CN111690057B - 一种重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞重组抗体技术领域,具体涉及一种SP2/0细胞灌注用培养基及重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法,包括培养基配制、瘤细胞驯化、流加培养和抗体纯化;其中的培养器包括反应罐、补充罐和控制器;由于在批次补料的过程中,流加的培养基成分未能完全补充至重组瘤细胞增殖消耗的区域,削弱了流加培养基中营养成分的补充作用,进而影响到重组瘤细胞的增殖效果;故此,本发明通过设置在反应罐内壁上环绕的凹槽,使补充罐中转动摇匀的培养基成分,在额外的动能作用下沿反应罐的内壁冲刷到重组瘤细胞的培养基中,使流加补充的培养基均衡分布在重组瘤细胞间,从而提升了重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法的应用效果。
Description
技术领域
本发明涉及细胞重组抗体技术领域,具体涉及一种重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法。
背景技术
随着人们日常生活中工作犬和宠物犬的大幅增加,犬类的生命健康逐渐受到关注,而其中犬细小病毒是危害犬类的最主要的烈性传染病之一,在临床上主要通过高免血清和单克隆抗体进行治疗;在体外环境中培养犬细小病毒的单克隆抗体成为了临床诊疗的有效手段;SP2/0细胞即为骨髓瘤细胞,其体外无限增殖的特性被用于重组抗体的培养,而体外培养的单克隆抗体表达量处于较低水平,阻碍了犬细小病毒单克隆抗体治疗的推广;关于骨髓瘤细胞重组单克隆抗体的介绍,可参见:黄亚杰等,混合培养基模式培养杂交瘤细胞表达单克隆抗体[J],生物学杂志,2016(No.6),104-109。
为提高体外培养中单克隆抗体的表达量,重组骨髓瘤细胞的培养基优化与培养工艺设计成为关键;出现的无血清培养基中添加几十种成分来满足瘤细胞的增殖,来避免血清成分在瘤细胞增殖中带来肉毒素的风险,以及后续分离纯化的困难,但其繁琐的优化设计带来的单克隆抗体表达量提升有限,同时增加了灌注用培养基持续补充的难度。
现有技术中也出现了一些关于SP2/0细胞灌注用培养基及重组单克隆抗体生产方法的技术方案,如申请号为2009100664783的一项中国专利公开了一种制备单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆用培养基及其制备方法,按常规方法配制RPMI-1640完全培养基,然后分别与一定比例的BHK-21、CRFK、Hela等细胞的无细胞培养上清混合,完全培养基与每种细胞上清的体积比为7:1-1:1;该技术方案所提供的杂交瘤细胞克隆用培养基,可完全省略在常规杂交瘤细胞克隆过程中以BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞的环节,大大简化了克隆操作,并使被克隆细胞的生长速度明显提高;但是该技术方案中未解决在杂交瘤细胞的增殖过程中,批次灌注的培养基在杂交瘤细胞间的分布不均衡问题,降低了其中瘤细胞的存活率,进而削弱了瘤细胞中单克隆抗体的有效表达量。
鉴于此,为了克服上述技术问题,本公司设计研发了一种重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法,采用了特殊的SP2/0细胞灌注用培养基及重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法,解决了上述技术问题。
发明内容
为了弥补现有技术的不足,本发明提出了一种重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法,通过设置在反应罐中切向连通的补料管,与其内壁上环绕的凹槽相配合,使补充罐中转动摇匀的培养基成分,在额外的动能作用下沿反应罐的内壁冲刷到重组瘤细胞的培养基中,使得流加补充的培养基均衡分布在重组瘤细胞间,从而提升了重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法的应用效果。
本发明所述的一种重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法,该方法步骤如下:
S1、培养基配制:选择重组瘤细胞型培养基作为主成分,并准备Tris-HCL缓冲液、乙酸和10%血清浓度的胎牛血清,控制培养基处于pH5.2-6.4的弱酸性状态下;通过设置的缓冲液将培养基的调节为弱酸性的状态,抑制了血清中含有的影响因子活性,且延长了培养基的保质时间;
S2、瘤细胞驯化:将重组处理的SP2/0细胞复苏后接种于S1的培养基中,置于37.2-37.8℃,6-12%二氧化碳的培养箱中,每36-44h进行传代培养,观察细胞增殖的程度,依次降低培养基中1-2%的血清浓度,直至血清浓度递减到3%,获得驯化培养完成的重组瘤细胞;通过在传代培养中逐步降低血清的浓度,提升重组瘤细胞在低血清含量下的适应性,降低培养基中血清带来的负面效果,并提高了重组瘤细胞中产生的单克隆抗体表达量,在血清与培养基中重组瘤细胞间的作用取得平衡;
S3、流加培养:选择S2中驯化完成的重组瘤细胞培养液,进行离心处理并祛除其上清成分,然后转移至培养器中,在每54h内对培养器进行批次补料流加操作,且进一步降低其中的血清浓度至1.5%的水平,控制单次补料流加的培养基占培养器中总体积的5-8%;通过批次流加补料维持重组瘤细胞的灌注培养效果,且控制单次流加更新的物质量,防止重组瘤细胞在大量补料作用下过快的增殖提前将培养基耗尽,而造成自身存活率的下降;
S4、抗体纯化:在对S3中的培养器进行4-5轮的流加培养后,将其加入到洗液瓶中,添加盐酸缓冲液调节其中的pH值在3.6-4.4范围内,然后加入1.1-1.6%的生理盐水,与其中的蛋白质成分反应析出浑浊物,经离心后取其上清成分获得抗体;在洗液瓶中对重组瘤细胞进一步的pH调节,稳定其中抗体成分的活性状态,添加略高浓度的生理盐水,将重组瘤细胞中的蛋白质成分析出,以获得纯化后的单克隆抗体;
SP2/0细胞灌注用培养基,包括以下组分:
1640型培养基40-55份;
CHO型培养基60-70份;
盐酸缓冲液10-15份;
生理盐水120-150份;
胎牛血清20-25份;
蒸馏水50-65份;
通过配比选用现有型号的培养基作为SP2/0细胞灌注用培养基的主要成分,降低了培养基中繁杂成分的配制,在盐酸缓冲液与蒸馏水的调配下,将培养基转化为弱酸性的状态,限制其中SP2/0细胞的活性,稳定其增殖的速率,避免在指数级增殖条件下迅速消耗培养基的营养成分,而降低SP2/0细胞的存活率,利用生理盐水稀释胎牛血清中的血清浓度,在培养基的灌注过程中,逐渐降低其中血清的含量,降低了培养基中血清成分对单克隆抗体生产提纯过程的干扰,替代了无血清成分培养基中大量替代成分的选用添加,从而提升了SP2/0细胞灌注用培养基的应用效果;
其中,S3中所述的培养器包括反应罐、补充罐和控制器;所述反应罐中培养有重组瘤细胞,反应罐上设置有补料管和排渣管;所述补料管与反应罐的侧壁相切,补料管的末端设有补充罐,补料管与补充罐相连通;所述反应罐的内壁上设置有螺旋的凹槽,凹槽的顶端与补料管的端口相连通;所述补充罐的下方设有支腿,补充罐与支腿之间设有转座;所述转座中设置有伺服电机,伺服电机驱动补充罐在支腿上转动起来;所述控制器用于记录培养的时间和控制伺服电机的运行;培养器中的重组瘤细胞在流加培养的过程中,通过控制器的计时将新鲜培养基成分持续供给到重组瘤细胞中,并通过排渣管排出反应罐中消耗的培养基,由于重组瘤细胞的增殖呈量变状态,逐渐消耗了培养基中的营养成分,而在批次补料的过程中,流加的培养基成分未能完全补充至重组瘤细胞增殖消耗的区域,且培养基中的各成分在静置下产生了分层,削弱了流加培养基中营养成分的补充作用,进而影响到重组瘤细胞的增殖效果;因此,本发明通过设置在反应罐内壁上螺旋的凹槽,配合切向连通到反应罐中的补料管,引导其中的培养基成分沿着反应罐的内壁环绕加入,使更新的培养基成分均衡分布在反应罐中,同时在伺服电机的驱动下,补充罐在支腿上呈动态变化的转动,对其中保存的培养基成分起到摇匀作用,并增加了培养基进入反应罐时的动能;本发明利用了设置在反应罐中切向连通的补料管,与其内壁上环绕的凹槽相配合,使补充罐中转动摇匀的培养基成分,在额外的动能作用下沿反应罐的内壁冲刷到重组瘤细胞的培养基中,使得流加补充的培养基均衡分布在重组瘤细胞间,从而提升了重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法的应用效果。
优选的,所述补充罐上设有槽环,槽环转动安装在补充罐的外壁上;所述槽环的内侧与补充罐相连通,槽环的外侧连通有固定的补料管;在重组瘤细胞的过程中,需要控制补充罐处于静止状态,然后通过连通的补料管添加新鲜的培养基成分,而削弱了补充罐转动中营养成分的混匀程度,进而影响到反应罐中重组瘤细胞的增殖效果;通过设置在补充罐上转动的槽环,使固定的补料管连通到槽环上,在补充罐转动混匀其中培养基成分的过程中,同时通过补料管对反应罐进行培养基的更新,确保了补充罐转动状态下的补料管的运行,从而提升了重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法的应用效果。
优选的,所述槽环中设置有滑动的槽盘,槽盘垂直于槽环的内壁;所述槽盘安装在补充罐的侧壁上,槽盘随补充罐的转动在槽环中扫掠而过;补料管通过转动的槽环使补充罐中的培养基均匀流加至反应罐中,而在补充罐转动过程中的培养基会离心至槽环上的各个位置,未通过补料管流加到反应罐中,造成了培养基的浪费;通过设置在槽环中滑动的槽盘,将槽盘安装在补充罐上,将槽环中各处的培养基通过扫掠的槽盘转移至补料管的位置,流加到反应罐中,避免了槽环中培养基的浪费,从而提升了重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法的应用效果。
优选的,所述排渣管的端口上设置有隔膜,隔膜使反应罐中的培养液与外部的气压维持平衡;所述隔膜在流加培养基的增量作用力下形变开启排渣管,隔膜在排出相应量的培养基后形变恢复使排渣管的闭合起来;在对反应罐进行流加培养基的过程中,需要同时将耗尽营养成分的培养基排出,维持反应罐中培养基的体积处于稳定范围内,通过补料管和凹槽加入的培养基中,会存在附着在管壁及槽壁的部分,降低了最终加入至重组瘤细胞的培养基有效含量,而固定的排出量会造成反应罐中培养基的失衡,最终影响到重组瘤细胞的增殖效果;通过设置在排渣管上的隔膜,将流加至反应罐内部培养基增量的重力作用在隔膜上,排除了附着在流加管路上培养基减量的干扰,利用隔膜自身的形变特性使反应罐中作用到重组瘤细胞的培养基维持在恒定的范围内,从而提升了重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法的应用效果。
优选的,所述排渣管的中心设有轴杆,轴杆上设置有浆轮,轴杆的顶部贯穿隔膜伸入至反应罐内;所述轴杆的顶端设置有扣盖,轴杆通过扣盖转动安装在排渣管中;所述扣盖的侧壁上设置有环绕的排渣口,扣盖的周向上设置有伸出的拨条,拨条与反应罐的底面滑动接触;重组瘤细胞转化培养基的残渣会散步沉降在反应罐底面上,而在排渣管开启的状态下,培养基的液体会沿着排渣管的端口产生涡流,在与残渣的混合作用下,加大了对隔膜的冲击力,不同惯性力的作用下使隔膜的形变恢复状态受干扰,造成了反应罐中培养基的过度排出,且反应罐底面边缘的残渣难以随排渣管端口的涡流排出,降低了反应罐中重组瘤细胞的培养效果;通过设置在排渣管中的轴杆,配合排渣管顶端转动安装的扣盖,在排渣管开启后,通过排渣口流向排渣管中的涡流作用到浆轮上,使轴杆带动扣盖转动起来,扣盖上的拨条在反应罐的底面滑动扫过,将其边缘处的残渣搅动起来,随排渣管的端口排出,同时扣盖上的排渣口限制了单位时间的流通量,避免在过大涡流效应作用下的惯性力破坏了隔膜的形变状态,从而提升了重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法的应用效果。
本发明的有益效果如下:
1.本发明通过设置在反应罐中切向连通的补料管,与其内壁上环绕的凹槽相配合,使得流加补充的培养基均衡分布在重组瘤细胞间;设置在补充罐上转动的槽环,在补充罐转动混匀其培养基成分的过程中,确保了补充罐转动状态下的补料管的运行;设置在槽环中滑动的槽盘,将槽环中各处的培养基通过扫掠至补料管的位置,避免了槽环中培养基的浪费。
2.本发明通过设置在排渣管上的隔膜,将流加至反应罐内部培养基增量的重力作用在隔膜上,排除了附着在流加管路上培养基减量的干扰,使反应罐中的培养基维持在恒定的范围内;设置在排渣管中的轴杆配合转动安装的扣盖,使轴杆上的浆轮带动扣盖转动起来,扣盖上的拨条将反应罐底面边缘处的残渣搅动起来,同时扣盖上的排渣口限制了单位时间的流通量,避免在过大涡流效应作用下的惯性力破坏了隔膜的形变状态。
附图说明
下面结合附图和实施方式对本发明进一步说明。
图1是本发明中重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法的流程图;
图2是本发明中培养器的立体图;
图3是本发明中排渣管部件的立体图;
图4是图2中的A处局部放大图;
图5是图2中的B处局部放大图;
图中:反应罐1、补料管11、排渣管12、隔膜121、凹槽13、补充罐2、槽环21、槽盘22、支腿3、转座4、伺服电机41、轴杆5、浆轮51、扣盖52、排渣口53、拨条54。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解,下面结合具体实施方式,进一步阐述本发明。
如图1至图5所示,本发明所述的一种重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法,该方法步骤如下:
S1、培养基配制:选择重组瘤细胞型培养基作为主成分,并准备Tris-HCL缓冲液、乙酸和10%血清浓度的胎牛血清,控制培养基处于pH5.2-6.4的弱酸性状态下;通过设置的缓冲液将培养基的调节为弱酸性的状态,抑制了血清中含有的影响因子活性,且延长了培养基的保质时间;
S2、瘤细胞驯化:将重组处理的SP2/0细胞复苏后接种于S1的培养基中,置于37.2-37.8℃,6-12%二氧化碳的培养箱中,每36-44h进行传代培养,观察细胞增殖的程度,依次降低培养基中1-2%的血清浓度,直至血清浓度递减到3%,获得驯化培养完成的重组瘤细胞;通过在传代培养中逐步降低血清的浓度,提升重组瘤细胞在低血清含量下的适应性,降低培养基中血清带来的负面效果,并提高了重组瘤细胞中产生的单克隆抗体表达量,在血清与培养基中重组瘤细胞间的作用取得平衡;
S3、流加培养:选择S2中驯化完成的重组瘤细胞培养液,进行离心处理并祛除其上清成分,然后转移至培养器中,在每54h内对培养器进行批次补料流加操作,且进一步降低其中的血清浓度至1.5%的水平,控制单次补料流加的培养基占培养器中总体积的5-8%;通过批次流加补料维持重组瘤细胞的灌注培养效果,且控制单次流加更新的物质量,防止重组瘤细胞在大量补料作用下过快的增殖提前将培养基耗尽,而造成自身存活率的下降;
S4、抗体纯化:在对S3中的培养器进行4-5轮的流加培养后,将其加入到洗液瓶中,添加盐酸缓冲液调节其中的pH值在3.6-4.4范围内,然后加入1.1-1.6%的生理盐水,与其中的蛋白质成分反应析出浑浊物,经离心后取其上清成分获得抗体;在洗液瓶中对重组瘤细胞进一步的pH调节,稳定其中抗体成分的活性状态,添加略高浓度的生理盐水,将重组瘤细胞中的蛋白质成分析出,以获得纯化后的单克隆抗体;
SP2/0细胞灌注用培养基,包括以下组分:
1640型培养基40-55份;
CHO型培养基60-70份;
盐酸缓冲液10-15份;
生理盐水120-150份;
胎牛血清20-25份;
蒸馏水50-65份;
通过配比选用现有型号的培养基作为SP2/0细胞灌注用培养基的主要成分,降低了培养基中繁杂成分的配制,在盐酸缓冲液与蒸馏水的调配下,将培养基转化为弱酸性的状态,限制其中SP2/0细胞的活性,稳定其增殖的速率,避免在指数级增殖条件下迅速消耗培养基的营养成分,而降低SP2/0细胞的存活率,利用生理盐水稀释胎牛血清中的血清浓度,在培养基的灌注过程中,逐渐降低其中血清的含量,降低了培养基中血清成分对单克隆抗体生产提纯过程的干扰,替代了无血清成分培养基中大量替代成分的选用添加,从而提升了SP2/0细胞灌注用培养基的应用效果;
其中,S3中所述的培养器包括反应罐1、补充罐2和控制器;所述反应罐1中培养有重组瘤细胞,反应罐1上设置有补料管11和排渣管12;所述补料管11与反应罐1的侧壁相切,补料管11的末端设有补充罐2,补料管11与补充罐2相连通;所述反应罐1的内壁上设置有螺旋的凹槽13,凹槽13的顶端与补料管11的端口相连通;所述补充罐2的下方设有支腿3,补充罐2与支腿3之间设有转座4;所述转座4中设置有伺服电机41,伺服电机41驱动补充罐2在支腿3上转动起来;所述控制器用于记录培养的时间和控制伺服电机41的运行;培养器中的重组瘤细胞在流加培养的过程中,通过控制器的计时将新鲜培养基成分持续供给到重组瘤细胞中,并通过排渣管12排出反应罐1中消耗的培养基,由于重组瘤细胞的增殖呈量变状态,逐渐消耗了培养基中的营养成分,而在批次补料的过程中,流加的培养基成分未能完全补充至重组瘤细胞增殖消耗的区域,且培养基中的各成分在静置下产生了分层,削弱了流加培养基中营养成分的补充作用,进而影响到重组瘤细胞的增殖效果;因此,本发明通过设置在反应罐1内壁上螺旋的凹槽13,配合切向连通到反应罐1中的补料管11,引导其中的培养基成分沿着反应罐1的内壁环绕加入,使更新的培养基成分均衡分布在反应罐1中,同时在伺服电机41的驱动下,补充罐2在支腿3上呈动态变化的转动,对其中保存的培养基成分起到摇匀作用,并增加了培养基进入反应罐1时的动能;本发明利用了设置在反应罐1中切向连通的补料管11,与其内壁上环绕的凹槽13相配合,使补充罐2中转动摇匀的培养基成分,在额外的动能作用下沿反应罐1的内壁冲刷到重组瘤细胞的培养基中,使得流加补充的培养基均衡分布在重组瘤细胞间,从而提升了重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法的应用效果。
作为本发明的一种实施方式,所述补充罐2上设有槽环21,槽环21转动安装在补充罐2的外壁上;所述槽环21的内侧与补充罐2相连通,槽环21的外侧连通有固定的补料管11;在重组瘤细胞的过程中,需要控制补充罐2处于静止状态,然后通过连通的补料管11添加新鲜的培养基成分,而削弱了补充罐2转动中营养成分的混匀程度,进而影响到反应罐1中重组瘤细胞的增殖效果;通过设置在补充罐2上转动的槽环21,使固定的补料管11连通到槽环21上,在补充罐2转动混匀其中培养基成分的过程中,同时通过补料管11对反应罐1进行培养基的更新,确保了补充罐2转动状态下的补料管11的运行,从而提升了重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法的应用效果。
作为本发明的一种实施方式,所述槽环21中设置有滑动的槽盘22,槽盘22垂直于槽环21的内壁;所述槽盘22安装在补充罐2的侧壁上,槽盘22随补充罐2的转动在槽环21中扫掠而过;补料管11通过转动的槽环21使补充罐2中的培养基均匀流加至反应罐1中,而在补充罐2转动过程中的培养基会离心至槽环21上的各个位置,未通过补料管11流加到反应罐1中,造成了培养基的浪费;通过设置在槽环21中滑动的槽盘22,将槽盘22安装在补充罐2上,将槽环21中各处的培养基通过扫掠的槽盘22转移至补料管11的位置,流加到反应罐1中,避免了槽环21中培养基的浪费,从而提升了重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法的应用效果。
作为本发明的一种实施方式,所述排渣管12的端口上设置有隔膜121,隔膜121使反应罐1中的培养液与外部的气压维持平衡;所述隔膜121在流加培养基的增量作用力下形变开启排渣管12,隔膜121在排出相应量的培养基后形变恢复使排渣管12的闭合起来;在对反应罐1进行流加培养基的过程中,需要同时将耗尽营养成分的培养基排出,维持反应罐1中培养基的体积处于稳定范围内,通过补料管11和凹槽13加入的培养基中,会存在附着在管壁及槽壁的部分,降低了最终加入至重组瘤细胞的培养基有效含量,而固定的排出量会造成反应罐1中培养基的失衡,最终影响到重组瘤细胞的增殖效果;通过设置在排渣管12上的隔膜121,将流加至反应罐1内部培养基增量的重力作用在隔膜121上,排除了附着在流加管路上培养基减量的干扰,利用隔膜121自身的形变特性使反应罐1中作用到重组瘤细胞的培养基维持在恒定的范围内,从而提升了重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法的应用效果。
作为本发明的一种实施方式,所述排渣管12的中心设有轴杆5,轴杆5上设置有浆轮51,轴杆5的顶部贯穿隔膜121伸入至反应罐1内;所述轴杆5的顶端设置有扣盖52,轴杆5通过扣盖52转动安装在排渣管12中;所述扣盖52的侧壁上设置有环绕的排渣口53,扣盖52的周向上设置有伸出的拨条54,拨条54与反应罐1的底面滑动接触;重组瘤细胞转化培养基的残渣会散步沉降在反应罐1底面上,而在排渣管12开启的状态下,培养基的液体会沿着排渣管12的端口产生涡流,在与残渣的混合作用下,加大了对隔膜121的冲击力,不同惯性力的作用下使隔膜121的形变恢复状态受干扰,造成了反应罐1中培养基的过度排出,且反应罐1底面边缘的残渣难以随排渣管12端口的涡流排出,降低了反应罐1中重组瘤细胞的培养效果;通过设置在排渣管12中的轴杆5,配合排渣管12顶端转动安装的扣盖52,在排渣管12开启后,通过排渣口53流向排渣管12中的涡流作用到浆轮51上,使轴杆5带动扣盖52转动起来,扣盖52上的拨条54在反应罐1的底面滑动扫过,将其边缘处的残渣搅动起来,随排渣管12的端口排出,同时扣盖52上的排渣口53限制了单位时间的流通量,避免在过大涡流效应作用下的惯性力破坏了隔膜121的形变状态,从而提升了重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法的应用效果。
工作时,培养器中的重组瘤细胞在流加培养的过程中,通过控制器的计时将新鲜培养基成分持续供给到重组瘤细胞中,并通过排渣管12排出反应罐1中消耗的培养基;通过设置在反应罐1内壁上螺旋的凹槽13,配合切向连通到反应罐1中的补料管11,引导其中的培养基成分沿着反应罐1的内壁环绕加入,使更新的培养基成分均衡分布在反应罐1中,同时在伺服电机41的驱动下,补充罐2在支腿3上呈动态变化的转动,对其中保存的培养基成分起到摇匀作用,并增加了培养基进入反应罐1时的动能;设置在补充罐2上转动的槽环21,使固定的补料管11连通到槽环21上,在补充罐2转动混匀其中培养基成分的过程中,同时通过补料管11对反应罐1进行培养基的更新,确保了补充罐2转动状态下的补料管11的运行;设置在槽环21中滑动的槽盘22,将槽盘22安装在补充罐2上,将槽环21中各处的培养基通过扫掠的槽盘22转移至补料管11的位置,流加到反应罐1中,避免了槽环21中培养基的浪费;设置在排渣管12上的隔膜121,将流加至反应罐1内部培养基增量的重力作用在隔膜121上,排除了附着在流加管路上培养基减量的干扰,利用隔膜121自身的形变特性使反应罐1中作用到重组瘤细胞的培养基维持在恒定的范围内;设置在排渣管12中的轴杆5,配合排渣管12顶端转动安装的扣盖52,在排渣管12开启后,通过排渣口53流向排渣管12中的涡流作用到浆轮51上,使轴杆5带动扣盖52转动起来,扣盖52上的拨条54在反应罐1的底面滑动扫过,将其边缘处的残渣搅动起来,随排渣管12的端口排出,同时扣盖52上的排渣口53限制了单位时间的流通量,避免在过大涡流效应作用下的惯性力破坏了隔膜121的形变状态。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (3)
1.一种重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法,其特征在于:该方法步骤如下:
S1、培养基配制:选择重组瘤细胞型培养基作为主成分,并准备Tris-HCL缓冲液、乙酸和10%血清浓度的胎牛血清,控制培养基处于pH5.2-6.4的弱酸性状态下;
S2、瘤细胞驯化:将重组处理的SP2/0细胞复苏后接种于S1的培养基中,置于37.2-37.8℃,6-12%二氧化碳的培养箱中,每36-44h进行传代培养,观察细胞增殖的程度,依次降低培养基中1-2%的血清浓度,直至血清浓度递减到3%,获得驯化培养完成的重组瘤细胞;
S3、流加培养:选择S2中驯化完成的重组瘤细胞培养液,进行离心处理并祛除其上清成分,然后转移至培养器中,在每54h内对培养器进行批次补料流加操作,且进一步降低其中的血清浓度至1.5%的水平,控制单次补料流加的培养基占培养器中总体积的5-8%;
S4、抗体纯化:在对S3中的培养器进行4-5轮的流加培养后,将其加入到洗液瓶中,添加盐酸缓冲液调节其中的pH值在3.6-4.4范围内,然后加入1.1-1.6%的生理盐水,与其中的蛋白质成分反应析出浑浊物,经离心后取其上清成分获得抗体;
补料流加的培养基为SP2/0细胞灌注用培养基,包括以下组分:
1640型培养基40-55份;
CHO型培养基60-70份;
盐酸缓冲液10-15份;
生理盐水120-150份;
胎牛血清20-25份;
蒸馏水50-65份;
其中,S3中所述的培养器包括反应罐(1)、补充罐(2)和控制器;所述反应罐(1)中培养有重组瘤细胞,反应罐(1)上设置有补料管(11)和排渣管(12);所述补料管(11)与反应罐(1)的侧壁相切,补料管(11)的末端设有补充罐(2),补料管(11)与补充罐(2)相连通;所述反应罐(1)的内壁上设置有螺旋的凹槽(13),凹槽(13)的顶端与补料管(11)的端口相连通;所述补充罐(2)的下方设有支腿(3),补充罐(2)与支腿(3)之间设有转座(4);所述转座(4)中设置有伺服电机(41),伺服电机(41)驱动补充罐(2)在支腿(3)上转动起来;所述控制器用于记录培养的时间和控制伺服电机(41)的运行;
所述补充罐(2)上设有槽环(21),槽环(21)转动安装在补充罐(2)的外壁上;所述槽环(21)的内侧与补充罐(2)相连通,槽环(21)的外侧连通有固定的补料管(11);
所述槽环(21)中设置有滑动的槽盘(22),槽盘(22)垂直于槽环(21)的内壁;所述槽盘(22)安装在补充罐(2)的侧壁上,槽盘(22)随补充罐(2)的转动在槽环(21)中扫掠而过。
2.根据权利要求1所述的一种重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法,其特征在于:所述排渣管(12)的端口上设置有隔膜(121),隔膜(121)使反应罐(1)中的培养液与外部的气压维持平衡;所述隔膜(121)在流加培养基的增量作用力下形变开启排渣管(12),隔膜(121)在排出相应量的培养基后形变恢复使排渣管(12)的闭合起来。
3.根据权利要求2所述的一种重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法,其特征在于:所述排渣管(12)的中心设有轴杆(5),轴杆(5)上设置有浆轮(51),轴杆(5)的顶部贯穿隔膜(121)伸入至反应罐(1)内;所述轴杆(5)的顶端设置有扣盖(52),轴杆(5)通过扣盖(52)转动安装在排渣管(12)中;所述扣盖(52)的侧壁上设置有环绕的排渣口(53),扣盖(52)的周向上设置有伸出的拨条(54),拨条(54)与反应罐(1)的底面滑动接触。
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