KR102604988B1 - 관류 배지 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 칼륨 농도를 증가시켜 칼륨에 대한 나트륨의 몰비를 감소시킴으로써 낭비되는 세포 배출을 감소시켜 단백질 생산을 증가시키는 것을 포함하는, 이종성 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 관류 세포 배양으로 배양하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 높은 칼륨 이온 농도 및 칼륨에 대한 나트륨의 낮은 몰비를 포함하는 무혈청 관류 배지에 관한 것이고, 생산 단계 동안 관류 배양에서 세포를 배양하는데 사용하거나 또는 생산 단계 동안 세포 배출 부피를 감소시키기 위한 상기 배지의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 칼륨 농도를 증가시켜 칼륨에 대한 나트륨의 몰비를 감소시킴으로써 낭비되는 세포 배출(cell bleed)을 감소시켜 단백질 생산을 증가시키는 것을 포함하는, 이종성 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 관류 세포 배양으로 배양하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 높은 칼륨 이온 농도 및 칼륨에 대한 나트륨의 낮은 몰비를 포함하는 무혈청 관류 배지에 관한 것이고, 생산 단계 동안 관류 배양에서 세포를 배양하는데 사용하거나 또는 생산 단계 동안 세포 배출 부피를 감소시키기 위한 상기 배지의 용도에 관한 것이다.
포유동물 세포 배양을 사용한 재조합 단백질의 생산을 위한 상업적 공정에서는 일반적으로 회분식 배양, 유가식 배양 및 관류 배양의 3가지 방법이 이용된다.
관류 기반 배양법은 새로운 배지를 첨가함과 동시에 소비된 배지를 제거함으로써 회분식 및 유가식 배양법에 비해 개선 가능성을 제공한다. 대규모의 상업적 세포 배양 전략은 60~90×106 개의 세포/mL의 높은 세포 밀도에 도달할 수 있으며, 이 경우 반응기 부피의 약 1/3 내지 절반 이상은 바이오매스일 수 있다. 관류 기반 배양법을 사용하여, > 1×108 개의 세포/mL의 극한의 세포 밀도가 달성되었다. 전형적인 관류 배양은, 급속한 초기 세포 증식 및 바이오매스 축적이 이루어지도록 하기 위해 하루 이상 동안 지속되는 회분식 배양 개시 단계로 시작한 후, 상기 배양에 대한 새로운 관류 배지의 연속적, 단계적 및/또는 간헐적 첨가 단계, 및 상기 배양의 증식 및 생산 단계를 수행하는 동안 세포를 보유함과 동시에 소비된 배지의 제거 단계로 이어진다. 침강, 원심 분리 또는 여과와 같은 다양한 방법들을 사용하여 세포를 유지하면서 소비된 배지를 제거할 수 있다. 하루에 적게는 작업 부피(working volume)의 몇분의 일에서부터 많게는 하루에 몇배수의 작업 부피까지를 관류 유속으로 사용하였다.
생물제제의 제조를 위한 연속적인 가공처리는 통상적인 유가식 배양에 비해 이점이 다수 있지만, 여전히 어려운 과제들이 많이 남아 있다. 배지의 개선으로 더 높은 생존 세포 밀도(viable cell density: VCD)를 달성하였던 결과, 관류식 방법에서 더 높은 역가를 유도할 수 있었다. 그러나, 이렇게 증가된 세포 밀도를 지속시킬 수가 없기 때문에, 생존율 손실 및 관류 실행의 단축을 초래할 수 있다. 장기간의 관류 배양, 특히 더 많은 영양분이 필요한 세포 밀도가 높은 배양물을 지원하기 위해서는 수차례의 배지 준비, 사용, 보관 및 폐기가 이루어지는 것이 필요한데, 이 모든 것들은 회분식 및 유가식 방법에 비해 생산 비용을 훨씬 높이게 된다.
칼륨 및 나트륨 이온 농도는 배양물 중의 세포에 있어서 중요한 환경적 요소이다. 내부 이온 농도는 세포에 의해 놀랄만할 정도로 일정하게 유지되며, 칼륨 및 나트륨은 주로 세포막을 가로지르는 막전위의 원인이 된다. 일반적으로 생체 내에서 세포내 나트륨 및 칼륨 이온의 농도는 각각 약 12 mM 및 139 mM이고, 생체 내에서 세포 외부의 일반적인 나트륨 및 칼륨 이온 농도는 각각 약 145 mM 및 4 mM이다. 1970년대 초에, 높은 칼륨 농도가 세포 증식에 억제 효과를 나타낼 수 있음이 처음으로 관측되었으나, 이는 아직까지 관류 세포 배양을 개선하는데 성공적으로 사용되지 못했다.
오르(Orr) 등 (Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1972) 69(1): 243-247)은, 114 mM의 칼륨 농도 (Na+/K+ = 0.53)가 12% 송아지 혈청을 함유하는 햄(Ham)의 F12 배지 또는 나트륨이 칼륨으로 대체된 동일한 배지를 사용한 단층 BHK 세포에서의 세포 증식을 억제한다는 사실을 개시하였다. 36 내지 72 mM의 칼륨 농도는 실제로 세포 밀도를 증가시켰다. 칼륨 농도가 128 mM보다 높은 배양물 중에서는, 세포들이 곧바로 응집되었으며, 플레이트로부터 분리되어 사멸하였다. 114 mM로 처리된 세포에 대해서도 형태학적 변화가 보고되었다. 상기 문헌은 증가된 칼륨 농도가 관류 세포 배양에서 세포 배출을 조절하거나 생산성을 향상시키는데 유리할 것이라는 점에 대하여 시사하는 바가 없다.
JP H01247097A호는 무혈청 배지에서 30 mM의 염화칼륨을 사용하여 하이브리도마 세포 관류 배양물을 처리한 결과, 항체 생산 (역가 및 세포 특이적 생산성)이 증가함과 동시에 세포 증식율과 세포 생존율이 감소되었음을 개시하고 있다. 따라서, 염화칼륨 농도를 증가시키면 생존율을 감소시킬 것으로 보인다. 또한, 단백질 생산 증가도 생존율 감소와 연관성이 있는 것으로 보인다.
WO 2011/134920호는 유가식 배양을 위한 10:1 내지 1:1의 나트륨 대 칼륨의 몰비 및 약 8 내지 약 12 mM의 칼륨 농도를 포함하는 CHO 세포를 위한 화학적으로 규명된 조성을 갖는 세포 배양 배지를 개시하고 있다.
사토(Sato) 등 (Cytotechnology (1989) 2: 63-67)은, 무혈청 배지 중에서 상승된 칼륨 및 인산나트륨 농도가 하이브리도마 세포에서 단일클론성 항체 생성을 자극한다는 것을 개시하고 있다. 그러나, KCl은 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 또한, 상기 문헌에서는 30 mM의 인산칼륨 농도는 특히 연속 배양에 있어서 생존율을 심각하게 감소시켰음도 개시하고 있다. 또한, 나트륨 농도를 증가시키는 것이 나트륨을 칼륨으로 대체하는 것보다 생산성을 더 증가시킨다는 점에 대해서도 교시하고 있다.
스즈키 (Suzuki) 등 (Biotechnol. Prog. (1990) 6(3): 231-236)은, 회분식 배양으로 무혈청 RPMI 1640에서 10 내지 100 mM의 아세트산 칼륨을 이용한 하이브리도마 세포 배양물의 처리가 증식속도에 따른 항체 생성을 유도하였음을 개시하고 있다. 그러나, 이러한 상관 관계는 비교적 높은 증식속도에서만 적용되었고 생존율은 58%까지 감소하여, 아세트산나트륨이 장기간의 관류 배양에는 적합하지 않을 것임을 시사하고 있다.
퐁(Fong) 등 (Cytotechnology (1997) 24: 47-54)은, 약 10 mM 농도의 아세트산칼륨이 관류 배양에서 세포 밀도를 유지하거나 약간만 증가시키면서 하이브리도마 세포에서 항체 생성을 증대시킨다는 것을 개시하고 있다. 그러나, 상기 관류 배양은 아세트산칼륨의 존재하에 고작 4일 미만 동안만 유지되었으며, 생존율 데이터도 개시되어 있지 않다. 또한, 상기 관찰된 결과는 삼투압 또는 아세테이트의 증가가 원인이었을 수도 있었을 것이다. 사용된 배지는 >100 mM의 나트륨을 포함하는 10% 혈청을 갖는 RPMI 1640 배지였기 때문에, 상기 배양물은 무혈청 배양물은 아니었으며 칼륨에 비해 몰과량의 나트륨으로 수행되었다.
윤(Yoon) 등 (Biotechnology and Bioprocess Engineering (2007), 12: 399-403)은, 높은 칼륨 이온 농도 (≥60 mM)가 무혈청 배양 배지를 사용하는 반복된 회분식 방법에 있어서 CHO 세포에서 단백질 생산을 증가시키고 세포 증식을 억제한다는 것에 대해 개시하고 있다. 40 mM까지의 칼륨 농도는 세포 증식에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 보고되었으며, 60 mM 이상의 농도는 세포 생존율에 영향을 미쳤던 것으로 나타났다. 상기 문헌도 나트륨 농도에 대해서는 아무런 교시가 없다.
칼륨과 나트륨은 모든 세포 배양 배지 중에 존재하고 있어, 이들의 농도를 변경하는 것이 안전성과 클리어런스에 관한 우려가 없기 때문에 다른 첨가제를 도입하는 것에 비해 유리하다. 또한, 배양 배지를 개발하는 경우에, 배지를 가능한 한 단순하게 유지하여 필수 화합물로 제한하는 것이 바람직하다. 이로써 불필요한 화합물을 피하고 삼투질 농도와 관련된 문제를 줄일 수 있다. 배양 배지가 계속 변화되고 개선되고는 있지만, 폐기물을 감소시키고 생산성을 증가시켜 관류 배양을 개선할 필요성은 여전히 존재한다.
낭비되는 세포 배출은 지속가능한 VCD를 유지하여 생존율을 보전하는데 이용될 수 있다. 연속 공정에서, 대부분의 배양 배지 및 이로 인한 생성물은, 생물반응기 내 일정하고 지속가능한 생존 세포 밀도를 유지하기 위해서 증식하고 있는 세포 및 배지를 흡입하여 제거하는 세포 "배출(bleed)"로 인해 손실된다. 세포 배출로 인해 수확가능한 물질의 1/3까지 손실될 수 있다. 따라서, 세포 배출을 사용하면 세포 배출물 내의 생성물이 수확되지 않기 때문에, 1회의 작업 실행에 따른 생성물 수율이 감소된다. 따라서, 세포 배출 부피를 감소시켜 수확을 위한 상청액을 더 많이 보유하기 위해, 일단 목적하는 생존 세포 밀도가 생산 단계에서 달성되면, 생존율 또는 단백질의 비생산성(specific productivity)에 영향을 주지 않으면서 세포 증식을 억제하는 것이 유리하다. 세포 배출을 감소시키거나 근절시키게 되면, 단백질 생산은 통상적인 관류 방법에 비해 증대된다. 따라서, 일단 최적의 VCD가 수득되면 세포 증식을 억제하고, 이에 따라 1회의 관류작업 실행당 회수되는 생성물을 증가시키기 위해 세포 배출을 최소화시키는 동시에, 세포의 비생산성을 증가시켜 관류 공정을 가동시키기 위한 보다 효율적인 방법을 개발할 필요가 있다.
본 발명에서는 1 미만의 Na:K 비율 및 >30 mM의 칼륨 농도로 나트륨과 칼륨을 포함하는 관류 배양 배지 및 상기 배지를 사용하여 포유동물 세포를 배양하는 방법이 제공된다. 상기 배지는 생존율에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 증식을 억제하여 세포의 비생산성 (qp)을 증가시키는 것으로 나타났다. 특히, 높은 칼륨 농도는 세포 증식의 정지를 유발시켰으며, 낮은 나트륨 농도는 관류 세포 배양에서 중국 햄스터 난소 (CHO)의 세포 비생산성을 증가시켰다. 세포 증식을 억제하고, 이에 따라 세포 배출을 최소화시킴으로써, 1회의 관류작업 실행당 회수되는 생성물을 크게 증가시켜, 관류 공정을 가동시키기 위한 보다 효율적인 방법을 제공한다. 이 방법은 세포 비생산성에 대한 긍정적인 효과로 인해 더욱 개선된다.
한 양태에서, 이종성 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 관류 세포 배양으로 배양하는 방법으로서, (a) 이종성 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 무혈청 배양 배지 중에 접종하는 단계; (b) 상기 포유동물 세포를 무혈청 관류 배지를 사용한 관류에 의해 증식 단계 동안 배양하는 단계; 및 (c) 30 mM 내지 250 mM의 농도 및 1 미만의 칼륨 이온에 대한 나트륨 이온의 몰비로 칼륨 이온을 포함하는 무혈청 관류 배지를 사용한 관류에 의해 생산 단계 동안 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 이때 단계 (b)는 선택적인 것인, 방법이 제공된다.
한 관련 양태에서, 이종성 단백질을 발현시키는 관류 세포 배양에서 세포 배출을 감소시키는 방법으로서, (a) 이종성 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 무혈청 배양 배지 중에 접종하는 단계; (b) 상기 포유동물 세포를 무혈청 관류 배지를 사용한 관류에 의해 증식 단계 동안 배양하는 단계; 및 (c) 30 mM 내지 250 mM의 농도 및 1 미만의 칼륨 이온에 대한 나트륨 이온의 몰비로 칼륨 이온을 포함하는 무혈청 관류 배지를 사용한 관류에 의해 생산 단계 동안 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 이때 단계 (b)는 선택적인 것인, 방법이 제공된다.
또 다른 관련 양태에서, 이종성 단백질을 발현시키는 관류 세포 배양에서 단백질 생산을 증가시키는 방법으로서, (a) 이종성 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 무혈청 배양 배지 중에 접종하는 단계; (b) 상기 포유동물 세포를 무혈청 관류 배지를 사용한 관류에 의해 증식 단계 동안 배양하는 단계; 및 (c) 30 mM 내지 250 mM의 농도 및 1 미만의 칼륨 이온에 대한 나트륨 이온의 몰비로 칼륨 이온을 포함하는 무혈청 관류 배지를 사용한 관류에 의해 생산 단계 동안 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 이때 단계 (b)는 선택적인 것인, 방법이 제공된다.
단계 (c)는 목표한 세포 밀도가 달성되면 개시한다. 따라서, 상기 단계는 10×106 개의 세포/ml 내지 약 120×106 개의 세포/ml 또는 그 이상의 세포 밀도에서 개시할 수 있다. 바람직하게는, 단계 (c)는 적어도 10×106 개의 세포/ml, 적어도 20×106 개의 세포/ml, 적어도 30×106 개의 세포/ml, 적어도 40×106 개의 세포/ml 또는 적어도 50×106 개의 세포/ml의 세포 밀도에서 개시한다. 가장 바람직하게는, 단계 (c)는 약 30 내지 약 50×106 개의 세포/ml의 세포 밀도에서 개시한다.
본 발명의 방법의 단계 (c)는 세포 배출에 의해 세포 밀도를 유지하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하면, 30 mM 미만의 농도 및 2 이상의 칼륨에 대한 나트륨의 몰비로 칼륨 이온을 포함하는 동일한 무혈청 관류 배지를 사용하여 동일한 조건 하에 배양되는 관류 세포 배양에 비해, 세포 배출이 감소된다.
본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 칼륨 이온의 농도는 약 40 mM 내지 약 200 mM, 바람직하게는 약 60 mM 내지 약 150 mM, 보다 바람직하게는 약 80 mM 내지 약 100 mM이다. 일부 실시양태에서, 칼륨에 대한 나트륨의 몰비는 약 0.9 내지 0.1, 약 0.8 내지 0.2, 약 0.7 내지 0.2, 바람직하게는 약 0.6 내지 0.3, 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 0.4이다.
본 발명에 따르면, 칼륨 이온은 하나 이상의 칼륨염으로 제공된다. 한 바람직한 실시양태에서, 상기 하나 이상의 칼륨염은 중탄산칼륨, 염화칼륨, 수산화칼륨, L-티로신 이칼륨염, 제2인산칼륨(potassium phosphate dibasic), 제1인산칼륨(potassium phosphate monobasic), 아셀렌산칼륨, 피루브산칼륨, 글루타티온칼륨, D-글루콘산칼륨, 숙신산칼륨 및 아스코르브산칼륨으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 하나 이상의 칼륨염은 무혈청 관류 배양 배지 내의 상응하는 나트륨염을 대체한다. 보다 구체적으로, 상기 하나 이상의 칼륨염은 바람직하게는 단계 (b)의 무혈청 관류 배지 내의 상응하는 나트륨염을 대체한다.
무혈청 관류 배지의 삼투 몰농도는 300 내지 1400 mOsmol/kg, 바람직하게는 300 내지 500 mOsmol/kg, 보다 바람직하게는 330 내지 450 mOsmol/kg, 보다 더 바람직하게는 360 내지 390 mOsmol/kg의 범위이어야 한다.
포유동물 세포는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 바람직하게는 CHO-DG44 세포, CHO-K1 세포, CHO DXB11 세포, CHO-S 세포, CHO GS 결핍성 세포 또는 임의의 상기 세포들의 유도체일 수 있다.
상기 무혈청 관류 배지는 화학적으로 규명된 조성을 갖고/갖거나 가수분해물을 함유하지 않을 수 있다. 바람직하게는, 상기 무혈청 관류 배지는 단백질을 함유하지 않거나, 또는 재조합 인슐린 및/또는 인슐린 유사 성장 인자를 제외하고는 단백질을 함유하지 않으며, 보다 바람직하게는 상기 무혈청 관류 배지는 화학적으로 규명된 조성을 가지면서, 단백질을 함유하지 않거나, 또는 재조합 인슐린 및/또는 인슐린 유사 성장 인자를 제외하고는 단백질을 함유하지 않는다.
추가의 양태에서, 치료용 단백질을 정제하여 약학적으로 허용가능한 조성물로 제제화하는 추가의 단계를 임의로 포함하는, 본 발명의 방법을 사용하여 치료용 단백질을 제조하는 방법이 제공된다.
또 다른 양태에서, 30 mM 내지 250 mM 농도 및 1 미만의 칼륨 이온에 대한 나트륨 이온의 몰비로 칼륨 이온을 포함하는 무혈청 관류 배지가 제공된다. 일부 실시양태에서, 칼륨 이온의 농도는 약 40 mM 내지 약 200 mM, 바람직하게는 약 60 mM 내지 약 150 mM, 보다 바람직하게는 약 80 mM 내지 약 100 mM이다. 일부 실시양태에서, 칼륨에 대한 나트륨의 몰비는 약 0.9 내지 0.1, 약 0.8 내지 0.2, 약 0.7 내지 0.2, 바람직하게는 약 0.6 내지 0.3, 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 0.4이다.
본 발명에 따르면, 칼륨 이온은 하나 이상의 칼륨염으로 제공된다. 한 바람직한 실시양태에서, 상기 하나 이상의 칼륨염은 중탄산칼륨, 염화칼륨, 수산화칼륨, L-티로신 이칼륨염, 제2인산칼륨, 제1인산칼륨, 아셀렌산칼륨, 피루브산칼륨, 글루타티온칼륨, D-글루콘산칼륨, 숙신산칼륨 및 아스코르브산칼륨으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 하나 이상의 칼륨염은 무혈청 관류 배양 배지 내의 상응하는 나트륨염을 대체한다.
무혈청 관류 배지의 삼투 몰농도는 300 내지 1400 mOsmol/kg, 바람직하게는 300 내지 500 mOsmol/kg, 보다 바람직하게는 330 내지 450 mOsmol/kg, 보다 더 바람직하게는 360 내지 390 mOsmol/kg의 범위이어야 한다.
상기 무혈청 관류 배지는 화학적으로 규명된 조성을 갖고/갖거나 가수분해물을 함유하지 않을 수 있다. 바람직하게는, 상기 무혈청 관류 배지는 단백질을 함유하지 않거나, 또는 재조합 인슐린 및/또는 인슐린 유사 성장 인자를 제외하고는 단백질을 함유하지 않으며, 보다 바람직하게는 상기 무혈청 관류 배지는 화학적으로 규명된 조성을 가지면서, 단백질을 함유하지 않거나, 또는 재조합 인슐린 및/또는 인슐린 유사 성장 인자를 제외하고는 단백질을 함유하지 않는다.
또 다른 양태에서, 생산 단계 동안 포유동물 세포를 관류 배양으로 배양하거나, 또는 관류 배양에서 총 세포 배출 부피를 감소시키기 위한 본 발명의 무혈청 관류 배지의 용도가 제공된다. 다른 대안으로, 관류 세포 배양에서 단백질 생산을 증가시키기 위한 본 발명의 무혈청 관류 배지의 용도가 제공된다.
도 1: 총생산성에 대한 세포 배출의 효과. 아래와 같이 2개의 서로 다른 재순환 장치를 이용하여 3L의 유리 관류 생물반응기 중에서 2L의 작업 부피로 단일클론성 항체 mAb1을 생성하는 CHO 세포주를 배양하였다: ATF#1과 ATF#2는 ATF2 장치 [미국 매사추세츠주 월섬 소재의 레플리젠(Repligen) 제조]를 사용하여 복제하였으며, TFF 생물반응기는 원심분리 펌프 [스위스 취리히 소재의 레비트로닉스(Levitronix) 제조]를 사용하였다. 수확물 (투과물) 스트림 (회수된 생성물) 및 생물반응기 내용물 (반응기 역가)에 대하여 매일 역가를 측정하였고, 세포 배양 종료시(29일째)에 생산된 총 그램 (전체 생산량)과 배출 및 반응기에서 손실된 생성물을 계산하였다.
도 2: 심정(deep-well) 관류 모델에서 Na+/K+ 농도의 변화에 대한 세포 증식 및 생산성 반응. 반응의 정도는 대조군 조건인 Na = 78 mM, K = 37 mM (Na:K = 2)와의 차이에 대한 비율로 나타내는데, 여기서 0.4의 점수는 나타낸 Na+과 K+ 수준에서 예상되는 반응이 대조군 (Na:K = 2) 조건의 40%인 영역에 해당한다. 단일클론성 항체 mAb1을 생성하는 CHO 세포주에서 시험된 농도 범위에 대하여, 누적 비증식속도 (SGR) (도 2a) 및 누적 세포 비생산성 (qp) (도 2b)의 등고선 그래프가 도시되어 있다. 시험된 조건들에 대한 실제 데이터 지점들을 양 등고선 그래프 모두에 마커로 표시하였다. 세포 배양의 전체 시간에 대하여 대표적인 생존 세포 밀도 (VCD) 및 생존율 그래프를 각각 도 2c 및 도 2d에 도시하였다. 상기 생존 세포 밀도 (VCD)는 e5 세포/mL로 나타내었는데, 이는 "105 개의 세포/mL"에 대한 기술적인 표현이다. 시간이 경과함에 따라 생존 세포 밀도에서 서로 다른 조건들 간의 차이가 관찰되었던 반면에, 생존율은 총 7일간의 배양 동안 일관되게 높게 유지되었다 (>85%).
도 3: 심정 관류 모델에서 서로 다른 Na+/K+ 농도로 처리된 단일클론성 항체 mAb1을 생성하는 CHO 세포주의 세포 주기 분석. 프로피디움 요오다이드 염색과 FACS 분석을 사용하여 세포 주기 분석을 수행하였다. sub G0, G0/1, S 및 G2/M 단계의 세포 및 세포 응집체에 대한 막대 그래프를 패널 (A)에 나타냈으며, 시험된 농도비 Na:K = 2 (37 mM의 칼륨) 및 Na:K = 0.5 (76 mM의 칼륨)에 대한 G0/1:G2M 비율을 패널 (B)에 나타내었다. Na:K = 2에 대한 통계적 유의성을 측정하기 위해 양측 스튜던트 t-검정(Two tailed student’s t-test)을 수행하였다 (*p<0.05; **p<0.001).
도 4: 2L의 관류 반응기에서 Na+/K+ 농도의 변화에 대한 세포 증식 및 생산성 반응. 단일클론성 항체 mAb2를 생성하는 CHO-K1 세포주에 있어서, 도 4a에서는 일일 qp를, 도 4b에서는 일일 비증식속도 (SGR)를, 도 4c에서는 생존율을, 도 4d에서는 세포 배출 유속에 대한 예시적인 그래프를 나타내었다. 목표 세포 밀도가 달성될 때까지 생물반응기 배양용 세포를 동일한 관류 배지(9 Na+/K+) 중에서 증식시킨 후, Na:K = 0.5 배지 (~ 76 mM의 K)로 전환하거나(검은 사각형) 또는 Na:K = 9 배지 (12 mM의 K)에 잔류시켰다 (다이아몬드형). 화살표는 배지가 Na:K = 9 비율의 배지에서 더 낮은 Na:K = 0.5 비율의 배지로 전환된 시점 (10일째)을 나타낸다.
도 5: 22일째의 관류 배양에서, 2L의 관류 반응기에서 Na+/K+ 농도의 변화에 대한 세포 증식 및 생산성 반응. 목표 세포 밀도가 달성될 때까지 생물반응기 배양용 세포를 동일한 관류 배지(9 Na+/K+) 중에서 증식시킨 후, 0.5 Na:K 배지 (76 mM의 K)로 전환하거나 또는 9 Na:K 배지 (12 mM의 K)에 잔류시켰다. 단일클론성 항체 mAb1 (CHO-DG44 mAb1), mAb2 (CHO-K1 mAb2) 또는 mAb3 (CHO-K1 mAb3)을 발현하는 3개의 CHO 세포주에 대하여, 상기 서로 다른 두 배지 간의 누적 평균 qp 및 평균 비증식속도 (SGR)의 차이를 예시적인 그래프로 나타내었다. 평균 qp 및 평균 SGR은, 배지를 전환하기 전에 이들의 각 수치로 보정한 배지 전환 후의 평균 qp 및 SGR로 나타냈다 (즉, mAb1 및 mAb3에 대해서는 10-22일/0-10 및 mAb2에 대해서는 12-22일/0-12일). 통계적 유의성을 측정하기 위해 양측 스튜던트 t-검정을 수행하였다 (*p<0.05; **p<0.001).
도 2: 심정(deep-well) 관류 모델에서 Na+/K+ 농도의 변화에 대한 세포 증식 및 생산성 반응. 반응의 정도는 대조군 조건인 Na = 78 mM, K = 37 mM (Na:K = 2)와의 차이에 대한 비율로 나타내는데, 여기서 0.4의 점수는 나타낸 Na+과 K+ 수준에서 예상되는 반응이 대조군 (Na:K = 2) 조건의 40%인 영역에 해당한다. 단일클론성 항체 mAb1을 생성하는 CHO 세포주에서 시험된 농도 범위에 대하여, 누적 비증식속도 (SGR) (도 2a) 및 누적 세포 비생산성 (qp) (도 2b)의 등고선 그래프가 도시되어 있다. 시험된 조건들에 대한 실제 데이터 지점들을 양 등고선 그래프 모두에 마커로 표시하였다. 세포 배양의 전체 시간에 대하여 대표적인 생존 세포 밀도 (VCD) 및 생존율 그래프를 각각 도 2c 및 도 2d에 도시하였다. 상기 생존 세포 밀도 (VCD)는 e5 세포/mL로 나타내었는데, 이는 "105 개의 세포/mL"에 대한 기술적인 표현이다. 시간이 경과함에 따라 생존 세포 밀도에서 서로 다른 조건들 간의 차이가 관찰되었던 반면에, 생존율은 총 7일간의 배양 동안 일관되게 높게 유지되었다 (>85%).
도 3: 심정 관류 모델에서 서로 다른 Na+/K+ 농도로 처리된 단일클론성 항체 mAb1을 생성하는 CHO 세포주의 세포 주기 분석. 프로피디움 요오다이드 염색과 FACS 분석을 사용하여 세포 주기 분석을 수행하였다. sub G0, G0/1, S 및 G2/M 단계의 세포 및 세포 응집체에 대한 막대 그래프를 패널 (A)에 나타냈으며, 시험된 농도비 Na:K = 2 (37 mM의 칼륨) 및 Na:K = 0.5 (76 mM의 칼륨)에 대한 G0/1:G2M 비율을 패널 (B)에 나타내었다. Na:K = 2에 대한 통계적 유의성을 측정하기 위해 양측 스튜던트 t-검정(Two tailed student’s t-test)을 수행하였다 (*p<0.05; **p<0.001).
도 4: 2L의 관류 반응기에서 Na+/K+ 농도의 변화에 대한 세포 증식 및 생산성 반응. 단일클론성 항체 mAb2를 생성하는 CHO-K1 세포주에 있어서, 도 4a에서는 일일 qp를, 도 4b에서는 일일 비증식속도 (SGR)를, 도 4c에서는 생존율을, 도 4d에서는 세포 배출 유속에 대한 예시적인 그래프를 나타내었다. 목표 세포 밀도가 달성될 때까지 생물반응기 배양용 세포를 동일한 관류 배지(9 Na+/K+) 중에서 증식시킨 후, Na:K = 0.5 배지 (~ 76 mM의 K)로 전환하거나(검은 사각형) 또는 Na:K = 9 배지 (12 mM의 K)에 잔류시켰다 (다이아몬드형). 화살표는 배지가 Na:K = 9 비율의 배지에서 더 낮은 Na:K = 0.5 비율의 배지로 전환된 시점 (10일째)을 나타낸다.
도 5: 22일째의 관류 배양에서, 2L의 관류 반응기에서 Na+/K+ 농도의 변화에 대한 세포 증식 및 생산성 반응. 목표 세포 밀도가 달성될 때까지 생물반응기 배양용 세포를 동일한 관류 배지(9 Na+/K+) 중에서 증식시킨 후, 0.5 Na:K 배지 (76 mM의 K)로 전환하거나 또는 9 Na:K 배지 (12 mM의 K)에 잔류시켰다. 단일클론성 항체 mAb1 (CHO-DG44 mAb1), mAb2 (CHO-K1 mAb2) 또는 mAb3 (CHO-K1 mAb3)을 발현하는 3개의 CHO 세포주에 대하여, 상기 서로 다른 두 배지 간의 누적 평균 qp 및 평균 비증식속도 (SGR)의 차이를 예시적인 그래프로 나타내었다. 평균 qp 및 평균 SGR은, 배지를 전환하기 전에 이들의 각 수치로 보정한 배지 전환 후의 평균 qp 및 SGR로 나타냈다 (즉, mAb1 및 mAb3에 대해서는 10-22일/0-10 및 mAb2에 대해서는 12-22일/0-12일). 통계적 유의성을 측정하기 위해 양측 스튜던트 t-검정을 수행하였다 (*p<0.05; **p<0.001).
일반적인 실시양태인 "~을 포함하는" 또는 "~으로 포함된"이라는 말은 보다 구체적인 실시양태인 "~로 이루어진"도 포함한다. 또한, 단수 및 복수 형태는 제한적인 방식으로는 사용되지 않는다. 본 출원에서 사용되는 단수 형태( "a", "an" 및 "the")는, 단수만을 나타내는 것으로 명백히 명시하지 않는 한, 단수와 복수 모두를 나타낸다.
본 출원에서 사용되는 "관류"라는 용어는, 세포를 반응기에서 보유시키는 동안에, 동일한 부피의 배지가 동시에 첨가하고 반응기로부터 제거함으로써 세포 배양 생물반응기를 유지하는 것을 지칭한다. 관류 배양은 연속 배양으로도 지칭될 수 있다. 상기 배양은 새로운 영양분을 일관되게 공급하고 세포 폐기물을 계속적으로 제거한다. 관류는 통상적인 생물반응기의 회분식 또는 유가식 조건에서보다 훨씬 더 높은 세포 밀도 및 이로 인해 보다 높은 부피 생산성을 달성하기 위해 일반적으로 사용된다. 분비된 단백질 생성물은, 예를 들어, 여과, 교호 접선 유동 (alternating tangential flow: ATF), 세포 침강, 초음파 분리, 하이드로사이클론, 또는 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되거나 콤팔라(Kompala)와 오즈투르크(Ozturk) (문헌 [Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies, (2006), Taylor & Francis Group, LLC, pages 387-416])에 의해 개시된 임의의 기타 방법에 의해, 반응기 중에서 세포를 보유하면서 연속적으로 수확될 수 있다. 포유동물 세포는 부유 배양으로 증식되거나 (균질 배양), 표면에 부착되거나 서로 다른 장치들에 포획될 수도 있다 (불균질 배양). 생물반응기에서 작업 부피를 일정하게 유지하기 위해서는, 수확 속도와 세포 배출 (유체 제거)은 사전에 결정된 관류 속도와 동일해야 한다. 상기 배양은 일반적으로 회분식 배양에 의해 개시되며, 관류는 접종후 2~3일째로서 영양분 제한을 두기 전 세포들이 여전히 기하급수적 증식 단계에 있을 때에 시작한다.
관류 기반 배양법은 새로운 배지를 첨가함과 동시에 소비된 배지를 제거함으로써 회분식 및 유가식 배양법에 비해 개선 가능성을 제공한다. 대규모의 상업적 세포 배양 전략은 60~90×106 개의 세포/mL의 높은 세포 밀도에 도달할 수 있으며, 이 경우 반응기 부피의 약 1/3 내지 절반 이상은 바이오매스일 수 있다. 관류 기반 배양법을 사용하여, > 1×108 개의 세포/mL의 극한의 세포 밀도가 달성되었다. 통상적인 관류 배양은, 1일 이상 동안 지속되는 회분식 배양 개시로 시작하여 급속한 초기 세포 증식 및 바이오매스 축적을 가능하게 한 후, 상기 배양에 새로운 공급 배지의 연속적, 단계적 및/또는 간헐적 첨가, 및 배양물의 증식 단계 및 생산 단계 동안에 세포를 보유하면서 소비된 배지를 동시에 제거한다. 침강, 원심 분리 또는 여과와 같은 다양한 방법들을 사용하여 세포를 유지하면서 소비된 배지를 제거할 수 있다. 하루에 적게는 작업 부피의 몇분의 일에서부터 많게는 하루에 몇배수의 작업 부피까지를 관류 유속으로 사용하였다.
본원에서 사용되는 "관류 속도"라는 용어는, 첨가 및 제거되는 부피이며, 일반적으로 하루마다 측정한다. 이눈 세포 밀도와 배지에 따라 다르다. 영양분 첨가 및 부산물 제거에 대한 적절한 속도를 담보할 수 있으면서도 관심대상인 생성물, 즉, 수확물 역가의 희석도를 감소시키는 것이 최소화되어야 한다. 관류는 일반적으로 접종후 2~3일째로서 세포들이 여전히 기하급수적 증식 단계에 있을 때에 시작하기 때문에, 관류 속도는 배양하는 동안에 증가될 수 있다. 관류 속도의 증가는 점진적이거나 연속적으로서, 즉, 세포 밀도 또는 영양분 소비에 기반하여 증가할 수 있다. 상기 관류 속도는 일반적으로 0.5 또는 1의 용기 부피/일 (vessel volume per day: VVD)로 시작하여, 약 5 VVD까지 증가할 수 있다. 바람직하게는, 관류 속도는 0.5 내지 2 VVD이다. 상기 증가는 0.5 내지 1 VVD일 수 있다. 관류의 연속적인 증가를 위해, 바이오매스 프로브를 수확 펌프와 접속시킴으로써, 목적하는 세포 비관류속도 (cell specific perfusion rate: CSPR)에 기반한 바이오매스 프로브에 의해 결정된 세포 밀도의 선형 함수로서 관류 속도를 증가시킬 수 있다. CSPR은 세포 밀도당 관류 속도와 같으며, 이상적인 CSPR은 세포주 및 세포 배지에 따라 다르다. 이상적인 CSPR은 최적의 증식 속도 및 생산성을 유발시켜야 한다. 1일당 50 내지 100 pL/세포의 CSPR은 특정 세포주에 대한 최적의 속도를 찾기 위해 조절될 수 있는 합리적인 시작 범위일 수 있다.
본원에서 사용되는 "정상 상태"라는 용어는, 세포 밀도 및 생물반응기 환경이 비교적 일정하게 유지되는 상태를 지칭한다. 상기 정상 상태는 세포 배출, 영양분 제한 및/또는 온도 저감에 의해 달성될 수 있다. 대부분의 관류 배양에서, 영양분 공급 및 폐기물 제거로 일정한 세포 증식 및 생산성의 달성이 가능하며, 세포 배출은 일정한 생존 세포 밀도를 유지하거나 세포를 정상 상태로 유지하기 위해 필요하다. 정상 상태에서의 일반적인 생존 세포 밀도는 20 내지 50e6 세포/ml이다. 상기 생존 세포 밀도는 관류 속도에 따라 달라질 수 있다. 보다 높은 세포 밀도는 관류 속도를 증가시키거나 관류에 사용하는 배지를 최적화함으로써 달성할 수 있다. 매우 높은 생존 세포 밀도에서는, 생물반응기 내에서 관류 배양을 제어하기가 어려워진다.
"세포 배출 (cell bleed 및 cell bleeding)"이라는 용어는 서로 교환하여 사용가능하고, 생물반응기 내에서 일정하고 지속가능한 생존 세포 밀도를 유지하기 위해 생물반응기로부터 세포 및 배지를 제거하는 것을 지칭한다. 상기 일정하고 지속가능한 생존 세포 밀도는 목표 세포 밀도로도 지칭될 수 있다. 이러한 세포 배출은 정해진 유량으로 침적관 및 연동 펌프를 사용하여 수행될 수 있다. 너무 협소한 관은 세포 응집 및 막힘이 쉬운 반면, 너무 넓으면 세포가 침전될 수 있으므로, 배관은 적절한 크기를 가져야 한다. 세포 배출은 증식 속도를 기반으로 하여 결정될 수 있으므로, 생존 세포 밀도는 연속적인 방식의 목적하는 부피로 제한될 수 있다. 대안으로, 세포는 특정 빈도, 예를 들어, 하루에 한 번 제거되고 배지로 대체되어 세포 밀도를 예측가능한 범위 내로 유지할 수 있다. 이상적으로는, 일정한 세포 밀도를 유지시키기 위해 세포 배출 속도를 증식 속도와 같게 한다.
일반적으로, 세포 배출로 제거된 관심대상 생성물은 폐기되므로, 수확에서는 손실된다. 투과물과는 반대로, 세포 배출물은 세포를 함유하고 있어서 정제 전 생성물의 보관을 더욱 어렵게 하고 생성물 품질에 유해한 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 세포는 보관 및 생성물 정제 전에 연속적으로 제거되어야 하는데, 이는 수고롭고 비용면에서 비효율적인 작업이다. 느리게 증식하는 세포의 경우, 세포 배출물은 제거된 유체의 약 10%일 수 있으며, 빠르게 증식하는 세포의 경우에는 세포 배출물이 제거된 유체의 약 30%일 수 있다. 따라서, 세포 배출을 통한 생성물 손실은 전체 생성된 생성물의 약 30%일 수 있다. 본원에서 사용되는 "투과물"이라는 말은, 세포가 배양 용기 중에 보유되도록 분리된 수확물을 지칭한다.
"배양"또는 "세포 배양"이라는 용어는 서로 교환하여 사용가능하며, 세포 군집의 생존 및/또는 증식이 가능한 적절한 조건 하의 배지 중에서 유지되는 세포 군집을 지칭한다. 본 발명은 포유동물 세포 배양에만 해당된다. 포유동물 세포는 현탁액 중에서 배양하거나 고체 지지체에 부착시킬 수 있다. 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 세포 배양은 세포 군집과 상기 군집이 현탁되는 배지를 포함하는 배합물을 지칭한다.
본원에서 사용되는 "배양"이라는 용어는, 제어된 조건 하 및 세포의 증식 및/또는 생존을 지원하는 조건 하에 포유동물 세포를 증식 또는 유지시키는 과정을 지칭한다. 본원에서 사용되는 "세포를 유지하는"이라는 용어는 "세포를 배양하는"이라는 말과 서로 교환하여 사용가능하다. 또한, 배양이라는 것은 배양 배지에 세포를 접종하는 단계를 지칭할 수도 있다.
본원에서 사용되는 "회분식 배양"이라는 용어는, 단시간 동안 고정된 부피의 배양 배지 중에서 세포를 증식시킨 후 완전히 수확하는 불연속적인 방법이다. 회분식 방법을 사용하여 증식된 배양물은, 최대 세포 밀도가 달성될 때까지는 세포 밀도가 증가하다가, 이후 배지 성분이 소비되어 대사 부산물 (예를 들어, 락테이트 및 암모니아)의 농도가 증가하기 때문에, 생존 세포 밀도는 감소된다. 수확은 일반적으로 최대 세포 밀도 (배지 조성물, 세포주 등에 따라 다르지만 통상 5~10×106 개의 세포/mL)가 달성되는 시점이나 그 직후로서, 보통 대략 3일 내지 7일에 이루어진다.
본원에서 사용되는 "유가식 배양"이라는 용어는, 소비된 배지 성분들을 보충하기 위해 볼루스 또는 연속 배지 공급물을 제공함으로써 회분식 공정을 개선한 것이다. 유가식 배양은 배양 공정 내내 추가의 영양분을 공급받기 때문에, 회분식 방법에 비해 더 높은 세포 밀도 (배지 조성물, 세포주 등에 따라 다르지만 >10~30×106 개의 세포/mL) 및 증가된 생성물 역가를 달성할 수 있다. 회분식 공정과 달리, 공급 전략 및 배지 조성물을 조정하여 목적하는 세포 밀도를 달성하기 위한 세포 증식 기간 (증식 단계)을 유예되거나 느린 세포 증식의 기간 (생산 단계)과 달리함으로써 2상 배양물을 만들어 유지할 수도 있다. 이와 같이, 유가식 배양은 회분식 배양에 비해 더 높은 생성물 역가를 달성할 수 있다. 회분식 방법과 마찬가지로, 대사 부산물의 축적은 시간 경과에 따라 세포 생존율을 감소시킬 것인데, 그 이유는 상기 부산물이 세포 배양 배지 내에 점진적으로 축적되어 생산 단계의 지속 시간을 약 1.5주 내지 3주로 제한하기 때문이다. 유가식 배양은 불연속적이라서, 수확은 일반적으로 대사 부산물의 농도 또는 배양물 생존율이 예정된 수준에 도달하는 경우에 이루어진다.
"폴리펩타이드" 또는 "단백질"이라는 용어는 본원에서 "아미노산 잔기 서열"과 서로 교환하여 사용가능하고, 아미노산의 중합체를 지칭한다. 이러한 용어들은 당화 (glycosylation), 아세틸화, 인산화 또는 단백질 가공을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 반응을 통해 번역후 변형된 단백질들도 포함한다. 변형 및 변화, 예를 들어, 다른 단백질에 대한 융합, 아미노산 서열 치환, 결실 또는 삽입은 폴리펩타이드의 구조에서 이루어질 수 있는 반면, 분자는 이의 생물학적 기능 활성을 유지한다. 예를 들어, 특정 아미노산 서열의 치환은 폴리펩타이드 또는 이의 근본이 되는 핵산 암호화 서열에서 행해질 수 있어, 동일한 특성을 갖는 단백질을 수득할 수 있다. 상기 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 유사체 또는 모방체인 아미노산 중합체에도 적용된다. "폴리펩타이드"라는 용어는 일반적으로는 10개 초과의 아미노산을 갖는 서열을 지칭하며, "펩타이드"라는 용어는 10개 이하의 아미노산 길이를 갖는 서열을 가리킨다.
본원에서 사용되는 "이종성 단백질"이라는 용어는 숙주 세포와 다른 유기체 또는 종에서 유래된 폴리펩타이드를 지칭한다. 이종성 단백질은 해당 단백질을 자연적으로 발현하지 않는 숙주 세포에 실험적으로 삽입되는 이종성 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된다. 이종성 폴리뉴클레오타이드는 이식유전자로도 지칭될 수 있다. 따라서, 이는 이종성 단백질을 암호화하는 유전자 또는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame:ORF)일 수 있다. 단백질과 관련하여 사용되는 경우에 "이종성"이라는 용어는, 해당 단백질이 자연에서 서로 동일한 관계 또는 동일한 길이로 발견되지 않는 아미노산 서열을 포함함을 의미할 수도 있다. 따라서, 이는 재조합 단백질도 망라한다. 또한, 이종성은 통상적으로 발견되지 않는 위치에서 포유동물 세포의 유전체에 삽입되는 폴리뉴클레오타이드 서열, 예컨대 유전자 또는 이식유전자 또는 이의 일부를 지칭할 수도 있다. 본 발명에서, 이종성 단백질은 치료용 단백질인 것이 바람직하다.
"배지", "세포 배양 배지" 및 "배양 배지"라는 용어는 본원에서 서로 교환하여 사용이 가능하며, 세포, 특히, 포유동물 세포에 영양분을 공급하는 영양액을 지칭한다. 세포 배양 배지 조성물은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 세포 배양 배지는 최소한의 증식 및/또는 생존을 위해 세포에 필요한 필수 및 비필수 아미노산, 비타민, 에너지원, 지질 및 미량원소 뿐만 아니라 완충제와 염도 제공한다. 배양 배지는, 증식 및/또는 생존을 최소 속도 이상으로 향상시키는 보충 성분들, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 호르몬 및/또는 기타 성장 인자, 특정 이온 (예컨대, 나트륨, 염화물, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충제, 비타민, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드, 미량원소 (보통 매우 낮은 최종 농도로 존재하는 무기 화합물), 아미노산, 지질 및/또는 글루코오스 또는 기타 에너지원을 포함할 수도 있다. 특정 실시양태에서, 배지는 세포 생존 및 증식에 최적인 pH와 염 농도로 제제화되는 것이 유리하다. 본 발명에 따른 배지는 세포 배양의 시작 후에 첨가되는 관류 배양 배지이다. 특정 실시양태에서, 세포 배양 배지는 출발 영양액 (기본 배지 또는 접종 배지)과 세포 배양의 시작 후에 첨가되는 임의의 배양 배지의 혼합물이다.
본원에서 사용되는 "무혈청"이라는 용어는 소 태아 혈청과 같은 동물 또는 사람 혈청을 함유하지 않는 세포 배양 배지를 지칭한다. 바람직하게는, 무혈청 배지는 임의의 동물 또는 사람 유래 혈청에서 분리된 단백질을 함유하지 않는다. 조성이 규명되어 있는 배양 배지를 비롯한 다양한 조직 배양 배지가 시판 중이며, 예를 들어, 하기의 세포 배양 배지들 중 임의의 하나 또는 조합이 사용될 수 있다: 특히, RPMI-1640 배지, RPMI-1641 배지, 둘베코의 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: DMEM), 최소 필수 배지 이글, F-12K 배지, 햄의 F12 배지, 이스코브의 변형 둘베코 배지, 맥코이의 5A 배지, 라이보비츠의 L-15 배지, 및 무혈청 배지, 예컨대, EX-CELL™ 300 시리즈 [미국 캔자스주 르넥사 소재의 JRH 바이오사이언시즈(JRH Biosciences)]. 이러한 배양 배지의 무혈청 버전도 이용가능하다. 세포 배양 배지는 배양하고자 하는 세포의 요건 및/또는 목적하는 세포 배양 파라미터에 따라 아미노산, 염, 당류, 비타민, 호르몬, 증식 인자, 완충제, 항생제, 지질, 미량원소 등과 같은 추가의 성분 또는 증가된 농도의 성분으로 보충될 수 있다.
본원에서 사용되는 "무단백"이라는 용어는 어떠한 단백질도 함유하지 않는 세포 배양 배지를 지칭한다. 따라서, 이는 포유동물, 세균, 곤충 또는 효모 세포에서 생산된 재조합 단백질과 같은 혈청 또는 재조합적으로 생산된 단백질로부터 유래되는, 동물 또는 사람으로부터 분리된 단백질이 결여되어 있다. 무단백 배지는 인슐린 또는 인슐린 유사 성장 인자와 같은 단일 재조합 단백질을 함유할 수 있지만, 이러한 첨가가 명시적으로 언급된 경우에만 가능하다.
본 출원에서 사용되는 "화학적으로 규명된 조성을 갖는(chemically defined)"이라는 용어는, 혈청이 없고, 효모, 식물 또는 동물로부터 유래된 단백질 가수분해산물과 같은 어떠한 가수분해산물도 함유하지 않는 배양 배지를 가리키는 것이다. 바람직하게는, 화학적으로 규명된 조성을 갖는 배지도 무단백이거나, 인슐린 또는 인슐린 유사 성장 인자와 같이 선택된 (동물 유래가 아닌) 재조합적으로 생산된 단백질만을 함유한다. 화학적으로 규명된 조성을 갖는 배지는 특성이 규명되어 정제된 물질들의 혼합물로 이루어진다. 화학적으로 규명된 조성을 갖는 배지의 예로는, 예를 들어, 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재의 인비트로겐(Invitrogen)의 CD-CHO 배지를 들 수 있다.
본원에서 사용되는 "부유성 세포" 또는 "비부착성 세포"라는 용어는, 액체 배지 중에서 현탁액으로 배양되는 세포에 관한 것이다. CHO 세포와 같은 접착성 세포는 현탁액 중에서 증식하도록 개조될 수 있고, 이로써 용기 또는 조직 배양 접시의 표면에 부착하는 능력을 상실할 수도 있다.
본원에서 사용되는 "생물반응기"라는 용어는 세포 배양물의 증식에 유용한 임의의 용기를 의미한다. 생물반응기는 세포의 배양에 유용하기만 하다면 임의의 크기일 수 있으며; 통상적으로, 생물반응기는 해당 반응기 내에서 증식하는 세포 배양물의 부피에 적절한 크기를 갖는다. 일반적으로, 생물반응기는 적어도 1 리터일 것이며, 2, 5, 10, 50, 100, 200, 250, 500, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 5,000, 8,000, 10,000, 12,000 리터 또는 그 이상, 또는 이들 사이의 임의의 부피일 수 있다. 생물반응기의 내부 조건, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, pH 및 온도는 배양 기간 동안 제어될 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자라면 관련 고려사항들에 기초하여 본 발명을 실시하는데 사용하기 적절한 생물반응기를 알아서 선택할 수 있을 것이다. 본 발명의 방법에서 사용된 세포 배양물은 관류 배양에 적합한 임의의 생물반응기 중에서 증식될 수 있다.
본원에서 사용되는 "세포 밀도"는 주어진 부피의 배양 배지 중의 세포의 수를 가리킨다. "생존 세포 밀도"는, 표준 생존율 검정 (예컨대, 트리판 블루 염료 배제법)으로 측정시, 주어진 부피의 배양 배지 중의 살아있는 세포의 수를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "세포 생존율"이라는 용어는 주어진 세트의 배양 조건 또는 실험적 변동 하의 배양물에서 생존하는 세포의 능력을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어들은 특정 시간에 배양물 중에서 생존하고 사멸하는 세포들의 총 수에 대한 해당 시간에 생존하고 있는 세포들의 일부를 지칭하기도 한다.
본원에서 사용되는 "역가"라는 용어는, 소정량의 배지 부피 중에서 세포 배양에 의해 생성된 관심대상 폴리펩타이드 또는 단백질 (자연발생되거나 재조합된 관심대상 단백질일 수 있음)의 총량을 의미한다. 역가는 배지 1 밀리리터 (또는 다른 부피 단위)당 밀리그램 또는 마이크로그램의 단위의 폴리펩타이드 또는 단백질로 나타낼 수 있다.
본원에서 사용되는 "수율"이라는 용어는 일정한 기간 동안에 관류 배양으로 생산된 이종성 단백질의 양을 가리킨다. "총 수율"은 전체 작업 실행기간 동안에 관류 배양으로 생성된 이종성 단백질의 양을 가리킨다.
본원에서 사용되는 "감소", "감소된" 또는 "감소하다"라는 용어는, 일반적으로 기준 수준과 비교했을 때 적어도 10% 감소, 예를 들어, 본 발명의 관류 배지에서 사용된 농도보다 낮은 칼륨 이온을 포함하는 동일한 무혈청 관류 배지를 사용하여 동일한 조건 하에 배양시킨 대조군 포유동물 세포 배양물과 비교했을 때 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%, 또는 100% 이하의 감소, 또는 10~100% 중 임의의 정수치만큼의 감소를 의미한다.
본 출원에서 사용되는 "향상", "향상된", "향상되다", "증가" 또는 "증가된"이라는 용어는, 일반적으로 대조군 세포와 비교했을 때 적어도 10% 증가, 예를 들어, 본 발명의 관류 배지에서 사용된 농도보다 낮은 칼륨 이온을 포함하는 동일한 무혈청 관류 배지를 사용하여 동일한 조건 하에 배양시킨 포유동물 세포 배양물과 비교했을 때 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 100%, 또는 적어도 약 200%, 또는 적어도 약 300%의 증가, 또는 10~300% 중 임의의 정수치만큼의 증가를 의미한다.
본원에서 사용된 "대조군 세포 배양물" 또는 "대조군 포유동물 세포 배양물"은, 해당 관류 배지가 본 발명의 관류 배지의 칼륨 농도를 갖지 않는다는 점, 바람직하게는 상기 대조군 관류 배지가 본 발명의 관류 배지의 칼륨 농도를 갖지 않으며 본 발명의 관류 배지의 Na:K 몰비를 갖지 않는다는 점을 제외하고는 비교되는 세포 배양물과 동일한 세포이다.
본원에서 사용되는 "포유동물 세포"라는 용어는 이종성 단백질, 바람직하게는 치료용 단백질, 보다 바람직하게는 분비된 재조합 치료용 단백질의 생산에 적합한 세포주이다. 본 발명에 따른 바람직한 포유동물 세포는 햄스터 세포와 같은 설치류 세포이다. 포유동물 세포는 분리된 세포 또는 세포주이다. 포유동물 세포는 바람직하게는 형질전환 및/또는 불멸화 세포주이다. 이들은 세포 배양에서 연속 계대배양에 적합하며, 형질전환되지 않은 1차 세포 또는 장기 구조의 일부인 세포들을 포함하지 않는다. 바람직한 포유동물 세포는 BHK21, BHK TK-, CHO, CHO-K1, CHO-S 세포, CHO-DXB11 (CHO-DUKX 또는 DuxB11로도 지칭함) 및 CHO-DG44 세포, 또는 임의의 이러한 세포주의 유도체/후대 개체이다. CHO-DG44, CHO-K1 및 BHK21이 특히 바람직하며, CHO-DG44 및 CHO-K1 세포가 보다 더 바람직하다. CHO-DG44 세포가 가장 바람직하다. 포유동물 세포, 특히, CHO-DG44 및 CHO-K1 세포의 글루타민 신타아제 (GS)-결핍성 유도체도 포함된다. 포유동물 세포는 이종성 단백질, 바람직하게는 재조합된 치료용 분비 단백질을 암호화하는 하나 이상의 발현 카세트(들)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 포유동물 세포는 쥐과의 골수종 세포, 예를 들어, NS0 및 Sp2/0 세포와 같은 쥐과의 세포, 또는 이러한 세포주 중 임의의 세포주의 유도체/후대 개체일 수도 있다. 그러나, 이러한 세포들의 유도체/후대 개체로서, 사람, 마우스, 랫트, 원숭이 및 설치류 세포주를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다른 포유동물 세포도 본 발명에서, 특히, 생물약제 단백질의 제조에 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 "증식 단계"라는 용어는, 세포가 기하급수적으로 증식하고 생물반응기 내의 생존 세포 밀도가 증가하는 세포 배양 단계를 가리킨다. 배양물 중의 세포는 일반적으로 표준 증식 패턴에 따라 증식한다. 배양물이 분주된 후의 제1 증식 단계는, 세포가 배양 환경에 적응하여 빠른 성장을 준비하는 느린 증식 기간에 해당하는 유도 단계이다. 유도 단계 이후에는 세포가 기하급수적으로 증식하고 증식 배지의 영양분을 소비하는 기간인 증식 단계 (대수기 또는 대수증식기로도 지칭함)가 이어진다. 생산 단계는 일단 목표한 세포 밀도가 달성되고/달성되거나 수확이 개시되면 시작된다. 통상적인 목표 세포 밀도는 10×106 개의 세포/ml 내지 약 120×106 개의 세포/ml의 범위이지만, 이보다 훨씬 더 클 수도 있다. 따라서, 본 발명에 따른 목표 세포 밀도는 적어도 10×106 개의 세포/ml, 적어도 20×106 개의 세포/ml, 적어도 30×106 개의 세포/ml, 적어도 40×106 개의 세포/ml 또는 적어도 50×106 개의 세포/ml이다. 가장 바람직하게는, 목표 세포 밀도는 약 30 내지 약 50×106 개의 세포/ml이다. 생존 세포 밀도는 관류 속도에 의존하여, 규칙적이거나 연속적인 세포 배출을 사용하여 일정한 수준으로 유지할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "성장 정지"라는 용어는, 즉, 세포 분열에서 개체 수의 증가가 정지된 세포들을 가리킨다. 세포 주기는 간기 및 유사분열기를 포함한다. 상기 간기는 3가지 단계로 이루어진다: DNA 복제는 S기에 국한되며; G1은 M기와 S기 사이의 휴지기인 반면, G2는 S기와 M기 사이의 휴지기이다. M기에서, 핵과 세포질이 차례로 분열한다. 증식을 지시하는 유사분열 신호의 부재 하 또는 성장 정지를 유도하는 화합물의 존재 하에, 세포 주기는 정지하게 된다. 세포들은 이들의 세포 주기 제어 시스템을 부분적으로 풀어내어 상기 주기에서 빠져나와 G0기로 불리는 특수한 비분열 상태로 들어갈 수 있다.
본원에서 사용되는 "약"이라는 용어는 제시된 실제값 근방의 변동값을 지칭하는 것으로, 해당값의 ±10%를 포함한다.
관류 배양을 이용한 세포 배양법
이에 제한되지는 않지만, 이해를 위한 목적에서, 통상의 기술자라면 단백질 생산을 위한 세포 배양 및 배양작업 실행이 3가지 일반적인 유형, 즉, 관류 배양, 회분식 배양 및 유가식 배양을 포함할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 관류 배양에서는, 새로운 배양 배지 보충물을 배양 기간 동안 세포에 제공하면서, 오래된 배양 배지를 매일 제거하고 생성물은 예를 들어, 매일 또는 연속적으로 수확한다. 관류 배양에서, 관류 배지는 매일 첨가할 수 있으며, 연속적으로, 즉 적하 또는 주입을 통해 첨가할 수 있다. 관류 배양의 경우, 세포가 생존 상태로 유지되고 환경 및 배양 조건이 유지되는 한, 세포는 목적하는 만큼 배양물 중에 유지될 수 있다. 세포가 연속적으로 증식하기 때문에, 일정한 생존 세포 밀도를 유지하기 위해서는 작업 실행 동안 통상적으로 세포를 제거하는 것이 필요하며, 이를 세포 배출이라고 한다. 세포 배출물은 세포와 함께 제거된 배양 배지 중의 생성물을 함유하는데, 이는 통상적으로 폐기되어 낭비된다. 따라서, 세포 배출을 실시하지 않거나 이를 최소한으로만 실시하여 생산 단계 동안에 생존 세포 밀도를 유지하는 것이 유리하고 이로써 작업 실행에 따른 총 수율이 증가된다.
회분식 배양에서, 세포는 처음에 배지에서 배양되고, 상기 배지는 제거, 교체 또는 보충되지 않는데, 즉 세포는 배양작업을 실행하는 동안 또는 배양작업 실행을 종료하기 전에는 새로운 배지가 "공급되지" 않는다. 목적하는 생성물은 배양작업 실행 종료시에 수확된다.
유가식 배양의 경우, 작업실행 동안 배양 배지를 매일 1회 이상 (또는 연속적으로) 새로운 배지로 보충함으로써, 즉 배양작업 기간 동안 세포에 새로운 배지 ("공급 배지")를 "공급함"으로써, 배양작업 실행 시간을 증가시킨다. 유가식 배양은 상술한 바와 같은 다양한 공급 계획 및 시간, 예를 들어, 매일, 격일로, 2일마다 등, 하루에 1회 이상 또는 하루에 1회 미만 등을 포함할 수 있다. 또한, 유가식 배양은 공급 배지가 연속적으로 공급될 수 있다. 이후, 목적하는 생성물은 배양/생산작업 실행의 종료시에 수확된다.
본 발명에 따르면, 포유동물 세포는 관류 배양으로 배양된다. 이종성 단백질을 생산하는 동안, 세포를 목적하는 생존 세포 밀도로 증식시킨 후 해당 세포가 세포 증식 및 세포 분열보다는 오히려 에너지 및 기질을 사용하여 관심대상인 이종성 단백질을 생산하게 하는, 증식이 정지된 높은 생산성 상태로 전환되는 제어 시스템을 갖는 것이 바람직하다. 온도 이동 및 아미노산을 결핍시키는 것과 같이 상기 목표를 달성하는 방법들은 항상 성공적이지는 않았으며, 생성물 품질에 바람직하지 않은 영향을 미칠 수도 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 생산 단계 동안의 생존 세포 밀도는 규칙적인 세포 배출을 수행함으로써 바람직한 수준으로 유지될 수 있다. 그러나, 상기 배출로 관심대상 이종성 단백질이 버려질 수 있게 된다. 생산 단계 동안의 세포 성장 정지는 세포 배출에 대한 필요성을 감소시켜, 나아가 세포를 보다 생산적인 상태로 유지할 수 있다.
본원에서는, 이종성 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 관류 세포 배양으로 배양하는 방법으로서, (a) 이종성 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 무혈청 배양 배지 중에 접종하는 단계; (b) 상기 포유동물 세포를 무혈청 관류 배지를 사용한 관류에 의해 증식 단계 동안 배양하는 단계; 및 (c) 30 mM 내지 250 mM의 농도 및 1 미만의 칼륨 이온에 대한 나트륨 이온의 몰비로 칼륨 이온을 포함하는 무혈청 관류 배지를 사용한 관류에 의해 생산 단계 동안 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 이때 단계 (b)는 선택적인 것인, 방법이 제공된다.
또한, 본원에서는, 관류 세포 배양에서 세포 배출을 감소시키고/감소시키거나 이종성 단백질을 발현하는 관류 세포 배양물에서 단백질 생산을 증가시키는 방법으로서, (a) 이종성 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 무혈청 배양 배지 중에 접종하는 단계; (b) 상기 포유동물 세포를 무혈청 관류 배지를 사용한 관류에 의해 증식 단계 동안 배양하는 단계; 및 (c) 30 mM 내지 250 mM의 농도 및 1 미만의 칼륨 이온에 대한 나트륨 이온의 몰비로 칼륨 이온을 포함하는 무혈청 관류 배지를 사용한 관류에 의해 생산 단계 동안 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 이때 단계 (b)는 선택적인 것인, 방법이 제공된다.
또한, 본 발명은, 관류 배양물을 매우 높은 세포 밀도로 접종하고, 무혈청 배양 배지 중에서 이종성 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 접종한 직후에 또는 접종하고 조금 지나서 관류를 시작하는 것도 포함한다. 또한, 단계 (b): 포유동물 세포를 무혈청 관류 배지를 사용한 관류에 의해 증식 단계 동안 배양하는 단계는 선택적이어서, 상기 포유동물 세포를, 30 mM 내지 250 mM의 농도 및 1 미만의 칼륨 이온에 대한 나트륨 이온의 몰비로 칼륨 이온을 포함하는 무혈청 관류 배지를 사용한 관류에 의해 생산 단계 동안 단계 (c)에 따라 직접 배양시킨다.
따라서, 본원에서는, 이종성 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 배양하고/배양하거나 관류 세포 배양에서 세포 배출을 감소시키고/감소시키거나 이종성 단백질을 발현하는 관류 세포 배양물에서 단백질 생산을 증가시키는 방법으로서, (a) 이종성 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 무혈청 배양 배지 중에 접종하는 단계; (b) 선택적으로, 상기 포유동물 세포를 무혈청 관류 배지를 사용한 관류에 의해 증식 단계 동안 배양하는 단계; 및 (c) 30 mM 내지 250 mM의 농도 및 1 미만의 칼륨 이온에 대한 나트륨 이온의 몰비로 칼륨 이온을 포함하는 무혈청 관류 배지를 사용한 관류에 의해 생산 단계 동안 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법도 제공된다. 단백질 생산의 증가는 관류작업 실행 동안 또는 일정 기간 동안 증가된 단백질 생성물 수율을 포함한다. 또한, 단백질 생산의 증가는 세포당 증가된 특정 단백질 생산, 또는 상기 양자 모두를 포함한다.
본 발명의 방법에 따르면, 단계 (a)에서 포유동물 세포를 배양하는 것은 이종성 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 무혈청 배지 중에 접종하는 것으로 한정될 수 있기 때문에, 관류를 시작하기 전 실제 배양 단계를 포함시킬 필요는 없다. 또한, 본 발명의 방법에 따르면, 관류에 의한 생산 단계 동안 포유동물 세포를 배양하는 것은 관류에 의한 생산 단계 동안 상기 포유동물 세포를 일정한 생존 세포 밀도로 유지하는 것을 포함한다.
상기 생산 단계는 목표한 세포 밀도가 달성되면 시작한다. 바람직하게는, 단계 (c)는 목표한 세포 밀도가 달성되면 시작한다. 상기 단계는 10×106 개의 세포/ml 내지 약 120×106 개의 세포/ml 또는 그 이상 범위의 세포 밀도에서 시작할 수 있다. 바람직하게는, 단계 (c)는 적어도 10×106 개의 세포/ml, 적어도 20×106 개의 세포/ml, 적어도 30×106 개의 세포/ml, 적어도 40×106 개의 세포/ml 또는 적어도 50×106 개의 세포/ml의 세포 밀도에서 개시한다. 가장 바람직하게는, 단계 (c)는 약 30 내지 약 50×106 개의 세포/ml의 세포 밀도에서 개시한다.
본 발명의 방법은 단계 (c)에서 세포 밀도를 세포 배출에 의해 유지하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에서 언급된 세포 밀도는 당해 분야에 공지된 임의의 방법으로 측정될 수 있는 생존 세포 밀도이다. 예를 들어, 세포 배출 속도를 조절하는 계산은 목표 VCD에 상응하는 인사이트(Incyte) 또는 푸투라(Futura) 바이오매스 용량 탐침센서 값 [해밀턴 컴퍼니(Hamilton Company), 아버 인스트루먼츠(Aber Instruments) 제조]을 유지하는 것을 기초로 할 수 있고, 또는 일일 세포 및 생존율 계수는 혈구계산기, Vi-Cell (Beckman Coulter), Cedex HiRes (Roche) 또는 Viacount 검정 (EMD Millipore Guava EasyCyte)과 같은 임의의 세포 계수기를 통해 오프라인으로 수행할 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하면, 세포 배출이 대조군 관류 세포 배양에 비해 감소되는데, 이때 대조군 관류 세포 배양물은 본 발명에 따른 칼륨 농도 및 칼륨 이온에 대한 나트륨 이온의 비율을 사용하지 않은 동일한 무혈청 관류 배지를 사용하는 동일한 조건 하에 배양되는 관류 세포 배양물이다. 보다 구체적으로, 세포 배출은 대조군 관류 세포 배양에 비해 감소되는데, 이때 대조군 관류 세포 배양물은 30 mM 미만의 농도 및 2 이상의 칼륨에 대한 나트륨의 몰비로 칼륨 이온를 포함하는 동일한 무혈청 관류 배지를 사용하여 동일한 조건 하에 배양되는 관류 세포 배양물이다.
본 발명의 무혈청 관류 배지 중의 바람직한 칼륨 이온 농도는 약 40 mM 내지 약 200 mM, 바람직하게는 약 60 mM 내지 약 150 mM, 보다 바람직하게는 약 80 mM 내지 약 100 mM이다. 일부 실시양태에서, 칼륨에 대한 나트륨의 몰비는 약 0.9 내지 0.1, 약 0.8 내지 0.2, 약 0.7 내지 0.2, 바람직하게는 약 0.6 내지 0.3, 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 0.4이다. 적절한 칼륨 농도 및 Na:K 비율의 예로는 약 40 mM 내지 약 200 mM 및 약 0.1 내지 0.9의 Na:K 몰비, 약 40 mM 내지 약 200 mM 및 약 0.2 내지 0.8의 Na:K 몰비; 약 40 mM 내지 약 200 mM 및 약 0.2 내지 0.7의 Na:K 몰비; 40 mM 내지 약 200 mM 및 약 0.3 내지 0.6의 Na:K 몰비; 40 mM 내지 약 200 mM 및 약 0.4 내지 0.5의 Na:K 몰비; 약 60 mM 내지 약 150 mM 및 약 0.1 내지 0.9의 Na:K 몰비; 약 60 mM 내지 약 150 mM 및 약 0.2 내지 0.8의 Na:K 몰비; 약 60 mM 내지 약 150 mM 및 약 0.2 내지 0.7의 Na:K 몰비; 약 60 mM 내지 약 150 mM 및 약 0.3 내지 0.6의 Na:K 몰비; 약 60 mM 내지 약 150 mM 및 약 0.4 내지 0.5의 Na:K 몰비; 약 80 mM 내지 약 100 mM 및 약 0.1 내지 0.9의 Na:K 몰비, 약 80 mM 내지 약 100 mM 및 약 0.2 내지 0.8의 Na:K 몰비; 약 80 mM 내지 약 100 mM 및 약 0.2 내지 0.7의 Na:K 몰비; 약 80 mM 내지 약 100 mM 및 약 0.3 내지 0.6의 Na:K 몰비; 약 80 mM 내지 약 100 mM 및 약 0.4 내지 0.5의 Na:K 몰비를 들 수 있다. 약 60 mM 내지 약 150 mM의 칼륨 농도 및 약 0.6 내지 0.3의 Na:K 몰비가 특히 바람직하고, 약 60 mM 내지 약 150 mM의 칼륨 농도 및 약 0.5 내지 0.4의 Na:K 몰비가 보다 더 바람직하며, 약 80 mM 내지 약 100 mM의 칼륨 농도 및 약 0.5 내지 0.4의 Na:K 몰비가 더욱 바람직하다. 본 발명에 따른 칼륨 농도는 본 발명에 따른 Na:K 몰비와 함께 G0/G1 세포 주기 정지를 가져온다. 추가로, 본 발명에 따른 칼륨 농도는 본 발명에 따른 Na:K 몰비와 함께 증가된 세포 비생산성 (qp)을 유도한다. 따라서, 본 발명에 따른 높은 칼륨 농도 및 그에 따른 본 발명의 낮은 나트륨 농도는 상승작용을 내도록 작용하는 것으로 보인다. 임의의 특정 이론에 구속시키고자하는 것은 아니지만, 본 발명에 따른 칼륨 농도가 G0/G1 세포 주기 정지 및 나트륨 이온의 동시적 감소를 위해 필요한 것으로 미루어 볼때, Na:K 몰비의 감소는 세포의 비생산성 증가를 촉진하는 것으로 보인다.
칼륨 이온은 하나 이상의 칼륨염으로 제공될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 상기 하나 이상의 칼륨염은 중탄산칼륨, 염화칼륨, 수산화칼륨, L-티로신 이칼륨염, 제2인산칼륨, 제1인산칼륨, 아셀렌산칼륨, 피루브산칼륨, 글루타티온칼륨, D-글루콘산칼륨, 숙신산칼륨 및 아스코르브산칼륨으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 칼륨염은 중탄산칼륨, 염화칼륨, 수산화칼륨, L-티로신 이칼륨염, 제2인산칼륨 및 제1인산칼륨이다. 바람직하게는, 배지의 삼투 몰농도는 칼륨염의 첨가로 인해 변화되지는 않는다. 이는 나트륨염을 상응하는 칼륨염으로 대체함으로써 달성될 수 있다. 따라서, 통상의 기술자라면 세포 배양 배지에 통상적으로 사용되는 임의의 나트륨 염이 상기 상응하는 칼륨염으로서 사용하기에 바람직한 염이라는 것을 이해할 수 있을 것이다. 바람직하게는, 상기 칼륨염은 단계 (b)의 무혈청 관류 배지 내의 상응하는 나트륨염을 대체한다.
본 발명의 무혈청 관류 배지 중의 바람직한 나트륨 이온 농도는 100 mM 미만, 보다 바람직하게는 60 mM 미만, 보다 더 바람직하게는 10-50 mM이다. 나트륨 이온은 하나 이상의 칼륨염으로 제공될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 상기 하나 이상의 나트륨염은 중탄산나트륨, 염화나트륨, 수산화나트륨, L-티로신 이나트륨염, 제2인산나트륨, 제1인산나트륨, 아셀렌산나트륨, 피루브산나트륨, 글루타티온나트륨, D-글루콘산나트륨, 숙신산나트륨 및 아스코르브산나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 나트륨염은 중탄산나트륨, 염화나트륨, 수산화나트륨, L-티로신 이나트륨염, 제2인산나트륨 및 제1인산나트륨이다.
동일한 이유로 증식 단계 동안 증식되도록 하기 위해, 본 발명의 무혈청 관류 배지의 칼륨 이온 농도 및 Na:K 몰비는 증식 단계 동안 접종 배지에서는 적용시키지 말아야 한다. 따라서, 단계 (a)의 무혈청 배양 배지 및 단계 (b)의 무혈청 관류 배지는, 본 발명의 무혈청 관류 배지의 칼륨 이온 농도보다 낮은 농도 및 본 발명의 무혈청 관류 배지의 Na:K 몰비보다 높은 Na:K 몰비로 칼륨을 포함해야 한다. 바람직하게는, 단계 (a)의 무혈청 배양 배지 및 단계 (b)의 무혈청 관류 배지는 30 mM 미만의 칼륨 농도를 포함한다. 보다 바람직하게는, 단계 (a)의 무혈청 배양 배지 및 단계 (b)의 무혈청 관류 배지는 30 mM 미만의 칼륨 농도 및 1 이상, 바람직하게는 2 이상의 칼륨에 대한 나트륨의 몰비를 포함한다.
본 발명의 무혈청 관류 배지의 삼투 몰농도는 300 내지 1400 mOsmol/kg, 바람직하게는 300 내지 500 mOsmol/kg, 보다 바람직하게는 330 내지 450 mOsmol/kg, 보다 더 바람직하게는 360 내지 390 mOsmol/kg의 범위 이내여야 한다. 여기서, 상기 삼투 몰농도는 mOsmol/kg(물)로서 제시된다.
본 발명의 무혈청 관류 배지 및 본 발명의 방법에서 사용되는 무혈청 관류 배지는 화학적으로 규명된 조성을 가지고/가지거나 가수분해산물을 함유하지 않을 수 있다. 가수분해산물을 함유하지 않는다는 것은, 해당 배지가 동물, 식물 (대두, 감자, 쌀), 효모 또는 다른 공급원에서 유래된 단백질 가수분해산물을 함유하지 않는다는 것을 의미한다. 일반적으로, 화학적으로 규명된 조성을 갖는 배지는 가수분해산물을 함유하지 않는다. 어떤 경우가 됐건간에, 상기 무혈청 관류 배지는 동물 공급원으로부터 유래된 화합물, 특히 동물로부터 유래하여 분리된 단백질 또는 펩타이드(이것은 세포 배양으로 생성된 재조합 단백질을 포함하지 않음)를 함유하지 않아야 한다. 바람직하게는, 상기 무혈청 관류 배지는 단백질을 함유하지 않거나, 또는 재조합 인슐린 및/또는 인슐린 유사 성장 인자를 제외하고는 단백질을 함유하지 않는다. 보다 바람직하게는, 상기 무혈청 관류 배지는 화학적으로 규명된 조성을 가지며, 단백질을 함유하지 않거나, 또는 재조합 인슐린 및/또는 인슐린 유사 성장 인자를 제외하고는 단백질을 함유하지 않는다. 이는 단계 (a)의 무혈청 배양 배지 및 단계 (b)의 무혈청 관류 배지에도 적용된다.
관류 배양은 일반적으로 회분식 배양과 같이 접종 배양으로 시작한다. 관류는 즉시 또는 하루 이상 지난 후에 시작될 수 있다. 일반적으로, 관류는 세포 배양 2일째 또는 그 후에 작된다. 한 실시양태에서, 단계 (b)의 관류는 세포 배양 2일째에 또는 그 후에 시작된다. 일단 목표한 세포 밀도에 도달하게 되면, 세포 배양물 중의 칼륨 이온 농도를 증가시킴과 동시에 Na:K 몰비를 감소시켜 세포 배양물 내에서 본 발명의 무혈청 관류 배지에서의 농도 및 비율을 수득함으로써 성장 정지를 유도한다. 생산 단계 동안, 30 mM 내지 250 mM의 농도 및 1 미만의 칼륨 이온에 대한 나트륨 이온의 몰비로 칼륨 이온을 포함하는 무혈청 관류 배지를 사용하는 관류에 의해 포유동물 세포를 배양한다.
일반적으로, 본 발명에 따른 포유동물 세포 배양은 세포 배양의 연속적인 관류를 포함한다. 관류 속도는 관류가 시작된 후에 증가할 수 있다. 일반적으로, 더 빠른 관류 속도는 더 높은 생존 세포 밀도를 유지하게 하므로, 더 높은 목표 세포 밀도가 가능하다. 관류 속도는 0.5 용기 부피/일 이하에서 5 용기 부피/일로 증가할 수 있다. 바람직하게는, 관류 속도는 0.5 용기 부피/일 이하에서 2 용기 부피/일로 증가한다.
본 발명의 방법은 관류 세포 배양물로부터 이종성 단백질을 수확하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 단계는 바람직하게는, 세포가 세포 보유 장치에 의해 회수된 후에 생성된 상청액인 투과물로부터 연속적으로 수행한다. 유가식 방법과 비해 관류 생물반응기 내의 세포 배양물 중에서 생성물 단백질의 더 짧은 생성물 체류 시간으로 인해, 프로테아제, 시알리다아제 및 기타 분해성 단백질에 대한 노출이 최소화되기 때문에, 관류 배양에서 생성된 이종성 단백질의 품질은 더욱 우수할 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 임의의 세포 관류 생물반응기 및 세포 보유 장치를 관류 배양에 사용할 수 있다. 관류에 사용되는 생물반응기는, 크기가 더 소형으로 세포 보유 장치에 연결된다는 점을 제외하고는, 회분식/유가식 배양에 사용된 것과 그렇게 다르지는 않다. 생물반응기 내 중에 세포를 보유하는 방법은, 해당 세포들이 표면에 부착되어 성장하는지 또는 단일 세포 현탁액 또는 세포 응집체로 성장하는지 여부에 의해 주로 결정된다. 과거에는, 대부분의 포유 동물 세포를 표면 또는 기질에 부착시켜 증식시켰던 반면 (불균질 배양), 여러 산업에서 포유 동물 세포주를 현탁액 중에 적용하여 증식시키고자 하는 노력이 이루어졌는데 (균질 배양), 그 주된 이유는 현탁 배양이 그 규모를 확장시키기가 쉽기 때문이다. 따라서, 본 발명의 방법에 사용되는 세포는 바람직하게는 현탁액 중에서 증식시킨다. 여기에 제한되지는 않지만, 현탁액 중에서 증식시킨 세포에 대한 예시적인 보유 시스템으로는 스핀 여과기, 외부 여과 시스템, 예를 들어, 접선 유동 여과 (tangential flow filtration: TFF), 교호 접선 유동 (ATF) 시스템, 세포 침강 (수직 침강 및 경사 침강), 원심분리, 초음파 분리 및 하이드로사이클론을 들 수 있다. 관류 시스템은 스핀 여과기, 외부 여과 및 ATF와 같은 여과 기반 시스템과 중력 침강기, 원심 분리기, 초음파 분리 장치 및 하이드로클론과 같은 개방형 관류 시스템의 2가지 범주로 분류할 수 있다. 여과 기반 시스템은 높은 세포 보유도를 나타내며 유속에 따라서도 변하지 않는다. 그러나, 여과기는 막힐 수 있으므로, 배양작업 실행은 그 길이가 제한되거나 필터를 교환할 필요가 있다. ATF 시스템의 예로는 레플리젠의 ATF2 시스템을 들 수 있으며, TFF 시스템의 예로는 원심분리 펌프를 사용하는 레비트로닉스의 TFF 시스템이다. 중공 섬유 (HF) 또는 평판 여과기와 같은 직교류 여과기가 ATF 및 TFF 시스템과 함께 사용될 수 있다. 구체적으로, 개질 폴리에테르 설폰 (mPES), 폴리에테르설폰 (PES) 또는 폴리설폰 (PE)으로 제조된 중공 섬유는 ATF 및 TFF 시스템과 함께 사용될 수 있다. HF의 공극 크기는 수백 kDa 내지 15 μM의 범위일 수 있다. 개방형 관류 시스템은 막히지 않으므로, 적어도 이론적으로는 무기한으로 작동될 수 있다. 그러나, 세포 보유도는 더 높은 관류 속도에서 감소된다. 현재 산업적 규모로 사용될 수 있는 것으로 교호 접선 여과기 (ATF), 중력 침강기 (특히 경사 침강기), 접선 유동 여과 (TFF) 및 원심분리기의 4개 시스템을 들 수 있다. 불균질 또는 균질 배양에 적합한 세포 보유 장치는 콤팔라 및 오즈투르크 (문헌 [Kompala and Ozturk, Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies, (2006), Taylor & Francis Group, LLC, pages 387-416])에 의해 보다 상세하게 기재되어 있다. 관류 배양은 엄밀히 말하면 정상 상태 과정이 아니며, 세포 배출 스트림이 생물반응기에서 제거될 경우에만 총 세포 농도 및 생존 세포 농도가 정상 상태에 도달한다.
관류 생물반응기에서의 pH, 용존 산소량 및 온도와 같은 물리적 파라미터들은 온라인으로 모니터링하여 실시간으로 조절되어야 한다. 세포 밀도, 생존율, 대사산물 및 생성물 농도의 측정은 오프라인 또는 온라인 샘플링을 사용하여 수행될 수 있다. 관류 작업을 연속적인 수확 및 공급과 함께 시작하는 경우, 상기 관류 속도는 통상적으로 수확 유속을 가리키며, 이는 목적하는 값으로 수동으로 설정할 수 있다. 예를 들어, 생물반응기에 대한 중량 조절은 공급물 펌프를 활성화시켜 해당 생물반응기에서 일정한 부피가 유지될 수 있다. 대안으로, 수준 조절은 사전에 결정된 수준 이상의 배양물 부피를 퍼내어 배출시킴으로써 달성될 수 있다. 생물반응기에서의 관류 속도는 해당 세포에 충분한 영양분을 전달하도록 조정되어야 한다. 생물반응기 내의 세포 밀도가 증가함에 따라, 관류 속도도 증가되어야 한다.
관류 속도는, 예를 들어, 세포 밀도 측정, pH 측정, 산소 소비 또는 대사산물 측정을 사용하여 제어될 수 있다. 세포 밀도는 관류 속도 조절에 사용되는 가장 중요한 측정치이다. 세포 밀도 측정을 어떻게 수행하느냐에 따라, 관류 속도는 매일 또는 실시간으로 조절될 수 있다. 용량 탐침센서, 예컨대, 인사이트 탐침센서 (해밀턴 컴퍼니) 또는 푸투라 탐침센서 (아버 인스트루먼츠)와 같이, 세포 밀도의 추산을 위해 여러가지 온라인 탐침봉들이 개발되어 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 이러한 세포 밀도 탐침센서는 생물반응기로부터 과량의 세포들을 제거함, 즉 세포 배출에 의해 세포 밀도를 원하는 설정점으로 조절하는데에도 사용할 수 있다. 따라서, 세포 배출은 배양물 중에서 포유동물 세포의 비증식속도에 의해 결정된다. 세포 배출물은 통상적으로 수확되지 않으므로, 폐기물로 간주한다.
또 다른 양태에서, 생산 단계 동안 포유동물 세포를 관류 배양으로 배양하거나, 또는 관류 배양에서 총 세포 배출 부피를 감소시키기 위한 본 발명의 무혈청 관류 배지의 용도가 제공된다. 다른 대안으로, 관류 세포 배양에서 단백질 생산을 증가시키기 위한 본 발명의 무혈청 관류 배지의 용도가 제공된다. 상기 배지의 용도는 본 발명의 방법에 사용되는 무혈청 관류 배지 (단계 (c))에 대해 개시된 바와 같다.
본 발명의 방법 및 용도에 의해 생산된 이종성 단백질은 임의의 분비 단백질일 수 있으며, 이는 바람직하게는 치료용 단백질이다. 대부분의 치료용 단백질이 재조합 치료용 단백질이기 때문에, 이는 가장 바람직하게는 재조합 치료용 단백질이다. 치료용 단백질에 대한 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 항체, 융합 단백질, 사이토카인 및 성장 인자를 들 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 포유동물 세포에서 생산된 치료용 단백질로는, 이에 제한되지는 않지만, 항체 또는 융합 단백질, 예컨대, Fc-융합 단백질을 포함한다. 기타 재조합 치료용 분비 단백질로는, 예를 들어, 효소, 사이토카인, 림포카인, 부착 분자, 수용체 및 이들의 유도체 또는 단편, 및 작용제 또는 길항제로서 기능을 하고/하거나 치료용 또는 진단용인 임의의 다른 폴리펩타이드 및 스캐폴드를 들 수 있다.
관심대상인 기타 재조합 단백질로는, 예를 들어, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 하기를 들 수 있다: 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자, hGH, tPA, 사이토카인, 예컨대, 인터루킨 (IL), 예를 들어,IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, 인터페론 (IFN) 알파, IFN 베타, IFN 감마, IFN 오메가 또는 IFN 타우, 종양 괴사 인자 (TNF), 예컨대, TNF 알파 및 TNF 베타, TNF 감마, TRAIL; G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 및 VEGF. 또한, 에리트로포이에틴의 생산, 또는 작용제 또는 길항제로서 기능을 하고/하거나 치료용 또는 진단용인 임의의 기타 호르몬 성장 인자 및 임의의 기타 폴리펩타이드의 생산도 포함된다.
바람직한 치료용 단백질은 항체 또는 이의 단편 또는 유도체이고, 보다 바람직하게는 IgG1 항체이다. 따라서, 본 발명은 단일클론성 항체, 다중특이적 항체 또는 이의 단편과 같은 항체, 바람직하게는 단일클론성 항체, 이중특이적 항체 또는 이의 단편의 생산에 사용하는 것이 유리할 수 있다. 본 발명의 범위 내에서의 예시적인 항체로는, 이에 제한되지는 않지만, 항-CD2, 항-CD3, 항-CD20, 항-CD22, 항-CD30, 항-CD33, 항-CD37, 항-CD40, 항-CD44, 항-CD44v6, 항-CD49d, 항-CD52, 항-EGFR1 (HER1), 항-EGFR2 (HER2), 항-GD3, 항-IGF, 항-VEGF, 항-TNF알파, 항-IL2, 항-IL-5R 또는 항-IgE 항체를 포함하며, 바람직하게는 항-CD20, 항-CD33, 항-CD37, 항-CD40, 항-CD44, 항-CD52, 항-HER2/neu (erbB2), 항-EGFR, 항-IGF, 항-VEGF, 항-TNF알파, 항-IL2 및 항-IgE 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
항체 단편은, 예를 들어, "Fab 단편" (항원 결합 단편, Fragment antigen-binding = Fab)을 포함한다. Fab 단편은, 인접한 불변 영역에 의해 결합된 양 사슬 모두의 가변 영역으로 이루어진다. 이들은 통상적인 항체로부터, 예를 들어, 파파인을 사용한 프로테아제 분해에 의해 형성될 수 있으나, 이와 유사하게 Fab 단편은 유전자 조작에 의해 생성될 수도 있다. 추가의 항체 단편으로 F(ab')2 단편을 포함하는데, 이는 펩신에 의한 단백질 가수분해 절단에 의해 제조될 수 있다.
유전자 조작 방법을 사용하여, 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 영역만으로 이루어진 단축 항체 단편을 생산하는 것이 가능하다. 이들은 Fv 단편 (가변부 단편, Fragment variable = 가변부의 단편)으로 지칭된다. 이들 Fv 단편은 불변 쇄의 시스테인에 의한 2개의 쇄의 공유 결합이 없기 때문에, Fv 단편은 종종 안정화된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을, 예를 들어, 10개 내지 30개의 아미노산, 바람직하게는 15개의 아미노산의 단축 펩타이드 단편에 의해 연결하는 것이 유리하다. 이러한 방식으로, 펩타이드 링커에 의해 연결된 VH 및 VL로 이루어진 단일 펩타이드 가닥이 수득된다. 이러한 종류의 항체 단백질은 단쇄-Fv (scFv)로 알려져 있다. scFv-항체 단백질의 예는 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
본 발명에 따른 바람직한 치료용 항체는 이중특이적 항체이다. 이중특이적 항체는 일반적으로 한 분자에서 표적 세포 (예를 들어, 악성 B-세포) 및 효과기 세포 (예를 들어, T-세포, NK-세포 또는 대식세포)에 대한 항원-결합 특이성을 겸하고 있다. 예시적인 이중특이적 항체로는, 디아바디, BiTE (이중특이적 T 세포 관여항체, Bi-specific T-cell Engager) 포맷 및 DART (이중 친화도 재표적화, Dual-Affinity Re-Targeting) 포맷을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 디아바디 포맷은, 2개의 개별 폴리펩타이드 사슬 상에서 2개의 항원 결합 특이성의 중쇄 및 경쇄의 동족 가변 도메인을 분리하는데, 상기 2개의 폴리펩타이드 사슬은 비공유결합되어 있다. 상기 DART 포맷은 디아바디 포맷을 기반으로 하지만, C-말단 이황화 브릿지를 통해 추가로 안정화된다.
다른 바람직한 치료용 단백질은 융합 단백질, 예를 들어, Fc-융합 단백질이다. 따라서, 본 발명은 유리하게는 Fc-융합 단백질과 같은 융합 단백질의 제조에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 단백질 생산을 증가시키는 방법은 유리하게는 Fc-융합 단백질과 같은 융합 단백질의 생산에 사용될 수 있다.
융합 단백질의 효과기 부분은 천연 또는 변형 이종성 단백질의 완전한 서열 또는 해당 서열의 일부이거나, 또는 천연 또는 변형 이종성 단백질의 완전한 서열 또는 해당 서열의 일부의 조합일 수 있다. 면역글로불린의 불변 도메인 서열은 임의의 면역글로불린의 아형, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2 아형 또는 클래스, 예컨대 IgA, IgE, IgD 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다. 바람직하게는 이들은 사람 면역글로불린으로부터, 보다 바람직하게는 사람 IgG로부터, 보다 더 바람직하게는 사람 IgG1 및 IgG2로부터 유래한다. Fc-융합 단백질의 비제한적 예로는 N-결합된 당화 부위를 포함하는 중쇄 면역글로불린 불변 영역의 CH2 도메인에 연결된 MCP1-Fc, ICAM-Fc, EPO-Fc 및 scFv 단편 등을 들 수 있다. Fc-융합 단백질은, N-결합된 당화 부위를 포함하는 중쇄 면역글로불린 불변 영역의 CH2 도메인을, 예를 들어, 다른 면역글로불린 도메인, 효소적으로 활성인 단백질 부분 또는 효과기 도메인을 포함하는 또 다른 발현 작제물 내로 도입함으로써 유전공학적 방법에 의해 작제할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Fc-융합 단백질은, 예를 들어, N-결합된 당화 부위를 포함하는 중쇄 면역글로불린 불변 영역의 CH2 도메인에 연결된 단쇄 Fv 단편도 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하고, 선택적으로, 치료용 단백질을 정제하여 약제학적으로 허용가능한 제제로 제제화하는 단계를 임의로 추가로 포함하는, 치료용 단백질을 제조하는 방법도 제공된다.
상기 치료용 단백질, 특히, 항체, 항체 단편 또는 Fc-융합 단백질은 바람직하게는 배양 배지로부터 분비 폴리펩타이드로 회수/분리된다. 실질적으로 동종인 치료용 단백질의 제제를 수득하기 위해, 다른 재조합 단백질 및 숙주 세포 단백질로부터 치료용 단백질을 정제할 필요가 있다. 제1 단계로서, 세포 및/또는 미립자 세포 잔해물을 배양 배지로부터 제거한다. 추가로, 치료용 단백질은 예를 들어, 면역친화도 또는 이온교환 컬럼을 기반으로한 분별 분류, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 세파덱스(Sephadex) 크로마토그래피, 및 실리카 상에서 또는 DEAE와 같은 양이온 교환 수지 상에서의 크로마토그래피에 의해, 가용성 단백질, 폴리펩타이드 및 핵산의 오염물로부터 정제한다. 포유동물 세포에 의해 발현된 이종성 단백질을 정제하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 발현된 이종성 단백질은, 해당 이종성 단백질을 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 발현 카세트(들)에 의해 암호화된다. 상기 이종성 단백질은 디하이드로폴레이트 리덕타아제 (dihydrofolate reductase: DHFR), 글루타민 신테타제 (GS)와 같은 증폭가능한 유전자 선별 마커의 제어 하에 놓을 수 있다. 상기 증폭가능한 선별 마커 유전자는 이종성 단백질 발현 카세트와 동일한 발현 벡터 상에 존재할 수 있다. 대안으로, 상기 증폭가능한 선별 마커 유전자 및 이종성 단백질 발현 카세트는 서로 다른 발현 벡터 상에 존재할 수는 있지만, 숙주 세포의 유전체 내에 매우 근접하여 통합된다. 동시에 공동으로 형질감염되는 2종 이상의 벡터는, 예를 들어, 숙주 세포의 유전체 내에 매우 근접하여 통합되는 경우가 많다. 이후, 치료용 분비 단백질 발현 카세트를 함유하는 유전자 영역의 증폭은, 증폭제 (예를 들어, DHFR의 경우 MTX 또는 GS의 경우 MX)를 배양 배지에 첨가함으로써 조율한다.
포유동물 세포에 의해 발현되는 충분히 높은 안정한 수준의 이종성 단백질은, 예를 들어, 상기 이종 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 다수의 복제물을 발현 벡터 내에 클로닝함으로써 달성할 수도 있다. 상술한 바와 같이 이종성 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 다수의 복제물을 발현 벡터 내에 클로닝하는 단계와 상기 이종성 단백질 발현 카세트를 증폭시키는 단계는 추가로 조합될 수도 있다.
포유동물 세포주
본원에서 사용되는 포유동물 세포는 재조합 치료용 분비 단백질의 생산에 적절한 포유동물 세포주이기 때문에, "숙주 세포"로서도 지칭될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 포유동물 세포는 햄스터 세포와 같은 설치류 세포이다. 포유동물 세포는 분리된 세포 또는 세포주이다. 포유동물 세포는 바람직하게는 형질전환 및/또는 불멸화 세포주이다. 이들은 세포 배양에서 연속 계대배양에 적합하며, 형질전환되지 않은 1차 세포 또는 장기 구조의 일부인 세포들을 포함하지 않는다. 바람직한 포유동물 세포는 BHK21, BHK TK-, CHO, CHO-K1, CHO-DXB11 (CHO-DUKX 또는 DuxB11로도 지칭함), CHO-S 세포 및 CHO-DG44 세포, 또는 임의의 이러한 세포주의 유도체/후대 개체이다. CHO 세포, 예컨대 CHO-DG44, CHO-K1 및 BHK21가 특히 바람직하며, CHO-DG44 및 CHO-K1 세포가 보다 더 바람직하다. CHO-DG44 세포가 가장 바람직하다. 포유동물 세포, 특히, CHO-DG44 및 CHO-K1 세포의 글루타민 신타아제 (GS)-결핍성 유도체도 포함된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 상기 포유 동물 세포는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 바람직하게는 CHO-DG44 세포, CHO-K1 세포, CHO DXB11 세포, CHO-S 세포, CHO GS 결핍성 세포 또는 이들의 유도체이다.
상기 포유동물 세포는 치료용 단백질, 바람직하게는 재조합 치료용 분비 단백질과 같은 이종성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 발현 카세트(들)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 숙주 세포는 쥐과의 골수종 세포, 예를 들어, NS0 및 Sp2/0 세포와 같은 쥐과의 세포, 또는 이러한 세포주 중 임의의 세포주의 유도체/후대 개체일 수도 있다. 본 발명에서 의미하는 것으로 사용될 수 있는 포유동물 세포의 비제한적인 예는 표 1에도 요약되어 있다. 그러나, 이러한 세포들의 유도체/후대 개체로서, 사람, 마우스, 랫트, 원숭이 및 설치류 세포주를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다른 포유동물 세포도 본 발명에서, 특히, 생물약제 단백질의 제조에 사용될 수 있다.
포유동물 세포는, 무혈청 조건 하에 그리고 선택적으로 어떠한 동물 기원의 단백질/펩타이드도 함유하지 않는 배지 중에서 확립되고, 적응되어, 완전히 배양되는 경우에 가장 바람직하다. 햄의 F12 [독일 다이젠호펜 소재의 시그마(Sigma)], RPMI-1640 (시그마), 둘베코의 변형 이글 배지 (DMEM; 시그마), 최소 필수 배지 (MEM; 시그마), 이스코브의 변형 둘베코 배지 (IMDM; 시그마), CD-CHO (미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재의 인비트로겐), CHO-S (인비트로겐), 무혈청 CHO 배지 (시그마) 및 무단백질 CHO 배지 (시그마)와 같은 시판중인 배지가 적절한 대표적인 영양액이다. 임의의 상기 배지는 필요에 따라 다양한 화합물로 보충될 수 있는데, 이러한 화합물들의 비제한적인 예로는 재조합 호르몬 및/또는 기타 재조합 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린, 상피세포 성장 인자, 인슐린 유사 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 인산염), 완충액 (예를 들어, HEPES), 뉴클레오사이드 (예를 들어, 아데노신, 티미딘), 글루타민, 글루코오스 또는 기타 이와 동등한 에너지원, 항생제 및 미량원소를 들 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있는 임의의 기타 필요한 보충제들도 적절한 농도로 포함될 수 있다. 선택가능한 유전자를 발현하는 유전자 변형된 세포의 증식과 선별을 위해, 적절한 선별제가 배양 배지에 첨가된다.
무혈청 관류 배지
또 다른 양태에서, 30 mM 내지 250 mM 농도 및 1 미만의 칼륨 이온에 대한 나트륨 이온의 몰비로 칼륨 이온을 포함하는 무혈청 관류 배지가 제공된다.
일부 실시양태에서, 칼륨 이온의 농도는 약 40 mM 내지 약 200 mM, 바람직하게는 약 60 mM 내지 약 150 mM, 보다 바람직하게는 약 80 mM 내지 약 100 mM이다. 일부 실시양태에서, 칼륨에 대한 나트륨의 몰비는 약 0.9 내지 0.1, 약 0.8 내지 0.2, 약 0.7 내지 0.2, 바람직하게는 약 0.6 내지 0.3, 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 0.4이다.
본 발명의 무혈청 관류 배지 중의 바람직한 칼륨 이온 농도는 약 40 mM 내지 약 200 mM, 바람직하게는 약 60 mM 내지 약 150 mM, 보다 바람직하게는 약 80 mM 내지 약 100 mM이다. 일부 실시양태에서, 칼륨에 대한 나트륨의 몰비는 약 0.9 내지 0.1, 약 0.8 내지 0.2, 약 0.7 내지 0.2, 바람직하게는 약 0.6 내지 0.3, 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 0.4이다. 적절한 칼륨 농도 및 Na:K 비율의 예로는 약 40 mM 내지 약 200 mM 및 약 0.1 내지 0.9의 Na:K 몰비, 약 40 mM 내지 약 200 mM 및 약 0.2 내지 0.8의 Na:K 몰비; 약 40 mM 내지 약 200 mM 및 약 0.2 내지 0.7의 Na:K 몰비; 40 mM 내지 약 200 mM 및 약 0.3 내지 0.6의 Na:K 몰비; 40 mM 내지 약 200 mM 및 약 0.4 내지 0.5의 Na:K 몰비; 약 60 mM 내지 약 150 mM 및 약 0.1 내지 0.9의 Na:K 몰비; 약 60 mM 내지 약 150 mM 및 약 0.2 내지 0.8의 Na:K 몰비; 약 60 mM 내지 약 150 mM 및 약 0.2 내지 0.7의 Na:K 몰비; 약 60 mM 내지 약 150 mM 및 약 0.3 내지 0.6의 Na:K 몰비; 약 60 mM 내지 약 150 mM 및 약 0.4 내지 0.5의 Na:K 몰비; 약 80 mM 내지 약 100 mM 및 약 0.1 내지 0.9의 Na:K 몰비, 약 80 mM 내지 약 100 mM 및 약 0.2 내지 0.8의 Na:K 몰비; 약 80 mM 내지 약 100 mM 및 약 0.2 내지 0.7의 Na:K 몰비; 약 80 mM 내지 약 100 mM 및 약 0.3 내지 0.6의 Na:K 몰비; 약 80 mM 내지 약 100 mM 및 약 0.4 내지 0.5의 Na:K 몰비를 들 수 있다. 약 60 mM 내지 약 150 mM의 칼륨 농도 및 약 0.6 내지 0.3의 Na:K 몰비가 특히 바람직하고, 약 60 mM 내지 약 150 mM의 칼륨 농도 및 약 0.5 내지 0.4의 Na:K 몰비가 보다 더 바람직하며, 약 80 mM 내지 약 100 mM의 칼륨 농도 및 약 0.5 내지 0.4의 Na:K 몰비가 더욱 바람직하다. 본 발명에 따른 칼륨 농도는 본 발명에 따른 Na:K 몰비와 함께 G0/G1 세포 주기 정지를 가져온다. 추가로, 본 발명에 따른 칼륨 농도는 본 발명에 따른 Na:K 몰비와 함께 증가된 세포 비생산성 (qp)을 유도한다. 따라서, 본 발명에 따른 높은 칼륨 농도 및 그에 따른 본 발명의 낮은 나트륨 농도는 상승작용을 내도록 작용하는 것으로 보인다. 임의의 특정 이론에 구속시키고자하는 것은 아니지만, 본 발명에 따른 칼륨 농도가 G0/G1 세포 주기 정지 및 나트륨 이온의 동시적 감소를 위해 필요한 것으로 미루어 볼때, Na:K 몰비의 감소는 세포의 비생산성 증가를 촉진하는 것으로 보인다.
칼륨 이온은 하나 이상의 칼륨염으로 제공될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 상기 하나 이상의 칼륨염은 중탄산칼륨, 염화칼륨, 수산화칼륨, L-티로신 이칼륨염, 제2인산칼륨, 제1인산칼륨, 아셀렌산칼륨, 피루브산칼륨, 글루타티온칼륨, D-글루콘산칼륨, 숙신산칼륨 및 아스코르브산칼륨으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 칼륨염은 중탄산칼륨, 염화칼륨, 수산화칼륨, L-티로신 이칼륨염, 제2인산칼륨 및 제1인산칼륨이다. 바람직하게는, 배지의 삼투 몰농도는 칼륨염의 첨가로 인해 변화되지는 않는다. 이는 나트륨염을 상응하는 칼륨염으로 대체함으로써 달성될 수 있다. 따라서, 통상의 기술자라면 세포 배양 배지에 통상적으로 사용되는 임의의 나트륨 염이 상기 상응하는 칼륨염으로서 사용하기에 바람직한 염이라는 것을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명의 무혈청 관류 배지 중의 바람직한 나트륨 이온 농도는 100 mM 미만, 보다 바람직하게는 60 mM 미만, 보다 더 바람직하게는 10-50 mM이다. 나트륨 이온은 하나 이상의 칼륨염으로 제공될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 상기 하나 이상의 나트륨염은 중탄산나트륨, 염화나트륨, 수산화나트륨, L-티로신 이나트륨염, 제2인산나트륨, 제1인산나트륨, 아셀렌산나트륨, 피루브산나트륨, 글루타티온나트륨, D-글루콘산나트륨, 숙신산나트륨 및 아스코르브산나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 나트륨염은 중탄산나트륨, 염화나트륨, 수산화나트륨, L-티로신 이나트륨염, 제2인산나트륨 및 제1인산나트륨이다.
본 발명의 무혈청 관류 배지의 삼투 몰농도는 300 내지 1400 mOsmol/kg, 바람직하게는 300 내지 500 mOsmol/kg, 보다 바람직하게는 330 내지 450 mOsmol/kg, 보다 더 바람직하게는 360 내지 390 mOsmol/kg의 범위 이내여야 한다. 여기서, 상기 삼투 몰농도는 mOsmol/kg 물로서 제시된다.
본 발명의 무혈청 관류 배지는 화학적으로 규명된 조성을 갖고/갖거나 가수분해물을 함유하지 않을 수 있다. 가수분해산물을 함유하지 않는다는 것은, 해당 배지가 동물, 식물 (대두, 감자, 쌀), 효모 또는 다른 공급원에서 유래된 단백질 가수분해산물을 함유하지 않는다는 것을 의미한다. 일반적으로, 화학적으로 규명된 조성을 갖는 배지는 가수분해산물을 함유하지 않는다. 어떤 경우가 됐건간에, 상기 무혈청 관류 배지는 동물 공급원으로부터 유래된 화합물, 특히 동물로부터 유래하여 분리된 단백질 또는 펩타이드(이것은 세포 배양으로 생성된 재조합 단백질을 포함하지 않음)를 함유하지 않아야 한다. 바람직하게는, 상기 무혈청 관류 배지는 단백질을 함유하지 않거나, 또는 재조합 인슐린 및/또는 인슐린 유사 성장 인자를 제외하고는 단백질을 함유하지 않는다. 보다 바람직하게는, 상기 무혈청 관류 배지는 화학적으로 규명된 조성을 가지며, 단백질을 함유하지 않거나, 또는 재조합 인슐린 및/또는 인슐린 유사 성장 인자를 제외하고는 단백질을 함유하지 않는다.
또 다른 양태에서, 생산 단계 동안 포유동물 세포를 관류 배양으로 배양하거나, 또는 관류 배양에서 총 세포 배출 부피를 감소시키기 위한 본 발명의 무혈청 관류 배지의 용도가 제공된다. 다른 대안으로, 관류 세포 배양에서 단백질 생산을 증가시키기 위한 본 발명의 무혈청 관류 배지의 용도가 제공된다. 상기 배지의 용도는 본 발명의 방법에 사용되는 무혈청 관류 배지 (단계 (c))에 대해 개시된 바와 같다.
실시예
실시예 1: 총생산성에 대한 세포 배출의 효과.
아래와 같이 2개의 서로 다른 재순환 장치를 이용하여 3L의 유리 관류 생물반응기 중에서 2L의 작업 부피로 단일클론성 항체를 생성하는 CHO 세포주를 배양하였다: ATF#1과 ATF#2는 ATF2 장치 [미국 매사추세츠주 월섬 소재의 레플리젠 제조]를 사용하여 복제하였으며, TFF 생물반응기는 원심분리 펌프 [스위스 취리히 소재의 레비트로닉스 제조]를 사용하였다. 사용된 중공 섬유는 0.2 ㎛의 공극 크기 및 1mm의 내강 ID를 갖는 폴리에테르설폰 (PES)이었다. 전체 세포 배양 기간 동안 Na:K 농도비가 9인 관류 배지를 사용 하였다. 재순환 속도 및 관류 속도는 3개의 모든 반응기에서 일정하게 유지하였다. 수확물 (투과물) 스트림 (회수된 생성물) 및 생물반응기 내용물 (반응기 역가)에 대하여 매일 역가를 측정하여, 생물반응기 역가와 동일한 것으로 추정되는 세포 배출물의 역가를 갖는, 중공 섬유를 가로질러 체질되는 임의의 생성물을 확인하였다. 세포 배양 종료시 (29일째)에 생성된 총 그램은 아래의 계산에 따라 추산하였다:
도 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 세포 배출물은 정상 상태의 관류 공정에서 약 30%의 전체 생성물 손실량을 차지할 수 있다.
실시예 2: 심정 관류 모델에서 Na+/K+ 농도의 변화에 대한 세포 증식 및 생산성 반응.
관류를 위해 화학적으로 조성이 규명된 무혈청 배지를 모든 배지 실험의 백그라운드로 사용하였다. Na+ 및 K+의 수준은, 0.3 내지 무한대 (K+ 없음)의 Na+/K+ 비율에 도달한 경우에 변경하였다. 이는 삼투 몰농도를 변화시키지 않고 배지 성분인 염화나트륨 (NaCl), 수산화나트륨 (NaOH) 및 중탄산나트륨 (NaHCO3)을 각각의 칼륨 형태로 교환하여 하기의 시험된 모든 배지들에 대해 표 2에 나타낸 최종 Na 및 K 농도를 수득함으로써 달성되었다. 배지의 최종 삼투 몰농도는 모든 조건에서 360-390 mosmol/kg(물)이었다. 단일클론성 항체 mAb1 (IgG1)을 생성하는 재조합 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (CHO-DG44)를 사용하였다. 해동된 접종원 배양물을 화학적으로 규명된 조성을 갖는 무혈청 접종 배지 중에서 증식시켜 목표한 세포 밀도에 도달할 때까지 진탕 플라스크에서 유지시켰다. 심정 플레이트 작업을 위한 세포를 미리 멸균시킨 Axygen 24 웰 심정 플레이트 내로 직접 접종하였다 [미국 뉴저지주 헤인스포트 소재의 네타 사이언티픽 인코포레이티드(Neta Scientific Inc.)]. 심정 플레이트 모델 작업에 20e6 개의 세포/mL의 출발 세포 밀도를 사용하여, 관류의 높은 세포 밀도상을 시뮬레이션하고 배지 깊이를 시험하였다. 진탕 플라스크 배양으로부터 이러한 높은 세포 밀도를 달성하기 위해, 필요한 부피를 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 세포 펠렛을 관류 배지 중에 원하는 밀도로 재현탁시킨 후 심정 플레이트에 배분하였다. 웰당 작업 부피는 3 mL였다. 궤도 직경이 5.0 cm인 항온배양기에서 5% CO2, 80% 습도 및 200 rpm에서 33℃로 세포를 증식시켰다. 플레이트를 1200 rpm으로 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거한 후, 일당 2/3 용기 부피 (VVD)의 교환 속도로 신선한 배지에서 세포를 재현탁시킴으로써 배지의 교환을 매일 수행하였다.
심정 배양 5일째에 세포 주기 분석을 수행하였다. Na:K 2 (K = 37 mM) 또는 Na:K 0.5 (K = 76 mM)를 함유하는 배지 중에서 세포를 증식시키고, 5일째에 차가운 PBS 중에서 2회 세척하여 고정시킨 후 70% 에탄올 중에 현탁시켰다. 다음으로, DNA 함량을 위해 RNase (BD Biosciences)를 함유하는 요오드화 프로피디움으로 세포를 염색하고, Guava easyCyte 유세포 측정기 (EMD Millipore) 상에서 유세포 계측으로 분석하였다.
시험된 농도 범위에 대하여, 누적 비증식속도 (SGR) 및 누적 세포 비생산성 (qp)의 등고선 그래프를 도 2a와 도 2b에 도시하였다. 반응의 정도는 대조군 조건인 Na = 78 mM, K = 37 mM (Na:K 2)와의 차이의 비율로 나타내며, 어두운 영역은 세포 증식이 낮거나 비생산성이 높은 상태를 나타낸다. 점선은 표기된 바와 같은 Na:K 비율을 나타낸다. 세포 증식 및 세포 비생산성은 모두 Na 및 K 농도에 따라 달라지는데, 높은 생산성과 느린 세포 증식은 높은 K 수준에서 나타난다. 더 높은 Na:K 비율 (Na:K >2)은 1 미만의 Na:K 비율에 비해 생산성이 더 낮고 세포 증식율이 더 높은 영역을 포함한다.
세포 배양의 전체 시간 동안의 예시적인 생존 세포 밀도 (VCD) 및 생존율 그래프를 도 2c 및 2d에 나타내었다. Na:K 비율이 감소되면 시간이 지남에 따라 생존 세포 밀도가 감소하였는데, 이는 비증식속도가 낮음을 나타내는 것인 반면에 (도 2c), 생존율은 총 7일간의 배양 동안 일관되게 높게 유지되었다 (>85%) (도 2d).
다른 Na+/K+ 농도로 처리된 CHO 세포에 대한 세포 주기 분석 결과는 도 3에 나타내었다. sub G0 및 G0/1 단계에서는 세포의 비율이 증가했던 반면에, S 및 G2/M 단계의 세포의 비율은 Na:K 2 배지에 비해 Na:K 0.5 배지 중에서 배양된 CHO 세포에서 감소했다 (그림 3(A)). 이러한 사실은, Na:K 2 배지와 비교한 Na:K 0.5 배지 중에서 배양된 CHO 세포에 대한 G0/1:G2/M 비율을 나타내고 있는 도 3(B)로부터 더욱 명백하게 알 수 있다. 이는 칼륨에 대한 나트륨 비율을 낮추면 G0/1 단계에서 세포가 정지된다는 점을 확인시켜 주는 것이다.
실시예 3: 2L 관류 반응기에서의 세포 성능.
서로 다른 단일클론성 항체들을 발현하는 3개의 CHO 세포주를 평가하였다. 목표한 세포 밀도가 달성될 때까지 생물반응기 배양용 세포를 동일한 관류 배지(9 Na+/K+) 중에서 증식시킨 후, 0.5 Na:K 배지 (~76 mM의 K)로 전환하거나 또는 9 Na:K 배지 (12 mM의 K)에 잔류시켰다. 모든 관류 생물반응기에서 사용한 중공 섬유는 0.2 ㎛의 공극 크기 및 1mm의 내강 ID를 갖는 폴리에테르설폰 (PES)으로 제조되었다. 모든 실시예에서 사용된 재순환 장치는 ATF2 시스템 (미국 매사추세츠주 월섬 소재의 레플리젠 제조) 또는 원심분리 펌프를 사용하는 TFF 시스템 (스위스 취리히 소재의 레비트로닉스 제조)이었다. 상기 두 시스템은 2L 규모로 서로 교환이 가능한 것으로 입증된 바 있다. 모든 연구는 3L의 유리 교반형 탱크 생물반응기 중에서 2L의 작업 부피로 수행하였다 [네덜란드 델프트 소재의 애플리콘 바이오테크놀로지(Applikon Biotechnology) 제조]. 각 세포주에 대해 최소 세포 비관류속도를 확정하였는데, 정상 상태에서 0.03 내지 0.08 nL/세포/일의 범위였다. 상기 관류 속도는 동일한 세포주에 대해 서로 다른 배지 조건들 간에도 동일하게 유지하였다. 생존 세포 밀도는 인사이트 탐침센서 (미국 네바다주 레노 소재의 해밀턴 제조)를 사용한 온라인 피드백에 의해 제어되는 세포 배출에 의해 시간의 경과에 따라 일정하게 유지하였다. 본 실험에 사용된 세포주들은, mAb1을 발현하는 CHO-DG44 세포 (저생산율 세포주의 예; qp < 20 pg/세포/일), mAb2를 발현하는 CHO-K1 세포 (중간 생산율 세포주의 예; 20 pg/세포/일 <qp< 40 pg/세포/일) 및 mAb3을 발현하는 CHO-K1 세포 (고생산율 세포주의 예; qp > 50 pg/세포/일)였다.
추가로, 상기 3개의 세포주에서 글리코실화 패턴, 산성 및 염기성종 또는 고분자량 및 저분자량 종에 대한 특이적 효과를 분석하였다. 3개의 세포주 모두에 대하여, 감소된 Na:K 비율의 반응기 및 대조군 배지 (Na:K 9)의 반응기에서 세포 배양 기간 동안에 투과물을 매일 수집하였다. 산성 및 염기성종은 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX), 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의한 고분자량 및 저분자량 종, 및 2-AA 친수성 상호작용 액체 크로마토 그래피 (HILIC)에 의한 N-글리칸에 의해 측정하였다. 크로마토그램을 종 백분율에 대해 분석하였다.
예시적인 일일 qp, SGR, 생존율 및 세포 배출에 대한 그래프를 도 4a 내지 4d에서 중간 생성율 세포주 (mAb2)에 대해 나타내었다. 도 4a로부터 알 수 있는 바와 같이, Na:K 9 배지 중에 유지시킨 대조군 세포와 비교했을 때, 배양 배지를 10일째에 Na:K 0.5 배지로 전환시킨 직후에 세포 비생산성이 증가되었다. 동시에, 비증식속도는 대조군 세포에 비해 더 빠르게 감소하였으며 전체 수준도 낮아졌다 (도 4b). 이러한 사실도 역시 일정한 생존 세포 밀도를 유지하는 데 필요한 훨씬 더 낮은 배출 유량 (그림 4d)으로 반영되어 있다 (데이터는 나타내지 않음). Na:K 비율을 0.5로 줄였더니 세포 생존율에 영향을 미치지 않았다 (그림 4c).
3개의 세포주 모두에 대한 최종 총 배출 부피를 표 3에 나타내었다. 배출 부피는 대조군 (Na/K 9 조건)에 대해 보정하였고, Na/K 9 조건에 대한 Na/K 0.5 조건의 백분율로 나타내었다.
서로 다른 단일클론성 항체를 발현하여 생산성이 서로 다른 3개의 다른 CHO 세포주들에 대하여, 관류 배양 22일째에 2개의 서로 다른 배지 간의 평균 qp 및 SGR의 차이를 도 5에 나타내었다. 평균 qp 및 평균 SGR은, 배지를 전환하기 전에 이들의 각 수치로 보정한 배지 전환 후의 평균 qp 및 SGR로 나타냈다 (즉, mAb1 및 mAb3에 대해서는 10-22일/0-10 및 mAb2에 대해서는 12-22일/0-12일). 3개의 CHO 세포주 모두 Na:K 0.5 배지로 전환된 후 비증식속도가 감소하였다. 상기 효과는 CHO-DG44 mAb1 및 CHO-K1 mAb2에서 가장 두드러졌으며, CHO-DG44 mAb1에 훨씬 더 강력한 효과를 나타내었다. Na:K 비율을 감소시킨 배지에서 CHO-K1 mAb3 (IgG4)의 비증식속도가 감소하는 경향이 있기는 하지만, 이러한 차이는 통계적으로 유의성은 없다. CHO-K1 mAb3 세포에 대한 일일 증식속도의 평가를 통해서, 배지를 더 낮은 Na:K 비율로 전환시킨 후의 증식 속도는 시간이 경과함에 따라 배지를 전환시키기 전날의 SGR에 비해 약 0.2로 감소되었던 반면에, 대조군 배양물에서의 증식 속도는 배지를 전환시키기 전날의 SGR에 비해 22일째까지 약 0.6으로 안정적으로 유지되었음을 알 수 있었다. 시험된 다른 2개의 세포주와 비교하여, CHO-DG44 mAb3은 배지 전환에 대한 반응 시간이 더 느린 것 같았다. 따라서, 배양 기간이 연장되었다면 평균 증식 속도는 상당한 차이를 나타내고 있는 것으로 생각할 수 있다. 동시에, 세포의 비생산성은, Na:K 비율을 감소시킨 배지 중에서 배양하는 경우에 3개의 세포주 모두에서 통계적으로 유의하게 증가된다. 상기 효과는 CHO-K1 mAb2에서 가장 두드러졌다. CHO-DG44 mAb1 및 CHO-K1 mAb3에 있어서의 증가는 약간 덜 두드러진 수준으로 유사하였으나, 통계적으로 유의성이 있었다.
시험된 상기 3개의 세포주에서 글리코실화 패턴, 산성 및 염기성종 또는 고분자량 및 저분자량 종에 대한 특이적 효과는 관찰되지 않았다.
상기 내용에 비추어 볼 때, 본 발명은 아래의 항목들에 관한 것임도 알 수 있을 것이다:
본 발명의 골자항목들
1. 이종성 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 관류 세포 배양으로 배양하는 방법으로서,
(a) 이종성 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 무혈청 배양 배지 중에 접종하는 단계;
(b) 상기 포유동물 세포를 무혈청 관류 배지를 사용한 관류에 의해 증식 단계 동안 배양하는 단계; 및
(c) 30 mM 내지 250 mM의 농도 및 1 미만의 칼륨 이온에 대한 나트륨 이온의 몰비로 칼륨 이온을 포함하는 무혈청 관류 배지를 사용한 관류에 의해 생산 단계 동안 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함하고,
이때 단계 (b)는 선택적인 것인, 방법
2. 이종성 단백질을 발현시키는 관류 세포 배양에서 세포 배출(cell bleeding)을 감소시키는 방법으로서,
(a) 이종성 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 무혈청 배양 배지 중에 접종하는 단계;
(b) 상기 포유동물 세포를 무혈청 관류 배지를 사용한 관류에 의해 증식 단계 동안 배양하는 단계; 및
(c) 30 mM 내지 250 mM의 농도 및 1 미만의 칼륨 이온에 대한 나트륨 이온의 몰비로 칼륨 이온을 포함하는 무혈청 관류 배지를 사용한 관류에 의해 생산 단계 동안 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함하고,
이때 단계 (b)는 선택적인 것인, 방법
3. 이종성 단백질을 발현시키는 관류 세포 배양에서 단백질 생산을 증가시키는 방법으로서,
(a) 이종성 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 무혈청 배양 배지 중에 접종하는 단계;
(b) 상기 포유동물 세포를 무혈청 관류 배지를 사용한 관류에 의해 증식 단계 동안 배양하는 단계; 및
(c) 30 mM 내지 250 mM의 농도 및 1 미만의 칼륨 이온에 대한 나트륨 이온의 몰비로 칼륨 이온을 포함하는 무혈청 관류 배지를 사용한 관류에 의해 생산 단계 동안 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함하고,
이때 단계 (b)는 선택적인 것인, 방법
4. 제1항목 내지 제3항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (c)가 세포 배출에 의해 세포 밀도를 유지하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
5. 제4항목에 있어서, 상기 세포 배출이, 30 mM 미만의 농도 및 2 이상의 칼륨에 대한 나트륨의 몰비로 칼륨 이온을 포함하는 동일한 무혈청 관류 배지를 사용하여 동일한 조건 하에 배양되는 관류 세포 배양에 비해 감소되는 것인, 방법.
6. 제1항목 내지 제5항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 칼륨 이온의 농도가 약 40 mM 내지 약 200 mM, 바람직하게는 약 60 mM 내지 약 150 mM, 보다 바람직하게는 약 80 mM 내지 약 100 mM인 것인, 방법.
7. 제1항목 내지 제6항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 칼륨에 대한 나트륨의 몰비가 약 0.9 내지 0.1, 약 0.8 내지 0.2, 약 0.7 내지 0.2, 바람직하게는 약 0.6 내지 0.3, 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 0.4인 것인, 방법.
8. 제1항목 내지 제7항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 칼륨 이온이 하나 이상의 칼륨염으로서 제공되는 것인, 방법.
9. 제8항목에 있어서, 상기 하나 이상의 칼륨염이 중탄산칼륨, 염화칼륨, 수산화칼륨, L-티로신 이칼륨염, 제2인산칼륨, 제1인산칼륨, 아셀렌산칼륨, 피루브산칼륨, 글루타티온칼륨, D-글루콘산칼륨, 숙신산칼륨 및 아스코르브산칼륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
10. 제9항목에 있어서, 상기 하나 이상의 칼륨염이 무혈청 관류 배양 배지 내의 상응하는 나트륨염을 대체하는 것인, 방법.
11. 제10항목에 있어서, 상기 칼륨 이온이 하나 이상의 칼륨염으로서 제공되고, 상기 하나 이상의 칼륨염이 단계 (b)의 무혈청 관류 배지 내의 상응하는 나트륨염을 대체하는 것인, 방법.
12. 제1항목 내지 제10항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 포유동물 세포가 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포인 것인, 방법.
13. 제12항목에 있어서, 상기 CHO 세포가 CHO-DG44 세포, CHO-K1 세포, CHO DXB11 세포, CHO-S 세포, CHO GS 결핍성 세포 또는 임의의 상기 세포들의 유도체인 것인, 방법.
14. 제1항목 내지 제13항목 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 (a)의 무혈청 배양 배지 및 단계 (b)의 무혈청 관류 배지가 30 mM 미만으로 칼륨 이온을 포함하는 것인, 방법.
15. 제1항목 내지 제14항목 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 (b)의 관류를 세포 배양 2일째에 또는 그 후에 시작하는 것인, 방법.
16. 제1항목 내지 제15항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 관류가 연속적인 관류를 포함하는 것인, 방법.
17. 제1항목 내지 제16항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 관류 속도가 관류 시작 후에 증가하는 것인, 방법.
18. 제17항목에 있어서, 상기 관류 속도가 0.5 용기 부피/일 이하에서 5 용기 부피/일로 증가하는 것인, 방법.
19. 제18항목에 있어서, 상기 관류 속도가 0.5 용기 부피/일 이하에서 2 용기 부피/일로 증가하는 것인, 방법.
20. 제1항목 내지 제19항목 중 어느 한 항목에 있어서, 관류 세포 배양물로부터 이종성 단백질을 수확하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
21. 제1항목 내지 제20항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 이종성 단백질이 치료용 단백질인 것인, 방법.
22. 제21항목에 있어서, 상기 치료용 단백질이 항체, 융합 단백질, 사이토카인 및 성장 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
23. 제1항목 내지 제22항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 무혈청 관류 배지가 화학적으로 규명된 조성을 갖는 것인, 방법.
24. 제1항목 내지 제23항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 무혈청 관류 배지가 가수분해산물을 함유하지 않는 것인, 방법.
25. 제1항목 내지 제24항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 무혈청 관류 배지가 재조합 인슐린 및/또는 인슐린 유사 성장 인자를 제외하고는 단백질을 함유하지 않는 것인, 방법.
26. 제1항목 내지 제24항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 무혈청 관류 배지가 단백질을 함유하지 않는 것인, 방법.
27. 제1항목 내지 제26항목 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 (c)는 10×106 개의 세포/ml 내지 약 120×106 개의 세포/ml의 세포 밀도에 도달되면 시작하는 것인, 방법.
28. 제1항목 내지 제27항목 중 어느 한 항목에 있어서, 배지 중의 삼투 몰농도가 300 내지 1400 mOsmol/kg, 바람직하게는 300 내지 500 mOsmol/kg인 것인, 방법.
29. 제1항목 내지 제28항목 중 어느 한 항목의 방법을 사용하여 치료용 단백질을 생산하는 방법.
30. 제29항목에 있어서, 포유동물 세포에 의해 발현된 상기 이종성 단백질이 치료용 단백질이고, 이때 상기 치료용 단백질을 정제하여 약제학적으로 허용가능한 제제로 제제화시키는 것인, 방법.
31. 30 mM 내지 250 mM의 농도 및 1 미만의 칼륨 이온에 대한 나트륨 이온의 몰비로 칼륨 이온을 포함하는 무혈청 관류 배지.
32. 제31항목에 있어서, 상기 칼륨 이온의 농도가 약 40 mM 내지 약 200 mM, 바람직하게는 약 60 mM 내지 약 150 mM, 보다 바람직하게는 약 80 mM 내지 약 100 mM인 것인, 무혈청 관류 배지.
33. 제31항목 또는 제32항목에 있어서, 상기 칼륨에 대한 나트륨의 몰비가 약 0.9 내지 0.1, 약 0.8 내지 0.2, 약 0.7 내지 0.2, 바람직하게는 약 0.6 내지 0.3, 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 0.4인 것인, 무혈청 관류 배지.
34. 제31항목 내지 제33항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 칼륨 이온이 하나 이상의 칼륨염으로서 제공되는 것인, 무혈청 관류 배지.
35. 제34항목에 있어서, 상기 하나 이상의 칼륨염이 중탄산칼륨, 염화칼륨, 수산화칼륨, L-티로신 이칼륨염, 제2인산칼륨, 제1인산칼륨, 아셀렌산칼륨, 피루브산칼륨, 글루타티온칼륨, D-글루콘산칼륨, 숙신산칼륨 및 아스코르브산칼륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 무혈청 관류 배지.
36. 제35항목에 있어서, 상기 하나 이상의 칼륨염 및/또는 수산화칼륨이 무혈청 관류 배양 배지 내의 상응하는 나트륨염을 대체하는 것인, 무혈청 관류 배지.
37. 제31항목 내지 제36항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 무혈청 관류 배지가 화학적으로 규명된 조성을 갖는 것인, 무혈청 관류 배지.
38. 제31항목 내지 제37항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 무혈청 관류 배지가 가수분해산물을 함유하지 않는 것인, 무혈청 관류 배지.
39. 제31항목 내지 제38항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 무혈청 관류 배지가 재조합 인슐린 및/또는 인슐린 유사 성장 인자를 제외하고는 단백질을 함유하지 않는 것인, 무혈청 관류 배지.
40. 제31항목 내지 제38항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 무혈청 관류 배지가 가수분해산물을 함유하지 않는 것인, 무혈청 관류 배지.
41. 제31항목 내지 제40항목 중 어느 한 항목에 있어서, 배지 중의 삼투 몰농도가 300 내지 1400 mOsmol/kg, 바람직하게는 300 내지 500 mOsmol/kg인 것인, 무혈청 관류 배지.
42. 생산 단계 동안 포유동물 세포를 관류 배양으로 배양하기 위한, 제31항목 내지 제41항목 중 어느 한 항목의 무혈청 관류 배지의 용도.
43. 관류 배양에서 총 세포 배출 부피를 감소시키기 위한, 제31항목 내지 제41항목 중 어느 한 항목의 무혈청 관류 배지의 용도.
44. 관류 세포 배양에서 단백질 생산을 증가시키기 위한, 제31항목 내지 제41항목 중 어느 한 항목의 무혈청 관류 배지의 용도.
45. 관류 세포 배양에서 세포 단백질의 비생산성을 증가시키기 위한, 제31항목 내지 제41항목 중 어느 한 항목의 무혈청 관류 배지의 용도.
Claims (26)
- 이종성 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 관류 세포 배양으로 배양하는 방법으로서,
(a) 이종성 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 무혈청 배양 배지 중에 접종하는 단계; 및
(c) 상기 포유동물 세포를, 30 mM 내지 250 mM 농도의 칼륨 이온을 포함하고 칼륨 이온에 대한 나트륨 이온의 몰비가 1 미만인 무혈청 관류 배지를 사용한 관류에 의해 생산 단계 동안 배양하는 단계를 포함하고,
이때, 상기 무혈청 관류 배지의 삼투 몰농도는 300 내지 500 mOsmol/kg인, 방법. - 이종성 단백질을 발현시키는 관류 세포 배양에서 세포 배출(cell bleeding)을 감소시키는 방법으로서,
(a) 이종성 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 무혈청 배양 배지 중에 접종하는 단계; 및
(c) 상기 포유동물 세포를, 30 mM 내지 250 mM 농도의 칼륨 이온을 포함하고 칼륨 이온에 대한 나트륨 이온의 몰비가 1 미만인 무혈청 관류 배지를 사용한 관류에 의해 생산 단계 동안 배양하는 단계를 포함하고,
이때, 상기 무혈청 관류 배지의 삼투 몰농도는 300 내지 500 mOsmol/kg인, 방법. - 이종성 단백질을 발현시키는 관류 세포 배양에서 단백질 생산을 증가시키는 방법으로서,
(a) 이종성 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 무혈청 배양 배지 중에 접종하는 단계; 및
(c) 상기 포유동물 세포를, 30 mM 내지 250 mM 농도의 칼륨 이온을 포함하고 칼륨 이온에 대한 나트륨 이온의 몰비가 1 미만인 무혈청 관류 배지를 사용한 관류에 의해 생산 단계 동안 배양하는 단계를 포함하고,
이때, 상기 무혈청 관류 배지의 삼투 몰농도는 300 내지 500 mOsmol/kg인, 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)가 세포 배출에 의해 세포 밀도를 유지하는 것을 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 칼륨 이온의 농도가 40 mM 내지 200 mM인 것인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 칼륨에 대한 나트륨의 몰비가 0.9 내지 0.1, 0.8 내지 0.2, 또는 0.7 내지 0.2인 것인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 칼륨 이온이 하나 이상의 칼륨염으로서 제공되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포인 것인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 단백질이 치료용 단백질인 것인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 치료용 단백질을 생산하는 방법.
- 30 mM 내지 250 mM 농도의 칼륨 이온을 포함하고 칼륨 이온에 대한 나트륨 이온의 몰비가 1 미만인 무혈청 관류 배지로서, 상기 무혈청 관류 배지의 삼투 몰농도가 300 내지 500 mOsmol/kg인, 무혈청 관류 배지.
- 제11항에 있어서, 생산 단계 동안 포유동물 세포를 관류 배양으로 배양하기 위한, 무혈청 관류 배지.
- 제11항에 있어서, 관류 배양에서 총 세포 배출 부피를 감소시키기 위한, 무혈청 관류 배지.
- 제11항에 있어서, 관류 세포 배양에서 단백질 생산을 증가시키기 위한, 무혈청 관류 배지.
- 제11항에 있어서, 관류 세포 배양에서 세포 단백질의 비생산성(specific productivity)을 증가시키기 위한, 무혈청 관류 배지.
- 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)와 단계 (c) 사이에, (b) 상기 포유동물 세포를 무혈청 관류 배지를 사용한 관류에 의해 증식 단계 동안 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 세포 배출이, 30 mM 미만 농도의 칼륨 이온을 포함하고 칼륨에 대한 나트륨의 몰비가 2 이상인 동일한 무혈청 관류 배지를 사용하여 동일한 조건 하에 배양되는 관류 세포 배양에 비해 감소되는 것인, 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 칼륨 이온의 농도가 60 mM 내지 150 mM인 것인, 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 칼륨 이온의 농도가 80 mM 내지 100 mM인 것인, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 칼륨에 대한 나트륨의 몰비가 0.6 내지 0.3인 것인, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 칼륨에 대한 나트륨의 몰비가 0.5 내지 0.4인 것인, 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 하나 이상의 칼륨염이 중탄산칼륨, 염화칼륨, 수산화칼륨, L-티로신 이칼륨염, 제2인산칼륨(potassium phosphate dibasic), 제1인산칼륨(potassium phosphate monobasic), 아셀렌산칼륨, 피루브산칼륨, 글루타티온칼륨, D-글루콘산칼륨, 숙신산칼륨 및 아스코르브산칼륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 하나 이상의 칼륨염은 무혈청 관류 배양 배지 내의 상응하는 나트륨염을 대체하는 것인, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 칼륨 이온이 하나 이상의 칼륨염으로서 제공되며 상기 하나 이상의 칼륨염은 단계 (b)의 무혈청 관류 배지 내의 상응하는 나트륨염을 대체하는 것인, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 CHO-DG44 세포, CHO-K1 세포, CHO DXB11 세포, CHO-S 세포, CHO GS 결핍성 세포 또는 임의의 상기 세포들의 유도체인 것인, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 이종성 단백질이 항체, 융합 단백질, 사이토카인 및 성장 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료용 단백질인 것인, 방법.
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