언급된 세포 밀도는 당해 분야에 공지된 임의의 방법으로 측정될 수 있는 생존 세포 밀도이다. 예를 들어, 세포 배출 속도를 제어하는 계산은, 목표 VCD에 상응하는 INCYTE™ 생존 세포 밀도 프로브 (HAMILTON^® COMPANY) 또는 FUTURA™ 바이오매스 캐패시턴스 프로브 값 (ABER^® instruments)을 유지하는 것에 기초할 수 있거나, 일일 세포 및 생존력 계수는 혈구계, VI-CELL XR™ (BECKMAN COULTER^®), CEDEX HI-RES™ (ROCHE^®) 또는 VIACOUNT™ 검정 (EMD MILLIPORE^® GUAVA EASYCYTE^®)과 같은 임의의 세포 계수 장치를 통해 오프-라인으로 수행될 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여, 세포 배출은 대조군 관류 세포 배양과 비교하여 감소되며, 여기서, 대조군 관류 세포 배양은 본 발명에 따른 첨가된 지질을 함유하지 않는 동일한 무혈청 관류 배지를 사용하여 동일한 조건하에 배양되는 관류 세포 배양이다. 보다 특히, 상기 세포 배출은 대조군 관류 세포 배양과 비교하여 감소되며, 여기서, 대조군 관류 세포 배양은 목적하는 농도의 첨가된 지질을 함유하는 동일한 무혈청 관류 배지를 사용하여 동일한 조건하에 배양되는 관류 세포 배양이다.

동일한 이유로 그리고 성장기 동안 성장을 가능하게 하기 위해, 특정 실시형태에서는 본 발명의 무혈청 관류 배지의 지질 농도가 접종 배지에서 및 성장기 동안 회피되어야 한다. 따라서, 단계 (a)의 무혈청 배양 배지 및 단계 (b)의 무혈청 관류 배지는 지질 (즉, 리놀레산, 아라키돈산 또는 프로스타글란딘 E2)을 포함하지 않아야 한다. 바람직하게는, 단계 (a)의 무혈청 배양 배지 및 단계 (b)의 무혈청 관류 배지는 지질 (즉, 리놀레산, 아라키돈산 또는 프로스타글란딘 E2)을 포함하지 않는다.

본 발명의 무혈청 관류 배지의 삼투압은 300 내지 1400 mOsmol/kg, 바람직하게는 300 내지 500 mOsmol/kg, 보다 바람직하게는 330 내지 450 mOsmol/kg, 보다 더 바람직하게는 360 내지 390 mOsmol/kg의 범위이어야 한다. 여기서, 상기 삼투압은 mOsmol/kg 물로서 제공된다.

관류 배양은 전형적으로 회분식 배양으로서 접종 배양으로 시작된다. 관류는 즉시 또는 1일 이상 후에 시작될 수 있다. 전형적으로, 관류는 세포 배양 2일째에 또는 그 후에 시작된다. 하나의 실시형태에서, 단계 (b)의 관류는 세포 배양 2일째에 또는 그 후에 시작된다. 표적 세포 밀도에 도달하면, 성장 정지가 세포 배양 배지에서 리놀레산, 아라키돈산 또는 프로스타글란딘 E2 중 하나 이상의 농도를 목적하는 농도로 증가시킴으로써 유도된다. 바람직하게는, 목적하는 농도로의 지질/지질 대사 산물 농도의 이러한 증가는, 예를 들어, 볼루스 첨가에 의해 순간적으로 일어난다. 세포 배양 중 리놀레산, 아라키돈산 및/또는 프로스타글란딘 E2의 농도의 이러한 조정은, 목적하는 특정 농도의 세포에 도달하면, 즉, 성장기의 종료에 도달하면, 하나의 실시형태에서 일어날 수 있다. 다음 단계, 즉, 생산기 동안, 상기 포유 동물 세포는 목적하는 농도의 외인성으로 첨가되는 리놀레산, 아라키돈산 또는 프로스타글란딘 E2 중 하나 이상을 포함하는 무혈청 관류 배지에 의한 관류에 의해 배양될 수 있다. 상기 지질/지질 대사 산물은 시작부터 상기 배양에 첨가될 수 있으므로, 성장 정지가 상기에서 기재된 바와 같이 볼루스 첨가에 의해 유도되기 전에, 따라서, 목표 세포 밀도에 도달하기 전에, 접종에 사용되는 무혈청 배양 배지에 또는 무혈청 관류 배지에 첨가될 수 있다. 늦어도, 표적 세포 밀도에 도달하면, 상기 지질/지질 대사 산물을 무혈청 관류 배지에 첨가해야 한다. 또 다른 실시형태에서, 포유 동물 세포 배양에서 목적하는 지질/지질 대사 산물 농도는, 목표 세포 밀도에 도달하기 전에 그리고 세포 정지가 포유 동물 세포 배양에서 지질/지질 대사 산물의 증가에 의해 유도되기 전에 도달된다.

전형적으로, 본 발명에 따른 포유 동물 세포 배양은 세포 배양의 연속적인 관류를 포함한다. 관류 속도는 관류가 시작된 후에 증가할 수 있다. 일반적으로, 더 높은 관류 속도는 더 높은 생존 세포 밀도를 뒷받침하므로, 더 높은 목표 세포 밀도를 가능하게 한다. 관류 속도는 0.5 용기 부피/일에서 5 용기 부피/일로 증가할 수 있다. 바람직하게는, 관류 속도는 0.5 용기 부피/일 이하에서 2 용기 부피/일로 증가한다.

생물 반응기

본 발명의 방법에 따르면, 회분식, 유가식 및 연속식 관류를 포함하지만 이들에 제한되지 않는 임의의 세포 배양 시스템, 유형 또는 형식이 이용될 수 있다.

임의의 세포 관류 생물 반응기 및 세포 보유 장치가 관류 배양에 사용될 수 있다. 관류에 사용되는 생물 반응기는, 크기가 더 작고 세포 보유 장치에 연결된다는 점을 제외하고는, 회분식/유가식 배양에 사용된 것과 매우 상이하지 않다. 생물 반응기 내에서 세포를 보유하는 방법은 주로 세포가 표면에 부착되어 성장하는지 또는 단일 세포 현탁액 또는 세포 응집체로 성장하는지 여부에 의해 결정된다. 역사적으로, 대부분의 포유 동물 세포가 표면 또는 매트릭스에 부착되어 성장한 반면 (불균질 배양), 주로 현탁 배양이 확대하기 쉽기 때문에 다수의 산업 포유 동물 세포주를 현탁액 중에서 성장시키도록 적응시키려는 노력이 이루어졌다 (균질 배양). 따라서, 본 발명의 방법에서 사용되는 세포는 바람직하게는 현탁액 중에서 성장된다. 이들에 제한되지 않지만, 현탁 중에서 성장된 세포에 대한 예시적인 보유 시스템은 회전 필터, 외부 여과, 예를 들어, 접선 유동 여과 (tangential flow filtration: TFF), 교호 접선 유동 (alternating tangential flow: ATF) 시스템, 세포 침강 (수직 침강 및 경사 침강), 원심 분리, 초음파 분리 및 하이드로사이클론이다. 관류 시스템은 회전 필터, 외부 여과 및 ATF와 같은 여과 기반 시스템과 중력 침강기, 원심 분리기, 초음파 분리 장치 및 하이드로클론과 같은 개방 관류 시스템인 2가지의 범주로 분류될 수 있다. 여과 기반 시스템은 높은 세포 보유도를 나타내며 유속에 따라 변하지 않는다. 그러나, 필터는 막힐 수 있으며, 이로 인해, 배양 실행은 길이가 제한되거나 필터가 교환될 필요가 있다. ATF 시스템에 대한 예는 REPLIGEN™의 XCELL™ ATF 시스템이며, TFF 시스템에 대한 예는 원심 펌프를 사용하는 LEVITRONIX®의 TFF 시스템이다. 중공 섬유 (hollow fiber: HF) 또는 평판 필터와 같은 직교류 필터가 ATF 및 TFF 시스템과 함께 사용될 수 있다. 구체적으로, 개질 폴리에테르 설폰 (modified polyethersulfone: mPES), 폴리에테르설폰 (PES) 또는 폴리설폰 (PE)으로 제조된 중공 섬유는 ATF 및 TFF 시스템과 함께 사용될 수 있다. HF의 기공 크기는 수백 kDa 내지 15 μM의 범위일 수 있다. 개방 관류 시스템은 막히지 않으며, 이로 인해, 적어도 이론적으로 무기한으로 조작될 수 있다. 그러나, 세포 보유도는 더 높은 관류 속도에서 감소된다. 현재, 산업 규모, 교호 접선 필터 (alternating tangential filter: ATF), 중력 (특히 경사 침강기) 및 원심 분리에서 사용될 수 있는 3가지 시스템이 있다. 불균질 또는 균질 배양에 적합한 세포 보유 장치는 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Kompala and Ozturk, Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies, (2006), Taylor & Francis Group, LLC, pages 387-416])에 보다 상세하게 기재되어 있다. 관류 배양은 진정한 정상 상태 과정이 아니며, 세포 배출 스트림이 생물 반응기로부터 제거될 때에만 총 및 생존 세포 농도가 정상 상태에 도달한다.

관류 생물 반응기에서의 pH, 용존 산소 및 온도와 같은 물리적 파라미터는 온라인으로 모니터링되며 실시간으로 제어되어야 한다. 세포 밀도, 생존력, 대사 산물 및 생성물 농도의 결정은 오프라인 또는 온라인 샘플링을 사용하여 수행될 수 있다. 관류 작업은 연속 수확 및 공급과 함께 시작되며, 관류 속도는 전형적으로 목적하는 값으로 수동으로 설정될 수 있는 수확 유속을 지칭한다. 예를 들어, 생물 반응기에 대한 중량 제어는, 생물 반응기에서의 일정한 부피가 유지될 수 있도록, 공급물 펌프를 활성화시킬 수 있다. 대안으로, 수준 제어는 배양 부피를 예정된 수준 이상으로 펌프에 의해 배출함으로써 달성될 수 있다. 생물 반응기에서의 관류 속도는 세포에 충분한 영양소를 전달하도록 조정되어야 한다. 세포 밀도가 생물 반응기에서 증가함에 따라, 관류 속도는 증가되어야 한다.

관류 속도는, 예를 들어, 세포 밀도 측정, pH 측정, 산소 소비 또는 대사산물 측정을 사용하여 제어될 수 있다. 세포 밀도는 관류 속도 조정에 사용되는 가장 중요한 측정이다. 세포 밀도 측정을 수행하는 방법에 따라, 관류 속도는 매일 또는 실시간으로 조정될 수 있다. 몇몇 온라인 프로브가 세포 밀도의 추정을 위해 개발되었으며, 커패시턴스 프로브, 예를 들어, INCYTE™ 프로브 (HAMILTON® COMPANY) 또는 FUTURA™ 바이오매스 캐패시턴스 프로브 값 (ABER® instruments)와 같이 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 이들 세포 밀도 프로브는 또한 생물 반응기로부터 과잉 세포, 즉, 세포 배출물을 제거함으로써 세포 밀도를 목적하는 설정점으로 제어하는데 사용될 수 있다. 따라서, 세포 배출물은 배양에서 포유 동물 세포의 특정 성장 속도에 의해 결정된다. 세포 배출물은 전형적으로 수확되지 않으며, 따라서, 폐기물로서 간주된다.

본 발명의 방법은 관류 세포 배양물로부터 이종 단백질을 수확하는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명은 관심 대상 단백질을 수확하고 정제하기 위한 임의의 적합한 방법을 고려한다. 상기 수확은 또한 세포 배양 생활 주기 전체에 걸쳐 또는 세포 배양의 종료시에 간헐적으로 일어날 수 있다. 수확은 바람직하게는, 세포가 세포 보유 장치에 의해 회수된 후에 생성된 상청액인 투과물로부터 연속적으로 수행된다. 유가식과 비교하여 관류 생물 반응기 내부의 세포 배양에서 생성물 단백질의 더 낮은 생성물 체류 시간으로 인해, 프로테아제, 시알리다아제 및 기타 분해 단백질에 대한 노출이 최소화되어, 관류 배양에서 생산된 이종 단백질의 보다 우수한 품질이 초래될 수 있다.

세포 배양 배지

본 발명은 상업적으로 이용 가능한 배지 등을 포함하는 임의의 적합한 세포 배양 배지의 사용을 고려한다. 본 출원에서 고려되는 임의의 배지는 본 발명의 지질 및/또는 지질 대사 산물 (예를 들어, 본 출원에서 정의된 목적하는 유효 농도의 리놀레산, 아라키돈산 및 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체)의 첨가에 의해 변형될 수 있어야한다. 사용되는 기본 세포 배양 배지의 유형은 사용되는 세포 배양의 유형 또는 형식, 예를 들어, 회분식, 유가식 또는 관류에 좌우될 수 있다. 통상의 기술자는 적합한 기본 배지를 선택할 수 있을 것이다.

하나의 실시형태에서, 무혈청 관류 배지가 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 무혈청 관류 배지는 화학적으로 제한되고/되거나 가수분해물을 함유하지 않는다. 단백질 가수분해물을 함유하지 않는다는 것은, 배지가 동물, 식물 (대두, 감자, 쌀), 효모 또는 다른 공급원 유래의 단백질 가수분해물을 함유하지 않는다는 것을 의미한다. 전형적으로, 화학적 제한 배지는 가수분해물을 함유하지 않는다. 어떠한 경우에도, 무혈청 관류 배지는 동물 공급원으로부터 유래된 화합물, 특히, 동물로부터 유래되고 단리된 단백질 또는 펩타이드 (이것은 세포 배양에 의해 생산된 재조합 단백질을 포함하지 않음)가 없어야 한다. 바람직하게는, 상기 무혈청 관류 배지는 단백질이 없거나, 재조합 인슐린 및/또는 인슐린 유사 성장 인자를 제외하고는 단백질이 없다. 보다 바람직하게는, 상기 무혈청 관류 배지는 화학적으로 제한되고, 단백질이 없거나, 재조합 인슐린 및/또는 인슐린 유사 성장 인자를 제외하고는 단백질이 없다. 이것은 또한 단계 (a)의 무혈청 배양 배지 및 단계 (b)의 무혈청 관류 배지에도 적용된다.

추가의 또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 생산기 동안 포유 동물 세포를 관류 배양으로 배양시키거나 관류 배양에서 총 세포 배출 부피를 감소시키기 위한 본 발명의 무혈청 관류 배지의 용도를 제공한다. 대안으로, 본 개시 내용은 관류 세포 배양에서 단백질 생산을 증가시키기 위한 본 발명의 무혈청 관류 배지의 용도를 제공한다.

다양한 실시형태에서, 첨가될 때의 상기 배지 중 리놀레산의 유효량은 (상기 배지 중 최종 농도 당) 약 1800~2000 μM이다. 다른 실시형태에서, 상기 배지에 첨가될 때의 리놀레산의 유효량은 약 1~5000 μM (상기 배지 중 최종 농도 당), 또는 약 1~2500 μM, 또는 약 1~1250 μM, 또는 약 1~1000 μM, 또는 약 1~800 μM, 또는 약 1~600 μM, 또는 약 1~400 μM, 또는 약 1~200 μM, 또는 약 1~100 μM, 또는 약 1~50 μM, 또는 약 1~25 μM이다. 하나의 실시형태에서, 리놀레산은 500~2000 μM의 농도로 존재한다.

다른 실시형태에서, 아라키돈산의 유효량은 약 150~500 μM이다. 또 다른 실시형태에서, 아라키돈산의 유효량은 약 1~5000 μM, 또는 약 1~2500 μM, 또는 약 1~1250 μM, 또는 약 1~1000 μM, 또는 약 1~800 μM, 또는 약 1~600 μM, 또는 약 1~400 μM, 또는 약 1~200 μM, 또는 약 1~100 μM, 또는 약 1~50 μM, 또는 약 1~25 μM이다. 하나의 실시형태에서, 아라키돈산은 100~600 μM의 농도로 존재한다.

다른 실시형태에서, 프로스타글란딘 E2의 유효량은 약 0.001 μM 내지 60 μM이다. 추가의 다른 실시형태에서, 프로스타글란딘 E2의 유효량은 0.001 μM, 10 μM, 20 μM 또는 60 μM이다. 또 다른 실시형태에서, 프로스타글란딘 E2의 유효량은 약 1~5000 μM, 또는 약 1~2500 μM, 또는 약 1~1250 μM, 또는 약 1~1000 μM, 또는 약 1~800 μM, 또는 약 1~600 μM, 또는 약 1~400 μM, 또는 약 1~200 μM, 또는 약 1~100 μM, 또는 약 1~50 μM, 또는 약 1~25 μM, 또는 약 0.0001~0.001 μM, 또는 약 0.0005~0.01 μM, 또는 약 0.005~0.1 μM, 또는 약 0.05~1.0 μM, 또는 약 0.5~100 μM, 또는 약 50~1000 μM 또는 그 이상이다. 하나의 실시형태에서, 프로스타글란딘 E2는 0.0001~100 μM의 농도로 존재한다.

일부 실시형태에서, 상기 배양 배지는 상기 농도 또는 농도 범위의 임의의 농도의 조합으로 적어도 2개의 상기 지질 또는 지질 대사 산물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 배양 배지는 100~300 μM 농도의 아라키돈산 및 500~1800 μM 농도의 리놀레산을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 배양 배지는 500~1800 μM 농도의 리놀레산 또는 100~150 μM 농도의 아라키돈산과 조합하여 0.0001~0.0009 μM 농도의 프로스타글란딘 E2를 포함한다.

추가의 또 다른 실시형태에서, 상기 배양 배지는 상기 농도 또는 농도 범위의 임의의 농도의 조합으로 3개의 모든 상기 지질 또는 지질 대사 산물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 배양 배지는 500~2000 μM 농도의 리놀레산, 100~300 μM 농도의 아라키돈산, 및 0.0001~0.0009 μM 농도의 프로스타글란딘 E2를 포함한다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 세포 배양 배지 또는 방법은 세포 성장을 감소시키고 세포 비생산성을 개선시키기 위해 나트륨 대 칼륨 비의 감소를 포함하는 세포 배양 배지 (즉, 증가된 칼륨 농도; 도 5에 인용되는 바와 같은 "K-팝" 배지로도 또한 공지됨)를 이용할 수 있다. 예를 들어, 2017년 3월 31일자로 출원된 미국 가출원 62/479,422에 기재된 배지는 본 출원에서 기재된 지질 및/또는 지질 대사 산물을 포함함으로써 이용될 수 있으며, 본 출원에 참조로 포함된다. 본 출원에서 기재된 방법 및 지질 첨가제를 사용하여 생존 세포 밀도, 세포 성장을 추가로 감소시키고 세포 비생산성을 개선시킬 수 있다.

다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 세포 배양 배지 또는 방법은 비타민 첨가제 (예를 들어, 비타민 A 또는 레티닐 아세테이트)를 이용하여 관류 세포 배양에서 세포 성장을 늦출 수 있다. 본 출원에서 기재된 방법 및 지질 첨가제를 사용하여 이러한 배지에서 생존 세포 밀도, 세포 성장을 추가로 감소시키고 세포 비생산성을 개선시킬 수 있다. 이러한 배지의 예는 그 전문이 본 출원에 참조로 포함되는 2017년 3월 31일자로 출원된 미국 가출원 62/479,414에서 발견될 수 있다.

본 출원에서 기재된 세포 배양 방법은 본 발명의 지질 및/또는 지질 대사 산물 (예를 들어, 리놀레산, 아라키돈산 및/또는 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체)을 포함하는 특정 세포 배지를 첨가, 혼합, 조합 또는 그렇지 않으면 수득하기 위한 임의의 적합한 방식 및 시기를 고려한다. 예를 들어, 본 발명의 지질 및/또는 지질 대사 산물은 세포 배양을 시작하기 전 또는 시작할 때 목적하고/하거나 유효한 농도로 초기 배양 배지에 혼합될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 지질 및/또는 지질 대사 산물은 세포 배양 접종의 다운스트림의 어느 지점에서 활발하게 성장하는 세포 배양에 첨가되거나 그렇지 않으면 혼합 또는 조합될 수 있다. 추가의 또 다른 실시형태에서, 일단 첨가되면, 본 발명의 지질 및/또는 지질 대사 산물의 최적 유효 농도는 상기 지질 및/또는 지질 대사 산물의 추가의 증분을 세포 배양 배지에 계속하여 첨가함으로써 목적하는 유효 농도로 유지될 수 있는 것으로 예상된다. 다양한 실시형태에서, 상기 지질 및/또는 지질 대사 산물은, "스톡 (stock) 농도" 또는 "스톡 물질"로서 지칭될 수 있는, 제1 고농도의 (세포 배양 배지와 동일 또는 상이할 수 있고/있거나 에탄올, 아세톤, 벤젠 또는 다른 지질 용해성 용매와 같은 지질 용매를 적절한 유효량으로 함유할 수 있는) 액체 배지에서 제조될 수 있다. 세포 배양 배지를 상기 지질 및/또는 지질 대사 산물의 목적하는 "작업" 농도로 조정하기 위해서, 당해 분야의 통상의 기술자는 적절한 부피 또는 양의 스톡 물질을 세포 배양 배지로 이전하여 목적하는 작업 농도를 달성할 것이다. 일부 경우, 세포 배양에 첨가되는 일시적인 높은 국소 농도의 스톡 물질과 접촉할 수 있는 세포에 아마 유해할 수 있는 너무 높은 국소 농도의 상기 지질 및/또는 지질 대사 산물 (또는 스톡 배지에 사용되는 지질 용해성 용매)을 도입하는 것을 회피하는 속도로 스톡 물질을 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양에 대한 스톡 물질의 볼루스 첨가를 단순히 추가하는 것을 고려한다.

또한, 본 발명의 지질 및/또는 지질 대사 산물을, 예를 들어, 스톡 농도의 물질로서 첨가하는 것과 관련한 세포 배양 생물 반응기의 구성과 관련하여, 상기 지질 및/또는 지질 대사 산물은 세포 배양 배지와 동일한 밸브 또는 진입점을 통해 첨가될 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 지질 및/또는 지질 대사 산물은 독립적인 밸브 또는 진입점을 통해 첨가될 수 있다. 세포 배양 생물 반응기는 세포 배양의 시작시, 세포 배양의 성장기 동안 및 세포 배양의 생산기 동안을 비롯하여 세포 배양 주기의 임의의 시간에 상기 지질 및/또는 지질 대사 산물을 첨가하는 단계를 수용하도록 구성될 수 있다. 상기 생물 반응기는 또한 공유 밸브 또는 포트를 통해, 또는 별개의 또는 독립적인 밸브 또는 포트를 통해 지질 및/또는 지질 대사 산물의 단일 볼루스 첨가를 위해 구성될 수 있다. 상기 생물 반응기는 또한 공유 밸브 또는 포트를 통해, 또는 별도의 또는 독립적인 밸브 또는 포트를 통해 세포 배양 배지에 대한 지질 및/또는 지질 대사 산물의 간헐적인 일련의 첨가 또는 연속적인 스트림 첨가를 수용하도록 구성될 수 있다. 스톡 농도의 본 발명의 지질 및/또는 지질 대사 산물의 투입은 임의의 공지된 수단에 의해 수동, 자동 또는 반자동으로 첨가되도록 구성될 수 있다.

발현 산물

본 발명의 방법 및 용도에 의해 생산된 이종 단백질은 임의의 분비되는 단백질일 수 있으며, 이것은 바람직하게는 치료학적 단백질이다. 대부분의 치료학적 단백질은 재조합 치료학적 단백질이기 때문에, 이것은 가장 바람직하게는 재조합 치료학적 단백질이다. 치료학적 단백질에 대한 예로는 항체, 융합 단백질, 사이토카인 및 성장 인자가 있지만, 이들에에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 방법에 따라 포유 동물 세포에서 생산된 치료학적 단백질로는 항체 또는 융합 단백질, 예를 들어, Fc-융합 단백질이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 기타 분비되는 재조합 치료학적 단백질로는, 예를 들어, 효소, 사이토카인, 림포카인, 유착 분자, 수용체 및 이의 유도체 또는 단편, 및 작용제 또는 길항제로서 역할을 하고/하거나 치료 또는 진단 용도를 가질 수 있는 임의의 다른 폴리펩타이드 및 스캐폴드일 수 있다.

관심 대상의 기타 재조합 단백질로는, 예를 들어, 다음과 같지만, 이들에 한정되는 것은 아니다: 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자, hGH, tPA, 사이토카인, 예를 들어, 인터루킨 (IL), 예를 들어,IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, 인터페론 (IFN) 알파, IFN 베타, IFN 감마, IFN 오메가 또는 IFN 타우, 종양 괴사 인자 (tumor necrosis factor: TNF), 예를 들어, TNF 알파 및 TNF 베타, TNF 감마, TRAIL; G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 및 VEGF. 에리트로포이에틴, 또는 작용제 또는 길항제로서 작용하고/하거나 치료 또는 진단 용도를 가질 수 있는 임의의 기타 호르몬 성장 인자 및 임의의 기타 폴리펩타이드의 생산도 또한 포함된다.

바람직한 치료학적 단백질은 항체 또는 이의 단편 또는 유도체, 보다 바람직하게는 IgG1 항체이다. 따라서, 본 발명은 유리하게는 단클론 항체, 다중 특이적 항체 또는 이의 단편과 같은 항체, 바람직하게는 단클론 항체, 이중 특이적 항체 또는 이의 단편의 생산에 사용될 수 있다. 본 발명의 범위내의 예시적인 항체로는 항-CD2, 항-CD3, 항-CD20, 항-CD22, 항-CD30, 항-CD33, 항-CD37, 항-CD40, 항-CD44, 항-CD44v6, 항-CD49d, 항-CD52, 항-EGFR1 (HER1), 항-EGFR2 (HER2), 항-GD3, 항-IGF, 항-VEGF, 항-TNF 알파, 항-IL2, 항-IL-5R 또는 항-IgE 항체가 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 항-CD20, 항-CD33, 항-CD37, 항-CD40, 항-CD44, 항-CD52, 항-HER2/neu (erbB2), 항-EGFR, 항-IGF, 항-VEGF, 항-TNF 알파, 항-IL2 및 항-IgE 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

항체 단편은, 예를 들어, "Fab 단편" (단편 항원-결합 = Fab)을 포함한다. Fab 단편은, 인접한 불변 영역에 의해 함께 유지되는 2개의 쇄의 가변 영역으로 이루어진다. 이들은 통상적인 항체로부터, 예를 들어, 파파인에 의한 프로테아제 분해에 의해 형성될 수 있지만, 유사하게는 Fab 단편은 또한 유전자 조작에 의해 생산될 수 있다. 추가의 항체 단편은, 펩신에 의한 단백질 가수분해 절단에 의해 제조될 수 있는 F(ab')₂ 단편을 포함한다.

유전자 조작 방법을 사용하여, 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 영역만으로 이루어진 단축 항체 단편을 생산하는 것이 가능하다. 이들은 Fv 단편 (단편 가변 = 가변 부분의 단편)으로서 지칭된다. 이들 Fv 단편은 불변 쇄의 시스테인에 의한 2개의 쇄의 공유 결합이 결여되어 있기 때문에, Fv 단편은 종종 안정화된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을, 예를 들어, 10개 내지 30개의 아미노산, 바람직하게는 15개의 아미노산의 단축 펩타이드 단편에 의해 연결하는 것이 유리하다. 이러한 방식으로, 펩타이드 링커에 의해 연결된 VH 및 VL로 이루어진 단일 펩타이드 가닥이 수득된다. 이러한 종류의 항체 단백질은 단쇄-Fv (scFv)로서 공지되어 있다. scFv-항체 단백질의 예는 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.

본 발명에 따른 바람직한 치료 항체는 이중 특이적 항체이다. 이중 특이적 항체는 전형적으로 하나의 분자에서 표적 세포 (예를 들어, 악성 B-세포) 및 효과기 세포 (예를 들어, T-세포, NK-세포 또는 대식 세포)에 대한 항원-결합 특이성을 조합한다. 예시적인 이중 특이적 항체로는 디아바디, BiTE (Bi-specific T-cell Engager) 형식 및 DART (Dual-Affinity Re-Targeting) 형식이 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 디아바디 형식은 2개의 개별 폴리펩타이드 쇄 상에서 2개의 항원 결합 특이성의 중쇄 및 경쇄의 동족 가변 도메인을 분리하며, 여기서, 2개의 폴리펩타이드 쇄는 비공유적으로 결합되어 있다. DART 형식은 디아바디 형식을 기초로 하지만, C-말단 이황화 브릿지를 통해 추가의 안정화를 제공한다.

다른 바람직한 치료학적 단백질은 융합 단백질, 예를 들어, Fc-융합 단백질이다. 따라서, 본 발명은 유리하게는 Fc-융합 단백질과 같은 융합 단백질의 생산에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 단백질 생산을 증가시키는 방법은 유리하게는 Fc-융합 단백질과 같은 융합 단백질의 생산에 사용될 수 있다.

융합 단백질의 효과기 부분은 천연 또는 변형된 이종 단백질의 완전한 서열 또는 당해 서열의 일부, 또는 천연 또는 변형된 이종 단백질의 완전한 서열 또는 당해 서열의 일부의 조성일 수 있다. 면역글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 면역글로불린 하위 유형, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2 하위 유형, 또는 부류, 예를 들어, IgA, IgE, IgD 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다. 바람직하게는, 이들은 사람 면역글로불린, 보다 바람직하게는 사람 IgG, 보다 더 바람직하게는 사람 IgG1 및 IgG2으로부터 유래된다. Fc-융합 단백질의 비제한적인 예로는 N-연결된 당화 부위를 포함하는 중쇄 면역글로불린 불변 영역의 CH2 도메인에 커플링된 MCP1-Fc, ICAM-Fc, EPO-Fc 및 scFv 단편 등이 있다. Fc-융합 단백질은, N-연결된 당화 부위를 포함하는 중쇄 면역글로불린 불변 영역의 CH2 도메인을, 예를 들어, 다른 면역글로불린 도메인, 효소적 활성 단백질 부분 또는 효과기 도메인을 포함하는 또 다른 발현 작제물 내에 도입함으로써 유전자 공학적 접근법에 의해 작제될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Fc-융합 단백질은, 예를 들어, N-연결된 당화 부위를 포함하는 중쇄 면역글로불린 불변 영역의 CH2 도메인에 연결된 단쇄 Fv 단편을 또한 포함한다.

발현 산물의 회수 및 제형화

추가의 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하고, 치료학적 단백질을 정제하고 약제학적으로 허용되는 제형으로 제형화하는 단계를 임의로 추가로 포함하는, 치료학적 단백질을 생산하는 방법이 제공된다.

치료학적 단백질, 특히, 항체, 항체 단편 또는 Fc-융합 단백질은 바람직하게는 분비된 폴리펩타이드로서 배양 배지로부터 회수/단리된다. 치료학적 단백질의 실질적인 동종 제제를 수득하기 위해 다른 재조합 단백질 및 숙주 세포 단백질로부터 치료학적 단백질을 정제할 필요가 있다. 제1 단계로서, 세포 및/또는 미립자 세포 잔해물을 배양 배지로부터 제거한다. 또한, 치료학적 단백질은, 예를 들어, 면역 친화성 또는 이온-교환 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, Sephadex 크로마토그래피, 및 실리카 상에서 또는 DEAE와 같은 양이온 교환 수지 상에서의 크로마토그래피에 의해 가용성 단백질, 폴리펩타이드 및 핵산의 오염물로부터 정제된다. 포유 동물 세포에 의해 발현된 이종 단백질을 정제하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.

발현 벡터

하나의 실시형태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 발현된 이종 단백질은 이종 단백질을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 1종 이상의 발현 카세트(들)에 의해 암호화된다. 이종 단백질은 디히드로폴레이트 리덕타아제 (dihydrofolate reductase: DHFR), 글루타민 신타아제 (GS)와 같은 증폭 가능한 유전자 선택 마커의 제어하에 놓일 수 있다. 증폭 가능한 선택 마커 유전자는 이종 단백질 발현 카세트와 동일한 발현 벡터 상에 존재할 수 있다. 대안으로, 증폭 가능한 선택 마커 유전자 및 이종 단백질 발현 카세트는 상이한 발현 벡터 상에 존재할 수 있지만, 숙주 세포의 게놈 내에 아주 근접하여 통합된다. 동시에 공동 형질 감염되는 2종 이상의 벡터는, 예를 들어, 종종 숙주 세포의 게놈 내에 아주 근접하여 통합된다. 이어서, 분비된 치료학적 단백질 발현 카세트를 함유하는 유전자 영역의 증폭은, 증폭제 (예를 들어, DHFR의 경우 MTX 또는 GS의 경우 MX)를 배양 배지에 첨가함으로써 매개된다.

포유 동물 세포에 의해 발현되는 충분히 높은 안정한 수준의 이종 단백질은 또한, 예를 들어, 이종 단백질 암호화-폴리뉴클레오타이드의 복수의 카피를 발현 벡터 내에 클로닝함으로써 달성될 수 있다. 상기에서 기재된 바와 같이 이종 단백질-암호화 폴리뉴클레오타이드의 복수의 카피를 발현 벡터 내에 클로닝하고 이종 단백질 발현 카세트를 증폭시키는 것은 추가로 조합될 수 있다.

포유 동물 세포주

본 출원에서 사용되는 포유 동물 세포는 분비되는 재조합 치료학적 단백질의 생산에 적합한 포유 동물 세포주이며, 이로 인해, "숙주 세포"로서도 또한 지칭될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 포유 동물 세포는 햄스터 세포와 같은 설치류 세포이다. 포유 동물 세포는 단리된 세포 또는 세포주이다. 포유 동물 세포는 바람직하게는 형질 전환 및/또는 불멸화 세포주이다. 이들은 세포 배양에서 일련의 계대에 적합하며, 장기 구조의 일부인 일차 비-형질 전환 세포 또는 세포들을 포함하지 않는다. 바람직한 포유 동물 세포는 BHK21, BHK TK-, CHO, CHO-K1, CHO-DXB11 (CHO-DUKX 또는 DuxB11로도 또한 지칭됨), CHO-S 세포 및 CHO-DG44 세포, 또는 임의의 이러한 세포주의 유도체/자손이다. CHO-DG44, CHO-K1 및 BHK21이 특히 바람직하며, CHO-DG44 및 CHO-K1 세포가 보다 더 바람직하다. CHO-DG44 세포가 가장 바람직하다. 포유 동물 세포, 특히, CHO-DG44 및 CHO-K1 세포의 글루타민 신타아제 (GS)-결핍 유도체도 또한 포함된다. 본 발명의 하나의 실시형태에서, 상기 포유 동물 세포는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 바람직하게는 CHO-DG44 세포, CHO-K1 세포, CHO DXB11 세포, CHO-S 세포, CHO GS 결핍 세포 또는 이들의 유도체이다.

상기 포유 동물 세포는 치료학적 단백질, 바람직하게는 재조합 분비된 치료학적 단백질과 같은 이종 단백질을 암호화하는 1종 이상의 발현 카세트(들)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 숙주 세포는 또한 쥐과 동물 골수종 세포, 예를 들어, NS0 및 Sp2/0 세포와 같은 쥐과 동물 세포, 또는 이러한 세포주 중 임의의 세포주의 유도체/자손일 수 있다. 본 발명의 의미에 사용될 수 있는 포유 동물 세포의 비제한적인 예는 또한 표 1에 요약되어 있다. 그러나, 이들 세포의 유도체/자손, 사람, 마우스, 래트, 원숭이 및 설치류 세포주를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다른 포유 동물 세포도 또한 본 발명에서, 특히, 생물 약제학적 단백질의 생산을 위해 사용될 수 있다.

무혈청 조건 하에, 및 임의로 어떠한 동물 기원의 단백질/펩타이드도 없는 배지 중에서 확립되고, 적응되고, 완전히 배양될 때, 포유 동물 세포가 가장 바람직하다. 햄 F12 (Sigma, Deisenhofen, Germany), RPMI-1640 (Sigma), 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM; Sigma), 최소 필수 배지 (MEM; Sigma), 이스코브 변형 둘베코 배지 (IMDM; Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA), CHO-S (Invitrogen), 무혈청 CHO 배지 (Sigma) 및 무단백질 CHO 배지 (Sigma)와 같은 시판되는 배지가 예시적인 적절한 영양소 용액이다. 임의의 배지는 필요에 따라 다양한 화합물로 보충될 수 있으며, 이들 화합물의 비제한적인 예로는 재조합 호르몬 및/또는 기타 재조합 성장 인자 (예를들어, 인슐린, 트랜스페린, 표피 성장 인자, 인슐린 유사 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화 나트륨, 칼슘, 마그네슘, 포스페이트), 완충액 (예를 들어, HEPES), 뉴클레오사이드 (예를 들어, 아데노신, 티미딘), 글루타민, 글루코오스 또는 기타 동등한 에너지원, 항생제 및 미량 원소가 있다. 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있는 임의의 기타 필요한 보충제도 또한 적절한 농도로 포함될 수 있다. 선택 가능한 유전자를 발현하는 유전자 변형된 세포의 성장 및 선택을 위해, 적절한 선택제가 배양 배지에 첨가된다.

실시예

방법 및 재료

달리 명시되지 않는다면, 하기 실시예들은 관류 세포 배양을 위한 하기 일반화된 프로토콜 및 장치를 사용하여 수행되었다. 상이한 2가지 형식의 관류 배양 공정을 실시예들에서 기재된 실험에 사용하였다. 하나는 생물 반응기 모델에서 실행되며, 다른 하나는 딥-웰 플레이트 모델에서 실행된다.

상기 생물 반응기 모델은 2L의 작업 부피를 갖는 3L의 유리 교반 탱크 생물 반응기를 사용하여 설정된다. 상기 생물 반응기의 보유 장치는 TFF 모드에서 자기 부상 원심 펌프 실행에 의해 재순환되는 0.2 μm의 중공 섬유이다. 출발 세포 밀도는 0.5~1.0e⁶ 세포/ml이다. 피크에서의 관류 속도는 2 VVD이다. 상기 구성의 추가의 세부 사항은 본 출원에 참조로 포함되는 문헌[Lin et al., Biotechnol. Prog., 2017, Vol. 33, No. 4]에 기재되어 있다.

상기 딥-웰 플레이트 모델은 8일 실행 지속 시간을 갖는 24 딥-웰 플레이트를 사용하여 수행된다. 20e⁶ 세포/ml의 출발 세포 밀도는 딥-웰 플레이트 모델 작업에 표적화된다. 웰 당 작업 부피는 3 ml이며, 세포는 5.0 cm의 궤도 직경을 갖는 인큐베이터에서 5% CO₂, 80% 습도 및 200 rpm으로 33℃에서 성장한다. 배지 교환은, 상기 플레이트를 1800 rpm에서 5분 동안 원심 분리하고, 상청액을 제거하고, 상기 세포를 새로운 배지에 70% 부피/일 (VVD) 교환 속도로 재현탁시킴으로써, 매일 수행된다. 상기 구성의 추가의 세부 사항은 문헌[Lin et al., Biotechnol. Prog., 2017, Vol. 33, No. 4]에 기재되어 있다.

실시예 1. 생존력, 생존 세포 밀도 및 비생산성에 대한 온도 변화의 영향

본 실시예에서, 생물 반응기 모델을 사용한다. 세포 배양에서 보다 낮은 온도 변화를 일반적으로 사용하여 세포 성장을 제한하거나 억제한다.

따라서, 본 실시예는 (A) 생존력 (%), (B) 생존 세포 밀도 (e⁵ 세포/ml) 및 (C) 비생산성 (pg/세포/일)에 대한 온도 변화의 영향을 조사한다. 도 1를 참조한다. 세포 배양 2일째에 관류를 시작하였으며, 2 용기 부피/일 (2VVD)의 교환으로 점진적으로 증가시켰다. 화살표는 온도가 37℃에서부터 범례에서 표시된 값 (29℃ - 사각형 또는 28℃ - 삼각형)으로 변화된 일자 (7일째)를 나타낸다.

본 실시예에서, 이러한 방법은 성장을 늦추지만 세포 비생산성에는 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌다. 하나의 세포주 (데이터는 나타내지 않음)에서, 온도 변화는 생성물 품질에 부정적인 영향을 미쳐서 경쇄 및 염기성 종을 증가시켰다. 도 1c에서 도시된 바와 같이, 7일 (흑색 화살표) 후의 (28℃ 및 29℃로) 온도 변화는 VCD를 감소시키는 반면 (도 1b), 저온 변화는 세포 비생산성에 긍정적인 영향을 나타내지 않는다. 대조적으로, 본 발명의 지질 첨가제의 사용은 VCD를 감소시키면서 이에 수반하여 세포 비생산성을 증가시킨다.

실시예 2. 외인성 리놀레산에 의한 세포 성장 억제 및 세포 생산성 증가

본 실시예에서, 딥-웰 플레이트 모델을 사용한다. 본 실시예는 리놀레산이 관류 배지에 첨가될 때 세포 성장을 억제하고 CHO 관류 세포 배양에서 세포 비생산성 (q_p)을 증가시킨다는 것을 입증한다. 도 3를 참조한다.

500 μM, 900 μM, 1350 μM 및 1800 μM의 다양한 농도의 리놀레산을 세포 배양 배지에 첨가하고, (A) 생존 세포 밀도 (e⁵ 세포/ml), (B) 세포 생존력 (%) 및 (C) 비생산성 (q_p)을 측정하였다. 리놀레산의 보다 높은 농도는 세포 성장을 억제하고 비생산성을 증가시키는데 보다 상당한 영향을 나타냈다. 예를 들어, 7일째에, 500, 900 및 1350 μM의 리놀레산은 세포 거의 동일하고 정상 관류 배지에 비해 상당히 증가한 비생산성을 나타냈다. 1800 μM의 리놀레산은 500 μM의 아라키돈산과 생존 세포 밀도, 생존력 및 비생산성에 대해 유사하였으며, 정상 관류 배지에 비해 가장 상당한 차이를 갖는다.

본 도면은 또한 500 μM 농도의 아라키돈산이 관류 세포 배양에서 세포 성장과 q_p에 영향을 미칠 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 3. 외인성 아라키돈산에 의한 세포 성장 억제 및 세포 생산성 증가

본 실시예에서, 딥-웰 플레이트 모델을 사용한다. 본 실시예는 관류 배지에 첨가될 때 아라키돈산의 영향을 분석한다. 도 4를 참조한다.

세포 배양의 (A) 생존 세포 밀도 (e⁵ 세포/ml), (B) 세포 생존력 (%) 및 (C) 비생산성 (q_p)에 대한 아라키돈산의 영향을 측정하였다.

정상 관류 배지에 첨가된 500 μM의 아라키돈 농도가 세포 성장을 최대 31% 억제하고 세포 비생산성을 46% 이상 증가시켰다는 것을 알 수 있다. 따라서, 아라키돈산은 세포 성장을 억제하고 관류 세포 배양에서 세포 비생산성 (q_p)을 증가시킨다.

실시예 4. 증가된 칼륨 농도 이외의 외인성 아라키돈산에 의한 세포 성장 억제 및 세포 생산성 증가

본 실시예에서, 딥-웰 플레이트 모델을 사용한다. 본 실험은 이미 높은 칼륨 농도 (즉, "K-팝" 배지) 이외에 관류 배지에 첨가될 때 아라키돈산의 영향을 분석한다. 도 5를 참조한다.

대략 34 mM의 나트륨 농도 및 대략 94 mM의 높은 기존 칼륨 농도, 즉, 약 0.4의 낮은 칼륨에 대한 나트륨 비를 갖는 세포 배양 배지에 대해 150 μM, 300 μM 및 500 μM로 첨가되는 아라키돈산의 농도의 영향을, (A) 생존 세포 밀도 (e⁵ 세포/ml), (B) 세포 생존력 (%) 및 (C) 비생산성 (q_p)에 대해 측정하였다.

높은 칼륨 농도 이외에 150 μM 내지 500 μM 농도의 아라키돈산을 함유하는 세포 배양 배지는 높은 칼륨 농도 단독의 영향을 심지어 넘어서도 세포 성장을 감소시키고 세포 비생산성을 개선시킨다.

본 실험은 아라키돈산이 관류 배지에 첨가될 때, 예를 들어, 증가된 칼륨 농도에 의한 필적하는 효과 이외에도 세포 성장을 억제하고 세포 비생산성 (q_p)을 증가시킨다는 것을 입증한다.

낮은 칼륨에 대한 나트륨 배지 (즉, 증가된 칼륨 농도)는, 예를 들어, 본 출원에 참조로 포함되는 미국 가출원 62/479,422에 기재되어 있다.

실시예 5. 외인성 프로스타글란딘 E2 (PGE2)에 의한 세포 성장 억제 및 세포 생산성 증가

본 실시예에서, 딥-웰 플레이트 모델을 사용한다. 본 실험은 관류 배지에 첨가될 때 프로스타글란딘 E2의 영향을 분석한다. 도 6를 참조한다.

도 6은 관류 배지에 첨가된 500 μM의 아라키돈산, 0.001 μM, 10 μM, 20 μM 및 60 μM의 PGE2의 농도의 영향을 (A) 생존 세포 밀도 (VCD) (e5 세포/ml), (B) 세포 생존력 (%) 및 (C) 비생산성 (pg/세포/일)에 대해 측정하였다. 각각의 농도, VCD 및 비생산성 (즉, 비역가)에서, 성장은 억제된 세포 성장이었으며, 비생산성은 정상 관류 배지에서의 세포 배양에 비해 6일 전에 증가하였다.

상기 데이터는 또한 생존력이 6일째에 감소하기 시작함에 따라 0.001 μM 초과의 농도의 프로스타글란딘 E2가 세포에 대해 어느 정도 독성이 있다는 것을 입증하는 것으로 보인다. 약간의 독성이 0.001 μM 초과의 농도에서 관찰될 수 있지만, 이것은 그 자체로 이러한 역치 (threshold) 초과의 농도에서 프로스타글란딘 E2의 사용을 배제하지는 않는다.

본 실시예는 프로스타글란딘 E2가 관류 배지에 첨가될 때 세포 성장을 억제하고 세포 비생산성 (q_p)을 증가시킨다는 것을 입증한다.

실시예 6. 프로스타글란딘 E2는 성장 억제의 조절제이며 세포 생산성을 증가시켰다.

본 실시예에서, 딥-웰 플레이트 모델을 사용한다. ASA는, 아라키돈산을 전환시켜 프로스타글란딘 E2를 합성하는 대사 효소인 COX-1 및 COX-2의 억제제이다 (도 2 참조). 따라서, 본 실험은 관류 배지에 첨가될 때 아세틸살리실산 (ASA)의 영향을 분석한다. 도 7를 참조한다.

억제제 함유 배지는 정상 관류 배지보다 높은 생존 세포 밀도 (A)를 나타냈으며, 정상 관류 배지와 동일한 비생산성에 대한 영향 (C)을 나타냈다. 프로스타글란딘 E2는 사이클로옥시게나아제 효소 1 및 2 (COX-1 및 COX-2)에 의해 아라키돈산으로부터 합성되므로, 아세틸살리실산 (ASA)에 의한 COX-1 및 COX-2의 억제는 아마도 아라키돈산으로부터 프로스타글란딘 E2의 합성을 방지할 것이다.

이러한 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 상기 데이터는 (그렇지 않으면 ASA 억제제의 부재하에 세포 성장을 억제하고 생산성을 증가시키는) 아라키돈산이 먼저 COX-1 및 COX-2에 의해 대사되어 (도 2 참조) 활성제인 프로스타글란딘 E2를 형성함으로써 세포 배양에 영향을 미친다는 것을 시사한다. COX-1 및 COX-2가 ASA에 의해 억제될 때, 어떠한 프로스타글란딘 E2도 생성되지 않으며, 아라키돈산은 세포 성장을 억제하고 생산성을 증가시키는데 영향을 미치지 않는다.

본 실험은 500 μM의 아라키돈산을 함유하는 관류 배지에서 (A) 생존 세포 밀도, (B) 생존력 (%) 및 (C) 비생산성에 대한 아세틸살리실산 (ASA)의 영향을 입증한다. 상기 데이터는 프로스타글란딘 E2가 세포 성장 억제를 촉발하고 세포 비생산성을 증가시키는데 효과적이다는 증거를 제공한다.

항목들

상기의 관점에서, 본 발명은 또한 하기 항목들에 관한 것으로 인식될 것이다:

항목 1. 유효량의 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물을 포함하는 배양 배지에서 상기 포유 동물 세포를 배양시키는 단계를 포함하는, 세포 배양에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키는 방법으로서, 상기 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물이 500~2000 μM 리놀레산, 100~600 μM 아라키돈산, 0.0001~100 μM 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체를 포함하는, 방법.

항목 2. 제1항목에 있어서, 상기 배양 배지가 적어도 2개의 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체를 포함하는, 방법.

항목 3. 제1항목 또는 제2항목에 있어서, 상기 배양 배지가 100~300 μM 농도의 아라키돈산 및 500~1800 μM 농도의 리놀레산을 포함하는, 방법.

항목 4. 제1항목 내지 제3항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 배양 배지가 500~1800 μM 농도의 리놀레산 또는 100~150 μM 농도의 아라키돈산과 조합하여 0.0001~0.0009 μM 농도의 프로스타글란딘 E2를 포함하는, 방법.

항목 5. 제1항목 내지 제4항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 배양 배지가 3개의 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체를 포함하는, 방법.

항목 6. 제1항목 내지 제5항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 세포 배양이 회분식, 유가식 또는 관류 세포 배양인, 방법.

항목 7. 제1항목 내지 제6항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 포유 동물 세포가 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 저캇 세포, 293 세포, HeLa 세포, CV-1 세포 또는 3T3 세포, 또는 이들 세포 중 임의의 세포의 유도체를 포함하고, 여기서, 상기 CHO 세포가 CHO-DG44 세포, CHO-K1 세포, CHO DXB11 세포, CHO-S 세포 및 CHO GS 결핍 세포 또는 이의 돌연변이체로 이루어진 그룹으로부터 추가로 선택될 수 있는, 방법.

항목 8. 제1항목 내지 제7항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 이종 단백질이 치료학적 단백질, 항체 또는 이의 치료학적 유효 단편인, 방법.

항목 9. 제8항목에 있어서, 상기 항체가 단클론 항체 또는 이의 단편 또는 이중 특이적 항체인, 방법.

항목 10. 제1항목 내지 제9항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 조합물이 성장 억제 및 생산성 증가를 초래하는, 방법.

항목 11. 제1항목 내지 제10항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 배양 배지가 무혈청 관류 배지인, 방법.

항목 12. 제11항목에 있어서, 상기 배양 배지가 임의로 (a) 화학적으로 제한되거나, (b) 가수 분해물을 함유하지 않거나, (c) 단백질을 함유하지 않지만 임의로 인슐린 및/또는 인슐린 유사 성장 인자를 포함하는, 방법.

항목 13. 제1항목 내지 제12항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 세포 배양에 의해 생산된 이종 단백질의 총 생산이 상기 지질 또는 지질 대사 산물을 포함하지 않는 대조군 세포 배양에서의 총 생산의 수준에 비해 적어도 5~50% 증가하는, 방법.

항목 14. 제1항목 내지 제13항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 세포 배양의 세포 비생산성 (pg/세포/일)이 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체를 포함하지 않는 대조군 세포 배양에서의 세포 비생산성에 비해 적어도 5~50% 증가하는, 방법.

항목 15. 제1항목 내지 제14항목 중 어느 한 항목에 있어서, 세포 성장이 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체를 포함하지 않는 대조군 세포 배양에 비해 적어도 5~50% 낮은 생존 세포 밀도를 갖는 정상 상태로 상기 세포를 유지하기에 충분한 수준으로 억제되는, 방법.

항목 16. 제1항목 내지 제15항목 중 어느 한 항목에 있어서, 2일째의 상기 세포 배양이 관류 세포 배양으로 변경되는, 방법.

항목 17. 제6항목 또는 제16항목에 있어서, 상기 관류 속도가 관류 시작 후에 증가하는, 방법.

항목 18. 제17항목에 있어서, 상기 관류 속도가 0.5 용기 부피/일 이하에서 5 용기 부피/일로, 또는 0.5 용기 부피/일 이하에서 2 용기 부피/일로 증가하는, 방법.

항목 19. 제1항목 내지 제18항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 세포 배양물로부터 상기 이종 단백질을 수확하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

항목 20. 제1항목 내지 제19항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 유도체가 10×10⁶ 세포/ml 내지 약 120×10⁶ 세포/ml의 세포 밀도에 도달하면 상기 세포 배지에 첨가되는, 방법.

항목 21. 제1항목 내지 제20항목 중 어느 한 항목의 방법을 사용하여 치료학적 단백질을 생산하는 방법.

항목 22. 하기 단계들을 포함하는, 세포 배양으로부터 치료학적 단백질을 생산하는 방법:

(a) 유효량의 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물을 포함하는 배양 배지에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키되, 여기서, 상기 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물이 500~2000 μM 리놀레산, 100~600 μM 아라키돈산, 0.0001~100 μM 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체를 포함하는 단계,

(b) 상기 세포 배양물로부터 상기 이종 단백질을 수확하는 단계.

항목 23. 제22항목에 있어서, 상기 배양 배지가 적어도 2개의 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체를 포함하는, 방법.

항목 24. 제22항목 또는 제23항목에 있어서, 상기 배양 배지가 100~300 μM 농도의 아라키돈산 및 500~1800 μM 농도의 리놀레산을 포함하는, 방법.

항목 25. 제22항목 내지 제24항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 배양 배지가 500~1800 μM 농도의 리놀레산 또는 100~150 μM 농도의 아라키돈산과 조합하여 0.0001~0.0009 μM 농도의 프로스타글란딘 E2를 포함하는, 방법.

항목 26. 제22항목 내지 제25항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 배양 배지가 적어도 3개의 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체를 포함하는, 방법.

항목 27. 제22항목 내지 제26항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 세포 배양이 회분식, 유가식 또는 관류 세포 배양인, 방법.

항목 28. 제22항목 내지 제27항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 포유 동물 세포가 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 저캇 세포, 293 세포, HeLa 세포, CV-1 세포 또는 3T3 세포, 또는 이들 세포 중 임의의 세포의 유도체를 포함하고, 여기서, 상기 CHO 세포가 CHO-DG44 세포, CHO-K1 세포, CHO DXB11 세포, CHO-S 세포 및 CHO GS 결핍 세포 또는 이들 세포 중 임의의 세포의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 추가로 선택될 수 있는, 방법.

항목 29. 제22항목 내지 제28항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 이종 단백질이 치료학적 단백질, 항체 또는 이의 치료학적 유효 단편인, 방법.

항목 30. 제29항목에 있어서, 상기 항체가 단클론 항체 또는 이의 단편 또는 이중 특이적 항체인, 방법.

항목 31. 제22항목 내지 제30항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 유효량의 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체가 세포 배양 동안 일정하게 유지되는, 방법.

항목 32. 제22항목 내지 제31항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 배양 배지가 무혈청 관류 배지인, 방법.

항목 33. 제32항목에 있어서, 상기 배양 배지가 임의로 (a) 화학적으로 제한되거나, (b) 가수 분해물을 함유하지 않거나, (c) 단백질을 함유하지 않지만 임의로 인슐린 및/또는 인슐린 유사 성장 인자를 포함하는, 방법.

항목 34. 제22항목 내지 제33항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 세포 배양에 의해 생산된 이종 단백질의 총 생산이 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체를 포함하지 않는 대조군 세포 배양에서의 총 생산의 수준에 비해 적어도 5~50% 증가하는, 방법.

항목 35. 제22항목 내지 제34항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 세포 배양의 세포 비생산성 (pg/세포/일)이 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체를 포함하지 않는 대조군 세포 배양에서의 세포 비생산성에 비해 적어도 5~50% 증가하는, 방법.

항목 36. 제22항목 내지 제35항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 생존 세포 밀도가 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체를 포함하지 않는 대조군 세포 배양에 비해 적어도 5~50% 감소하는, 방법.

항목 37. 제22항목 내지 제36항목 중 어느 한 항목에 있어서, 2일째의 상기 세포 배양이 관류 세포 배양으로 변경되는, 방법.

항목 38. 제27항목 또는 제37항목에 있어서, 상기 관류 속도가 관류 시작 후에 증가하는, 방법.

항목 39. 제38항목에 있어서, 상기 관류 속도가 0.5 용기 부피/일 이하에서 5 용기 부피/일로 증가하는, 방법.

항목 40. 제38항목에 있어서, 상기 관류 속도가 0.5 용기 부피/일 이하에서 2 용기 부피/일로 증가하는, 방법.

항목 41. 제22항목 내지 제40항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 세포 배양물로부터 상기 이종 단백질을 연속 방식으로 수확하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

항목 42. 제22항목 내지 제41항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 유도체가 10×10⁶ 세포/ml 내지 약 120×10⁶ 세포/ml의 세포 밀도에 도달하면 상기 세포 배지에 첨가되는, 방법.

항목 43. 500~2000 μM 리놀레산, 100~600 μM 아라키돈산, 0.0001~100 μM 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체를 포함하는 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물을 포함하는 관류 세포 배양 배지.

항목 44. 제43항목에 있어서, 100~300 μM 농도의 아라키돈산 및 500~1800 μM 농도의 리놀레산을 포함하는, 관류 세포 배양 배지.

항목 45. 제43항목 또는 제44항목에 있어서, 500~1800 μM 농도의 리놀레산 또는 이의 유도체 또는 100~150 μM 농도의 아라키돈산 또는 이의 유도체와 조합하여 0.0001~0.0009 μM 농도의 프로스타글란딘 E2 또는 이의 유도체를 포함하는, 관류 세포 배양 배지.

항목 46. 제43항목 내지 제45항목 중 어느 한 항목에 있어서, 500~2000 μM 농도의 리놀레산 또는 이의 유도체, 100~300 μM 농도의 아라키돈산 또는 이의 유도체 및 0.0001~0.0009 μM 농도의 프로스타글란딘 E2 또는 이의 유도체를 포함하는, 관류 세포 배양 배지.

항목 47. 제43항목 내지 제46항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 배양 배지가 무혈청 관류 배지인, 관류 세포 배양 배지.

항목 48. 제43항목 내지 제47항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 배양 배지가 임의로 (a) 화학적으로 제한되거나, (b) 가수 분해물을 함유하지 않거나, (c) 단백질을 함유하지 않지만 임의로 인슐린 및/또는 인슐린 유사 성장 인자를 포함하는, 관류 세포 배양 배지.

항목 49. 포유 동물 세포를 관류 배양으로 배양시키기 위한, 제43항목 내지 제48항목 중 어느 한 항목의 관류 세포 배양 배지의 용도.

항목 50. 상기 배양의 성장을 억제하고 생산성을 증가시키기 위한, 제43항목 내지 제48항목 중 어느 한 항목의 관류 세포 배양 배지의 용도.

항목 51. 제50항목에 있어서, 상기 세포 배양에 의해 생산된 이종 단백질의 총 생산이 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체를 포함하지 않는 대조군 세포 배양에서의 총 생산의 수준에 비해 적어도 5~50% 증가하는, 용도.

항목 52. 제50항목 또는 제51항목에 있어서, 상기 세포 배양의 세포 비생산성 (pg/세포/일)이 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체를 포함하지 않는 대조군 세포 배양에서의 세포 비생산성에 비해 적어도 5~50% 증가하는, 용도.

항목 53. 제50항목 내지 제52항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 성장 억제가 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체를 포함하지 않는 대조군 세포 배양에 비해 적어도 5~50% 낮은 생존 세포 밀도를 갖기에 충분한, 용도.

Claims (16)

1. 유효량의 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물을 포함하는 배양 배지에서 상기 포유 동물 세포를 배양시키는 단계를 포함하는, 세포 배양에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키는 방법으로서, 상기 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물이 500~2000 μM 리놀레산, 100~600 μM 아라키돈산, 0.0001~100 μM 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체를 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 배양 배지가 적어도 2개의 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체를 포함하고, 바람직하게는
   (a) 상기 배양 배지가 100~300 μM 농도의 아라키돈산 및 500~1800 μM 농도의 리놀레산을 포함하거나,
   (b) 상기 배양 배지가 500~1800 μM 농도의 리놀레산 또는 100~150 μM 농도의 아라키돈산과 조합하여 0.0001~0.0009 μM 농도의 프로스타글란딘 E2를 포함하는, 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배양 배지가 3개의 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체를 포함하는, 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양이 회분식, 유가식 또는 관류 세포 배양이고, 바람직하게는 2일째의 세포 배양이 관류 세포 배양으로 변경되고, 보다 바람직하게는 관류 속도가 관류 시작 후에 증가하고, 보다 더 바람직하게는 상기 관류 속도가 0.5 용기 부피/일 이하에서 5 용기 부피/일로, 또는 0.5 용기 부피/일 이하에서 2 용기 부피/일로 증가하는, 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유 동물 세포가 중국 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary: CHO) 세포, 저캇 세포 (Jurkat cell), 293 세포, HeLa 세포, CV-1 세포 또는 3T3 세포, 또는 이들 세포 중 임의의 세포의 유도체를 포함하고, 여기서, 상기 CHO 세포가 CHO-DG44 세포, CHO-K1 세포, CHO DXB11 세포, CHO-S 세포 및 CHO GS 결핍 세포 또는 이의 돌연변이체로 이루어진 그룹으로부터 추가로 선택될 수 있는, 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 단백질이 치료학적 단백질, 항체 또는 이의 치료학적 유효 단편이고, 여기서, 바람직하게는 상기 항체가 단클론 항체 또는 이의 단편 또는 이중 특이적 항체인, 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 조합물이 성장 억제 및/또는 생산성 증가를 초래하고, 바람직하게는
   (a) 상기 세포 배양에 의해 생산된 이종 단백질의 총 생산이 상기 지질 또는 지질 대사 산물을 포함하지 않는 대조군 세포 배양에서의 총 생산의 수준에 비해 적어도 5~50% 증가하고/하거나,
   (b) 상기 세포 배양의 세포 비생산성 (pg/세포/일)이 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체를 포함하지 않는 대조군 세포 배양에서의 세포 비생산성에 비해 적어도 5~50% 증가하고/하거나,
   (c) 세포 성장이 상기 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체를 포함하지 않는 대조군 세포 배양에 비해 적어도 5~50% 낮은 생존 세포 밀도를 갖는 정상 상태로 상기 세포를 유지하기에 충분한 수준으로 억제되는, 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지가 무혈청 관류 배지이고, 바람직하게는 상기 배양 배지가 임의로 (a) 화학적으로 제한되거나, (b) 가수 분해물을 함유하지 않거나, (c) 단백질을 함유하지 않지만 임의로 인슐린 및/또는 인슐린 유사 성장 인자를 포함하는, 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물로부터 상기 이종 단백질을 수확하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 유도체가 10×10⁶ 세포/ml 내지 약 120×10⁶ 세포/ml의 세포 밀도에 도달하면 상기 세포 배지에 첨가되는, 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 치료학적 단백질을 생산하는 방법.
12. 하기 단계들을 포함하는, 세포 배양으로부터 치료학적 단백질을 생산하는 방법:
    (a) 유효량의 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물을 포함하는 배양 배지에서 이종 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 배양시키되, 여기서, 상기 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물이 500~2000 μM 리놀레산, 100~600 μM 아라키돈산, 0.0001~100 μM 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체를 포함하는 단계,
    (b) 상기 세포 배양물로부터 상기 이종 단백질을 수확하는 단계.
13. 제12항에 있어서,
    (a) 상기 유효량의 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체가 세포 배양 동안 일정하게 유지되거나,
    (b) 상기 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물, 또는 이들의 유도체가 10×10⁶ 세포/ml 내지 약 120×10⁶ 세포/ml의 세포 밀도에 도달하면 상기 세포 배지에 첨가되는, 방법.
14. 500~2000 μM 리놀레산, 100~600 μM 아라키돈산, 0.0001~100 μM 프로스타글란딘 E2, 또는 이들의 유도체 및/또는 전구체를 포함하는 하나 이상의 지질 또는 지질 대사 산물을 포함하는 관류 세포 배양 배지.
15. 포유 동물 세포를 관류 배양으로 배양시키기 위한, 제14항의 관류 세포 배양 배지의 용도.
16. 상기 배양의 성장을 억제하고 생산성을 증가시키기 위한, 제14항의 관류 세포 배양 배지의 용도.

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